CN113604416B

CN113604416B - 产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用

Info

Publication number: CN113604416B
Application number: CN202111024381.3A
Authority: CN
Inventors: 陈涛; 崔真真; 郑美玉; 王智文
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2021-09-02
Filing date: 2021-09-02
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-09-02
Also published as: CN113604416A

Abstract

本发明公开了产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用，产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其构建方法为通过共表达α‑乙酰乳酸合成酶、α‑乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，得到产乙偶姻的大肠杆菌工程菌；构建大肠杆菌工程菌中使用的宿主菌为突变型大肠杆菌BL‑2，本发明是以乳酸为底物生产乙偶姻，产品产量高，底物成本低，且反应体系中无需额外添加NAD⁺，进一步降低了生产成本。本发明的方法，乙偶姻产量达到87.5mM以上，产率达到3.65mM/h以上，得率达到0.444mol/mol以上，即理论得率的88.8％以上。此方法的反应条件温和，过程简单。

Description

产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术与应用领域，具体涉及产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用。

背景技术

乙偶姻，又名3-羟基-2-丁酮，单体为无色或淡黄色液体，二聚体为白色结晶粉末，可自燃，易溶于水，溶于乙醇、丙二醇、微溶于乙醚。乙偶姻存在于很多食品中，具有奶香气味，常用作食品添加剂来提升食物中的奶香味。乙偶姻是4-C平台化合物的一种，被美国能源部列为30种值得优先开发的平台化合物之一，广泛应用于材料、医药生产和化学合成等领域。乙偶姻也是重要化学品2,3-丁二醇，液态烃燃料和杂环化合物的前体物。

目前，乙偶姻工业化生产的主要方法是化学合成法，包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解和丁二酮的部分加氢等方法。这些工艺虽然操作简便，但能耗大，得率低且对环境有一定的污染。近年来，生物法生产化学品成为热点，许多研究者将目光转向经济环保的微生物方法生产乙偶姻，微生物生产乙偶姻的报道很多，产量较高，但得率较低，微生物代谢复杂，体内合成不易调控，且目前使用微生物发酵法生产乙偶姻一直没有很大的提升。所以近几年也有许多的研究者使用基于纯化酶的体外合成生物系统生产乙偶姻，目前已实现从2,3-丁二醇、丙酮酸、甘油、乳酸、木糖等生产乙偶姻。Li等^[1]利用乳酸氧化酶、过氧化氢酶和丙酮酸脱氢酶组成体外酶催化系统催化乳酸生产乙偶姻，最终21.1mM的乳酸生产了9.8mM的乙偶姻。但在体外酶催化中，酶的制备成本较高，酶的稳定性较低，目前以乳酸为底物的乙偶姻产量还较低。

相比之下，全细胞催化具有很多明显的优势：制备简单，成本低，效率高，稳定性好等，此方法已经成功应用在很多化学品的生产，包括乙偶姻。目前已实现利用全细胞催化以meso-2,3-丁二醇，双乙酰，葡萄糖和乙醛为底物合成乙偶姻，且乙偶姻的产量都较高。Zhou等^[2]利用氧化葡糖杆菌全细胞催化生产乙偶姻，以2,3-丁二醇为底物，最终乙偶姻的产量达到165.9g/L。虽然乙偶姻的产量很高，但底物2,3-丁二醇价格昂贵。Zhang等^[3]利用Corynebacterium crenatum全细胞催化葡萄糖生产乙偶姻，菌体经过3次重复利用，乙偶姻的产量达到76.93g/L，但得率低，为0.67mol/mol。目前全细胞催化方法中，以乙醛为底物的催化体系中，乙偶姻的产量最高，达到222g/L^[4]，但该催化体系对细胞密度要求高(30gCDW/L),其底物乙醛较贵，属于危险品且难以储存，不利于乙偶姻的工业化制备，因此亟待开发一种利用廉价安全的底物的全细胞催化方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供产乙偶姻的大肠杆菌工程菌。

本发明的第二个目的是提供产乙偶姻的大肠杆菌工程菌的构建方法。

本发明的第三个目的是提供产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用。

本发明的技术方案概述如下：

产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其构建方法为通过共表达α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，得到产乙偶姻的大肠杆菌工程菌；

构建大肠杆菌工程菌中使用的宿主菌为突变型大肠杆菌BL-2，

所述突变型大肠杆菌BL-2为将大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中乙酸生成途径的磷酸乙酰转移酶和乙酸裂解酶编码基因pta-ackA和丙酮酸氧化酶编码基因poxB敲除后得到；

所述α-乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3；

所述NADH氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC、乳酸脱氢酶的编码基因ldh和NADH氧化酶的编码基因nox；

所述重组表达载体为pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；

所述α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述乳酸脱氢酶的编码基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述NADH氧化酶的编码基因nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述重组表达载体的基本载体是pET28a。

上述产乙偶姻的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

1)以引物LDH-F为上游引物，以引物LDH-R为下游引物，以载体pET28a-ldh为模板，经PCR，制备含乳酸脱氢酶的编码基因ldh的片段ldh-1；

以引物NOX-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，以载体pET28a-nox为模板，经PCR，制备含NADH氧化酶的编码基因nox的片段nox-1；

以引物LDH-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-1和nox-1，经PCR，制备融合片段ldh-nox；

2)以引物aldC-F为上游引物，以aldC-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC和部分S2的片段aldC-1；

以引物alsS-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS和另外部分S2的片段alsS-1；

以引物aldC-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，利用片段aldC-1和alsS-1，制备融合片段aldC-S2-alsS；

3)以引物aldC-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-nox和aldC-S2-alsS，经PCR，制备融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox；

将融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox与pET28a通过NheI/XhoI双酶切，经连接、转化后得到质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；将质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox导入突变型大肠杆菌BL-2中得到产乙偶姻大肠杆菌工程菌BL-3；

所述pET28a-ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述pET28a-nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述引物LDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；

所述引物LDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

所述引物NOX-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；

所述引物NOX-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示；

所述引物aldC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；

所述引物aldC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；

所述引物alsS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；

所述引物alsS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。

产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用，包括如下步骤：

1)将权利要求1或2的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在LB培养基中进行培养，培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，18-25℃下诱导12-16h，离心收集菌体；

2)将步骤1)获得的菌体悬于含乳酸的转化液中，使OD₆₀₀＝15-30，所述乳酸的浓度为190.8-295.2mM，在37-40℃，220rpm反应，得到乙偶姻。

转化液的组成为10mM的MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液。

有益效果

本发明是以乳酸为底物生产乙偶姻，产品产量高，底物成本低，且反应体系中无需额外添加NAD⁺，进一步降低了生产成本。本发明产乙偶姻的大肠杆菌工程菌催化乳酸生成乙偶姻，乙偶姻产量达到87.5mM以上，产率达到3.65mM/h以上，得率达到0.444mol/mol以上，即理论得率的88.8％以上。此方法的反应条件温和，过程简单。

附图说明

图1为乳酸出发合成乙偶姻的反应示意图；

图2为产乙偶姻的大肠杆菌工程菌BL-3转化乳酸生产乙偶姻的生产曲线；

图3为补料转化生产乙偶姻图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好的理解本发明，但对本发明不作任何限制。

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水定容。

磷酸缓冲液(pH 6.0)：100mM Na₂HPO4水溶液和100mM NaH₂PO4水溶液以1:7.13体积比混合。

原始质粒pET28a来源为biovector(http://www.biovector.net/)；

原始质粒pTKRed和pTKS/CS来源为Addgene(https://www.addgene.org/)。

λ-Red基因重组的方法和菌株摇瓶发酵方法来源于如下文章：Lin,Z.；Xu,Z.；Li,Y.；Wang,Z.；Chen,T.；Zhao,X.,Metabolic engineering of Escherichia coli for theproduction of riboflavin.Microbial cell factories 2014,13(1),104.

