CN114591985B

CN114591985B - 一种突变果胶裂解酶及应用

Info

Publication number: CN114591985B
Application number: CN202210399380.5A
Authority: CN
Inventors: 李丕武; 魏晓凤; 汪俊卿; 王瑞明; 肖静; 刘开泉; 王婷; 吉兴香; 田中建
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2042-04-15
Also published as: CN114591985A

Abstract

本发明提供了一种突变果胶裂解酶及应用，本发明提供的突变果胶裂解酶pelF‑th耐碱能力明显提高，其最适pH值由10.0提高至11.0，酶活力也明显提高，拓宽了果胶裂解酶pelF的应用范围，在制浆、造纸、纺织等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种突变果胶裂解酶及应用

技术领域

本发明涉及一种突变果胶裂解酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

果胶(pectin)存在于植物细胞的胞间层和细胞壁中，是由半乳糖醛酸通过α-1，4糖苷键连接而成的多聚物，是一种呈弱酸性且耐热性强的杂多糖，主要由半乳糖醛酸、鼠李糖、半乳糖和阿拉伯糖组成。果胶通常由果胶酶进行催化降解，果胶酶是一种常见工业用酶，广泛应用于造纸、食品、纺织以及环境领域。

根据底物作用的方式，果胶酶分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶以及果胶酯酶。其来源非常广泛，可以由不同种类的微生物产生。根据其对酸碱环境的耐受度，果胶酶分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶在食品行业具有重要作用，例如果汁的澄清。碱性果胶酶主要应用于造纸、纺织行业，例如苎麻脱胶、纸浆漂白等。碱性果胶裂解酶通过反式消除作用断开α-1，4糖苷键，生成不饱和半乳糖醛酸。

生物酶因其安全、低耗等特点，广泛应用于各个行业，但是由于受到酶活以及酶稳定性的影响，生物酶制剂的生产有很大的局限性。因此利用序列编辑的方法提高某一特定序列的性能仍十分必要。此外，目前多数研究针对果胶裂解酶耐热性研究较多，对耐碱特性酶的构建仍较少。

中国专利文献CN108588061A(申请号：201810396518.X)公开了一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶酶突变体，该酶的突变位点位于野生型低温碱性果胶裂解酶的184和185氨基酸处，该位点是将184位点的谷氨酸突变为天冬氨酸，185位点的氨基酸突变为丝氨酸，突变后低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性显著提高。并未涉及果胶裂解酶耐碱性的变化。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种突变果胶裂解酶及应用。

发明人发现将果胶裂解酶基因pelF的loop区的12个氨基酸的36个碱基进行替换，进行替换的36个碱基来自于pel4N-B的loop区的12个氨基酸。本发明提供的果胶裂解酶pelF-th耐碱能力显著提高，其耐碱能力较原始酶pelF的最适pH值由10.0提高到了11.0。

本发明技术方案如下：

一种突变果胶裂解酶pelF-th编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种突变果胶裂解酶pelF-th的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶pelF-th编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.1所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶pelF-th编码基因的核苷酸序列，如SEQ IDNO.1所示。

一种含突变果胶裂解酶pelF-th基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以pET-28a(+)-pelF基因为模板，通过反向PCR扩增pET-28a(+)-pelF-th基因，pelF-th的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，获得重组质粒pET-28a(+)-pelF-th；

(2)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(1)制得的重组质粒pET-28a(+)-pelF-th转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含突变果胶裂解酶pelF-th基因的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，以pET-28a(+)-pelF基因片段为模板进行反向PCR扩增，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1:GGATTCTGGCATAGCAGTCGAACAGGTTACTGGCATGTTT SEQ ID NO.5；

R1:ATGCCAGAATCCTAACGGGTTGGTCGCATTTTCGAACAGA SEQ ID NO.6；

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；94℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

上述重组菌或上述构建方法制得的大肠杆菌工程菌在生产果胶裂解酶中的应用。

有益效果

本发明提供了一种突变果胶裂解酶pelF-th，本发明中突变果胶裂解酶pelF-th耐碱能力显著提高，其最适pH值由10.0提高至11.0，原始酶pelF的纯化酶比酶活在最适条件75℃、pH10为36.8U/mg，突变酶pelF-th的纯化酶比酶活在最适条件60℃、pH11为69.84U/mg，酶活力有显著提高。拓宽了果胶裂解酶pelF的应用范围，在制浆、造纸、纺织等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为原始酶pelF不同温度条件下酶活检测结果图。

