CN104126003A

CN104126003A - 重组大肠杆菌菌株

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Publication number: CN104126003A
Application number: CN201380009844.6A
Authority: CN
Inventors: 托比亚斯·奥尔施拉格尔; E·J·徐; 简·韦坎普; 爱德华·F·施坦格; 乌尔里希·索南伯恩; 于尔根·马林卡; 汉斯·普罗珀特
Original assignee: Pharma Zentrale GmbH
Current assignee: Pharma Zentrale GmbH
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2013-02-14
Publication date: 2014-10-29
Also published as: US20160015781A1; AU2013220738A9; WO2013120618A1; AU2013220738A1; EP2628793A1; CA2864870A1; IN2014DN06920A; EA201491513A1; HK1199060A1

Abstract

本发明涉及一种利用编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸转化的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞。本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述细胞以及可药用的载体，本发明还涉及制备重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞的方法、及其在治疗克罗恩氏病中的应用。

Description

重组大肠杆菌菌株

技术领域

本发明涉及一种利用编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸转化的重组大肠杆菌(E.coli)菌株Nissle1917(EcN)细胞。本发明还涉及一种药物组合物，其包含所述细胞以及可药用的载体，本发明还涉及制备重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞的方法、及其在治疗克罗恩氏病中的应用。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)菌株Nissle1917(EcN)是研究得最为彻底的益生菌菌株之一，并且其为微生物药物(Ardeypharm GmbH公司，赫尔德克，德国)的活性成分。所述益生菌药物在许多欧洲国家被成功用于治疗各种消化道疾病，包括急性和长期腹泻、无并发症憩室病(uncomplicated diverticular disease)以及炎症性肠病(IBD)。其特别地用于缓解患有溃疡性结肠炎(UC)的患者的症状的维持治疗。对于溃疡性结肠炎，认为EcN的主要作用机制之一在于诱导肠上皮细胞中的防卫素合成。EcN在UC治疗中的临床疗效背后的分子机制可能在于，由于NF-kB-依赖性信号通路和AP-1-依赖性信号通路的诱导，鞭毛蛋白介导增强了人β-防卫素2(HBD2)的产生。

另一方面，除了小规模临床试验，EcN尚未显示出在克罗恩氏病(CD)患者中的普遍有效性。其原因在于抗菌肽(特别是防卫素)在CD患者的消化道中的量低，这似乎是由于防卫素合成的原始缺陷。据报道，NOD2(核苷酸结合寡聚化结构域2)基因(细菌胞壁酰二肽的胞内受体)中的突变与回肠克罗恩氏病明显相关。Wehkamp及其同事也发现，与携带野生型的NOD2相比，携带NOD2突变的患有克罗恩氏病的患者中的α-防卫素转录本显著降低(Wehkamp等，2004b，Wehkamp等，2005)。此外，Wehkamp的研究组表明，与结肠克罗恩氏病患者和溃疡性结肠炎患者相比，TCF4(一种已知的对帕内特(Paneth)细胞分化和α-防卫素表达的调节子)在回肠克罗恩氏病患者中的表达降低(van Es等，2005；Wehkamp等，2007)。此外，与对照相比，在结肠CD中，HBD2基因拷贝数变为较低的数目(3vs.4)(Fellermann等，2006)。

防卫素是富含阳离子、精氨酸的大小在3.5至4kDa的小肽，其由6个半胱氨酸构成三个二硫桥。它们表现出针对细菌、真菌和一些包膜病毒的广谱抗菌活性，并且还可以作为趋化因子。它们的抗菌作用的机制在于，阳离子防卫素附着在带负电的细菌细胞表面，导致对质膜的溶膜破坏。根据分子内的3个二硫桥的位置，防卫素分为α-或β-防卫素。在人体内已经鉴定了6种α-防卫素(HNP1-4、HD5和HD6)以及6种β-防卫素(HBD1-6)。人α-防卫素通过在嗜中性粒细胞(granulocytic neutrophil)和帕内特细胞群体中的表达和释放从而在整个小肠及其周边提供抗菌宿主防御。人α-防卫素被合成为较大的无活性的前肽(pro-peptide)分子，并经翻译后加工得到成熟的活性肽。人α-防卫素5(HD5)首先在肠帕内特细胞中表达为无活性的前肽。然后被储存在帕内特细胞颗粒中的胰蛋白酶切割成有活性的成熟HD5。人β-防卫素由作为先天性免疫应答和适应性免疫应答的一部分的上皮细胞产生。与人α-防卫素相反，人β-防卫素不以前体形式表达。HBD2的合成是在皮肤以及泌尿、胃肠和呼吸道上皮细胞中，通过接触微生物或细胞因子(诸如TNF-α和IL-1β)而刺激上皮细胞来诱导的。

