JP6920491B2 - 合成代謝弁を用いた迅速かつ動的なフラックス制御のための組成物及び方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年6月11日出願の米国仮特許出願第61/010,574号の利益を主張するものであり、上記仮特許出願の全内容は、参照により本出願に援用される。
本発明は、米国科学財団によって与えられた連邦政府補助金No.MCB‐1445726、及び米国国防総省の国防高等研究計画局によって与えられた連邦契約No.HR0011‐14‐C‐0075の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本出願は配列表を含む。上記配列表は、「OLG Ref 210‐44_ST25.txt」というタイトルのASCIIテキストファイルとして、EFS‐Webによって電子提出されている。上記配列表のサイズは184,352バイトであり、2015年6月11日に作成された。上記配列表はその全体が参照により本出願に援用される。
本明細書及び請求項において使用される場合、単数形「a、an(ある)」及び「上記、前記(the)」は、文脈がそうでないことを明らかに指示していない限り、複数の指示対象を含む。従って例えば、「ある発現ベクター(an expression vector)」に関する言及は、単一の発現ベクター、及び同一の(例えば同一オペロンの)又は異なる複数の発現ベクターを含み、また「ある微生物(a microorganism)」に関する言及は、単一の微生物及び複数の微生物を含み、他の表現もまた同様である。
本発明において組み換え微生物が使用する生物学的産生培地は、成長段階及び産生段階の両方のために、好適な炭素源又は基質を含有していなければならない。好適な基質としては、グルコース、スクロース、キシロース、マンノース、アラビノース、油、二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド及びグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。全ての上述の炭素基質及びその混合物は、本発明において1つ又は複数の炭素源として好適であると考える。
本出願において記載及び請求されるような特徴は、本出願のリストから選択された微生物、又は1つ若しくは複数の天然の、導入された、若しくは増強された産物生物学的産生経路を備える別の好適な微生物において提供できる。従っていくつかの実施形態では、上記1つ又は複数の微生物は、(いくつかのこのような実施形態では増強されていてよい)内因性産物産生経路を備え、他の実施形態では、上記微生物は内因性産物産生経路を備えない。
本出願に開示されているタイプのうちの1つから選択されるもの等の適切な炭素源に加えて、生物学的産生培地は、好適な無機物、塩、共因子、緩衝剤、並びに当業者に公知であり、かつ培養物の成長、及び本発明のもとでの化学産物の生物学的産生に必要な酵素経路の促進のために好適な、他の成分を含有していなければならない。
本発明による方法及び/又は組成物を利用する発酵系もまた、本発明の範囲内である。
本発明の実施形態は、宿主微生物への発現ベクターの導入によって得られ、上記発現ベクターは、宿主微生物中に通常確認される、又は確認されない酵素に対する核酸配列コーディングを含有する。
特に本発明は、制御遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスのうちの1つ若しくは複数、又はその組み合せを含む、合成代謝弁の構築について記載している。当業者であれば、遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスのためのいくつかの方法論を認識していることが理解される。CRISPR干渉に基づく遺伝子サイレンシングと制御下プロテオリシスとの組み合わせの例を図2に示す。
特に本発明は、制御下多段階発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御の実現を補助するための、制御下遺伝子サイレンシングの使用について記載している。mRNAサイレンシング又はRNA干渉、転写リプレッサを介するサイレンシング、及びCRISPR干渉を含むがこれらに限定されない、制御下遺伝子サイレンシングについて、当該技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。RNA干渉のための方法及び機序は、アグラワール(Agrawal)ら著「RNA干渉:生物学、機序及び応用(RNA Interference: Biology, Mechanism, and Applications)」、マイクロバイオロジー アンド モレキュラーバイオロジー レビュー(Microbiology and Molecular Biology Reviews)、2003年12月;67(4)、657‐685ページ、DOI:10.1128/MMBR.67.657‐685.2003年によって教示されている。CRISRPR干渉のための方法及び機序は、チー(Qi)ら著「遺伝子発現の配列特異的制御のためのRNAガイドプラットフォームとしてのCRISPRの再利用(Repurposing CRISPR as an RNA‐guided platform for sequence‐specific control of gene expression)」、セル(Cell)、2013年2月;152(5)、1173‐1183ページ、DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022によって教示されている。更に、ネイティブ大腸菌CASCADE系を用いたCRISRPR干渉のための方法及び機序は、ルオー(Luo)ら著「プログラム可能な遺伝子抑制のための内因性I型CRIPR‐Cas系の再利用(Repurposing endogenous type I CRISPR‐Cas systems for programmable gene repression)」NAR.、2014年10月;DOI:10.1093によって教示されている。更なる多数の転写リプレッサ系が当該技術分野において公知であり、遺伝子発現をオフにするために使用できる。
特に本発明は、制御下多段発酵プロセスにおける代謝フラックスの制御の実現を補助するための、制御下タンパク質分解又はプロテオリシスの使用について記載している。特定のプロテアーゼによる標的タンパク質切断、及び特定のペプチドタグによる分解のためのタンパク質の制御下ターゲッティングを含むがこれらに限定されない、制御下タンパク質分解のための、当技術分野において公知のいくつかの方法が存在する。制御下タンパク質分解のために大腸菌clpXPプロテアーゼを使用するための系は、マッギネス(McGinness)ら著「制御可能なタンパク質分解の設計(Engineering controllable protein degradation)」、モレキュラー セル(Mol Cell)、2006年6月;22(5)、701‐707ページによって教示されている。この方法は、DAS4(又はDAS + 4)タグのような特定のC末端ペプチドタグの付加によるものである。このタグを有するタンパク質は、特異性増強シャペロンsspBが発現されるまで、clpXPプロテアーゼによって分解されない。sspBは、clpXPプロテアーゼによるDAS4標識タンパク質の分解を誘導する。更なる多くの部位特異的プロテアーゼ系が当該技術分野において公知である。タンパク質は、所与のプロテアーゼの特定の標的部位を含むように設計でき、次いでプロテアーゼの制御下発現後に切断できる。いくつかの実施形態では、上記切断はタンパク質の不活性化又は分解をもたらすことが予想され得る。例えばシュミット(Schmidt)ら著「ClpSは、N末端分解経路の大腸菌基質に対する認識成分である(ClpS is the recognition component for Escherichia coli substrates of the N‐end rule degradation pathway)」、モレキュラー マイクロバイオロジー(Molecular Microbiology)、2009年3月、72(2)、506‐517ページ、doi:10.1111は、clpS依存性clpAP分解を可能にする関心対象のタンパク質にN末端配列を付加できると教示している。またこの配列は更に、ULP加水分解酵素等によって制御可能に切断できる追加のN末端配列によってマスクできる。これにより、加水分解酵素の発現に応じた、制御下N則分解が可能となる。従って、N末端又はC末端のいずれかにおいて、制御下プロテオリシスに関してタンパク質を標識できる。N末端タグとC末端タグとの使用の優先性は、分解の制御下での開始前にいずれのタグがタンパク質機能に影響を及ぼすかに大きく左右される。
