CN109666688A - 一种重组人源脂肪细胞肽的创新制备工艺（简称：bmp-2干细胞） - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人源脂肪细胞肽的创新制备工艺(简称：BMP‑2干细胞)，包括如下步骤：BMP‑2干细胞的基因合成、具体为成熟肽的表达体系构建、诱导表达、分离纯化与扩增等多种步骤。本发明采用一种新颖的PCR扩增方法，在快速合成目的基因的同时构建高效表达载体；本发明所采用的启动子为Trc启动子，弱于原核表达系统常采用的T7启动子，可以实现在较高温度下可溶表达；并在基因的C端增加来源于酿酒酵母的分子伴侣PDI蛋白，更利于蛋白的正确折叠，保持BMP‑2干细胞的可溶性和高活性；在基因N端添加6×HIS标签，实现BMP‑2干细胞的快速分离纯化。本发明公开的方法，简便灵活，产品分离纯化工艺简单，纯度高，活性高，生产成本低，在临床病毒防治、抵抗细胞衰老、促进伤口愈合及在表皮、真皮、粘膜中的修复作用和在医疗、美容、保健等领域拥有广阔的应用前景。

Description

一种重组人源脂肪细胞肽的创新制备工艺(简称：BMP-2干细 胞)

发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有创伤疤痕修复、皱纹去除及抗皮肤衰老效果的BMP-2干细胞创新工艺制备方法。

发明背景

在皮肤伤口愈合过程中，随着大量胶原蛋白的产生，脂肪细胞大量流失，导致疤痕形成；皮肤衰老的过程中也伴随着脂肪细胞的流失，导致皱纹的出现，皱纹是每个女人的“天敌”，为了保持皮肤的年轻光滑，她们不惜花费重金在不同的保养品和化妆品上，但这些化妆品往往只是从表面上掩饰皱纹，并没有从根本上杜绝皱纹的产生。同时脂肪细胞流失也是人类衰老的自然结果，更是女性生殖系统免疫力下降、艾滋病病毒容易感染的常见并发症。

近期美国宾夕法尼亚大学的乔治·科察雷利斯教授研究表明(Plikus,MaksimV.,et al."Regeneration of fat cells from myofibroblasts during woundhealing."Science 355.6326(2017):748-752.)毛囊掌握着保持创面愈合、皮肤光滑无疤痕的关键，因为它们会释放一种叫做“骨形态发生蛋白”(BMP)的重要信号分子，BMP会指导那些在伤口中形成伤疤的细胞—肌成纤维细胞—转变成脂肪细胞。这项突破性的新发现不仅会给人类带来激动人心的抗病毒及抗衰老疗法，还可能为灭活各种病毒感染、抵抗细胞衰老，实现创伤无疤痕愈合铺路。年老者的脸上产生永久皱纹的原因之一就是脂肪细胞不足，随着科学家找到让脂肪细胞再生的方法，人们脸上的皱纹将会成为过去，用BMP-2干细胞治疗可以逆转人类鱼尾纹和皱纹，让皮肤看起来更年轻，而且BMP-2干细胞还能更好的修复创伤，让损伤细胞恢复光滑紧致弹性，起到减少疤痕形成，预防色素沉着的作用。

一般认为，肌成纤维细胞无法变成另一种细胞，但George Cotsarelis教授的研究显示，通过BMP的诱导作用，可以有效和稳定地将肌成纤维细胞转变成脂肪细胞来操纵创伤愈合过程，使其走向皮肤再生而不是结疤。英国《每日电讯报》网站2017年1月8日报道：脂肪细胞再生的方法，不仅能提高细胞充盈度，还能有效阻止伤口疤痕形成，减少表皮粗糙和皱纹、延缓细胞衰老，能促进人体表皮细胞逆生长，使人们的皮肤变得更年轻光滑有弹性，这将给人类带来更多治疗艾滋病毒、抵抗衰老和皱纹、减少创伤疤痕形成和促进伤口愈合的新疗法。

