CN113383080A

CN113383080A - 用于增加蛋白质分泌的细菌表达载体

Info

Publication number: CN113383080A
Application number: CN202080009276.XA
Authority: CN
Inventors: S·洛基雷迪
Original assignee: Oncosmis Biotechnology Pte Ltd
Current assignee: Oncosmis Biotechnology Pte Ltd
Priority date: 2019-02-15
Filing date: 2020-02-15
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2040-02-15
Also published as: US20220025383A1; CN113383080B; WO2020165874A1; KR20210125992A; WO2020165874A4; SG11202105519YA; EP3924496A1; JP2022520327A; CA3126796A1; EP3924496A4

Abstract

本发明提供了细菌表达载体(100)，包含与编码重组蛋白(103)的DNA序列串联的分泌信号序列，其中，所述分泌信号序列是包含以下序列的组合：a)至少一个编码选自pelB、ompA、yebF和ompF的基因的信号序列(101)的DNA序列，以及b)至少一个编码载体肽(102)的DNA序列，所述DNA序列选自编码截短的yebF的Seq.ID 5和Seq.ID 6。

Description

用于增加蛋白质分泌的细菌表达载体

技术领域

本发明涉及能够增加周质空间或细胞外的重组蛋白分泌的细菌表达载体。更具体地，本发明涉及用于表达和分泌来自大肠杆菌(Escherichia coli)的重组蛋白的表达载体。

背景技术

重组蛋白在体外和体内的异源表达和纯化代表了现代分子生物学的常规应用。重组蛋白的表达通常在原核宿主细胞中进行，并且微生物大肠杆菌经常被用于与制药和产业工业产业相关的重组蛋白的大规模生产。鉴于此，使用数种已知的方法和机制，已在宿主细胞中进行了相当多的修饰，以提高这些宿主细胞中目的蛋白的产量，从而使其在工业生产中的效用最大化。

工业生产需要大量目的蛋白从宿主细胞中分泌出来，以简化目的蛋白的纯化和下游加工。目前仍在进行一些努力，以通过调整表达的目标细胞来增加大肠杆菌中目标蛋白的胞外产量。一个重要的这种调整是使用选择的分泌信号肽，并且目的蛋白与分泌信号肽共表达，这有助于目的重组蛋白向周质空间或细胞外培养基的转移。

一些现有技术引用提供了用于产生宿主细胞分泌出的目的蛋白的新表达系统：

US5583038A描述了用于表达和分泌蛋白的表达载体，所述蛋白对表达这种蛋白的细菌来说是异源的，其中这种载体还包括至少编码脂蛋白分泌信号的DNA，所述脂蛋白分泌信号被设计成实现脂质酰化和异源蛋白的表面表达。所采用的细菌系统为分枝杆菌特异的，并且所述分泌信号是外表面蛋白A(Outer Surface Protein A)的分枝杆菌脂蛋白分泌信号序列。该表达载体专门设计用于表达和分泌诱导抗体针对伯氏疏螺旋体的抗原，以用于治疗莱姆病；

US5432082A描述了一种用于制备异源蛋白的酵母表达载体，包含指导异源蛋白分泌的合成寡核苷酸，其中该合成寡核苷酸位于诱导型杂合启动子GAL-CYC和多位点多接头之间，接着是酵母的RNA聚合酶识别的转录终止信号；

CN101687910A描述了一种基于哺乳动物细胞的表达和分泌系统。编码信号肽序列的DNA选自：编码氨基酸序列MMRP[疏水性氨基酸]nTSALA的DNA序列，或编码氨基酸序列MKT[疏水性氨基酸]nCATVHC的DNA序列，其中n为4-16之间的整数，疏水性氨基酸为A、I、L、M、F或V；以及

CN107082801A公开了一种能够提高蛋白质分泌效率的pelB信号肽突变体。

尽管通过控制大肠杆菌中的分泌方法已经成功地生产了大量蛋白质，但是由于蛋白质因在细胞质中聚集、细胞溶解、错误折叠、对易位的限制、或蛋白质降解而不能正确输出或者不能以功能状态输出，生产量仍然是一个限制因素。