通过重组DNA方法，已经在大肠杆菌(E.coli)中成功地合成了小的阳离子抗菌肽。然而，使用大肠杆菌(E.coli)作为表达阳离子抗菌肽的宿主细胞存在一些缺陷，例如产物的宿主杀伤活性、以及其对蛋白水解降解的敏感性。靶蛋白与伴侣的融合表达能减轻这些问题。然而，这引起另一个问题：大多数融合产物是无活性的、或者以不可溶的形式产生。据报道，硫氧还蛋白(TrxA)的融合表达系统导致可溶性产物的产量增加。这也见于HBD2和HBD3。如上所述，由于防卫素合成的原始缺陷，CD患者的消化道具有少量的抗菌肽，特别是防卫素。

因此，本发明的一个目的在于提供一种新的治疗体系，其使得可方便地在体内应用表达防卫素的生理可接受的细胞。本发明的另一个目的在于提供一种治疗方法，其能够克服患者的内源防卫素合成的生理缺陷，从而为患有克罗恩氏病的患者提供有效的治疗。本发明的另一个目的在于提供一种重组大肠杆菌(E.coli)细胞，其包含编码防卫素蛋白的核酸，并且能够将防卫素蛋白运送至人身体中的目的位点。本发明的另一个目的在于提供一种能够抵抗防卫素蛋白的宿主杀伤活性的宿主细胞。

发明内容

这些目的是通过根据本发明的转化有编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞来实现的。发明人成功的构建了产生和分泌防卫素的益生EcN细菌，以用于补充人类患者中内源防卫素合成的缺乏。

发明人出乎意料地发现，大肠杆菌(E.coli)菌株Nissle1917可表达治疗合适量的重组防卫素，而不会受到防卫素蛋白的宿主杀伤活性的影响。

因此，提供了一种新的药物组合物，其包含编码防卫素蛋白或其衍生物的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞，并且提供了该药物组合物在治疗克罗恩氏病中的应用。

本发明还涉及制备所述重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞的方法，所述方法包括以下步骤：提供编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸以及大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞；以及用所述核酸转化所述细胞，其中所述经转化的大肠杆菌Nissle1917细胞能够表达防卫素蛋白或其衍生物。

发明详述

根据第一个方面，本发明涉及用编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸转化的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞。

在本发明的上下文中，术语“核酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列的杂聚物。术语“核酸”包括RNA以及DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)的核酸等。

如本文所用，术语“衍生物”是指编码防卫素蛋白的核酸衍生物，其与原始防卫素核酸序列相比，包含一个或多个替换、插入和/或缺失。优选地，这些衍生物在所述核酸序列的5'-端或3'-端或内部缺失1个、2个、3个、4个或多个核苷酸，或者这些核苷酸被其它核苷酸替换。

术语衍生物特别地包含这样的核酸，其大体上与编码防卫素的原始核酸相同，但显示出与编码防卫素的原始序列有至少约80％、更通常为至少约90％或95％的序列同一性。

特别地，认为蛋白质的变体(例如在序列中缺失、插入和/或替换，其导致所谓的“沉默”改变)属于本发明的一部分。例如，认为核酸序列中的这些改变被会引起相应氨基酸的替换。优选地，所述氨基酸的替换是这样的替换的结果：用具有相似结构和/或化学性质的相似氨基酸来替换氨基酸，即保守性氨基酸替换。

可以基于有关残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性性质方面的相似性来进行氨基酸的替换。疏水性氨基酸的例子为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性、中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