图2为原始酶pelF不同pH值条件下酶活检测结果图。

图3为突变酶pelF-th不同温度条件下酶活检测结果图。

图4为突变酶pelF-th不同pH值条件下酶活检测结果图。

图5为突变酶pelF-th的pH稳定性酶活检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。

实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。

pelF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例1

(一)以pET-28a(+)-pelF基因为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，通过反向PCR扩增pET-28a(+)-pelF-th基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，获得重组质粒pET-28a(+)-pelF-th；

pelF-th的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的PCR扩增引物序列如下：

F1:GGATTCTGGCATAGCAGTCGAACAGGTTACTGGCATGTTT SEQ ID NO.5；

R1:ATGCCAGAATCCTAACGGGTTGGTCGCATTTTCGAACAGA SEQ ID NO.6；

所述的PCR扩增体系，见表1：

表1

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为约6100bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；

(二)制备大肠杆菌感受态

(i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB培养基中，220r/min、37℃培养过夜；

(ii)吸取0.1mL菌液至10mL的LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD₆₀₀达0.6～0.8；

(iii)吸取1mLOD₆₀₀达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；

(iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。

(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。

(三)pelF-th基因转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)

将经过反向PCR制备的质粒pET28a(+)-pelF-th进行转化，得到的细胞使用复苏培养基37℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，在37℃培养1天，筛选具有卡纳霉素抗性的阳性重组菌。

液体复苏培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、余量水。

(四)阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落，接种到含50μg/mL卡纳霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，F₁和R₁为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；

所述的PCR引物序列如下:

F1:GGATTCTGGCATAGCAGTCGAACAGGTTACTGGCATGTTT SEQ ID NO.5；

R1:ATGCCAGAATCCTAACGGGTTGGTCGCATTTTCGAACAGA SEQ ID NO.6；

所述的PCR扩增体系为20μl，见表2：

表2

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性5min；94℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3min30sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物F1和R1能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为6100bp，与理论值6178bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得含突变酶pelF-th基因的大肠杆菌工程菌。

实施例2

果胶裂解酶pelF-th发酵测试

将实施例1制备的含有果胶裂解酶pelF-th基因的大肠杆菌工程菌、同理制备的含有果胶裂解酶pelF基因的大肠杆菌工程菌，分别接种至LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中220rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀为0.8，再加入IPTG(0.5mM)诱导10h，取样。参考QB/T4482-2013碱性果胶酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度法，在235nm波长测定发酵液中果胶裂解糖酶最适酸碱度，在55℃，pH8.5-12.0的条件下分别处理后，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值；在pH9，45-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理后，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值。

原始酶的最适温度为75℃，见图1，突变酶的最适温度60℃，见图3。另外，与原始酶pelF最适pH为10.0相比，见图2，突变酶的最适pH提高到11，见图4。

重组后的含pelF-th基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶在pH 10～11.5下较稳定，见图5，耐碱性与原始酶pelF相比有一定提高，最适pH值由10.0提高至11.0。原始酶pelF的纯化酶比酶活在最适条件75℃、pH10为36.8U/mg，突变酶pelF-th的纯化酶比酶活在最适条件60℃、pH11为69.84U/mg，相对于原始酶pelF，突变酶pelF-th酶活力有显著提高。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种突变果胶裂解酶及应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgagcgcgt tgaacagtgg aaaagttaat ccgctggcag atttttccct gaagggcttc 60