本发明考虑了现有技术的缺点，并提供了一种用于重组蛋白的胞外分泌的新型细菌表达载体。

发明目的

本发明的主要目的是提供一种携带新型分泌信号序列的细菌表达载体，以引导重组蛋白分泌到细胞外培养基中，其中，分泌信号序列是信号肽的DNA序列和载体蛋白的DNA序列串联的新组合，以及编码重组蛋白的DNA序列可操作地与其连接。

因此，本发明的另一个目的是提供一种用于构建细菌表达载体的新型分泌信号序列，用于增加宿主细胞中重组蛋白的分泌，其中所述分泌信号序列是以下序列的组合：a)至少一个编码选自以下的基因的信号序列的DNA序列：由Seq.ID 1表示的pelB、由Seq.ID 2表示的ompA、由Seq.ID 3表示的yebF和由Seq.ID 4表示的ompF，以及b)编码载体蛋白的DNA序列，优选为编码由Seq.ID 5和Seq.ID 6表示的yebf截短的肽的DNA序列，其中Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变而产生。

本发明的另一个目的是提供一种增加重组蛋白从宿主细胞(更具体地为大肠杆菌)分泌到细胞外培养基中的系统。

发明内容

在本发明的主要实施方案中，本发明提供了新型细菌表达载体，以增加宿主细菌细胞(优选为大肠杆菌E.coli)中重组蛋白的分泌，用于简便高效地纯化重组蛋白。用于增加宿主细菌细胞中重组蛋白分泌的所述细菌表达载体，包含：

至少一个分泌信号序列，

至少一个基因表达盒，包含：至少一个诱导型启动子、RBS、编码所述重组蛋白的DNA序列、编码亲和标签的DNA序列和至少一个基因终止子，所述分泌信号序列可操作地连接到所述基因表达盒，并且所述亲和标签的DNA序列可操作地连接到所述重组蛋白的DNA序列，

至少一个细菌ori基因序列，用于所述宿主细菌细胞中所述载体的复制，以及

至少一个用于编码选择标记的DNA序列，合适的启动子和基因终止子序列位于所述选择标记的DNA序列的两侧。

此外，所述分泌信号序列是以下序列的组合：

a)至少一个编码选自以下的基因的信号肽的DNA序列：由编码氨基酸序列Seq.ID9的Seq.ID 1表示的pelB、由编码氨基酸序列Seq.ID 11的Seq.ID 2表示的信号肽ompA的DNA序列、由编码氨基酸序列Seq.ID 10的Seq.ID 3表示的信号肽yebF的DNA序列和由编码氨基酸序列Seq.ID 12的Seq.ID 4表示的信号肽ompF的DNA序列；以及

b)至少一个编码载体肽的DNA序列，优选为编码截短的yebF的DNA序列，并且所述编码截短的yebF的DNA序列属于由Seq.ID 5和Seq.ID 6组成的组，其中，Seq.ID 5编码由Seq.ID 7表示的截短的yebF；Seq.ID 6编码由Seq.ID 8表示的截短的yebF；并且所述DNA序列Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变而合成，其中，位于Seq.ID 5的第40位的TGC密码子突变为GCG密码子，使由Seq.ID 7表示的氨基酸序列第14位的Cys突变为由Seq.ID 8表示的氨基酸序列第14位的Ala。

由Seq.ID 13表示的细菌表达载体是包含分泌信号序列的6793个碱基对载体，其中，所述分泌信号序列是由Seq.ID 4表示的ompF信号肽的DNA序列和由Seq.ID 6编码的截短的yebF肽的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种新型细菌表达载体，包含至少一个亲和标签序列，所述亲和标签序列可操作地连接到编码重组蛋白的DNA序列，使得重组蛋白能够纯化。

在另一个实施方案中，分泌信号序列与基本载体中的另外的元件(elements)结合使用，所述另外的元件是其发挥载体的作用所必需的，包括至少一个抗生素选择标记和至少一个另外的选择标记；其中，所述选择标记是诱导型lac操纵子，并且载体是lac操纵子下的诱导型载体，并由乳糖或乳糖类似物(包括IPTG)诱导。