“插入”或“缺失”通常在1至5个氨基酸范围内。改变的允许的程度可以通过利用重组DNA方法系统地在蛋白质分子中进行氨基酸的插入、缺失或替换来实验地确定。可以检测所得变体的生物学活性。

影响蛋白质的N端和C端部分的核苷酸的改变通常不会改变蛋白质的活性，这是由于这些部分通常不涉及生物学活性。在重组制备蛋白质时，由于半胱氨酸会导致形成不期望的多聚体，因此希望去除序列中的一个或多个半胱氨酸。多聚体会使纯化步骤变得复杂。所建议的改变均在本领域现状的范围内，并且可保留所编码的产物的生物学活性。

在本文中，防卫素蛋白质的“生物学活性”特别是指它们针对细菌、真菌和一些包膜病毒的抗菌活性。还应注意的是，无论本发明何时提到防卫素蛋白的“衍生物”，该蛋白是指具有与原始防卫素蛋白相当的生物学功能的蛋白质，所述生物学功能即抗菌作用、以及在治疗克罗恩氏病中的有用性，即补充所缺乏的内源防卫素合成。

在一个优选的实施方案中，本发明的重组大肠杆菌(E.coli)细胞转化有编码选自人α-或β-防卫素中的防卫素蛋白的核酸。这些防卫素蛋白更优选选自人α-防卫素HNP1-4、人α-防卫素5(HD5)、人α-防卫素6(HD6)、以及人β-防卫素1-6(HBD1-6)，或选自所述蛋白的各自的成熟型。

术语“所述蛋白的成熟型”是指人α-防卫素以前体形式表达然后经切割而得到的有活性的成熟型α-防卫素。人β-防卫素不以前体形式表达。

上文所描述的人α-和β-防卫素的序列之前已经被公布，并且在(例如)以下数据库中公开：

人防卫素序列

人α-防卫素

人α-防卫素1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004084.3

人α-防卫素3

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005217.3

人α-防卫素4

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001925.l

人α-防卫素5

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_021010.1

人α-防卫素6

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001926.3

人β-防卫素

人β-防卫素1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_005218.3

人β-防卫素2

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/af040153

人β-防卫素3

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF301470.l

人β-防卫素4

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BC093983.l

人β-防卫素5

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB089180.1

人β-防卫素6

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB089181.1

在又一个优选的实施方案中，根据本发明，防卫素蛋白或其衍生物表达为融合蛋白，优选为与HIS-标签融合的或与大肠杆菌(E.coli)YEBF蛋白融合的融合蛋白。大肠杆菌(E.coli)蛋白YEBF(10.8kDa)是分泌到胞外介质中的可溶性内源性蛋白，并且过去被用作用于基因改造蛋白的载体。与YEBF的羧基末端相连的乘客蛋白(如防卫素)被相应的重组大肠杆菌(E.coli)菌株有效地分泌。也就是说，防卫素与YEBF的融合蛋白可从大肠杆菌(E.coli)细胞中有效地分泌出来，从而与从表达纯的形式的防卫素蛋白的大肠杆菌(E.coli)中分泌相比，得到了量更高的分泌的防卫素。

在又一个实施方案中，编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸经密码子优化而适合在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达。密码子优化是通过提高目的基因的翻译效率而用于改善蛋白质在活的生物体中的表达的技术。特别地，已知密码子优化可以提高大肠杆菌细胞中人类基因(如防卫素)的表达。因此，通过使用用于基因表达的最常用的宿主密码子来优化表达效率。适合在大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞中表达的编码防卫素蛋白的核酸的优选例子为根据序列ID NO：1、2和3的那些。SEQ ID NO:1为未经优化的原始HBD2cDNA，而SEQ ID NO:2和3被优化为hHBD2和nHBD2序列。对于在大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞中的表达，最优选为SEQ ID NO:2和3。

在又一个实施方案中，编码所述防卫素蛋白或其衍生物的核酸是表达载体的一部分，该表达载体还包含一条或多条调控序列。已知许多载体适用于转化细菌细胞：例如，质粒和噬菌体(如噬菌体λ)常常用作细菌宿主的载体。