特に本発明は、多段発酵プロセスにおける代謝フラックスを制御するための合成代謝弁の使用について記載している。多段階発酵の段階間の遷移において使用できる、発現を誘導するための当該技術分野で公知の多数の方法が存在する。上記方法としては、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、ラクトース、IPTG(イソプロピル‐ベータ‐D‐1‐チオガラクトピラノシド)、アラビノース、ラフィノース、トリプトファン及び多数の他のものを含む人工化学誘発剤が挙げられるが、これらに限定されない。これらの公知の誘導物質の使用を遺伝子発現サイレンシング及び/又は制御下プロテオリシスの制御に結び付ける系を、遺伝子修飾微生物系に組み込むことによって、多段発光プロセスにおける成長相と産生相との間の遷移を制御できる。
本出願において、本発明の様々な実施形態を示し、説明したが、これらの実施形態は実施例のみによって提供されることを強調しておく。本発明の様々な実施形態において、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更及び置換を行うことができる。具体的には、いずれの理由においても、本出願において言明されているか又はリスト、表で提示されている、化合物;核酸配列;機能的酵素、代謝経路酵素若しくは中間体を含む特定のタンパク質、元素、若しくは他の組成物を含むポリペプチド;又は濃度のいずれのグループ分け、あるいは他のグループ分け(図示されている代謝経路酵素等)に関して、そうでないことが言明されていない限り、このようなグループ分けはそれぞれ、様々な部分集合的実施形態の基礎を提供し、それらを識別する役割を果たすことを意図しており、上記部分集合的実施形態はその最大範囲において、言明されている各グループ分けの1つ又は複数のメンバー(又は部分集合)を除外することによる、上記グループ分けの各部分集合を含む。更に、本出願にいずれの範囲が記載されている場合、そうでないことが言明されていない限り、当該範囲はその中の全ての値及びその中の全ての下位範囲を含む。
この実施例は、温度感受性対立遺伝子を介したfabIの制御下不活性化を用いる、中間体マロニル‐CoAからの大腸菌におけるテトラヒドロキシナフタレン(THN)の産生の増大について記載する。簡潔には、株BWapldf(BW25113:ΔldhA、ΔpflB、ΔpoxB、ΔackA‐pta、ΔadhE)を更に遺伝子修飾することによって、fabI遺伝子を、温度感受性(ts)突然変異(F241S)を含有するよう、及びfabI遺伝子のC末端においてゲンタマイシン耐性カセットを組み込むよう、突然変異させた。これは、標準的な組み換えプロトコルを用いて達成された。上記株を更に修飾することによって、プラスミドpSMART‐HC‐Kan‐yibD‐THNS(配列番号1)を用いた形質転換によってリン酸塩制限条件下でテトラヒドロキシナフタレン(THN)シンターゼ遺伝子(ストレプトマイセス・セリカラー由来のrppA)を発現させた。対照株は、ルシゲン(Lucigen)社から入手した対照空ベクターpSMART‐HC‐Kan(Genbank受入番号#AF532107.1)を用いて作製した。ルシゲン社から入手したpSMART‐HC‐Kanキットを利用する慣用の分子生物学的方法を用いて、カナマイシン耐性を付与するこの高コピープラスミドを構築した。低リン酸塩のプロモータの制御下のrppA遺伝子は、大腸菌のyibD(waaH)遺伝子を誘導した。この株及び対照を、「一般的方法」の節に「振盪フラスコプロトコル‐1(Shake Flask Protocol‐1)」として概説されているような2段プロトコルを使用して、THN産生について評価した。相対THN産生を、340nmにおける上清の光学密度を測定することによって定量した。図4に結果をまとめる。
この実施例は、合成代謝技術を用いたfabIの制御下抑制を用いる、中間体マロニル‐CoAからの大腸菌中のテトラヒドロキシナフタレン(THN)の産生の増大について記載する。この実施例では、CRISPR干渉遺伝子サイレンシング技術と制御下タンパク質分解との組み合わせを2段プロセスにおいて使用した。簡潔には、株BWapldf(BW25113:ΔldhA、ΔpflB、ΔpoxB、ΔackA‐pta、ΔadhE)を更に遺伝子修飾することによって、fabI遺伝子を、C末端DAS4タグを含有するよう、及びfabI遺伝子のC末端においてゲンタマイシン耐性カセットを組み込むよう、タグ付けした。DAS4タグをエンコードするC末端ヌクレオチド配列は、以下の配列として組み込まれた:5’‐GCGGCCAACGATGAAAACTATTCTGAAAACTATGCGGATGCGTCT‐34。これは、標準的な組み換えプロトコルを用いて達成された。また、株を更に修飾することによって、sspB遺伝子を欠失させた。これもまた、標準的な組み換え方法で実施した。更に、これらの株をまた更に修飾することによって、3つのプラスミドを含有させた:第1のプラスミドは、上記のように、テトラヒドロキシナフタレン(THN)シンターゼ遺伝子pSMART‐HC‐Kan‐yibD‐THNS(配列番号1)を発現する。第2のプラスミドは、EMDミリポアバイオサイエンス(EMD Millipore Biosciences)社から入手したpCDF‐1b由来の高コピースペクチノマイシン耐性プラスミドから、fabI遺伝子をターゲッティングする小さなガイドRNAを発現するように構築された。上記プラスミドpCDF‐T2‐fabIsgRNA(配列番号2)は、S.pyogenes dCas9と共に使用するための小さなガイドRNAを発現する。特定のfabI T2ターゲッティング配列は、5’‐CAGCCTGCTCCGGTCGGACCG‐3’(配列番号47)によって与えられる。チー(Qi)ら、セル(Cell)、2013年2月;152(5)、1173‐1183ページ、DOI:10.1016/j.cell.2013.02.022に記載されているように、いずれのターゲッティング配列を失った対照プラスミドも作製した。最後のプラスミドpdCas9‐ptet‐sspB(配列番号3)は、アドジーン(Addgene)社(マサチューセッツ州ケンブリッジ;プラスミドID44249)から入手した、チー(Qi)らからのプラスミドpdCas9‐細菌由来であった。簡潔には、pdCas9‐細菌を直鎖化し、sspB遺伝子を、触媒的に不活性のdcas9遺伝子の3’における付加的なptetプロモータの制御下で導入した。アンヒドロテトラサイクリン(aTc)の添加は、このクロラムフェニコール耐性授与プラスミドからのdCas9及びsspBの両方の発現を誘導する。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法と、DNA配列決定によって確認された配列とを用いて構築した。これらの株及び対照を、「一般的方法」の節に「振盪フラスコプロトコル‐2」として概説されているような2段プロトコルを使用して、THN産生について評価した。相対THN産生を、340nmにおける上清の光学密度を測定することによって定量した。図5に結果をまとめる。