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)来源为BGSC(Bacillus Genetic StockCenter，http://www.bgsc.org/)；

E.coli BL21(DE3)感受态来源为NEB(http://www.neb-china.com/)；

乙偶姻标准品从Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。

所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等、分子生物学试剂从Thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)。

所用乳酸钠，乳酸等其他生化试剂(如胰蛋白胨，酵母抽提物，NaCl，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠、IPTG、MgCl₂等)从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http:// www.sangon.com/)。

所述α-乙酰乳酸合成酶来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168

所述α-乙酰乳酸脱羧酶来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168

所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述乳酸脱氢酶来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans 2-6

所述NADH氧化酶来源于乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactisIO-1实施例1：利用λ-Red重组方法敲除大肠杆菌基因组上的基因pta-ackA和poxB

以pta-ackA-U-F(SEQ ID NO.22)和pta-ackA-U-R(SEQ ID NO.23)为引物(表1)，

以大肠杆菌基因组为模板，通过PCR反应，得到pta-ackA-U(SEQ ID No.12)；

以pta-ackA-tet-1(SEQ ID NO.24)和pta-ackA-tet-2(SEQ ID NO.25)为引物，

以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到pta-ackA-tet-U(SEQ ID No.13)；

以pta-ackA-tet-3(SEQ ID NO.26)和pta-ackA-tet-4(SEQ ID NO.27)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到pta-ackA-tet-D(SEQ ID No.14)；

以pta-ackA-D-F(SEQ ID NO.28)和pta-ackA-D-R(SEQ ID NO.29)为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过PCR反应，得到pta-ackA-D(SEQ ID No.15)。

然后以pta-ackA-U-F和pta-ackA-D-R为引物，将上述PCR产物pta-ackA-U-F，pta-ackA-tet-U，pta-ackA-tet-D，pta-ackA-D通过融合PCR的方法，融合成一个片段pta-ackA-tet(SEQ ID No.16)。

将pTKRed质粒通过电转化导入到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，然后制作成感受态，利用电转化的方法，将片段pta-ackA-tet导入，利用四环素筛选出阳性克隆，并进行菌落PCR验证，然后通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，从而实现pta-ackA基因的敲除，得到大肠杆菌工程菌，命名为BL-1。

以poxB-U-F(SEQ ID NO.30)和poxB-U-R(SEQ ID NO.31)为引物(表1)，以大肠杆菌基因组为模板，通过PCR反应，得到poxB-U(SEQ ID No.17)；

以poxB-tet-1(SEQ ID NO.32)和poxB-tet-2(SEQ ID NO.33)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到poxB-tet-U(SEQ ID No.18)；

以poxB-tet-3(SEQ ID NO.34)和poxB-tet-4(SEQ ID NO.35)为引物，以pTKS/CS为模板，通过PCR反应，得到poxB-tet-D(SEQ ID No.19)；

以poxB-D-F(SEQ ID NO.36)和poxB-D-R(SEQ ID NO.37)为引物，以大肠杆菌基因组为模板，通过PCR反应，得到poxB-D(SEQ ID No.20)。

然后以poxB-U-F和poxB-D-R为引物，将上述PCR产物poxB-U-F，poxB-tet-U，poxB-tet-D，poxB-D通过融合PCR的方法，融合成一个片段poxB-tet(SEQ ID No.21)。

将pTKRed质粒通过电转化导入到大肠杆菌工程菌BL-1中，然后制作成感受态，利用电转化的方法，将片段poxB-tet导入，利用四环素筛选出阳性克隆，并进行菌落PCR验证，然后通过阿拉伯糖诱导的方法，消除掉基因重组过程中引入的四环素抗性基因，从而实现poxB基因的敲除，得到大肠杆菌工程菌，命名为BL-2(又称突变型大肠杆菌BL-2)。

表1菌株构建所用引物序列

实施例2：表达载体pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox与产乙偶姻的大肠杆菌工程菌的构建

本发明所用的α-乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168；所用的所述α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，来源于乳酸脱氢酶枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168；所用乳酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3；来源于凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans 2-6，所用NADH氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4，来源于乳酸乳球菌乳亚种Lactococcus lactissubsp.lactis IO-1。

以引物LDH-F(SEQ ID NO.38)为上游引物，以引物LDH-R(SEQ ID NO.39)为下游引物，以载体pET28a-ldh(SEQ ID NO.10)为模板，经PCR，制备含乳酸脱氢酶的编码基因ldh(SEQ ID NO.8)的片段ldh-1。以NOX-F(SEQ ID NO.40)为上游引物，以NOX-R(SEQ IDNO.41)为下游引物，以载体pET28a-nox(SEQ ID NO.11)为模板，经PCR，制备含NADH氧化酶的编码基因nox(SEQ ID NO.9)的片段nox-1。以引物LDH-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-1和nox-1，经PCR，制备融合片段ldh-nox。

以引物aldC-F(SEQ ID NO.42)为上游引物，以aldC-R(SEQ ID NO.43)为下游引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC(SEQ ID NO.6)和部分S2的片段aldC-1；以引物alsS-F(SEQ IDNO.44)为上游引物，以alsS-R(SEQ ID NO.45)为下游引物，以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS(SEQ IDNO.5)和另外部分S2的片段alsS-1；S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；以引物aldC-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，利用片段aldC-1和alsS-1，制备融合片段aldC-S2-alsS；

以引物aldC-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-nox和aldC-S2-alsS，经PCR，制备融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox，将融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox与pET28a通过NheI/XhoI双酶切，经连接、转化后得到质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；将质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox导入突变型大肠杆菌BL-2中得到产乙偶姻的大肠杆菌工程菌BL-3；

表2菌株构建所用引物序列

实施例3：产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用，包括如下步骤：

1)将实施例2中的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌BL-3，从平板上挑取单菌落，接种到5mL LB培养基中，培养10h，以1％接种量转接至200mL LB培养基中，在37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，25℃下诱导12h，4℃，4500rpm收集菌体，利用磷酸缓冲液(pH＝6.0)重悬洗涤一次菌体，再4℃，4500rpm离心菌体，最后用少量的磷酸缓冲液(pH＝6.0)将菌体重悬；

2)将步骤1)获得的菌体悬于含有乳酸的转化液中，使OD₆₀₀＝15，乳酸的浓度为190.8mM。在37℃，220rpm反应，得到乙偶姻。

转化液的组成为：10mM MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液，反应总体积为10mL。乙偶姻的生产曲线见图2，从反应结果可以看出，24h后乙偶姻的产量达到87.5mM(7.71g/L)，得率达到0.459mol/mol，是理论得率的91.8％。