在一个优选的实施方案中，表达载体为质粒，并且所述调控序列包含T7RNA聚合酶启动子。

在又一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上所述的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞和可药用的载体。

因此，本发明的活性成分优选与可药用的载体或载体材料以一定剂量混合而用于这样的药物组合物中，该药物组合物可治疗或至少减轻疾病。所述组合物可以(除了活性成分和载体以外)包含本领域已知的填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它材料。

术语“可药用的”是指无毒材料，其不影响活性成分的生物学活性的效果。根据应用选择载体。

药物组合物可包含能够增强活性成分的活性或增补治疗的其它成分。这些其它成分和/或因子可以为药物组合物的一部分，从而实现协同效果或者使不利的或不期望的效果最小化。

本发明的化合物的配制或制备以及应用/施药的常规技术可见于“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack出版公司,Easton,PA，最新版。

例如，本发明的经转化的大肠杆菌(E.coli)细胞可以口服给药，例如封装在硬质明胶胶囊中给药。该胶囊可包含大约2.5-25x10⁹活的大肠杆菌细胞作为单剂量。其它成分可选自常规助剂，如麦芽糖糊精、滑石、L100、聚乙二醇(4000)、柠檬酸三乙酯、甘油(仅列出一些)。

在又一个方面，本发明涉及如上所述的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞在治疗克罗恩氏病中的应用。

本发明的又一个方面为制备重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞的方法，包括以下步骤：提供编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸以及大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞，以及用所述核酸转化所述细胞，其中所述经转化的大肠杆菌(E.coli)Nissle1917细胞能够表达防卫素蛋白或其衍生物。

优选地，将核酸克隆到表达载体中，并通过电穿孔引入细胞中。如上所述，防卫素蛋白或其衍生物被表达为与N端组氨酸标签融合的融合蛋白，和/或与大肠杆菌(E.coli)YebF蛋白融合的融合蛋白。

除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有与本发明所属技术领域的技术人员所公知的相同的含义。本文提到的所有出版物通过引用将其全部内容并入本文中。在有冲突的情况下(包括定义)，以本说明书为准。另外，所用的材料、方法和例子仅用于说明而不用于限制本发明。

以下通过附图进一步说明本发明。

附图说明

图1：(A)HBD2的原始cDNA序列和修饰的序列之间的比较，以及(B)HD5的原始cDNA序列和修饰的序列之间的比较，第1行：cDNA原始序列，(A)HBD2基因(GeneBank登录号No AF040153)序列，(B)HD5基因(GeneBank登录号No M97925)序列；(A)的第2行：shHBD2的经优化的序列；(A)的第3行：nHBD2基因(EMBLHE583189)的经优化的序列；(A)的第4行：HBD2的相应氨基酸序列；(B)的第2行：nHD5基因(EMBL HE583188)；(B)的第3行：HD5的相应氨基酸序列。

图2：表达载体pET-28a(+)。(A)含有编码所示蛋白的基因(A中的空心箭头)的载体pET-28a(+)的物理图谱。(B)由载体pET-28a(+)编码的蛋白的示意性组成。

图3：表达质粒pEAS101。(A)编码融合基因的重组质粒pEAS101的物理图谱，所述融合基因包含含有组氨酸标签的融合伴侣和nHBD2-基因。(B)融合蛋白HisHBD2的示意性组成。

图4：表达质粒pEAS102。(A)含有融合基因的重组质粒pEAS102的物理图谱，所述融合基因包含含有组氨酸标签的融合伴侣和编码成熟型HBD2的那部分nHBD2-基因。(B)融合蛋白HisMHBD2的示意性组成。

图5：表达质粒pEAS103。(A)含有融合基因的重组质粒pEAS103的物理图谱，所述融合基因包含具有组氨酸标签的融合伴侣和nHD5基因。(B)融合蛋白HisHD5的组成的物理图谱。

图6：表达质粒pEAS104。(A)编码融合基因的重组质粒pEAS104的物理图谱，所述融合基因包含编码组氨酸标签的融合伴侣和编码成熟HD5的那部分nHD5基因。(B)融合蛋白HisMHD5及其构成部分。