例えば「一般的方法」の節に列挙されている株のうちのいずれか等の多数の微生物株は、産物の生合成のための酵素を発現するように遺伝子修飾してよい。更に、これらの修飾された微生物株を更に修飾することによって、増殖に必要なものを含む1つ又は複数の代謝経路の酵素活性の動的低減のための、制御可能な合成代謝弁を含有させることができる。これらの弁は、遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスを含む方法のうちの1つ又は組み合わせを利用してよい。更に、これらの修飾された株を多段階発酵プロセスで使用してよく、ここでは段階間の遷移はこれらの弁の制御下活性化と同時に行われる。具体的には、これらの微生物株のいずれかを更に、産物形成を可能にする異種産生経路を発現するように設計してよい。
簡潔には、株BWapldf(BW25113:ΔldhA、ΔpflB、ΔpoxB、ΔackA‐pta、ΔadhE)を、以下の遺伝子:arcA、iclR及びsspBの欠失のために更に遺伝子修飾して、株DLF_0002を構築した。これもまた、標準的な無瘢痕組み換え方法で実施した。大腸菌のネイティブCASCADE系を用いたCRISPRベースの遺伝子サイレンシング及び制御下プロテオリシスの両方が可能な株を構築するために、まず大腸菌のcas3遺伝子を欠失させた。この遺伝子をある配列で置換することによって、CASCADEベースの遺伝子サイレンシングを可能にするcasABCDE‐cas1,2オペロンの構成的発現と、sspBシャペロンの低リン酸塩誘導を可能にする構築との両方を可能とした。組み込まれる上記DNA配列を、単一の合成構築物:配列番号4として配列し、標準的な組み換え方法を用いて組み込んだ。cas3遺伝子の代わりに、この構築物は、転写ターミネータ、続いて低リン酸塩誘導性大腸菌ugpB遺伝子プロモータ及びsspB遺伝子を組み込む。sspB遺伝子には、別の転写ターミネータ、及びそれに続く(デイビス、JH.、ルービン、AJ.及びザウアー、RT.(Davis, JH., Rubin, AJ., and Sauer, RT.)、NAR.2011年2月;39(3)、1131‐1141ページ、DOI:10.1093)からの、カスケードオペロンの定常発現を駆動するために適合された構成的proBプロモータが続く。結果として得られる株はDLF_0025と呼ばれる。
合成代謝弁を制御するための異なる低リン酸塩誘導スキームを評価するために、大腸菌からのいくつかの公知の低リン酸塩誘導性プロモータを、紫外線励起性緑色蛍光タンパク質(GFPuv)レポータ遺伝子を用いて評価した。これらの遺伝子プロモータは、以下の遺伝子に関するものを含んでいた:amn、phoA、phoB、phoE、phoH、phoU、mipA、pstS、ugpB、waaH及びydfHを、低リン酸塩誘導について評価した。各プロモータをGFPuv遺伝子レポータに連結するレポータプラスミドを構築し、配列は以下の通りである:pSMART‐amnp‐GFPuv(配列番号36)、pSMART‐phoAp‐GFPuv(配列番号37)、pSMART‐phoBp‐GFPuv(配列番号38)、pSMART‐phoEp‐GFPuv(配列番号38)、pSMART‐phoHp‐GFPuv(配列番号40)、pSMART‐phoUp‐GFPuv(配列番号41)、pSMART‐mipAp‐GFPuv(配列番号42)、pSMART‐pstSp‐GFPuv(配列番号43)、pSMART‐ugpBp‐GFPuv(配列番号12)、pSMART‐waaHp‐GFPuv(配列番号44)、及びpSMART‐ydfHp‐GFPuv(配列番号45)。簡潔には、プラスミドは大腸菌株BWapldfに形質転換された(実施例4参照)。コロニーを用いて、カナマイシン(「一般的方法」の節を参照)を含む4mLのSM3培地に接種し、37℃、振盪速度225rpmで一晩インキュベートした。一晩成長させた後、細胞を600nmの光学密度で5に正規化し、正規化した培養物40μLを使用して、48ウェルフラワープレート(FlowerPlate)(商標)Bのウェル中で、760μLの新鮮なFGM3(「一般的方法」の節参照)培地にカナマイシンを接種し、バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタ(BioLector Microbioreactor)に移した(フラワープレート及びバイオリアクタ・マイクロバイオリアクタはいずれもM2Pラボ(M2P Labs)社(ドイツ、ベスヴァイラー)から入手した)。バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタは蛍光を連続的に測定できる。細胞をマイクロバイオリアクタ内で37℃、振盪速度1200rpmで60時間インキュベートした。成長が停止し、約15から20時間でリン酸塩枯渇が始まる(明瞭化のためにデータは示されていない)。各レポータ構築物及び空ベクター対照に関する蛍光結果を、図6において相対蛍光単位(R.F.U)として報告する。全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ(Gibson Assembly)法(ギブソンアセンブリマスターミックス(Gibson Assembly Master Mix)、ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手)、及びジーブロックス(Gblocks)(商標)(インテグレーテッド・DNAテクノロジー(Integrated DNA Technology)社、米国アイオワ州コーラルヴィル)として提供された合成直鎖二本鎖DNAを用いて構築した。プラスミドDNA配列の確認には、イートン・バイオサイエンス(Eton Bioscience)(米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
pcrRNAプラスミドのテトラサイクリン誘導性プロモータ(ルオー(Luo)ら著「プログラム可能な遺伝子抑制のための内因性I型CRIPR‐Cas系の再利用(Repurposing endogenous type I CRISPR‐Cas systems for programmable gene repression)」NAR.、2014年10月;DOI:10.1093)を、絶縁されたugpBプロモータに交換することにより、pCASCADE‐対照(配列番号13)を調製した。プラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ(Gibson Assembly)法(ギブソンアセンブリマスターミックス(Gibson Assembly Master Mix)、ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手)、及びジーブロックス(Gblocks)(商標)(インテグレーテッド・DNAテクノロジー(Integrated DNA Technology)社、米国アイオワ州コーラルヴィル)として提供された合成直鎖二本鎖DNAを用いて構築した。プラスミドDNA配列の確認には、イートン・バイオサイエンス(Eton Bioscience)(米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)を用いた。