BMP是一类酸性糖蛋白，属于转化生长因子TGF-β超家族成员，于1965年首次被发现。到目前为止，已发现20余种BMP成员。其中BMP-2干细胞研究最为广泛，分别获美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMEA)批准用于临床，具有广阔的应用前景。它不仅能抑制灭活多种病毒，还能让人体衰老细胞逆分化为年轻细胞，对创面能达到快速愈合损伤的目的。但是天然的BMP-2干细胞含量稀少、分离过程繁杂，纯度低，重复性差，质量控制困难，成本高昂，易失活，不适于工业化生产，临床应用严重受限。利用基因重组技术不仅可以实现规模化生产，还可以保证产品的质量，具有极佳的市场发展前景。

目前，BMP-2干细胞可以采用真核细胞和原核细胞两种系统表达。真核细胞表达系统使用哺乳动物细胞，其表达产物可以糖基化，有更好的翻译后修饰，活性相对较高。目前的国外产品大多采用真核表达体系制备。但真核体系表达量低，因此表达产物回收及纯化较困难，导致生产成本很高。目前国外BMP产品的价格十分昂贵，临床推广难度很大。与真核表达系统相比，大肠杆菌表达系统技术成熟，表达量高，成本低，已成为目前基因重组法生产BMP-2干细胞的一个热点技术，原核细胞表达系统具有对培养环境耐受性强、易于控制，产物稳定、生产成本低等优点，更利于临床推广。但其主要问题是较难正确加工和折叠形成有活性的蛋白质，致使大部分工作停留在实验室水平，无法实现产业化。

发明内容

本发明提供了一种具有诱导脂肪细胞再生的BMP-2干细胞，该BMP-2干细胞基因来源于人类基因组。

本发明是通过以下技术方案予以实施的：

本发明根据人类基因组序列，结合大肠杆菌密码子使用频率对脂肪细胞序列进行了密码子优化，全基因重组合成BMP-2干细胞基因碱基序列，在BMP-2干细胞基因序列的5’端添加6×HIS标签序列用于蛋白的纯化，在3’端增加来源于酿酒酵母的分子伴侣蛋白PDI促进其可溶表达，应用表达载体pET-30a(+)，在大肠杆菌中表达该基因，对编码蛋白进行分离纯化，经过测序分析表明，该基因的开放读码框含有342个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的BMP-2干细胞分子量为12.5kDa。

本发明是从人类基因组中获得的编码基因，其编码的蛋白可以诱导肌成纤维细胞有效和稳定地转变成BMP-2干细胞，可以弥补填充创伤疤痕、皱纹、皮肤衰老形成过程中脂肪细胞的流失，本发明的成果可以应用于伤口愈合，疤痕修复，抗皮肤老化，皱纹等，从而实现永葆青春的效果。

与现有技术相比，利用本发明的基因重组表达方法，包括利用全基因合成获得BMP-2干细胞基因，利用Trc启动子和分子伴侣蛋白构建高效表达载体，使得BMP-2干细胞保持可溶解高活性的正确折叠状态，比包涵体的形式保持了更高蛋白酶的活性，在序列中添加6×HIS标签利于蛋白的高效提纯，大幅度简化了纯化的步骤，这样制得的BMP-2干细胞纯度高，活性高，产品质量稳定，生产成本低，对临床伤口愈合和表皮、真皮、粘膜中的修复抗衰老作用及医疗和美容保健领域拥有重要的应用价值。

附图说明

图1构建含有BMP-2干细胞基因的表达载体pET-30a-BMP-2干细胞-PDI图谱

图2是SDS-PAGE分析BMP-2干细胞蛋白(含PDI)的诱导表达。

本发明采取下列具体措施：

一、BMP-2干细胞基因合成及表达载体的构建。

1.多轮PCR扩增合成BMP-2干细胞基因以含有来源于酿酒酵母分子伴侣PDI的质粒pET-30a(+)-PDI(其中T7启动子已换成Trc启动子)为模板，引物P1/P2，P1-2/P2-2，P1-3/P2-3，P1-4/P2-4，P1-5/P2-5(含有20bp左右同源臂)，分别进行多轮PCR扩增，PCR反应体系及循环设定如下：