gccgcattga acggcggtac caccggcggc gagggtggtc agaccgtgac cgtaaccaca 120

ggtgatcaac tgatcgcggc acttaagaat aaaaacgcaa acacgccgct gaagatttac 180

gttaatggta cgattaccac gagcaacacc agcgcgagta agatcgacgt caaggacgtt 240

tctaacgttt ctatcgttgg ttccggcacg aaaggggaac tgaagggtat tggtatcaag 300

atttggcgtg ctaataacat cattattcgt aatctcaaaa tccatgaggt cgcttctggc 360

gacaaggacg ccataggtat cgaggggccg tccaagaaca tttgggttga tcacaacgag 420

ctgtaccatt ctctgaacgt tgataaagac tattatgatg gtctgtttga tgtgaagcgt 480

gatgcggagt atatcacgtt ctcttggaat tacgtgcatg atggctggaa aagcatgctg 540

atgggtagca gcgattctga taactacaac cgtaccatta ccttccacca taactggttc 600

gagaacctga acagccgtgt tccgagcttt cgttttggtg aaggtcacat ttacaataac 660

tactttaaca aaatcattga ttccggcatc aactcccgca tgggcgctcg tatccgcatt 720

gagaataatc tgttcgaaaa tgcgaccaac ccgttaggat tctggcatag cagtcgaaca 780

ggttactggc atgtttccaa caataagttt gttaattctc gcggcagcat gcctactacc 840

agcaccacca cctacaaccc gccatatagc tattccttgg ataacgtgga caacgttaaa 900

tccattgtta aacagaatgc cggagttggc aaaatcaacc cg 942

<210> 2

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly

20 25 30

Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr

50 55 60

Ile Thr Thr Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val

65 70 75 80

Ser Asn Val Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly

85 90 95

Ile Gly Ile Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu

100 105 110

Lys Ile His Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu

115 120 125

Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser

130 135 140

Leu Asn Val Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Asp Ala Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp

165 170 175

Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr

180 185 190

Ile Thr Phe His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro

195 200 205

Ser Phe Arg Phe Gly Glu Gly His Ile Tyr Asn Asn Tyr Phe Asn Lys

210 215 220

Ile Ile Asp Ser Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Arg Ile Arg Ile

225 230 235 240

Glu Asn Asn Leu Phe Glu Asn Ala Thr Asn Pro Leu Gly Phe Trp His

245 250 255

Ser Ser Arg Thr Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn

260 265 270

Ser Arg Gly Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro

275 280 285

Tyr Ser Tyr Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys

290 295 300

Gln Asn Ala Gly Val Gly Lys Ile Asn Pro

305 310

<210> 3

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcgagcgcgt tgaacagtgg aaaagttaat ccgctggcag atttttccct gaagggcttc 60

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ggtgatcaac tgatcgcggc acttaagaat aaaaacgcaa acacgccgct gaagatttac 180

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tctaacgttt ctatcgttgg ttccggcacg aaaggggaac tgaagggtat tggtatcaag 300

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gacaaggacg ccataggtat cgaggggccg tccaagaaca tttgggttga tcacaacgag 420

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atgggtagca gcgattctga taactacaac cgtaccatta ccttccacca taactggttc 600

gagaacctga acagccgtgt tccgagcttt cgttttggtg aaggtcacat ttacaataac 660

tactttaaca aaatcattga ttccggcatc aactcccgca tgggcgctcg tatccgcatt 720

gagaataatc tgttcgaaaa tgcgaaagac ccaatcgttt cttggtattc cagtagcccg 780

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<210> 4

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly

20 25 30

Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys Ile Tyr Val Asn Gly Thr

50 55 60

Ile Thr Thr Ser Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Val Lys Asp Val

65 70 75 80

Ser Asn Val Ser Ile Val Gly Ser Gly Thr Lys Gly Glu Leu Lys Gly

85 90 95

Ile Gly Ile Lys Ile Trp Arg Ala Asn Asn Ile Ile Ile Arg Asn Leu

100 105 110

Lys Ile His Glu Val Ala Ser Gly Asp Lys Asp Ala Ile Gly Ile Glu

115 120 125

Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr His Ser

130 135 140

Leu Asn Val Asp Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Asp Ala Glu Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Gly Trp

165 170 175

Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Asn Tyr Asn Arg Thr

180 185 190

Ile Thr Phe His His Asn Trp Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro

195 200 205

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225 230 235 240

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245 250 255

Ser Ser Ser Pro Gly Tyr Trp His Val Ser Asn Asn Lys Phe Val Asn

260 265 270

Ser Arg Gly Ser Met Pro Thr Thr Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro

275 280 285

Tyr Ser Tyr Ser Leu Asp Asn Val Asp Asn Val Lys Ser Ile Val Lys

290 295 300

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

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actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

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ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