全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ(Gibson Assembly)法(ギブソンアセンブリマスターミックス(Gibson Assembly Master Mix)、ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手)、及びジーブロックス(Gblocks)(商標)(インテグレーテッド・DNAテクノロジー(Integrated DNA Technology)社、米国アイオワ州コーラルヴィル)として提供された合成直鎖二本鎖DNAを用いて構築した。プラスミドDNA配列の確認には、イートン・バイオサイエンス(Eton Bioscience)(米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。最初に、標準的なクローニング技術を用いて、低リン酸塩誘導性(大腸菌由来の低リン酸塩誘導性waaH遺伝子プロモータを利用する)紫外線励起性緑色蛍光タンパク質(GFPuv)を発現するプラスミドを構築し、これをpSMART‐waaHp‐GFPuv(配列番号12)と呼んだ。第2に、制御下プロテリオリシスを可能にするDAS+4タグでタグ付けされた赤色蛍光タンパク質(mCherry)の構成的発現を有する適合性ベクターpBT1‐mCherry‐DAS+4(配列番号28)を構築した。構成的発現は、proDプロモータ(デイビス、JH.、ルービン、AJ.及びザウアー、RT.(Davis, JH., Rubin, AJ., and Sauer, RT.)、NAR.2011年2月;39(3)、1131‐1141ページ、DOI:10.1093)を用いて達成された。最後に、proDプロモータをターゲッティングする遺伝子サイレンシングガイドRNAの低リン酸塩発現(大腸菌由来の低リン酸塩誘導性ugpB遺伝子プロモータの利用する)を可能にする、別の適合ベクターpCASCADE‐proD(配列番号29)を構築した。これらのプラスミドは、実施例4に記載されているように、いくつかの株を生成するための株DLF_0025を含むいくつかの宿主株に変換された。コロニーを用いて、カナマイシン(「一般的方法」の節を参照)を含む4mLのSM3培地に接種し、37℃、振盪速度225rpmで一晩インキュベートした。一晩成長させた後、細胞を600nmの光学密度で5に正規化し、正規化した培養物40μLを使用して、48ウェルフラワープレート(FlowerPlate)(商標)Bのウェル中で、760μLの新鮮なFGM3(「一般的方法」の節参照)培地にカナマイシンを接種し、バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタ(BioLector Microbioreactor)に移した(フラワープレート及びバイオリアクタ・マイクロバイオリアクタはいずれもM2Pラボ(M2P Labs)社(ドイツ、ベスヴァイラー)から入手した)。バイオリアクタ・マイクロバイオリアクタは蛍光を連続的に測定できる。細胞をマイクロバイオリアクタ内で37℃、振盪速度1200rpmで60時間インキュベートした。各レポータ構築物及び空ベクター対照に関する蛍光結果を、図7において、バイオマスレベルに対して平準化された相対蛍光単位(R.F.U)として報告する。全てのプラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ(Gibson Assembly)法(ギブソンアセンブリマスターミックス(Gibson Assembly Master Mix)、ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手)、及びジーブロックス(Gblocks)(商標)(インテグレーテッド・DNAテクノロジー(Integrated DNA Technology)社、米国アイオワ州コーラルヴィル)として提供された合成直鎖二本鎖DNAを用いて構築した。プラスミドDNA配列の確認には、イートン・バイオサイエンス(Eton Bioscience)(米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
全ての産生プラスミドは、標準的なギブソンアセンブリ(Gibson Assembly)法(ギブソンアセンブリマスターミックス(Gibson Assembly Master Mix)、ニューイングランド・バイオラボ(New England Biolabs)社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチから入手)、及びジーブロックス(Gblocks)(商標)(インテグレーテッド・DNAテクノロジー(Integrated DNA Technology)社、米国アイオワ州コーラルヴィル)として提供された合成直鎖二本鎖DNAを用いて構築した。プラスミドDNA配列の確認には、イートン・バイオサイエンス(Eton Bioscience)(米国ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)を用いた。標準的なコドン最適化を実施して、大腸菌での発現のために構築物を最適化した。
実施例5に記載されているような宿主株、実施例8に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例6に記載されているもののようなCASCADEベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準96ウェルプレート評価プロトコル「96ウェルプロトコル‐1」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表2に示す。
実施例5に記載されているような宿主株、実施例6に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例7に記載されているもののようなCASCADEベースの遺伝子サイレンシング構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準的なmL規模評価プロトコル「Micro24プロトコル‐1」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。測定の概要を表3に列挙し、図8に示す。
実施例10の大腸菌株39を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「1L発酵プロトコル‐1」を用いて、1L規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及び3‐HP産生を図9に示す。
実施例5に記載されているような宿主株、実施例8に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例6に記載されているもののようなCASCADEベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されているような標準96ウェルプレート評価プロトコル「96ウェルプロトコル‐1」を使用して、上記株を産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表4に示す。
実施例5に記載されているような宿主株、実施例8に記載されているような産生経路プラスミド、及び実施例6に記載されているもののようなCASCADEベースの遺伝子サイレンシン構築物を組み合わせて、いくつかの大腸菌株を構築した。次に、「一般的方法」の節に記載されている標準96ウェルプレート評価プロトコル「96ウェルプロトコル‐1」を使用して、産物形成について評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。これらの株及び関連する産生データを表5に示す。