扩增所用引物如下：

充分混匀，按以下程序进行PCR扩增：98℃预变性5min进入循环，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸1min，7个循环后于72℃继续延伸5min(最后一轮扩增时30个循坏)。反应完成后，利用DpnΙ消化可能残留的质粒模板。

2.消化产物转化E.coli DH5α感受态细胞

(1)将感受态细胞置于冰上缓慢融化；

(2)加入以上消化产物PCR产物，与感受态细胞混合均匀，冰浴30min；

(3)42℃热击90s后立即将离心其转移到冰上，静置2min；

(4)加入1mL LB培养基，于37℃，孵育1h；

(5)离心后取适量菌液涂于含有卡那霉素的LB平板37℃倒置培养过液12h。

3.BMP-2干细胞基因测序

挑取经PCR初步鉴定的含有与目的片段相同大小的大肠杆菌转化子，命名为pET-30a-BMP-2干细胞-PDI，置于LB培养基过夜培养，提取质粒。将上述转化子进行DNA测序，得到BMP-2干细胞基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示.

二、BMP-2干细胞基因的原核表达和表达蛋白的分离纯化

1.BMP-2干细胞基因在E.coli Transetta(DE3)中的表达

(1)提取重组质粒pET-30a-BMP-2干细胞-PDI转化E.coli Transetta(DE3)。

(2)挑取单克隆菌落培养，按1％比例接种至新鲜LB(含卡那霉素)培养基中，继续培养至OD600为1左右，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，30℃，200r/min诱导培养过液12h。

(3)表达产物的SDS-PAGE分析。

取1mL上述诱导发酵产物至1.5mL离心管中，离心去除上清，加入0.2mL PBS溶液，进行破胞，离心后上清和沉淀，分别于与50μL 5×SDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水浴10min，进行SDS-PAGE电泳检测BMP-2干细胞在大肠杆菌中的表达，检测结果如图2所示，经过IPTG诱导后，BMP-2干细胞(含PDI)获得了大量表达，主要以可溶形式在上清中表达。

2.重组表达BMP-2干细胞的纯化在高浓度的BMP-2干细胞的溶液中，4℃条件下利用Prescission Protease进行切割释放出BMP-2干细胞，调整其PH值到8.0。配制上柱缓冲液：

MCAC-15	MCAC-1000
		20mM/L Tris盐酸pH10.	20mM/L Tris盐酸pH10
0.5M/L NaCl	0.5M/L NaCl
		10％(v/v)甘油	10％(v/v)甘油
15mM/L咪唑	1M/L咪唑

用MCAC-15溶液清洗镍离子亲和柱(Ni-NTA His-Bind Resin)填料，然后把填料和BMP-2干细胞溶液共育，轻摇30min后上柱，用MCAC-50(MCAC-1000稀释获得)洗脱杂蛋白，最后用MCAC-250洗脱目的蛋白。将所得产物透析过液12h，即得到高纯度的BMP-2干细胞精品。

SEQ ID NO.1

BMP-2Stem Cells基因序列

ATGCAGGCTAAACACAAACAGCGTAAACGTCTGAAATCTTCTTGCAAACGTCACCCGCTGTACGTTGACTTCTCTGACGTTGGTTGGAACGACTGGATCGTTGCTCCGCCGGGTTACCACGCTTTCTACTGCCACGGTGAATGCCCGTTCCCGCTGGCTGACCACCTGAACTCTACCAACCACGCTATCGTTCAGACCCTGGTTAACTCTGTTAACTCTAAAATCCCGAAAGCTTGCTGCGTTCCGACCGAACTGTCTGCTATCTCTATGCTGTACCTGGACGAAAACGAAAAAGTTGTTCTGAAAAACTACCAGGACATGGTTGTTGAAGGTTGCGGTTGCCGTTAA