附图说明

通过参考附图(附图构成本说明书的一部分)中示出的本发明的具体实施方案，可以更详细地理解本发明的目的，尤其是上面简要概述的本发明的说明。然而，应注意，附图示出了本发明的优选实施方案，因此不应被认为是对本发明范围的限制，因为本发明可以允许其它同等有效的等效实施方案。

图1是新型细菌表达载体的示意图，包含用于增加宿主细胞外目的蛋白质/肽的分泌的分泌信号序列的组合；

图2是pBacSec-LC载体的示意图；

图3是采用高斯荧光素酶测定的Seq.ID 1、Seq.ID 2、Seq.ID 3和Seq.ID 4的比较效率的图示；

图4是含有细菌细胞培养物的裂解物或培养基成分的SDS-PAGE凝胶的图示，所述细菌细胞培养物表达具有包含Seq.ID 4和Seq.ID 6的分泌信号序列的pBacSec-LC载体；

图5是在IPTG诱导的时间点后重组蛋白产量的图示；以及

图6是含有细菌细胞培养物的培养基成分的SDS-PAGE凝胶的图示，所述细菌细胞培养物表达具有分泌信号序列的pBacSec-LC载体，所述分泌信号序列包含在还原或非还原条件下的Seq.ID 4和Seq.ID 5的组合，或Seq.ID 4和Seq.ID 6的组合。

具体实施方式

使用的缩写：

pelB是指：编码果胶酶B的N端氨基酸残基的前导DNA序列

ompA是指：编码外膜蛋白A氨基酸残基的前导DNA序列

ompF是指：编码外膜蛋白F氨基酸残基的前导DNA序列

yebF是指：编码蛋白yebF氨基酸残基的前导DNA序列

Amp^r/Kan^r是指：编码氨苄青霉素/卡那霉素抗性基因的DNA序列

F1 Ori是指：复制的起点

ptac启动子是指：用于结合RNA聚合酶或T7聚合酶的启动子

Lac或Lac1是指：编码lac抑制子/操纵子的DNA序列

IPTG是指：异丙基-β-d-1-硫代半乳糖苷，lac操纵子的诱导物

乳糖是指：二糖和lac操纵子的诱导物

RBS是指：核糖体结合位点

重组蛋白：由在表达载体中克隆并在细菌细胞中表达的基因编码目的蛋白

现在将参考详细说明在下文中说明本发明，详细说明中示出了本发明的一些实施方案但不是全部实施方案。实际上，本发明可以以多种不同的形式实施，并且不应该被解释为限于本文所述的实施方案；相反，提供这些实施方案是为了使本公开满足适用的法律要求。本文采用非限制性实施方案和示例性实验来全面描述本发明。

本发明涉及一种新型细菌表达载体，以增加宿主细菌细胞(优选为大肠杆菌)中重组蛋白的分泌，用于简便高效地纯化重组蛋白。

在主要实施方案中，本发明提供了细菌表达载体(100)，如图1所示，包含与编码重组蛋白(103)的DNA序列串联的分泌信号序列，其中，所述分泌信号序列是包含以下序列的组合：

a)至少一个编码选自以下的基因的信号序列(101)的DNA序列：由编码氨基酸序列Seq.ID 9的Seq.ID 1表示的pelB、由编码氨基酸序列Seq.ID 11的Seq.ID 2表示的ompA、由编码氨基酸序列Seq.ID 10的Seq.ID 3表示的yebF和由编码氨基酸序列Seq.ID 12的Seq.ID 4表示的ompF；以及b)至少一个编码载体肽(102)的DNA序列，优选为由Seq.ID 5和Seq.ID 6表示的编码截短的yebF的DNA序列。

Seq.ID 5编码由Seq.ID 7表示的载体肽(33个氨基酸)；并且Seq.ID 6编码由Seq.ID 8表示的肽；

DNA序列Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变而合成，其中，位于Seq.ID 5的第40位的TGC密码子突变为GCG密码子，使Seq.ID 7第14位的Cys突变为Seq.ID 8第14位的Ala。