実施例13の大腸菌株49を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Micro24プロトコル‐1」を用いて、mL規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図10に示す。
実施例13の大腸菌株60を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「1L発酵プロトコル‐1」を用いて、1L規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図11に示す。
宿主株DLF_00165をプラスミドpSMART‐2,3‐BDO1及びpCASCADE‐zwfの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した(実施例4,6及び8を参照)。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Micro24プロトコル‐1」を用いて、mL規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図12に示す。
宿主株DLF_00165をプラスミドpSMART‐2,3‐BDO1及びpCASCADE‐zwfの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した(実施例4,6及び8参照)。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「1L発酵プロトコル‐1」を用いて、1L規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図13に示す。
宿主株DLF_00049をプラスミドpSMART‐2,3‐BDO2及びpCASCADE‐udhAの両方で形質転換することによって、大腸菌株を作製した(実施例4,6及び8参照)。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「Micro24プロトコル‐1」を用いて、mL規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図14に示す。
宿主株DLF_0004をプラスミドpSMART‐Mev1で形質転換することによって、大腸菌株を作製した(実施例4及び8参照)。この株を、「一般的方法」の節に記載されているような標準的な評価プロトコル「1L発酵プロトコル‐1」を用いて、1L規模で評価した。そして産物レベルを、「一般的方法」の節に記載されているような分析方法を用いて測定した。バイオマス成長及びアラニン産生を図15に示す。
この節の全ての方法は、参照された場合に実施例に組み込むために提供される。
必要に応じて利用できる微生物種は以下の通りである:
上述の又は以下の具体的実施例に加えて、この実施例は、関心対象の核酸配列を導入する、除去する又は変化させるための、選択された微生物の遺伝子修飾への非制限的なアプローチを説明することを意図している。この一般的実施例内において、代替例及び変形例が提供される。この実施例の方法を実施することによって、選択された微生物種における所望の遺伝子修飾の組み合わせ、例えば本出願中の複数の節において記載されているような遺伝子修飾の組み合わせ、並びに他の細菌種及び他の微生物種におけるもののような、その機能的等価物を達成できる。
ファージ形質導入及び組み換えを含む多数の方法のうちの1つを用いて、大腸菌に染色体修飾を行うことができる。当業者はこれらの方法に精通していることが理解される。特に使用されるのは、リー、X.(Li, X.)ら著「tetA‐sacBカセットを用いた正及び負の選択:大腸菌における遺伝子改変及びP1形質導入(Positive and negative selection using the tetA‐sacB cassette: recombineering and P1 transduction in Escherichia coli)」、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Res.)、2013年12月、41(22) doi:10.1093によって教示されているような、不要な配列を残存させずに、染色体に対する配列の正確な欠失又は付加を可能にする、無瘢痕組み換え方法である。
同種組み換えに関する技術分野において公知の方法を用いて、サッカロマイセス・セレビシエを含む多数の酵母株に染色体修飾を行うことができる。当業者はこれらの方法に精通していることが理解される。
GM25培地:大腸菌のためのGM25最小成長培地は、1リットルあたり以下を含有していた:736mLの滅菌蒸留した脱イオン水;2.0mLの100X微量金属原料(Trace Metals Stock);100mLの10X GMリン酸塩;2.0mLの2M MgSO4;50mLの500g/Lグルコース50mL;100mLの1M MOPS緩衝液、pH7.4;及び10.0mLの100g/L酵母抽出物。100X微量金属原料は、1.0Lの蒸留した脱イオン水に、10.0mLの濃縮HCl、5.0gのCaCl2*2H2O、1.00gのFeCl3*6H2O、0.05gのCoCl2*6H2O、0.3gのCuCl2*2H2O、0.02gのZnCl2、0.02gのNa2MoO4*2H2O、0.01gのH3BO3、及び0.04gのMnCl2*4H2Oを加え、0.2μmフィルタで滅菌濾過することによって調製された。10X GMリン酸塩は、1.0Lの蒸留した脱イオン水に、3gのK2HPO4、2gのKH2PO4、30gの(NH4)2SO4、及び1.5gクエン酸(無水)を加え、オートクレーブすることによって調製された。2M MgSO4は、1.0Lの蒸留した脱イオン水に、240.0gの無水MgSO4を加え、0.2μmフィルタで滅菌濾過することによって調製された。500g/Lグルコース溶液は、1.0Lの加熱され蒸留した脱イオン水に500gの無水デキストロースを加え、0.2μmフィルタで滅菌濾過することによって調製された。1M 4‐モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝液は、700.0mLの蒸留した脱イオン水に、210.0gのMOPS及び30.0mLの50%KOH溶液を加えることによって調製された。pHは撹拌しながら測定され、50%KOHを、最終体積1.0Lまでの適量をゆっくりと添加することによって、pH7.4への最終調整が行われた。最終的なpH7.4の溶液を、0.2μmフィルタで滅菌濾過した。
振盪フラスコプロトコル‐1
生物学的産生を、リン酸塩を含まないGM25最小定義培地を用いて、50mL規模で実証する。培養物を単一のコロニーから開始し、標準的な実施方法によって、3.2mMリン酸塩及び適切な抗生物質を含有する50mLのGM25培地に入れ、200rpmで回転させながら30℃で1晩、静止相まで成長させる。各静止相培養物の光学密度(OD600、光路長1cm)を測定し、培養物全体を50mLコニカルチューブに移し、4000rpmで15分間遠心分離する。GM25培地の量を計算してペレットに添加することにより、各培養物について20光学密度再懸濁液を生成する。この再懸濁液2.5mLを、50mLのPM25培地及び適切な抗生物質に添加し、3つの250mL非バッフルフラスコに入れ、30℃、200rpmでインキュベートする。これらの培養物による細胞成長及び産生を監視するために、600nmでの光学密度測定(OD600、光路長1cm)用に、試料(2ml)を指定の時点で回収する。試料を14,000rpmで5分間遠心分離し、上清を分析物測定のために‐20℃に保持する。接種4時間後に振盪インキュベータの温度を37℃に変更することにより、培養物を産生へと移行させる。光学密度及び産物測定のために、この時点並びに接種後6時間、8時間及び24時間において試料を収集する。