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cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggcgagcg cgttgaacag tggaaaagtt 5100

aatccgctgg cagatttttc cctgaagggc ttcgccgcat tgaacggcgg taccaccggc 5160

ggcgagggtg gtcagaccgt gaccgtaacc acaggtgatc aactgatcgc ggcacttaag 5220

aataaaaacg caaacacgcc gctgaagatt tacgttaatg gtacgattac cacgagcaac 5280

accagcgcga gtaagatcga cgtcaaggac gtttctaacg tttctatcgt tggttccggc 5340

acgaaagggg aactgaaggg tattggtatc aagatttggc gtgctaataa catcattatt 5400

cgtaatctca aaatccatga ggtcgcttct ggcgacaagg acgccatagg tatcgagggg 5460

ccgtccaaga acatttgggt tgatcacaac gagctgtacc attctctgaa cgttgataaa 5520

gactattatg atggtctgtt tgatgtgaag cgtgatgcgg agtatatcac gttctcttgg 5580

aattacgtgc atgatggctg gaaaagcatg ctgatgggta gcagcgattc tgataactac 5640

aaccgtacca ttaccttcca ccataactgg ttcgagaacc tgaacagccg tgttccgagc 5700

tttcgttttg gtgaaggtca catttacaat aactacttta acaaaatcat tgattccggc 5760

atcaactccc gcatgggcgc tcgtatccgc attgagaata atctgttcga aaatgcgaaa 5820

gacccaatcg tttcttggta ttccagtagc ccgggttact ggcatgtttc caacaataag 5880

tttgttaatt ctcgcggcag catgcctact accagcacca ccacctacaa cccgccatat 5940

agctattcct tggataacgt ggacaacgtt aaatccattg ttaaacagaa tgccggagtt 6000

ggcaaaatca acccgctcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgctaacaaa 6060

gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 6120

ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggat 6178

<210> 8

<211> 6178

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggcgagcg cgttgaacag tggaaaagtt 5100

aatccgctgg cagatttttc cctgaagggc ttcgccgcat tgaacggcgg taccaccggc 5160

ggcgagggtg gtcagaccgt gaccgtaacc acaggtgatc aactgatcgc ggcacttaag 5220

aataaaaacg caaacacgcc gctgaagatt tacgttaatg gtacgattac cacgagcaac 5280

accagcgcga gtaagatcga cgtcaaggac gtttctaacg tttctatcgt tggttccggc 5340

acgaaagggg aactgaaggg tattggtatc aagatttggc gtgctaataa catcattatt 5400

cgtaatctca aaatccatga ggtcgcttct ggcgacaagg acgccatagg tatcgagggg 5460

ccgtccaaga acatttgggt tgatcacaac gagctgtacc attctctgaa cgttgataaa 5520

gactattatg atggtctgtt tgatgtgaag cgtgatgcgg agtatatcac gttctcttgg 5580

aattacgtgc atgatggctg gaaaagcatg ctgatgggta gcagcgattc tgataactac 5640

aaccgtacca ttaccttcca ccataactgg ttcgagaacc tgaacagccg tgttccgagc 5700

tttcgttttg gtgaaggtca catttacaat aactacttta acaaaatcat tgattccggc 5760

atcaactccc gcatgggcgc tcgtatccgc attgagaata atctgttcga aaatgcgacc 5820

aacccgttag gattctggca tagcagtcga acaggttact ggcatgtttc caacaataag 5880

tttgttaatt ctcgcggcag catgcctact accagcacca ccacctacaa cccgccatat 5940

agctattcct tggataacgt ggacaacgtt aaatccattg ttaaacagaa tgccggagtt 6000

ggcaaaatca acccgctcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgctaacaaa 6060

gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 6120

ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggat 6178

Claims

1.一种突变果胶裂解酶pelF-th，其编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种突变果胶裂解酶pelF-th，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述突变果胶裂解酶pelF-th。

4.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述突变果胶裂解酶pelF-th。

5.一种含突变果胶裂解酶pelF-th基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)以pET-28a(+)-pelF基因为模板，通过反向PCR扩增pET-28a(+)-pelF-th基因，pelF-th的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，获得重组质粒pET-28a(+)-pelF-th；

6.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中，以pET-28a(+)-pelF基因片段为模板进行反向PCR扩增，扩增引物F1的核苷酸序列为SEQIDNO.5，扩增引物R1的核苷酸序列为SEQIDNO.6。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

8.如权利要求5所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中，筛选阳性克隆的方法为，将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，测序后，保留测序结果正确的菌株作为目的菌株。

9.权利要求4所述重组菌或权利要求5所述的方法制得的大肠杆菌工程菌在生产果胶裂解酶中的应用。