表1提供了编码信号序列或载体肽的DNA序列

在另一个实施方案中，细菌表达载体还包含至少一个基因表达盒，该基因表达盒包含至少一个诱导型启动子、RBS、编码所述重组蛋白的DNA序列、编码亲和标签的DNA序列和至少一个基因终止子，所述分泌信号序列可操作地连接到所述基因表达盒，并且所述亲和标签的DNA序列可操作地连接到所述重组蛋白的DNA序列。所述细菌表达载体还包含至少一个多克隆位点(MSC)，使得能够在启动子下克隆重组蛋白的DNA序列。

在另一个实施方案中，所述细菌表达载体还包含至少一个抗生素抗性基因和至少一个另外的选择标记，均由各自的基因启动子控制。

在另一个实施方案中，所述细菌表达载体包含至少一个能够使表达载体在宿主细胞中复制的ori序列。

在另一个实施方案中，所述细菌表达载体(pBacSec-LC)，该载体在lac操纵子下是可诱导，并且由乳糖或乳糖类似物(包括IPTG)诱导。如图2所示，新型细菌表达载体(pBacSec-LC)具有约6793个碱基对，包含用于增加与分泌信号序列串联的重组蛋白的有效分泌的分泌信号序列。pBacSec-LC载体包含：

tac启动子和作为诱导型启动子的lac操作子；

RBS；

分泌信号序列，其为选自Seq.ID 1-4表示的DNA序列的基因的信号序列和由Seq.ID 5或Seq.ID 6表示的DNA序列的组合；

编码作为亲和标签的6-His标签和FLAG标签的DNA序列；

编码重组蛋白的DNA序列；

用于重组蛋白转录终止的基因终止子；

能够使载体在大肠杆菌中复制的ori序列；

作为用于蓝-白重组菌落筛选的选择标记的lac操纵子，以及

作为抗生素选择标记的卡那霉素抗性基因。

由Seq.ID 13表示的pBacSec-LC载体包含分泌信号序列，所述分泌信号序列为编码由Seq.ID 4表示的基因ompF的信号序列的DNA序列和编码由Seq.ID 6表示的截短的yebF的DNA序列的组合。

实施例1

不同组合的信号序列与载体肽的分泌效率

A.荧光素酶测定：

使用大肠杆菌菌株NEB 5-α和BL21(DE3)进行转化和荧光素酶测定。

不同组合的分泌信号按如下进行构建：

a)Seq.ID 1的信号序列和由Seq.ID 5表示的载体蛋白，

b)Seq.ID 2的信号序列和由Seq.ID 5表示的载体蛋白，

c)Seq.ID 3的信号序列和由Seq.ID 5表示的载体蛋白，

d)Seq.ID 4的信号序列和由Seq.ID 5表示的载体蛋白。

高斯荧光素酶被用作检测大肠杆菌分泌活性的报告系统。高斯荧光素酶测定使用Pierce高斯荧光素酶闪光测定试剂盒进行。诱导后以指定的时间间隔从培养物中收集培养基，并按照制造商的方法所述从培养基中测量荧光素酶活性。

如图3所示，在每个信号肽与Seq ID 5的组合显示的分泌中，Seq.ID 4表示的ompF的信号肽与载体蛋白Seq.ID 5的组合显示出较好的分泌效率。

B.5kDa-20kDa范围的肽的分泌效率

ⅰ.表达载体的构建：将编码5kDa、10kDa、15kDa和20kDa肽的重组蛋白的DNA序列克隆到具有分泌信号序列的pBacSec-LC载体中，所述分泌信号序列包含Seq.ID 4和Seq.ID6。

ⅱ.起始培养物的制备：将pH6.90的3ml高压灭菌生长培养基放入无菌弹扣盖(snap cap)管中。从Luria-Bertani琼脂平板上挑选单个CFU，无菌接种到生长培养基中，并在旋转式培养箱中于37℃以225rpm培养过夜。