生物学的産生を、リン酸塩を含まないGM25最小定義培地中で、50mL規模で実証する。培養物を単一のコロニーから開始し、標準的な実施方法によって、3.2mMリン酸塩及び適切な1つ又は複数の抗生物質を含有する50mLのGM25培地に入れ、200rpmで回転させながら37℃で1晩、静止相まで成長させる。各静止相培養物の光学密度(OD600、光路長1cm)を測定し、培養物全体を50mLコニカルチューブに移し、4,000rpmで15分間遠心分離する。GM25培地の量を計算してペレットに添加することにより、各培養物について20光学密度再懸濁液を生成する。この再懸濁液2.5mLを、50mLのPM25培地及び抗生物質に添加し、3つの250mL非バッフルフラスコに入れ、37℃、200rpmでインキュベートする。これらの培養物による細胞成長及び産生を監視するために、600nmでの光学密度測定(OD600、光路長1cm)用に、試料(2ml)を指定の時点で回収する。試料を14,000rpmで5分間遠心分離し、上清を分析物測定のために‐20℃に保持する。接種時に50ng/mLのアンヒドロテトラサイクリン(aTc)を用いて培養物を誘導することにより、培養物を産生へと移行させる。光学密度及び産物測定のために、この時点並びに接種後4時間及び20時間において試料を収集した。
生物学的産生を、最小培地中で、μL規模で実証する。複数のコロニーを用いて標準96ウェルプレートの個々のウェルに接種し、必要に応じて適切な抗生物質を含む150μLのSM10++培地で充填した。プレートをサンドイッチカバー(Model#CR1596、エンジスクリーン(EnzyScreen)社、オランダ、ハールレムから入手)で覆った。これらのカバーにより、インキュベーション中の蒸発による損失は確実に最小となる。十分な通気を保証するために、接種済みの96ウェルプレート及びサンドイッチカバーを、温度37℃、振盪速度1100rpmに設定された小型振盪インキュベータ(VWR Catalog#12620‐942、VWRインターナショナルLLC(VWR International LLC.)社、米国ペンシルバニア州ラドナー)内の所定の位置へとクランプ固定した。使用したプレートクランプは、エンジスクリーン(Enzyscreen)(Model#CR1600、エンジスクリーン(EnzyScreen)社、オランダ、ハールレム)から入手した。重要なことには、使用した振盪器は、0.125インチ、即ち3mmの軌道を有していた。軌道と最小振盪速度とのこの組み合わせは、必要な物質移動係数を得るため、及び十分な培養物の酸素化を可能とするために必要である。培養物を16時間成長させた。
生物学的産生を、最小培地中で、mL規模で実証する。以下のようにして培養種を調製した。コロニーを用いて、必要に応じて適切な抗生物質を含む4mLのSM10培地に接種し、滅菌された14mLの培養管に入れた。培養管を、225rpmの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、37℃において1晩インキュベートした。1晩の成長後、2.5mLのこれらの培養物を用いて、セルスター(Cellstar)(商標)細胞培養フラスコ(VWR Catalog#82050‐856、VWRインターナショナルLLC(VWR International LLC.)社、米国ペンシルバニア州ラドナー)等の、容積250mLの使い捨ての滅菌された長方形細胞培養フラスコ中で、新鮮なSM10培地及び必要に応じて適切な抗生物質に50mLを接種した。これらの種培養物を、225rpmの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、37℃においてインキュベートした。試料を数時間毎に採取し、光学密度(OD(600nm))が4〜10の範囲のOD(600nm)に到達するまで、光学密度(OD(600nm))によって成長を測定した。この時点で、細胞を遠心分離によって採集し、過剰な培地を除去し、新鮮なSM10培地中で再懸濁して、最終OD(600nm)10を得た。500μLの洗浄及び平準化された細胞を、水中の30%滅菌グリセロール500μLに添加し、混合し、超低温冷凍器内においてマイナス80℃でクライオバイアル(種バイアル)中で冷凍した。
生物学的産生を、最小培地中で、L規模で実証する。以下のようにして培養種を調製した。コロニーを用いて、必要に応じて適切な抗生物質を含む4mLのSM10培地に接種し、滅菌された14mLの培養管に入れた。培養管を、225rpmの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、37℃において1晩インキュベートした。1晩の成長後、2.5mLのこれらの培養物を用いて、セルスター(Cellstar)(商標)細胞培養フラスコ(VWR Catalog # 82050‐856、VWRインターナショナルLLC(VWR International LLC.)社、米国ペンシルバニア州ラドナー)等の、容積250mLの使い捨ての滅菌された長方形細胞培養フラスコ中で、新鮮なSM10培地及び必要に応じて適切な抗生物質に接種した。これらの種培養物を、225rpmの標準的なフロアモデル振盪インキュベータ中で、37℃においてインキュベートした。試料を数時間毎に採取し、光学密度(OD(600nm))が4〜10の範囲のOD(600nm)に到達するまで、光学密度(OD(600nm))によって成長を測定した。この時点で、細胞を遠心分離によって採集し、過剰な培地を除去し、新鮮なSM10培地中で再懸濁して、最終OD(600nm)10を得た。3.5mLの洗浄及び平準化された細胞を、水中の30%滅菌グリセロール3.5mLに添加し、混合し、超低温冷凍器内においてマイナス80℃でクライオバイアル(種バイアル)中で冷凍した。
予想される全ての代謝物及び産物に関して、分析方法を開発した。
有機酸及びアミノ酸を同時に定量するために、逆相UPLC‐MS/MS法を開発した。クロマトグラフィ分離を、45℃において、Acquity CSH C18カラム(100mm×2.1i.d.、1.7μm;Waters Corp.、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて行った。以下の溶離液を使用した:溶媒A:H2O、0.2%ギ酸及び0.05%アンモニウム(v/v);溶媒B:MeOH、0.1%ギ酸及び0.05%アンモニウム(v/v)。勾配溶出は:均一濃度5%のBで0〜0.2分、5%から90%へ線形上昇するBで0.2〜1.0分、均一濃度90%のBで1.0〜1.5分、90%〜5%へ線形低下するBで1.5〜1.8分であり、カラム平衡のための初期条件の5%のBについては1.8〜3.0分であった。流量は0.4ml/分で一定のままであった。5μlの試料注入体積を使用した。UPLC法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて実施した。分離は、Xevo(商標)TQD質量分光測定器と一体化されたAcquity H‐Class UPLC(ウォーターズコーポレーション(Waters Corp.)社、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて行った。MRM遷移を含むMS/MSパラメータは、各分析物について調整され、以下の表6に列挙されている。濃度36mg/Lのアジピン酸を、全ての試料の平準化のための内部標準として使用した。Mass Lynx v4.1ソフトウェアを用いて、ピーク積分及び更なる分析を実施した。全ての代謝物の線形範囲は2〜50mg/Lであった。正確な線形範囲内となるように、必要に応じて試料を希釈した。