图7：(A)在20℃下诱导表达6小时后，用抗HBD2兔多克隆抗血清进行全细胞蛋白的蛋白质印迹(Western blot)分析(样品是经离心和细胞密度调节(每个泳道上样1.5x10⁸cfu细胞)的全细胞蛋白质团)。第1泳道：EcN100，第2泳道：EcN101。(B)在20℃下诱导表达6小时后，用抗HBD2兔多克隆抗血清对在EcN101中表达的可溶和不可溶形式的HisHBD2进行蛋白质印迹分析(将样品调节至细菌细胞数(1.5x10⁸cfu)。第1泳道：细胞裂解并离心过滤后得到的全细胞蛋白上清液(即可溶蛋白组分)；第2泳道：细胞裂解和离心后得到的全细胞蛋白质团(即不可溶蛋白组分)。

图8：(A)在37℃下诱导表达后，用抗HBD2兔多克隆抗血清进行全细胞蛋白的蛋白质印迹分析(样品经调节至细菌细胞数(1.5x10⁸cfu))。第1泳道：EcN100，离心后全细胞蛋白质团；第2泳道：EcN100，离心和过滤后不含细胞的培养基；第3泳道：EcN102，离心后全细胞蛋白质团；第4泳道：EcN102，离心和过滤后不含细胞的培养基；第5泳道：阳性对照(市售HBD2，1μg)。(B)在37℃下诱导表达2小时后，用抗HBD2兔多克隆抗血清对在EcN102中表达的可溶和不可溶形式的HisMHBD2进行蛋白质印迹分析(样品经调节至细菌细胞数(1.5x10⁸cfu))。第1泳道：细胞裂解并离心过滤后得到的全细胞蛋白上清；第2泳道：细胞裂解和离心后得到的全细胞蛋白质团。

图9：(A)SDS-PAGE后的银染凝胶(示出的框表示表达的HisHD5)，以及(B)在37℃下诱导表达4小时后，用抗HD5兔多克隆抗血清进行全细胞蛋白的蛋白质印迹分析(样品为离心后的全细胞蛋白质团，每个泳道上样相等的光学密度(相当于1.5x10⁸cfu))。第1泳道：EcN1219，第2泳道：EcN100，第3泳道：EcN103，第4泳道：EcNc1219，第5泳道：EcNc100，第6泳道：EcNc103，第7泳道：阳性对照(市售HD5，1μg)。(C)在37℃下诱导表达4小时后，用抗HD5兔多克隆抗血清对在EcN103中表达的可溶和不可溶形式的HisHD5进行蛋白质印迹分析(样品经调节至细菌细胞数(1.5x10⁸cfu))。第1泳道：细胞裂解并离心过滤后得到的全细胞蛋白上清液(即可溶蛋白组分)；第2泳道：细胞裂解和离心后得到的全细胞蛋白质团(即不可溶蛋白组分)。

图10：在37℃下诱导之后，用抗HD5兔多克隆抗血清进行全细胞蛋白的蛋白质印迹分析(样品经调节至细菌细胞数(1.5x10⁸cfu))。第1泳道：EcN100，离心后全细胞蛋白质团；第2泳道：EcN100，离心和过滤后不含细胞的培养基；第3泳道：EcN104，离心后全细胞蛋白质团；第4泳道：EcN104，离心和过滤后不含细胞的培养基。

图11：HisMHBD2针对以下细菌的抗菌活性：(A)大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655，(B)鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovarTyphimurium)SL1344，以及(C)单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)EGD。1：阴性对照(EcN100)，从镍柱洗脱的部分0.03，4μg；2：含有HisHBD2的洗脱的蛋白质(EcN102)，从镍柱洗脱的部分0.03，4μg；3：阳性对照，市售HBD2，1μg；线段表示孔直径5mm。进行三次重复试验，并示出平均值和标准偏差。

图12：所构建的融合基因和相应的融合蛋白YebFMHBD2的DNA和氨基酸序列；第1行：yebFMHBD2基因的cDNA序列；第2行：相应的YebFMHBD2的氨基酸序列。