ⅲ.摇瓶培养：将1ml过夜的起始培养物接种到250ml三角烧瓶中pH6.90的25ml培养基(1：25的稀释度)中。烧瓶在保持在37℃、225rpm的旋转式摇床培养箱中培养。4小时培养后，OD600达到约1.8至2.0。用0.2mM的异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和lac操纵子诱导物诱导细胞。在诱导后加入补充剂如甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、还原型谷胱甘肽。诱导后每小时采集样本，即300μL培养物，以14K rpm离心3分钟，分离细胞和培养基以检测蛋白质的表达和分泌。将细胞裂解以形成裂解物。比较细胞裂解物和培养基成分中重组肽的存在情况。

ⅳ.SDS-PAGE：使用SDS-PAGE分析诱导后培养基中目的重组蛋白的异源基因表达。

如图4所示，发现培养基成分中出现的大小为5kDa-20kDa的重组肽比细胞裂解物中出现的更多，清楚地表明重组肽的分泌。并且所有5kDa-20kDa范围的多肽以相似的效率同样地分泌，表明该分泌序列能够分泌5kDa-20kDa范围的多肽。

C.重组蛋白的产量

将重组蛋白的DNA序列克隆到pBacSec-LC载体(Seq.ID 13)，并在大肠杆菌中转化。制备大肠杆菌起始培养物，并随后如前面实施例1的B部分所述进一步扩大起始培养物。用0.2mM IPTG诱导大肠杆菌培养物进行重组蛋白表达，并在IPTG诱导的不同时间间隔后测定重组蛋白的分泌量。

如图5所示，诱导1小时后重组蛋白的产量为约0.5g/L，并且诱导6小时后重组蛋白的产量超过5g/L。重组蛋白的产量在每小时诱导后持续增加。这表明细菌分泌技术能够使细胞在达到所需的细胞密度后，将最大限度的资源用于蛋白质表达并在诱导下分泌。在诱导第1小时后，重组蛋白被分泌到培养基中，而不会阻碍细胞增殖机制。

实施例2

与Seq.ID 5相比，Seq.ID 6的分泌效率

将重组蛋白的DNA序列克隆到具有分泌信号序列的pBacSec-LC载体中，所述分泌信号序列包含下列的组合：Seq.ID 4和Seq.ID 5，或Seq.ID 4和Seq.ID 6。

Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变而合成，其中，位于Seq.ID 5的第40位的TGC密码子突变为Seq.ID 6的GCG密码子，使由Seq.ID 7第14位的Cys突变为由Seq.ID 8第14位的Ala。肽第14位的Cys残基使二聚化成为可能，并增加了形成包含体的机会。Cys突变为Ala，消除了肽的二聚化的性质，从而减少了形成包含体的机会，这反过来又会增强肽和重组肽的分泌。

用各自的载体转化大肠杆菌细胞，并在还原条件和非还原条件下制备两组培养物，并使用IPTG诱导肽分泌。

如图6所示，与非还原条件相比，在还原条件下Seq.ID 5显示出更多的分泌，这解释了由于编码肽第14位的Cys残基的二聚化导致了包含体的形成，而在还原条件下包含体减少。因此，第14位的Cys突变为Ala必然对分泌很重要，并且因此Seq.ID 6在还原条件和非还原条件下显示出相同的结果。

虽然已在附图中描述并示出了某些示例性实施方案，但是应当理解，这些实施方案仅是对宽范围的发明的说明，而不是限制，并且本发明不限于所示出和描述的具体结构和布置，因为除了以上段落中阐述的那些之外，多种其他变化、组合、省略、修改和替换都是可能的。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对刚刚描述的实施方案进行多种适应和修改。

序列表

<110> 昂科斯密斯生物技术私人有限公司

<120> 用于增加蛋白质分泌的细菌表达载体

<130> Sudharshan Vector

<150> 201941005938

<151> 2019-02-15

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgaaatacc tgttacctac cgcggctgcg gggctgctgc tgttagcagc tcagccggca 60

atggct 66

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

atgaagaaga ccgcgattgc gattgcggtg gcgctggcgg gttttgcgac cgtggcgcag 60

gcg 63

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 3

atgaaaaagc gtggtgcgtt cctgggcctg ctgctggtta gcgcgtgcgc gagcgtgttt 60

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<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 4

atgatgaagc gcaatattct ggcagtgatc gtccctgctc tgttagtagc aggtactgca 60

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<210> 5

<211> 99

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 5

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<210> 6

<211> 99

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 6

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ggtattgcgg cgagcgttaa acgtgactac cagcaaaac 99