2,3‐ブタンジオール(2,3‐BDO)の定量のために、高速UPLC‐MS/MS法を開発した。クロマトグラフィ分離を、45℃において、Acquity UPLC BEH C18カラム(50mm×2.1i.d.、1.7μm;ウォーターズコーポレーション(Waters Corp.)社、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて行った。0.1%ギ酸及び0.05%アンモニウム(v/v)を含むイソプロパノールを、均一濃度分離に使用した。5μlの試料注入体積を使用した。UPLC法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて実施した。分離は、Xevo(商標)TQD質量分光測定器と一体化されたAcquity H‐Class UPLC(ウォーターズコーポレーション(Waters Corp.)社、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて行った。2,3‐BDOに関する90.972→55.074のMRM遷移を、ESI+モードで動作するコーン電圧16V及び衝突エネルギ10Vと共に用いた。濃度36mg/Lのアジピン酸を、全ての試料の平準化のための内部標準として使用した。アジピン酸は、ESI‐モードにおいて、144.77→82.96のMRM遷移、32Vのコーン電圧及び12Vの衝突エネルギを用いて測定した。Mass Lynx v4.1ソフトウェアを用いて、ピーク積分及び更なる分析を実施した。
2,3‐ブタンジオール立体異性体の定量のために、確証的HPLC法を開発した。バイオラッド・アミネックス(Biorad Aminex)HPX‐87Hカラム(300×7.8mm、1.7μm;バイオラッド(Biorad)社、米国カリフォルニア州ハーキュレス)を用いてクロマトグラフィ分離を行った。均一濃度分離は、移動相として5mM硫酸を用いて、室温で行った。流量は、注入後40分に亘って、0.4ml/分で一定のままであった。10μlの試料注入体積を使用した。方法の開発は、分析物の標準原料水溶液を用いて行った。分離は、ESAT/IN屈折率(RI)検出器と一体化されたAcquity H‐Class UPLC(ウォーターズコーポレーション(Waters Corp.)社、米国マサチューセッツ州ミルフォード)を用いて実施した。メソ‐2,3‐ブタンジオールは24.9分において溶出し、(R,R)‐2,3‐ブタンジオールは26.3分において溶出した。Masslynx Software v4.1を使用してピーク積分した。
YSI生化学分析器モデル2950M(YSIインコーポレイテッド(YSI Incorporated)社、米国オハイオ州イエロースプリングス)を用いて、グルコース濃度及びエタノールを慣用の方法で測定した。上記機器は、製造元の説明書に従って使用され、全ての試薬はYSIから供給されたものを用いた。
〔付記1〕
代謝フラックスに関与する少なくとも1つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化によって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記2〕
a)代謝フラックスに関与する少なくとも1つの遺伝子の遺伝子発現の制御下サイレンシング;及び
b)代謝フラックスに関与する少なくとも1つのタンパク質の制御下プロテオリシス性不活性化
の組み合わせによって、代謝フラックスが制御可能な様式で再分配される、遺伝子修飾された微生物。
〔付記3〕
前記代謝フラックスに関与する遺伝子は、成長に必須の酵素をエンコードし、
前記代謝フラックスに関与するタンパク質は、成長に必須の酵素である、付記1又は2に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記4〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、少なくとも1つのサイレンシングRNAの制御下発現を含む、付記2又は3に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記5〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、転写の少なくとも1つのリプレッサの発現を含む、付記2又は3に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記6〕
前記遺伝子発現の制御下サイレンシングは、転写サイレンシングを含み、
前記転写サイレンシングは、CRISPR干渉、少なくとも1つのターゲッティング小型ガイドRNAの発現、及びカスケードタンパク質又はカスケードタンパク質複合体の発現を含む、付記2又は3に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記7〕
前記プロテオリシス性不活性化は:
i)前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加;及び
ii)前記ペプチド配列を認識する少なくとも1つのプロテアーゼの制御下発現
を含む、付記1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記8〕
前記プロテオリシス性不活性化は:
i)前記代謝フラックスに関与するタンパク質に対するペプチド配列の付加;及び
ii)前記ペプチド配列に結合する少なくとも1つのタンパク質の制御下発現
を含み、
前記ペプチド配列への前記タンパク質の前記結合は、少なくとも1つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記1〜6のいずれか1項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記9〕
前記プロテアーゼの制御下発現は、前記ペプチド配列の切断を引き起こし、
前記ペプチド配列に結合する前記タンパク質は、切断された前記ペプチド配列に結合して、少なくとも1つのプロテアーゼによる、前記代謝フラックスに関与するタンパク質の分解を引き起こす、付記8に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記10〕
前記制御下遺伝子サイレンシング及び/又は前記制御下タンパク質分解は、10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超及び100%超からなる群から選択される量の、代謝フラックス分配の変化を引き起こす、付記1〜9のいずれか1項に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記11〕
前記代謝フラックスの分配の変化は、10%超、20%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超及び100%超からなる群から選択される量の、所望の産物の産生速度の変化に対応する、付記10に記載の遺伝子修飾された微生物。
〔付記12〕
付記1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び/又は制御下プロテオリシス性不活性化は、化学誘導物質の添加を含む、バイオプロセス。
〔付記13〕
付記1〜11のいずれか1項に記載の遺伝子修飾された微生物の使用を含む、バイオプロセスであって、
遺伝子発現の制御下サイレンシング及び/又は制御下プロテオリシス性不活性化は、栄養素の制限を含む、バイオプロセス。