实施例4：产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用，包括如下步骤：

1)将实施例2中的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌BL-3，从平板上挑取单菌落，接种到5mL LB培养基中，培养11h，以1％接种量转接至200mL LB培养基中，在37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，18℃下诱导16h，4℃，4500rpm收集菌体，利用磷酸缓冲液(pH＝6.0)重悬洗涤一次菌体，再4℃，4500rpm离心菌体，最后用少量的磷酸缓冲液(pH＝6.0)将菌体重悬。

2)将步骤1)获得的菌体以悬于含有乳酸的转化液中，使OD₆₀₀＝30，初始乳酸的浓度为222.2mM，在40℃，220rpm反应，得到乙偶姻。

转化液的组成为：10mM MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液，反应总体积为10mL。24h后，乙偶姻的产量达到101.5mM(8.94g/L)，得率达到0.457mol/mol，是理论得率的91.4％。

实施例5：产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用，包括如下步骤：

1)将实施例2中的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌BL-3，从平板上挑取单菌落，接种到5mL LB培养基中，培养12h，以1％接种量转接至200mL LB培养基中，在37℃，220rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6-0.8左右，加入终浓度为0.5mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)，22℃下诱导14h，4℃，4500rpm收集菌体，利用磷酸缓冲液(pH＝6.0)重悬洗涤一次菌体，再4℃，4500rpm离心菌体，最后用少量的磷酸缓冲液(pH＝6.0)将菌体重悬。

2)将步骤1)获得的菌体以悬于含有乳酸的转化液中，使OD₆₀₀＝15，乳酸的浓度为295.2mM。在40℃，220rpm反应，得到乙偶姻。

转化液的组成为：10mM MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液，反应总体积为10mL。24h后乳酸未全部消耗完，转化率较低，但乙偶姻的产量达到90.5mM(7.97g/L)，得率达到0.499mol/mol，是理论得率的99.9％。

实施例6：补料法生产乙偶姻应用，包括如下步骤：

2)将步骤1)获得的菌体以悬于含有乳酸的转化液中，使OD₆₀₀＝30，初始乳酸的浓度为216.6mM。在40℃，220rpm反应，得到乙偶姻。

转化液的组成为：10mM MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液，反应总体积为10mL。

反应过程中，监测pH，每3h补加乳酸,整个反应周期为24h，24h后乳酸总添加为567.6mM。乙偶姻的生产曲线见图3，从反应结果可以看出，24h时，乙偶姻产量达到252.0mM(22.2g/)，得率达到0.444mol/mol，是理论得率的88.8％。

参考文献：

[1]Li Z,Zhang M,Jiang T,et al.Enzymatic cascades for efficientbiotransformation of racemic lactate derived from corn steep water.ACSSustain Chem Eng,2017,5(4):3456-3464.

[2]Zhou X,Zhou X,Zhang H,et al.Improving the performance of cellbiocatalysis and the productivity of acetoin from 2,3-butanediol using acompressed oxygen supply.Process Biochem,2018,64:46-50.

[3]Zhang X,Han R,Bao T,et al.Synthetic engineering of Corynebacteriumcrenatum to selectively produce acetoin or 2,3-butanediol by one stepbioconversion method.Microb Cell Fact,2019,18(1):128.

[4]Peng K,Guo D,Lou Q,et al.Synthesis of ligustrazine fromacetaldehyde by a combined biological–chemical approach.ACS Synth Biol,2020,9(11):2902-2908.

序列表

<110> 天津大学

<120> 产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 570

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)

<400> 1

Met Thr Lys Ala Thr Lys Glu Gln Lys Ser Leu Val Lys Asn Arg Gly

1 5 10 15

Ala Glu Leu Val Val Asp Cys Leu Val Glu Gln Gly Val Thr His Val

20 25 30

Phe Gly Ile Pro Gly Ala Lys Ile Asp Ala Val Phe Asp Ala Leu Gln

35 40 45

Asp Lys Gly Pro Glu Ile Ile Val Ala Arg His Glu Gln Asn Ala Ala

50 55 60

Phe Met Ala Gln Ala Val Gly Arg Leu Thr Gly Lys Pro Gly Val Val

65 70 75 80

Leu Val Thr Ser Gly Pro Gly Ala Ser Asn Leu Ala Thr Gly Leu Leu

85 90 95

Thr Ala Asn Thr Glu Gly Asp Pro Val Val Ala Leu Ala Gly Asn Val

100 105 110

Ile Arg Ala Asp Arg Leu Lys Arg Thr His Gln Ser Leu Asp Asn Ala

115 120 125

Ala Leu Phe Gln Pro Ile Thr Lys Tyr Ser Val Glu Val Gln Asp Val

130 135 140

Lys Asn Ile Pro Glu Ala Val Thr Asn Ala Phe Arg Ile Ala Ser Ala

145 150 155 160

Gly Gln Ala Gly Ala Ala Phe Val Ser Phe Pro Gln Asp Val Val Asn

165 170 175

Glu Val Thr Asn Thr Lys Asn Val Arg Ala Val Ala Ala Pro Lys Leu

180 185 190

Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala Ile Ser Ala Ala Ile Ala Lys Ile Gln

195 200 205

Thr Ala Lys Leu Pro Val Val Leu Val Gly Met Lys Gly Gly Arg Pro

210 215 220

Glu Ala Ile Lys Ala Val Arg Lys Leu Leu Lys Lys Val Gln Leu Pro

225 230 235 240

Phe Val Glu Thr Tyr Gln Ala Ala Gly Thr Leu Ser Arg Asp Leu Glu

245 250 255

Asp Gln Tyr Phe Gly Arg Ile Gly Leu Phe Arg Asn Gln Pro Gly Asp

260 265 270

Leu Leu Leu Glu Gln Ala Asp Val Val Leu Thr Ile Gly Tyr Asp Pro

275 280 285

Ile Glu Tyr Asp Pro Lys Phe Trp Asn Ile Asn Gly Asp Arg Thr Ile

290 295 300

Ile His Leu Asp Glu Ile Ile Ala Asp Ile Asp His Ala Tyr Gln Pro

305 310 315 320

Asp Leu Glu Leu Ile Gly Asp Ile Pro Ser Thr Ile Asn His Ile Glu

325 330 335

His Asp Ala Val Lys Val Glu Phe Ala Glu Arg Glu Gln Lys Ile Leu

340 345 350

Ser Asp Leu Lys Gln Tyr Met His Glu Gly Glu Gln Val Pro Ala Asp

355 360 365

Trp Lys Ser Asp Arg Ala His Pro Leu Glu Ile Val Lys Glu Leu Arg

370 375 380

Asn Ala Val Asp Asp His Val Thr Val Thr Cys Asp Ile Gly Ser His

385 390 395 400

Ala Ile Trp Met Ser Arg Tyr Phe Arg Ser Tyr Glu Pro Leu Thr Leu

405 410 415

Met Ile Ser Asn Gly Met Gln Thr Leu Gly Val Ala Leu Pro Trp Ala

420 425 430

Ile Gly Ala Ser Leu Val Lys Pro Gly Glu Lys Val Val Ser Val Ser

435 440 445

Gly Asp Gly Gly Phe Leu Phe Ser Ala Met Glu Leu Glu Thr Ala Val

450 455 460

Arg Leu Lys Ala Pro Ile Val His Ile Val Trp Asn Asp Ser Thr Tyr

465 470 475 480

Asp Met Val Ala Phe Gln Gln Leu Lys Lys Tyr Asn Arg Thr Ser Ala

485 490 495

Val Asp Phe Gly Asn Ile Asp Ile Val Lys Tyr Ala Glu Ser Phe Gly

500 505 510

Ala Thr Gly Leu Arg Val Glu Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Val Leu