<210> 7

<211> 33

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 7

Ala Asn Asn Glu Thr Ser Lys Ser Val Thr Phe Pro Lys Cys Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Val Lys Arg Asp Tyr Gln Gln

20 25 30

Asn

<210> 8

<211> 33

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 8

Ala Asn Asn Glu Thr Ser Lys Ser Val Thr Phe Pro Lys Ala Glu Asp

1 5 10 15

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Val Lys Arg Asp Tyr Gln Gln

20 25 30

Asn

<210> 9

<211> 22

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 9

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala

20

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 10

Met Lys Lys Arg Gly Ala Phe Leu Gly Leu Leu Leu Val Ser Ala Cys

1 5 10 15

Ala Ser Val Phe Ala

20

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala

20

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 12

Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val

1 5 10 15

Ala Gly Thr Ala Asn Ala

20

<210> 13

<211> 6793

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 细菌表达载体: pBacSec-LC

<400> 13

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

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gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

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ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

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tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

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gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

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gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatcta tacgaaacgg 4980

gaatgcggta attacgcttt gtttttataa gtcagatttt aatttttatt ggttaacata 5040

acgaaaggta aaatacataa ggcttactaa aagccagata acagtatgcg tatttgcgcg 5100

ctgatttttg cggtataaga atatatactg atatgtatac ccgaagtatg tcaaaaagag 5160

gtgtgctatg aagcagcgta ttacagtgac agttgacagc gacagctatc agttgctcaa 5220

ggcatatgat gtcaatatct ccggtctggt aagcacaacc atgcagaatg aagcccgtcg 5280

tctgcgtgcc gaacgctgga aagcggaaaa tcaggaaggg atggctgagg tcgcccggtt 5340

tattgaaatg aacggctctt ttgctgacga gaacagggac tggtgaaatg cagtttaagg 5400

tttacaccta taaaagagag agccgttatc gtctgtttgt ggatgtacag agtgatatta 5460

ttgacacgcc cgggcgacgg atggtgatcc ccctggccag tgcacgtctg ctgtcagata 5520

aagtctcccg tgaactttac ccggtggtgc atatcgggga tgaaagctgg cgcatgatga 5580

ccaccgatat ggccagtgtg ccggtctccg ttatcgggga agaagtggct gatctcagcc 5640

accgcgaaaa tgacatcaaa aacgccatta acctgatgtt ctggggaata taaatgtcag 5700

gctccgttat acacagccag tctgcagcga tcccgcgaaa tttgacaatt aatcatcggc 5760

tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta 5820

actttaagaa ggagatatac atatgatgaa acgtaatatc ctggcggtga ttgttccggc 5880

gctgctggtt gcgggcaccg cgaatgcggc gaataatgag accagcaaaa gcgtgacctt 5940

tccgaaggcg gaggacctgg atgcggcggg tattgcggcg agcgttaaac gtgactacca 6000

gcaaaacggt ggcagcggtg gcagcggtag ccaccatcat catcaccaca gcagcggtgg 6060

cagcggtacc gactataagg acgatgacga taaacacgcg gaaggcacct ttaccagcga 6120

tgtgagcagc tacctggagg gtcaagcggc gaaggagttc attgcgtggc tggtgcgtgg 6180

tcgtggctaa tagtgagcgg ccgcggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg 6240

atacagatta aatcagaacg cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt 6300

agcgcggtgg tcccacctga ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat 6360

ggtagtgtgg ggtctcccca tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa 6420

ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct 6480

gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg 6540

gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac 6600

ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct ctcgagcacc accaccacca ccactgagat 6660

ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa 6720

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct gaaaggagga 6780

actatatccg gat 6793

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于增加宿主细菌细胞优选大肠杆菌中重组蛋白的分泌的乳糖或乳糖类似物诱导型细菌表达载体，所述细菌表达载体包含：