图13：表达质粒pEAS105。(A)含有yebF基因的质粒pEAS105的物理图谱。(B)相应蛋白YebF的示意图。

图14：表达质粒pEAS106。(A)编码融合基因的重组质粒pEAS106的物理图谱，所述融合基因包含融合伴侣、yebF和nMHBD2基因。(B)融合蛋白YebFMHBD2的示意性组成。

图15：对重组菌株EcN105和EcN106的胞内和分泌的多肽的分析(样品经调节至细菌细胞数(1.1x10⁸cfu))。第1泳道：EcN105，细胞蛋白(离心后的小团)；第2泳道：EcN105，不含细胞的上清液中的蛋白(离心和过滤后的上清液)；第3泳道：EcN106，细胞蛋白(离心后的小团)；第4泳道：EcN106，不含细胞的上清液中的蛋白(离心和过滤后的上清)。

图16：利用蛋白质印迹，在诱导后的2小时对编码HisMHBD2的重组菌株EcN102中的胞内和分泌的多肽与编码YebFMHBD2的重组菌株EcN106中的胞内和分泌的多肽进行比较(样品经调节至细菌细胞数(1.1x10⁸cfu))。第1泳道：EcN100，细胞蛋白(离心后的小团)；第2泳道：EcN100，不含细胞的上清中的蛋白(离心和过滤后的上清)；第3泳道：EcN102，细胞蛋白(离心后的小团)；第4泳道：EcN102，不含细胞的上清中的蛋白(离心和过滤后的上清)；第5泳道：EcN106，细胞蛋白(离心后的小团)；第6泳道：EcN106，不含细胞的上清中的蛋白(离心和过滤后的上清)；第7泳道：阳性对照(市售HBD2，1μg)，理论分子量为：HisMHBD2，8.2kDa；YebFMHBD2，17.3kDa；分泌的YebFMHBD2，15.1kDa；以及成熟的HBD2，4.3kDa。

图17：通过径向扩散，用以下细菌检测YebFMHBD2的抗菌活性：(A)大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655，(B)鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)SL1344，以及(C)单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)EGD。1：阴性对照，SK22D105的离心和过滤后的不含细胞的上清中的蛋白，4μg；2：SK22D106的离心和过滤后的含有YebFMHBD2的不含细胞的上清液中的蛋白，4μg；3：阳性对照，市售HBD2，1μg；线段表示孔直径5mm。进行三次重复试验，并示出平均值和标准偏差。

图18：在液体培养基中，通过致死试验确定分泌的YebFMHBD2对大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655的抗菌活性。进行三次重复试验，示出平均值和标准偏差。

例子

材料和方法

细菌菌株

使用大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α(F'Phi80dlacZDeltaM15Delta(lacZYA-argF)U169deoR recAl endAl hsdR17(rk-,mk+)phoA supE44thi-1gyrA96relAl)作为基因操作的宿主。大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)和EcNc(由隐性质粒修改得到的EcN)以及SK22D(EcN的等基因小菌素-阴性突变体)用于异源基因表达。所用的所有菌株和/或构建体在表1中示出。

表1：本文所用/构建的菌株。

质粒和酶

质粒载体pET-28a(+)(Novagen公司,Madison,Wisconsin,USA)用于目的防卫素基因的克隆和表达。其编码N端组氨酸标签以及可选的C端组氨酸标签，并允许蛋白在T7RNA聚合酶启动子的控制下进行表达。

基于pBR322的质粒pAR1219(Sigma-Aldrich公司,Saint Louis,Missouri,USA)在IPTG-诱导的lac UV5启动子(Davanloo等，1984)的控制下编码T7-RNA聚合酶。在本研究中，EcN、EcNc和SK22D与pAR1219和编码防卫素的重组pET-28a(+)质粒一起转化。