515 520 525

Arg Gln Gly Met Asn Ala Glu Gly Pro Val Ile Ile Asp Val Pro Val

530 535 540

Asp Tyr Ser Asp Asn Ile Asn Leu Ala Ser Asp Lys Leu Pro Lys Glu

545 550 555 560

Phe Gly Glu Leu Met Lys Thr Lys Ala Leu

565 570

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)

<400> 2

Met Lys Arg Glu Ser Asn Ile Gln Val Leu Ser Arg Gly Gln Lys Asp

1 5 10 15

Gln Pro Val Ser Gln Ile Tyr Gln Val Ser Thr Met Thr Ser Leu Leu

20 25 30

Asp Gly Val Tyr Asp Gly Asp Phe Glu Leu Ser Glu Ile Pro Lys Tyr

35 40 45

Gly Asp Phe Gly Ile Gly Thr Phe Asn Lys Leu Asp Gly Glu Leu Ile

50 55 60

Gly Phe Asp Gly Glu Phe Tyr Arg Leu Arg Ser Asp Gly Thr Ala Thr

65 70 75 80

Pro Val Gln Asn Gly Asp Arg Ser Pro Phe Cys Ser Phe Thr Phe Phe

85 90 95

Thr Pro Asp Met Thr His Lys Ile Asp Ala Lys Met Thr Arg Glu Asp

100 105 110

Phe Glu Lys Glu Ile Asn Ser Met Leu Pro Ser Arg Asn Leu Phe Tyr

115 120 125

Ala Ile Arg Ile Asp Gly Leu Phe Lys Lys Val Gln Thr Arg Thr Val

130 135 140

Glu Leu Gln Glu Lys Pro Tyr Val Pro Met Val Glu Ala Val Lys Thr

145 150 155 160

Gln Pro Ile Phe Asn Phe Asp Asn Val Arg Gly Thr Ile Val Gly Phe

165 170 175

Leu Thr Pro Ala Tyr Ala Asn Gly Ile Ala Val Ser Gly Tyr His Leu

180 185 190

His Phe Ile Asp Glu Gly Arg Asn Ser Gly Gly His Val Phe Asp Tyr

195 200 205

Val Leu Glu Asp Cys Thr Val Thr Ile Ser Gln Lys Met Asn Met Asn

210 215 220

Leu Arg Leu Pro Asn Thr Ala Asp Phe Phe Asn Ala Asn Leu Asp Asn

225 230 235 240

Pro Asp Phe Ala Lys Asp Ile Glu Thr Thr Glu Gly Ser Pro Glu

245 250 255

<210> 3

<211> 312

<212> PRT

<213> 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 2-6)

<400> 3

Met Lys Lys Val Asn Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Gly Ala Val Gly

1 5 10 15

Thr Ser Tyr Cys Tyr Ala Met Ile Asn Gln Gly Val Ala Glu Glu Leu

20 25 30

Val Leu Ile Asp Ile Asn Glu Ala Lys Ala Glu Gly Glu Ala Met Asp

35 40 45

Leu Asn His Gly Leu Pro Phe Ala Pro Thr Ser Thr Arg Val Trp Lys

50 55 60

Gly Asp Tyr Ser Asp Cys Gly Thr Ala Asp Leu Val Val Ile Thr Ala

65 70 75 80

Gly Ser Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val Ala Lys

85 90 95

Asn Ala Lys Ile Phe Lys Gly Met Ile Lys Ser Ile Met Asp Ser Gly

100 105 110

Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr

115 120 125

Tyr Val Thr Trp Lys Glu Ser Gly Leu Pro Lys Glu His Val Ile Gly

130 135 140

Ser Gly Thr Val Leu Asp Ser Ala Arg Leu Arg Asn Ser Leu Ser Ala

145 150 155 160

Gln Phe Gly Ile Asp Pro Arg Asn Val His Ala Ala Ile Ile Gly Glu

165 170 175

His Gly Asp Thr Glu Leu Pro Val Trp Ser His Thr Asn Ile Gly Tyr

180 185 190

Asp Thr Ile Glu Ser Tyr Leu Gln Lys Gly Ile Ile Asp Glu Lys Thr

195 200 205

Leu Asp Asp Ile Phe Val Asn Thr Arg Asp Ala Ala Tyr His Ile Ile

210 215 220

Glu Arg Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Gly Met Ser Leu Thr Arg

225 230 235 240

Ile Thr Arg Ala Ile Leu Asn Asn Glu Asn Ser Val Leu Thr Val Ser

245 250 255

Ala Phe Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Asn Ser Asp Val Tyr Val Gly Val

260 265 270

Pro Ala Ile Ile Asn Arg Gln Gly Ile Arg Glu Val Val Glu Ile Lys

275 280 285

Leu Asn Glu Lys Glu Gln Glu Gln Phe Asn His Ser Val Lys Val Leu

290 295 300

Lys Glu Thr Met Ala Pro Val Leu

305 310

<210> 4

<211> 446

<212> PRT

<213> 乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis IO-1)

<400> 4

Met Lys Ile Val Val Ile Gly Thr Asn His Ala Gly Ile Ala Thr Ala

1 5 10 15

Asn Thr Leu Ile Asp Gln Tyr Pro Gly His Glu Ile Val Met Ile Asp

20 25 30

Arg Asn Ser Asn Met Ser Tyr Leu Gly Cys Gly Thr Ala Ile Trp Val

35 40 45

Gly Arg Gln Ile Glu Lys Pro Asp Glu Leu Phe Tyr Ala Lys Ala Glu

50 55 60

Asp Phe Glu Lys Lys Gly Val Lys Ile Leu Thr Glu Thr Glu Val Ser

65 70 75 80

Glu Ile Asp Phe Thr Asn Lys Met Ile Tyr Ala Lys Ser Lys Thr Gly

85 90 95

Glu Lys Ile Thr Glu Ser Tyr Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Ser

100 105 110

Arg Pro Ile Ile Pro Asn Leu Pro Gly Lys Asp Leu Lys Gly Ile His

115 120 125

Phe Leu Lys Leu Phe Gln Glu Gly Gln Ala Ile Asp Glu Glu Phe Ala

130 135 140

Lys Asn Asp Val Lys Arg Ile Ala Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly

145 150 155 160

Thr Glu Ile Ala Glu Ala Ala Lys Arg Arg Gly Lys Glu Val Leu Leu

165 170 175

Phe Asp Ala Glu Ser Thr Ser Leu Ala Ser Tyr Tyr Asp Glu Glu Phe

180 185 190

Ala Lys Gly Met Asp Glu Asn Leu Ala Gln His Gly Ile Glu Leu His

195 200 205

Phe Gly Glu Leu Ala Gln Glu Phe Lys Ala Asn Glu Lys Gly His Val

210 215 220

Ser Gln Ile Val Thr Asn Lys Ser Thr Tyr Asp Val Asp Leu Val Ile

225 230 235 240

Asn Cys Ile Gly Phe Thr Ala Asn Ser Ala Leu Ala Gly Glu His Leu

245 250 255

Glu Thr Phe Lys Asn Gly Ala Ile Lys Val Asp Lys His Gln Gln Ser

260 265 270

Ser Asp Pro Asp Val Tyr Ala Val Gly Asp Val Ala Thr Ile Tyr Ser

275 280 285

Asn Ala Leu Gln Asp Phe Thr Tyr Ile Ala Leu Ala Ser Asn Ala Val

290 295 300

Arg Ser Gly Ile Val Ala Gly His Asn Ile Gly Gly Lys Ser Ile Glu

305 310 315 320

Ser Val Gly Val Gln Gly Ser Asn Gly Ile Ser Ile Phe Gly Tyr Asn

325 330 335

Met Thr Ser Thr Gly Leu Ser Val Lys Ala Ala Lys Lys Ile Ser Leu

340 345 350

Glu Val Ser Phe Ser Asp Phe Glu Asp Lys Gln Lys Ala Trp Phe Leu

355 360 365

His Glu Asn Asn Asp Ser Val Lys Ile Arg Ile Val Tyr Glu Thr Asn

370 375 380

Ser Arg Arg Ile Ile Gly Ala Gln Leu Ala Ser Lys Ser Glu Ile Ile

385 390 395 400

Ala Gly Asn Ile Asn Met Phe Ser Leu Ala Ile Gln Glu Lys Lys Thr

405 410 415

Ile Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asp Leu Phe Phe Leu Pro His Phe Asn

420 425 430

Ser Pro Tyr Asn Tyr Met Thr Val Ala Ala Leu Asn Ala Lys

435 440 445

<210> 5

<211> 1710

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)

<400> 5

atgacaaaag caacaaaaga acaaaaatcc cttgtgaaaa acagaggggc ggagcttgtt 60

gttgattgct tagtggagca aggtgtcaca catgtatttg gcattccagg tgcaaaaatt 120

gatgcggtat ttgacgcttt acaagataaa ggacctgaaa ttatcgttgc ccggcacgaa 180

caaaacgcag cattcatggc ccaagcagtc ggccgtttaa ctggaaaacc gggagtcgtg 240

ttagtcacat caggaccggg tgcctctaac ttggcaacag gcctgctgac agcgaacact 300

gaaggagacc ctgtcgttgc gcttgctgga aacgtgatcc gtgcagatcg tttaaaacgg 360

acacatcaat ctttggataa tgcggcgcta ttccagccga ttacaaaata cagtgtagaa 420

gttcaagatg taaaaaatat accggaagct gttacaaatg catttaggat agcgtcagca 480

gggcaggctg gggccgcttt tgtgagcttt ccgcaagatg ttgtgaatga agtcacaaat 540

acgaaaaacg tgcgtgctgt tgcagcgcca aaactcggtc ctgcagcaga tgatgcaatc 600

agtgcggcca tagcaaaaat ccaaacagca aaacttcctg tcgttttggt cggcatgaaa 660

ggcggaagac cggaagcaat taaagcggtt cgcaagcttt tgaaaaaggt tcagcttcca 720

tttgttgaaa catatcaagc tgccggtacc ctttctagag atttagagga tcaatatttt 780

ggccgtatcg gtttgttccg caaccagcct ggcgatttac tgctagagca ggcagatgtt 840

gttctgacga tcggctatga cccgattgaa tatgatccga aattctggaa tatcaatgga 900

gaccggacaa ttatccattt agacgagatt atcgctgaca ttgatcatgc ttaccagcct 960

gatcttgaat tgatcggtga cattccgtcc acgatcaatc atatcgaaca cgatgctgtg 1020

aaagtggaat ttgcagagcg tgagcagaaa atcctttctg atttaaaaca atatatgcat 1080

gaaggtgagc aggtgcctgc agattggaaa tcagacagag cgcaccctct tgaaatcgtt 1140

aaagagttgc gtaatgcagt cgatgatcat gttacagtaa cttgcgatat cggttcgcac 1200

gccatttgga tgtcacgtta tttccgcagc tacgagccgt taacattaat gatcagtaac 1260

ggtatgcaaa cactcggcgt tgcgcttcct tgggcaatcg gcgcttcatt ggtgaaaccg 1320

ggagaaaaag tggtttctgt ctctggtgac ggcggtttct tattctcagc aatggaatta 1380

gagacagcag ttcgactaaa agcaccaatt gtacacattg tatggaacga cagcacatat 1440

gacatggttg cattccagca attgaaaaaa tataaccgta catctgcggt cgatttcgga 1500

aatatcgata tcgtgaaata tgcggaaagc ttcggagcaa ctggcttgcg cgtagaatca 1560

ccagaccagc tggcagatgt tctgcgtcaa ggcatgaacg ctgaaggtcc tgtcatcatc 1620

gatgtcccgg ttgactacag tgataacatt aatttagcaa gtgacaagct tccgaaagaa 1680

ttcggggaac tcatgaaaac gaaagctctc 1710

<210> 6

<211> 765

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)

<400> 6

atgaaacgag aaagcaacat tcaagtgctc agccgtggtc aaaaagatca gcctgtgagc 60

cagatttatc aagtatcaac aatgacttct ctattagacg gagtatatga cggagatttt 120

gaactgtcag agattccgaa atatggagac ttcggtatcg gaacctttaa caagcttgac 180

ggagagctga ttgggtttga cggcgaattt taccgtcttc gctcagacgg aaccgcgaca 240

ccggtccaaa atggagaccg ttcaccgttc tgttcattta cgttctttac accggacatg 300

acgcacaaaa ttgatgcgaa aatgacacgc gaagactttg aaaaagagat caacagcatg 360

ctgccaagca gaaacttatt ttatgcaatt cgcattgacg gattgtttaa aaaggtgcag 420

acaagaacag tagaacttca agaaaaacct tacgtgccaa tggttgaagc ggtcaaaaca 480

cagccgattt tcaacttcga caacgtgaga ggaacgattg taggtttctt gacaccagct 540

tatgcaaacg gaatcgccgt ttctggctat cacctgcact tcattgacga aggacgcaat 600

tcaggcggac acgtttttga ctatgtgctt gaggattgca cggttacgat ttctcaaaaa 660

atgaacatga atctcagact tccgaacaca gcggatttct ttaatgcgaa tctggataac 720

cctgattttg cgaaagatat cgaaacaact gaaggaagcc ctgaa 765

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

taaggatccg aaggaga 17

<210> 8

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaaaaaag tgaaccgtat tgccgtggtt ggcaccggtg cagtgggcac cagctattgc 60