SEQ ID NO.2

pET-30a-BMP-2干细胞-PDI载体序列

tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgaattaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctagagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaatGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgcaccatcatcatcatcattcttctggTCAGGCTAAACACAAACAGCGTAAACGTCTGAAATCTTCTTGCAAACGTCACCCGCTGTACGTTGACTTCTCTGACGTTGGTTGGAACGACTGGATCGTTGCTCCGCCGGGTTACCACGCTTTCTACTGCCACGGTGAATGCCCGTTCCCGCTGGCTGACCACCTGAACTCTACCAACCACGCTATCGTTCAGACCCTGGTTAACTCTGTTAACTCTAAAATCCCGAAAGCTTGCTGCGTTCCGACCGAACTGTCTGCTATCTCTATGCTGTACCTGGACGAAAACGAAAAAGTTGTTCTGAAAAACTACCAGGACATGGTTGTTGAAGGTTGCGGTTGCCGTCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCCCTGAAGACTCCGCTGTCGTTAAGTTGGCCACCGACTCCTTCAATGAGTACATTCAGTCGCACGACTTGGTGCTTGCGGAGTTTTTTGCTCCATGGTGTGGCCACTGTAAGAACATGGCTCCTGAATACGTTAAAGCCGCCGAGACTTTAGTTGAGAAAAACATTACCTTGGCCCAGATCGACTGTACTGAAAACCAGGATCTGTGTATGGAACACAACATTCCAGGGTTCCCAAGCTTGAAGATTTTCAAAAACAGCGATGTTAACAACTCGATCGATTACGAGGGACCTAGAACTGCCGAGGCCATTGTCCAATTCATGATCAAGCAAAGCCAACCGGCTGTCGCCGTTGTTGCTGATCTACCAGCTTACCTTGCTAACGAGACTTTTGTCACTCCAGTTATCGTCCAATCCGGTAAGATTGACGCCGACTTCAACGCCACCTTTTACTCCATGGCCAACAAACACTTCAACGACTACGACTTTGTCTCCGCTGAAAACGCAGACGATGATTTCAAGCTTTCTATTTACTTGCCCTCCGCCATGGACGAGCCTGTAGTATACAACGGTAAGAAAGCCGATATCGCTGACGCTGATGTTTTTGAAAAATGGTTGCAAGTGGAAGCCTTGCCCTACTTTGGTGAAATCGACGGTTCCGTTTTCGCCCAATACGTCGAAAGCGGTTTGCCTTTGGGTTACTTATTCTACAATGACGAGGAAGAATTGGAAGAATACAAGCCTCTCTTTACCGAGTTGGCCAAAAAGAACAGAGGTCTAATGAACTTTGTTAGCATCGATGCCAGAAAATTCGGCAGACACGCCGGCAACTTGAACATGAAGGAACAATTCCCTCTATTTGCCATCCACGACATGACTGAAGACTTGAAGTACGGTTTGCCTCAACTCTCTGAAGAGGCGTTTGACGAATTGAGCGACAAGATCGTGTTGGAGTCTAAGGCTATTGAATCTTTGGTTAAGGACTTCTTGAAAGGTGATGCCTCCCCAATCGTGAAGTCCCAAGAGATCTTCGAGAACCAAGATTCCTCTGTCTTCCAATTGGTCGGTAAGAACCATGACGAAATCGTCAACGACCCAAAGAAGGACGTTCTTGTTTTGTACTATGCCCCATGGTGTGGTCACTGTAAGAGATTGGCCCCAACTTACCAAGAACTAGCTGATACCTACGCCAACGCCACATCCGACGTTTTGATTGCTAAACTAGACCACACTGAAAACGATGTCAGAGGCGTCGTAATTGAAGGTTACCCAACAATCGTCTTATACCCAGGTGGTAAGAAGTCCGAATCTGTTGTGTACCAAGGTTCAAGATCCTTGGACTCTTTATTCGACTTCATCAAGGAAAACGGTCACTTCGACGTCGACGGTAAGGCCTTGTACGAAGAAGCCCAGGAAAAAGCTGCTGAGGAAGCCGATGCTGACGCTGAATTGGCTGACGAAGAA