至少一个分泌信号序列；

至少一个基因表达盒，包含：至少一个诱导型启动子、RBS、编码所述重组蛋白的DNA序列、编码亲和标签的DNA序列和至少一个基因终止子，所述分泌信号序列可操作地连接到所述基因表达盒，并且所述亲和标签的DNA序列可操作地连接到所述重组蛋白的DNA序列；

至少一个细菌ori基因序列，用于所述宿主细菌细胞中所述载体的复制；以及

用于编码选择标记的DNA序列，包含至少一个抗生素抗性基因序列，具有合适的启动子和基因终止子序列位于所述选择标记的DNA序列的两侧，

其中，

所述分泌信号序列是以下序列的组合：a)至少一个编码选自pelB、ompA、yebF和ompF的基因的信号序列的DNA序列，以及b)至少一个编码载体肽的DNA序列，优选为编码截短的yebF的DNA序列；

所述编码截短的yebF的DNA序列属于由Seq.ID 5和Seq.ID 6组成的组；

Seq.ID 5编码由Seq.ID 7表示的截短的yebF；

Seq.ID 6编码由Seq.ID 8表示的截短的yebF；以及

所述DNA序列Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变合成，其中，位于Seq.ID 5的第40位的TGC密码子突变为GCG密码子，使由Seq.ID 7表示的氨基酸序列第14位的Cys突变为由Seq.ID 8表示的氨基酸序列第14位的Ala。

2.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，编码信号序列的DNA序列选自Seq.ID 1、Seq.ID 2、Seq.ID 3和Seq.ID 4表示的DNA序列。

3.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，信号肽pelB的DNA序列由编码氨基酸序列Seq.ID 9的Seq.ID 1表示，信号肽ompA的DNA序列由编码氨基酸序列Seq.ID 11的Seq.ID2表示，信号肽yebFis的DNA序列由编码氨基酸序列Seq.ID 10的Seq.ID 3表示，以及信号肽ompF的DNA序列由编码氨基酸序列Seq.ID 12的Seq.ID 4表示。

4.一种用于增加宿主细菌细胞优选大肠杆菌中重组蛋白的分泌的乳糖或乳糖类似物诱导型细菌表达载体，所述细菌表达载体包含分泌信号序列，

其中，

所述分泌信号序列是是由Seq.ID 4表示的ompF信号肽的DNA序列和由Seq.ID 6编码的截短的yebF肽的组合；

所述细菌表达载体由6793个碱基对的Seq.ID 13表示；以及

所述Seq.ID 13的细菌表达载体提供了约0.5g/L至约5g/L范围的重组蛋白产量。

Claims

1.一种用于增加宿主细菌细胞优选为大肠杆菌中重组蛋白的分泌的细菌表达载体，，所述细菌表达载体包含：

至少一个分泌信号序列；

至少一个用于编码选择标记的DNA序列，具有合适的启动子和基因终止子序列位于所述选择标记的DNA序列的两侧，

其中，

Seq.ID 5编码由Seq.ID 7表示的截短的yebF；

Seq.ID 6编码由Seq.ID 8表示的截短的yebF；

所述DNA序列Seq.ID 6通过对Seq.ID 5进行突变而合成，其中，位于Seq.ID 5的第40位的TGC密码子突变为GCG密码子，使由Seq.ID 7表示的氨基酸序列第14位的Cys突变为由Seq.ID 8表示的氨基酸序列第14位的Ala；以及

用于增加重组蛋白分泌的所述细菌表达载体是由Seq.ID 13表示的6793个碱基对的载体。

4.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，所述选择标记包含至少一个抗生素抗性基因序列，以及包括lac操纵子的另外的选择标记。

5.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，所述载体是lac操纵子下的诱导型载体，并且由乳糖或乳糖类似物诱导，所述乳糖类似物包括IPTG。

6.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，所述细菌是大肠杆菌。

7.根据权利要求1所述的细菌表达载体，其中，所述重组蛋白的产量为约0.5g/L至约5g/L的范围。