tacgccatga ttaaccaagg tgtggccgag gagctggtgc tgattgacat caatgaagcc 120

aaggccgagg gcgaagccat ggatctgaat catggtttac cttttgcccc gaccagcaca 180

cgcgtttgga agggcgatta cagtgattgc ggcaccgcag atctggtggt gattaccgcc 240

ggtagcccgc agaaaccggg tgaaacccgt ttagatctgg ttgcaaaaaa cgccaagatt 300

ttcaaaggta tgattaaaag tattatggat agcggcttca acggcatctt tttagtggca 360

agcaatccgg tggatatttt aacctacgtg acatggaagg agagtggttt accgaaagaa 420

cacgttattg gcagcggtac cgtgctggat agtgcccgtt tacgtaactc tttaagtgcc 480

cagtttggca ttgacccgcg caatgtgcac gcagccatca ttggcgaaca tggcgatacc 540

gaactgcccg tttggagcca taccaacatc ggctacgaca caatcgagag ctatttacag 600

aagggcatta tcgacgaaaa aactttagac gacatcttcg tgaacacccg cgatgccgca 660

taccatatca tcgaacgcaa gggcgccacc ttttatggca tcggcatgtc tttaacccgc 720

attacccgtg ccattttaaa taacgaaaac agcgtgctga ccgtgagtgc ctttctggag 780

ggccagtatg gcaacagcga cgtgtacgtt ggcgttccgg ccattatcaa ccgtcaaggt 840

atccgcgaag tggtggagat caaactgaat gaaaaagaac aagaacagtt taatcatagc 900

gtgaaagtgc tgaaagaaac catggccccc gttctgtaa 939

<210> 9

<211> 1338

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaagattg tggtgattgg caccaaccat gcgggtattg cgactgcgaa caccctgatt 60

gatcagtatc cgggccatga aattgtgatg attgatcgca acagcaacat gagctatctg 120

ggttgcggca ccgcgatttg ggttggccgc cagattgaaa aaccggacga gctgttttat 180

gcgaaagcgg aggactttga aaaaaagggc gtgaagattc tgaccgaaac cgaagtgagc 240

gaaattgact tcaccaacaa gatgatttac gcgaaaagca aaaccggcga gaaaattacc 300

gagagctacg ataaactggt gctggcgact ggtagccgcc ctattattcc taacctgccg 360

ggcaaagatc tgaaaggcat ccatttcctg aaactgtttc aggaaggcca ggcgattgat 420

gaagaatttg cgaagaacga tgtgaaacgc attgcggtga ttggcgcggg ttatattggc 480

accgaaattg cggaagcggc gaaacgccgt ggtaaagaag tgctgctgtt tgatgcggaa 540

agcaccagcc tggcgagcta ttatgatgag gaattcgcga aaggcatgga tgaaaacctg 600

gcgcagcatg gcattgaact gcattttggc gaactggcgc aggaatttaa agcgaacgaa 660

aaaggccatg tgagccagat tgtgaccaac aaaagcacct atgatgtgga tctggtgatt 720

aactgcattg gctttaccgc gaactcagcg ttagcgggcg aacatctgga aacctttaaa 780

aacggcgcga tcaaagtgga taaacatcag cagagcagcg atccggatgt gtatgcggtt 840

ggcgatgtgg cgaccattta tagcaacgcg ctgcaggatt ttacctatat tgcgctggcg 900

agcaatgcag ttcgtagcgg tattgtggcg ggccataaca ttggcggcaa aagcattgaa 960

agcgtgggtg tgcaaggcag caacggcatt agcattttcg gctataacat gaccagcacc 1020

ggcctgtcag ttaaagcggc gaaaaaaatt agcctggagg tgagctttag cgactttgaa 1080

gacaaacaga aagcgtggtt tctgcatgaa aacaacgata gcgtgaaaat ccgcattgtg 1140

tatgaaacca acagccgccg cattattggt gcacagctgg cgagcaaaag cgaaattatt 1200

gcgggcaaca tcaacatgtt tagcctggcg attcaggaaa aaaagaccat tgatgaactg 1260

gcgctgctgg atctgttttt tctgccgcat tttaacagcc cgtacaacta tatgaccgtg 1320

gcggcgctga acgcgaaa 1338

<210> 10

<211> 6274

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagttacaga acgggggcca 180

tggtttcttt cagcactttc acgctatgat taaactgttc ttgttctttt tcattcagtt 240

tgatctccac cacttcgcgg ataccttgac ggttgataat ggccggaacg ccaacgtaca 300

cgtcgctgtt gccatactgg ccctccagaa aggcactcac ggtcagcacg ctgttttcgt 360

tatttaaaat ggcacgggta atgcgggtta aagacatgcc gatgccataa aaggtggcgc 420

ccttgcgttc gatgatatgg tatgcggcat cgcgggtgtt cacgaagatg tcgtctaaag 480

ttttttcgtc gataatgccc ttctgtaaat agctctcgat tgtgtcgtag ccgatgttgg 540

tatggctcca aacgggcagt tcggtatcgc catgttcgcc aatgatggct gcgtgcacat 600

tgcgcgggtc aatgccaaac tgggcactta aagagttacg taaacgggca ctatccagca 660

cggtaccgct gccaataacg tgttctttcg gtaaaccact ctccttccat gtcacgtagg 720

ttaaaatatc caccggattg cttgccacta aaaagatgcc gttgaagccg ctatccataa 780

tacttttaat catacctttg aaaatcttgg cgttttttgc aaccagatct aaacgggttt 840

cacccggttt ctgcgggcta ccggcggtaa tcaccaccag atctgcggtg ccgcaatcac 900

tgtaatcgcc cttccaaacg cgtgtgctgg tcggggcaaa aggtaaacca tgattcagat 960

ccatggcttc gccctcggcc ttggcttcat tgatgtcaat cagcaccagc tcctcggcca 1020

caccttggtt aatcatggcg tagcaatagc tggtgcccac tgcaccggtg ccaaccacgg 1080

caatacggtt cacttttttc atggatccgc gacccatttg ctgtccacca gtcatgctag 1140

ccatatggct gccgcgcggc accaggccgc tgctgtgatg atgatgatga tggctgctgc 1200

ccatggtata tctccttctt aaagttaaac aaaattattt ctagagggga attgttatcc 1260

gctcacaatt cccctatagt gagtcgtatt aatttcgcgg gatcgagatc tcgatcctct 1320

acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata 1380

tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt 1440

tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc 1500

atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc 1560

taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagatcccgg acaccatcga atggcgcaaa 1620

acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 1680

aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 1740

cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 1800

atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 1860

ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 1920

gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 1980

agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 2040

ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 2100

aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 2160

tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 2220

atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 2280

cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 2340

gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 2400

atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 2460

ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 2520

tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 2580

gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 2640

tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 2700

ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 2760

gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccgggatctc gaccgatgcc 2820

cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 2880

cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 2940

ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 3000

ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 3060

tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc ccacgggtgc gcatgatcgt 3120

gctcctgtcg ttgaggaccc ggctaggctg gcggggttgc cttactggtt agcagaatga 3180

atcaccgata cgcgagcgaa cgtgaagcga ctgctgctgc aaaacgtctg cgacctgagc 3240

aacaacatga atggtcttcg gtttccgtgt ttcgtaaagt ctggaaacgc ggaagtcagc 3300

gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 3360

acctacatct gtattaacga agcgctggca ttgaccctga gtgatttttc tctggtcccg 3420

ccgcatccat accgccagtt gtttaccctc acaacgttcc agtaaccggg catgttcatc 3480

atcagtaacc cgtatcgtga gcatcctctc tcgtttcatc ggtatcatta cccccatgaa 3540

cagaaatccc ccttacacgg aggcatcagt gaccaaacag gaaaaaaccg cccttaacat 3600

ggcccgcttt atcagaagcc agacattaac gcttctggag aaactcaacg agctggacgc 3660

ggatgaacag gcagacatct gtgaatcgct tcacgaccac gctgatgagc tttaccgcag 3720

ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 3780

ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 3840

gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca cgtagcgata gcggagtgta 3900

tactggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca tatatgcggt 3960

gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 4020

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4080

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4140

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4200

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4260

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4320

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4380

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4440

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4500

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4560

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4620

acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 4680

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 4740

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taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 5880