序列表

<110> 易金阳

<120> 一种重组人源脂肪细胞肽的创新制备工艺（简称：BMP-2干细胞）

<130> CP20180

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgcaggcta aacacaaaca gcgtaaacgt ctgaaatctt cttgcaaacg tcacccgctg 60

tacgttgact tctctgacgt tggttggaac gactggatcg ttgctccgcc gggttaccac 120

gctttctact gccacggtga atgcccgttc ccgctggctg accacctgaa ctctaccaac 180

cacgctatcg ttcagaccct ggttaactct gttaactcta aaatcccgaa agcttgctgc 240

gttccgaccg aactgtctgc tatctctatg ctgtacctgg acgaaaacga aaaagttgtt 300

ctgaaaaact accaggacat ggttgttgaa ggttgcggtt gccgttaa 348

<210> 2

<211> 7052

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

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ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

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taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

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agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

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agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

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accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

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caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

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gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

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ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatgtcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcga tctcgatccc 4980

gcgaaatgtt gacaattaat catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac 5040

aattcccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgcaccatc 5100

atcatcatca ttcttctggt caggctaaac acaaacagcg taaacgtctg aaatcttctt 5160

gcaaacgtca cccgctgtac gttgacttct ctgacgttgg ttggaacgac tggatcgttg 5220

ctccgccggg ttaccacgct ttctactgcc acggtgaatg cccgttcccg ctggctgacc 5280

acctgaactc taccaaccac gctatcgttc agaccctggt taactctgtt aactctaaaa 5340

tcccgaaagc ttgctgcgtt ccgaccgaac tgtctgctat ctctatgctg tacctggacg 5400

aaaacgaaaa agttgttctg aaaaactacc aggacatggt tgttgaaggt tgcggttgcc 5460

gtctggaagt tctgttccag gggccccctg aagactccgc tgtcgttaag ttggccaccg 5520

actccttcaa tgagtacatt cagtcgcacg acttggtgct tgcggagttt tttgctccat 5580

ggtgtggcca ctgtaagaac atggctcctg aatacgttaa agccgccgag actttagttg 5640

agaaaaacat taccttggcc cagatcgact gtactgaaaa ccaggatctg tgtatggaac 5700

acaacattcc agggttccca agcttgaaga ttttcaaaaa cagcgatgtt aacaactcga 5760

tcgattacga gggacctaga actgccgagg ccattgtcca attcatgatc aagcaaagcc 5820

aaccggctgt cgccgttgtt gctgatctac cagcttacct tgctaacgag acttttgtca 5880

ctccagttat cgtccaatcc ggtaagattg acgccgactt caacgccacc ttttactcca 5940

tggccaacaa acacttcaac gactacgact ttgtctccgc tgaaaacgca gacgatgatt 6000

tcaagctttc tatttacttg ccctccgcca tggacgagcc tgtagtatac aacggtaaga 6060

aagccgatat cgctgacgct gatgtttttg aaaaatggtt gcaagtggaa gccttgccct 6120

actttggtga aatcgacggt tccgttttcg cccaatacgt cgaaagcggt ttgcctttgg 6180

gttacttatt ctacaatgac gaggaagaat tggaagaata caagcctctc tttaccgagt 6240