〔付記14〕
前記栄養素の制限は、無機リン酸塩の制限を含む、付記13に記載のバイオプロセス。
Claims (10)
- 生成物の生産のための少なくとも1つの酵素を含む生産経路と、
(i)遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第1の酵素をコードする遺伝子の遺伝子発現の制御されたサイレシング、及び(ii)前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な第2の酵素のタンパク質分解によって特性決定された少なくとも1つの合成代謝弁と、を備え、
前記第1の酵素及び前記第2の酵素は、同一又は異なるものであり、
遺伝子発現のサイレンシングは、mRNAサイレンシング、RNA干渉、転写リプレッサーを介したサイレンシング、またはCRISPR干渉によって行われ、
タンパク質分解は、タンパク質の切断、及びペプチドタグによる制御下タンパク質分解によって行われ、
合成代謝弁のトリガとは無関係に、前記微生物の中で固定又は非分裂細胞状態が誘導され、産物産生の期間中に前記静止相が維持され、
前記微生物の前記合成代謝弁(SMV)は、条件付きでトリガされる、
遺伝子修飾された微生物。 - 前記遺伝子修飾された微生物は、産物産生経路の異種酵素を発現することができ、前記異種酵素の前記発現は、条件付きであり、及び/又は前記SMVの前記条件付きトリガで調整される、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記異種酵素は、
酢酸キナーゼ、
耐酸素性エタノールデヒドロゲナーゼ、
アセトアセチル‐CoAチオラーゼ、クロトナーゼ、クロトニル‐CoAリダクターゼ、酪酸ホスホトランスフェラーゼ、酪酸キナーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐CoAシンターゼ、3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドラターゼ、エノイル‐CoAリダクターゼ、アシル‐CoAチオエステラーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐CoAシンターゼ、3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドラターゼ、エノイル‐CoAリダクターゼ、アシル‐CoAワックスエステルシンターゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアシル‐CoAチオラーゼ、3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドラターゼ、エノイル‐CoAリダクターゼ、アシル‐CoAチオエステラーゼ、又はそれらの組み合わせ、
ケトアセチル‐CoAシンターゼ、3‐ヒドロキシアシル‐CoAデヒドラターゼ、エノイル‐CoAリダクターゼ、脂肪アシル‐CoAリダクターゼ、脂肪アルデヒドリダクターゼ、又はそれらの組み合わせ、
アセトアセチル‐CoAチオラーゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐CoAシンターゼ、ヒドロキシメチルグルタリル‐CoAリダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ジホスフェートデカルボキシラーゼ、イソペンテニル‐ジホスフェートイソメラーゼ、イソプレンシンターゼ、又はそれらの組み合わせ、
ストレプトマイセス・セリカラーのrppA、
クロロフレクサス・アウランティカスのmcr遺伝子の断片及び大腸菌のydfG遺伝子、
シュードモナス・フルヴァのイソブチリル‐CoAチオエステラーゼの突然変異体、
バチルス・スブティリスのアラニンデヒドロゲナーゼ、
エンテロコッカス・フェカリス由来のmvaE遺伝子及びエンテロコッカス・フェカリス由来のmvaS遺伝子、又は、
エンテロバクター・クロアカエ亜種ディスソルベンス由来のbudA、budB、及びbudC遺伝子、からなる群から選択される、
請求項2に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記生産経路は、アセチル‐CoAカルボキシラーゼ酵素の発現の増大と生産経路の酵素の発現の増大の両方を含む、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な前記第1の酵素及び前記第2の酵素は、エノイル‐ACPリダクターゼ(fabI)、クエン酸シンターゼ(gltA)、可溶性トランスヒドロゲナーゼ(udhA)、グルコース‐6‐リン酸‐1‐デヒドロゲナーゼ(zwf)、リポアミドデヒドロゲナーゼ(lpd)、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な前記第1の酵素及び前記第2の酵素は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、サクシニル‐CoAシンテターゼ(sucD)、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、ATP依存性6‐ホスホフルクトキナーゼ(pfkA)、ATP依存性Lonプロテアーゼ(lon)、シグマ因子シグマ−38(rpoS)、トランスケトラーゼ1(tktA)、トランスケトラーゼ2(tktB)、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記合成代謝弁は、
(i)前記遺伝子修飾された微生物の成長に不可欠な酵素の複数の遺伝子をターゲッティングするのに特異的な複数の小さなガイドRNAをコードする遺伝子と、
(ii)Cas9をコードする遺伝子、又はdCAS9をコードする遺伝子と、
(iii)タンパク質分解酵素増強因子sspBをコードする遺伝子と、を含む、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記生産経路は、アルコール、ジオール、ポリオール、有機酸、アミノ酸、脂肪酸、脂肪酸誘導体、エステル、アルカン、アルケン、及び、イソプレノイドからなる群から選択される、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記成長培地の制限栄養因子は、リン酸塩、窒素、硫黄、及びマグネシウム、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される栄養素である、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。 - 前記遺伝子修飾された微生物は、前記遺伝子修飾された微生物に自然発生する遺伝子の破壊又は欠失と、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)、リン酸アセチルトランスフェラーゼ(pta)、ピルビン酸オキシダーゼ(poxB)、ピルビン酸‐ギ酸リアーゼ(pflB)、メチルグリオキサールシンターゼ(mgsA)、酢酸キナーゼ(ackA)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adhE)、clpXPプロテーゼ特異性増強因子(sspB)、ATP依存性Lonプロテアーゼ(lon)、外膜プロテアーゼ(ompT)、arcA転写二重調節因子(arcA)、iclR転写調節因子(iclR)、及びそれらの任意の組み合わせをコードする遺伝子からなる群から選択された遺伝子の破壊又は欠失と、を含む、
請求項1に記載の遺伝子修飾された微生物。
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