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<210> 11

<211> 6631

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

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gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

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gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

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<210> 12

<211> 528

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)

<400> 12

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<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

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tagcaggata ataatacagt aaaacgctaa accaataatc caaatccagc catcccaaat 660

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taaaccaagc ccaaaacttg cccctaacca accgaaccac ttcacgcgtt gagaagctga 1380

ggtggtatcg gcaatgaccg atgccgcgac agccccagta gctcctgtga tccctgaaag 1440

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tccaagccaa ggagcaaaga taacctgcat taacgcataa agtgcaagca atacgccaaa 1620

gtggttagcg atatcttccg aagcaataaa ttcacgtaat aacgttggca agactggcat 1680

gataaggcca atccccatgg catcgagtaa cgtaattacc aatgcgatct ttgtcgaact 1740

attcatattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc tatcatgcca tacgcgaaag 1800

gtggtgtcaa cgtaaatatt accctgttat ccctacgttt ttttagccac gtatcaatta 1860

taggtacttc ctctcgtcat catccgcagc tttgcgctgc ggatatctga accggaaata 1920

atcactattt ccggtttttt attctcttaa tttgcattaa tcctttctga ttatcttgct 1980

taactgcgct gcatcaatga attgcgccat cccactttgc atacttacca ctttgttttg 2040

tgcaagggaa tatttgcgct atgtccgcaa tcactgaatc caaaccaaca agaagatggg 2100

caatgcccga tacgttggtg attatctttt ttgttgctat tttaaccagc cttgccacct 2160

gggtagttcc ggtggggatg tttgacagtc aggaagtgca gtatcaggtt gatggtcaaa 2220

caaaaacacg caaagtcgta gatccacact catttcgcat tctgactaac gaagcaggcg 2280

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<210> 17

<211> 528

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)

<400> 17

ggctccgtat atggattggg tagagcagga agtgaaagcg ctcggcgtga cgcgtttctt 60

taaagagaaa ttcttcaccc cagtagcaga agcggcgacc agcggtctga aattcaccaa 120

actgcaaccg gcacgagaat tttacgcccc ggttggcacc acgctactgg aggcgctgga 180

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aaaagtggtt tccggtgaat atacggtgag cagcacaatg acgctgaccg acgccgaaat 300

cgctgaaggt tacgtactgg cctgctcctg ccatccgcag ggggatttgg ttctcgcata 360

atcgccttat gcccgatgat attcctttca tcgggctatt taaccgttag tgcctccttt 420

ctctcccatc ccttccccct ccgtcagatg aactaaactt gttaccgtta tcacattcag 480

gagatggaga accaaagggt ggcatttccc gtcataataa ggacatgc 528

<210> 18

<211> 784

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ccgtcataat aaggacatgc attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgttta 60

ctcccctgag cttgaggggt caacatgaag gtcattgata gcaggataat aatacagtaa 120

aacgctaaac caataatcca aatccagcca tcccaaattg gtagtgaatg attataaata 180

acagtaaaca gtaatgggcc aataacaccg gttgcattgg taaggctcac caataatccc 240

tgtaaagcac cttgctcatg actctttgtt tggatagaca tcactccctg taatgcaggt 300

aaagcgatcc caccaccagc caataaaatt aaaacaggga aatctaacca accttcagat 360

ataaacgcta aaaaggcaaa tgcactacta tctgcaataa attcgagcag tactgccgtt 420

ttttcgcccc atttagtggc tattcttcct gccacaaagg cttggaatac tgagtgtaaa 480

agaccaagac ccgctaatga aaagccaacc atcatgctat tccatccaaa acgattttcg 540

gtaaatagca cccacaccgt tgcgggaatt tggcctatca attgcgctga aaaataaata 600

atcaacaaaa tgggcatcgt tttaaataaa gtgatgtaca ccgaatttga ttgcgtctca 660

acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg tttcacggaa ccaaaacata 720

accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa aaaagggact atgcggtgaa 780

atct 784

<210> 19

<211> 703

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgaatttga ttgcgtctca acccctactt cggtatctgt attatcacgt gtatttttgg 60

tttcacggaa ccaaaacata accacaagga aagtgacaat atttagcaac gcagcgataa 120

aaaagggact atgcggtgaa atctctcctg caaaaccacc aataataggc cccgctatta 180

aaccaagccc aaaacttgcc cctaaccaac cgaaccactt cacgcgttga gaagctgagg 240

tggtatcggc aatgaccgat gccgcgacag ccccagtagc tcctgtgatc cctgaaagca 300

aacggcctaa atacagcatc caaagcgcac ttgaaaaagc cagcaataag taatccagcg 360

atgcgcctat taatgacaac aacagcactg ggcgccgacc aaatcggtca gacatttttc 420

caagccaagg agcaaagata acctgcatta acgcataaag tgcaagcaat acgccaaagt 480

ggttagcgat atcttccgaa gcaataaatt cacgtaataa cgttggcaag actggcatga 540

taaggccaat ccccatggca tcgagtaacg taattaccaa tgcgatcttt gtcgaactat 600

tcatattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata cgcgaaaggt 660

ggtgtcaacg taaatattac cctgttatcc ctaaaagggt ggc 703

<210> 20

<211> 500

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)

<400> 20

atccctaaaa gggtggcatt tcccgtcata ataaggacat gccatgattg atttacgcag 60

tgataccgtt acccgaccaa gccgcgccat gctcgaagcg atgatggccg ccccggttgg 120

ggacgacgtt tacggagacg accctaccgt taatgctctg caggactacg cagcagagct 180

ttccggtaaa gaagccgcca tttttctgcc taccggcact caggccaacc tggtcgctct 240

gctcagtcac tgcgaacgcg gcgaagagta tattgtcggt caggccgcgc ataactatct 300

gtttgaagcc ggtggcgcgg cggtgctggg cagtattcaa ccgcaaccca tagacgcggc 360

tgccgacggc acgctaccgc tggataaagt ggcgatgaaa atcaaacccg acgatatcca 420

tttcgcccgc accaaattac tcagtctgga aaacacccac aacggcaaag tgttgccgcg 480

ggaatacctg aaagaagcat 500

<210> 21

<211> 2334

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggctccgtat atggattggg tagagcagga agtgaaagcg ctcggcgtga cgcgtttctt 60