tggccaaaaa gaacagaggt ctaatgaact ttgttagcat cgatgccaga aaattcggca 6300

gacacgccgg caacttgaac atgaaggaac aattccctct atttgccatc cacgacatga 6360

ctgaagactt gaagtacggt ttgcctcaac tctctgaaga ggcgtttgac gaattgagcg 6420

acaagatcgt gttggagtct aaggctattg aatctttggt taaggacttc ttgaaaggtg 6480

atgcctcccc aatcgtgaag tcccaagaga tcttcgagaa ccaagattcc tctgtcttcc 6540

aattggtcgg taagaaccat gacgaaatcg tcaacgaccc aaagaaggac gttcttgttt 6600

tgtactatgc cccatggtgt ggtcactgta agagattggc cccaacttac caagaactag 6660

ctgataccta cgccaacgcc acatccgacg ttttgattgc taaactagac cacactgaaa 6720

acgatgtcag aggcgtcgta attgaaggtt acccaacaat cgtcttatac ccaggtggta 6780

agaagtccga atctgttgtg taccaaggtt caagatcctt ggactcttta ttcgacttca 6840

tcaaggaaaa cggtcacttc gacgtcgacg gtaaggcctt gtacgaagaa gcccaggaaa 6900

aagctgctga ggaagccgat gctgacgctg aattggctga cgaagaagat gccattcacg 6960

atgaattgta aagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg 7020

ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg at 7052

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

caggacatgg ttgttgaagg ttgcggttgc cgtgaagttc tgttccaggg gccc 54

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

tggacgaaaa cgaaaaagtt gttctgaaaa actaccagga catggttgtt gaaggttg 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

tccgaccgaa ctgtctgcta tctctatgct gtacctggac gaaaacgaaa aagttgtt 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tctgttaact ctaaaatccc gaaagcttgc tgcgttccga ccgaactgtc tgctatct 58

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

actctaccaa ccacgctatc gttcagaccc tggttaactc tgttaactct aaaatcccg 59

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

tttcagacgt ttacgctgtt tgtgtttagc ctgaccagaa gaatgatgat gatgatg 57

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

agaagtcaac gtacagcggg tgacgtttgc aagaagattt cagacgttta cgctgtttg 59

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

ggcggagcaa cgatccagtc gttccaacca acgtcagaga agtcaacgta cagcggg 57

<210> 11

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

gaacgggcat tcaccgtggc agtagaaagc gtggtaaccc ggcggagcaa cgatccag 58

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

cgatagcgtg gttggtagag ttcaggtggt cagccagcgg gaacgggcat tcaccgtgg 59

Claims (8)

1.一种重组人源脂肪细胞肽的创新制备工艺(简称：BMP-2干细胞)，其特征在于依次包括以下步骤：

(1)通过多重PCR快速合成基因同时构建表达载体；

(2)表达质粒导入宿主菌构建表达工程菌；

(3)发酵工程菌，30℃条件下诱导表达；

(4)对表达产物进行酶切释放BMP-2干细胞，经镍柱分离纯化获得BMP-2干细胞精品。

2.根据权利要求1所述的一种BMP-2干细胞的创新制备工艺(以下简称：权利要求1的创新制备工艺)，其特征在于：步骤(1)设计一系列引物，通过多轮PCR扩增，获得目的基因全长，并同时获得带有同源臂的载体(含目的基因)，经过PCR方式进行自连，构建含有缺口的环状DNA序列，通过转化大肠杆菌，在细胞内修复获得完整的表达载体BMP-2干细胞。

3.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：表达载体中BMP-2干细胞基因置于Trc启动子之下。

4.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：表达载体中BMP-2干细胞基因C端连接有促进折叠的分子伴侣PDI基因。

5.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：表达载体中BMP-2干细胞基因N端连接有用于分离的6×HIS标签。

6.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：构建的最优表达载体导入E.coliTransetta(DE3)，构建表达工程菌。

7.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：在30℃条件下诱导，大部分产品以可溶形式表达，经低温酶切释放BMP-2干细胞，再经镍柱分离纯化获得精品。

8.根据权利要求1的创新制备工艺，其特征在于：一种BMP-2干细胞在临床病毒防治、抵抗细胞衰老、促进伤口愈合及在表皮、真皮、粘膜中的修复作用和在医疗、美容、保健等领域拥有广阔的应用前景。