taaagagaaa ttcttcaccc cagtagcaga agcggcgacc agcggtctga aattcaccaa 120

actgcaaccg gcacgagaat tttacgcccc ggttggcacc acgctactgg aggcgctgga 180

aagcaataac gttccggttg tcgctgcctg ccgtgcgggt gtttgcggct gctgtaagac 240

aaaagtggtt tccggtgaat atacggtgag cagcacaatg acgctgaccg acgccgaaat 300

cgctgaaggt tacgtactgg cctgctcctg ccatccgcag ggggatttgg ttctcgcata 360

atcgccttat gcccgatgat attcctttca tcgggctatt taaccgttag tgcctccttt 420

ctctcccatc ccttccccct ccgtcagatg aactaaactt gttaccgtta tcacattcag 480

gagatggaga accaaagggt ggcatttccc gtcataataa ggacatgcat taccctgtta 540

tccctactaa gcacttgtct cctgtttact cccctgagct tgaggggtca acatgaaggt 600

cattgatagc aggataataa tacagtaaaa cgctaaacca ataatccaaa tccagccatc 660

ccaaattggt agtgaatgat tataaataac agtaaacagt aatgggccaa taacaccggt 720

tgcattggta aggctcacca ataatccctg taaagcacct tgctcatgac tctttgtttg 780

gatagacatc actccctgta atgcaggtaa agcgatccca ccaccagcca ataaaattaa 840

aacagggaaa tctaaccaac cttcagatat aaacgctaaa aaggcaaatg cactactatc 900

tgcaataaat tcgagcagta ctgccgtttt ttcgccccat ttagtggcta ttcttcctgc 960

cacaaaggct tggaatactg agtgtaaaag accaagaccc gctaatgaaa agccaaccat 1020

catgctattc catccaaaac gattttcggt aaatagcacc cacaccgttg cgggaatttg 1080

gcctatcaat tgcgctgaaa aataaataat caacaaaatg ggcatcgttt taaataaagt 1140

gatgtacacc gaatttgatt gcgtctcaac ccctacttcg gtatctgtat tatcacgtgt 1200

atttttggtt tcacggaacc aaaacataac cacaaggaaa gtgacaatat ttagcaacgc 1260

agcgataaaa aagggactat gcggtgaaat ctctcctgca aaaccaccaa taataggccc 1320

cgctattaaa ccaagcccaa aacttgcccc taaccaaccg aaccacttca cgcgttgaga 1380

agctgaggtg gtatcggcaa tgaccgatgc cgcgacagcc ccagtagctc ctgtgatccc 1440

tgaaagcaaa cggcctaaat acagcatcca aagcgcactt gaaaaagcca gcaataagta 1500

atccagcgat gcgcctatta atgacaacaa cagcactggg cgccgaccaa atcggtcaga 1560

catttttcca agccaaggag caaagataac ctgcattaac gcataaagtg caagcaatac 1620

gccaaagtgg ttagcgatat cttccgaagc aataaattca cgtaataacg ttggcaagac 1680

tggcatgata aggccaatcc ccatggcatc gagtaacgta attaccaatg cgatctttgt 1740

cgaactattc atattcacca ccctgaattg actctcttcc gggcgctatc atgccatacg 1800

cgaaaggtgg tgtcaacgta aatattaccc tgttatccct aaaagggtgg catttcccgt 1860

cataataagg acatgccatg attgatttac gcagtgatac cgttacccga ccaagccgcg 1920

ccatgctcga agcgatgatg gccgccccgg ttggggacga cgtttacgga gacgacccta 1980

ccgttaatgc tctgcaggac tacgcagcag agctttccgg taaagaagcc gccatttttc 2040

tgcctaccgg cactcaggcc aacctggtcg ctctgctcag tcactgcgaa cgcggcgaag 2100

agtatattgt cggtcaggcc gcgcataact atctgtttga agccggtggc gcggcggtgc 2160

tgggcagtat tcaaccgcaa cccatagacg cggctgccga cggcacgcta ccgctggata 2220

aagtggcgat gaaaatcaaa cccgacgata tccatttcgc ccgcaccaaa ttactcagtc 2280

tggaaaacac ccacaacggc aaagtgttgc cgcgggaata cctgaaagaa gcat 2334

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tgccagcaga gagtaaatac 20

<210> 23

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtaatggaa gtacctataa ttgatacgtg gctaaaaaaa cgtcagggag ccatagagcg 60

<210> 24

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aggtacttcc attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgtt 48

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

agatttcacc gcatagtcc 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ccgaatttga ttgcgtctc 19

<210> 27

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gatacgtggc taaaaaaacg tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 58

<210> 28

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

cgttttttta gccacgtatc aattataggt acttcctctc gtcatcatcc gcag 54

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcggtgatac tcaggttc 18

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ggctccgtat atggattgg 19

<210> 31

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gcatgtcctt attatgacgg gaaatgccac cctttggttc tccatctcct gaa 53

<210> 32

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccgtcataat aaggacatgc attaccctgt tatccctact aagcacttgt ctcctgtt 58

<210> 33

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

agatttcacc gcatagtcc 19

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccgaatttga ttgcgtctc 19

<210> 35

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gccacccttt tagggataac agggtaatat ttacgttgac accacctt 48

<210> 36

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

atccctaaaa gggtggcatt tcccgtcata ataaggacat gccatgattg atttacgcag 60

t 61

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

atgcttcttt caggtattcc 20

<210> 38

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

atgaaaacga aagctctcta aggatccgaa ggagatgggc aatgaaaaaa gtgaaccg 58

<210> 39

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ccttcttctc cttcaagctt aacaaattac agaacggggg ccatgg 46

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gttaagcttg aaggagaaga aggatgaaga ttgtggtg 38

<210> 41

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

acgtcctcga gtttcgcgtt cagcgccgcc acggt 35

<210> 42

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gtacggctag catgaaacga gaaagcaaca ttcaag 36

<210> 43

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ccaccgcccg agccaccgcc accttcaggg cttccttcag ttgtttcg 48

<210> 44

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgatg acaaaagcaa caaaagaac 49

<210> 45

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

cggttcactt ttttcattgc ccatctcctt cggatcctta gagagctttc gttttcat 58

Claims

1.产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其构建方法为通过共表达α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，得到产乙偶姻的大肠杆菌工程菌；

构建大肠杆菌工程菌中使用的宿主菌为突变型大肠杆菌BL-2，

所述α-乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3；

所述NADH氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC、乳酸脱氢酶的编码基因ldh和NADH氧化酶的编码基因nox；

所述重组表达载体为pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；

所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述NADH氧化酶的编码基因nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述重组表达载体的基本载体是pET28a。

3.权利要求1或2的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

2)以引物aldC-F为上游引物，以aldC-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC和部分S2的片段aldC-1；

以引物alsS-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS和另外部分S2的片段alsS-1；

所述pET28a-ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述pET28a-nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述引物LDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；

所述引物LDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

所述引物NOX-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；

所述引物NOX-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示；

所述引物aldC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；

所述引物aldC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；

所述引物alsS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；

所述引物alsS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。

4.产乙偶姻的大肠杆菌工程菌在全细胞催化生产乙偶姻的应用，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于转化液的组成为10mM的MgCl₂，余量为pH 6.0的100mM磷酸盐缓冲液。