此外，构建含有yebF基因(NCBI(B1847))的质粒pYebF01，其受到acrB启动子的控制。

所有限制酶和T4DNA连接酶购自New England BioLabs公司(NEB，Ipswich，Massachusetts，USA)。

设计具有用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的优化的密码子的HBD2和HD5基因。

根据密码子使用表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)对人β-防卫素2基因(GeneBank登录号No AF040153)的序列和人α-防卫素5基因(GeneBank登录号No M97925)的序列进行优化，从而在大肠杆菌(E.coli)中高表达。经优化的nHBD2和nHD5基因分别由Eurofins MWG Operon公司(Ebersberg,德国)(nHBD2)和SloningBiotechnology公司(Munich,德国)(nHD5)制备。所设计和使用的所有引物在表2中列出。

表2：用于扩增以及随后克隆入pET-28a(+)载体中的引物。

每个引物序列的下划线部分对应于限制酶的识别位点：P1(EcoRI)、P2(HindIII)、P3(EcoRI)、P4(BamHI)、P5(HindIII)、P6(BamHI)、P7(Ncol)、P8(XhoI)。

编码防卫素的重组质粒的构建

该应用中所用的和所产生的所有质粒在表3中列出。为了扩增目的DNA片段，以合成的nHBD2基因(由Eurofins MWG Operon公司制备)作为模板，使用引物P1(具有EcoRI位点)和P2(具有HindIII位点)扩增全长nHBD2基因，随后与EcoRI/HindIII-切割的pET-28a(+)连接。所得质粒pEAS101编码由HBD2和具有组氨酸标签的N端延伸序列构成的融合蛋白。类似地，用引物P2和P3(表2)扩增和克隆编码成熟HBD2的nHBD2基因-部分，以构建pEAS102。该质粒编码在N端延伸序列中具有组氨酸标签的成熟HBD2。

以相同的方式，使用引物P4、P5和P6(表2)构建编码HD5前体的质粒pEAS103和编码成熟HD5的质粒pEAS104，HD5前体和成熟HD5均具有N端组氨酸标签。

重组质粒的构建开始于目的DNA片段的扩增、琼脂糖凝胶电泳以及使用QIAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN公司,Hilden,德国)洗脱所述片段。之后，经洗脱的PCR产物和pET-28a(+)用EcoRI和HindIII消化以构建pEAS101和pEAS102，用BamHI和HindIII消化以构建pEAS103和pEAS104。每个指定的消化产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN公司)再次纯化。最后，使用T4连接酶(NEB公司)连接插入片段和pET-28a(+)。

此外，构建重组质粒以用于成熟HBD2的分泌。对于新的构建体，使用引物P2和P3扩增nMHBD2基因，并连接到用EcoRI-和HindIII-酶切的质粒pYebF01上，以将其融合到yebF基因的羧基端(表2)。用限制酶分析确定插入片段后，鉴定优选的DNA序列。之后，使用引物P2和P7将yebFnMHBD2基因克隆入NcoI/HindIII消化的质粒pET-28a(+)中，以使其受到T7RNA聚合酶启动子的控制。此外，使用引物P7和P8构建编码YebF的pEAS105。

通过电穿孔用所得质粒转化大肠杆菌(E.coli)K-12DH5α。使用限制酶分析检验所得菌落中是否含有期望的插入片段，并确定正确的DNA序列。之后用这些重组质粒转化具有质粒pAR1219的EcN、EcNc和SK22D菌株。

表3：本研究中使用的质粒

利用T7表达系统表达重组防卫素

向10ml的Turbo培养基(胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、甘油、KH₂PO₄、K₂HPO₄)中加入10μl的各重组菌株(参见表1)的甘油培养物，根据制造商的说明(Roche,Basel,瑞士)补入氨苄青霉素(20μg/ml)、卡那霉素(10μg/ml)和蛋白酶抑制剂混合物。培养物在37℃下生长16个小时。之后，将8ml的各培养物接种在800ml如上所述的含有氨苄青霉素、卡那霉素和适量蛋白酶抑制剂混合物的Turbo培养基中。所述培养物在37℃下孵育，并在OD600为1.0的情况下用IPTG(终浓度1.0mM)在37℃或20℃下诱导表达不同的时间。始终包括阴性对照，并用与重组EcN菌株表达防卫素相同的条件进行处理。

SDS-tricine蛋白质印迹分析

在13,000x g的转速下离心经诱导的培养物10分钟，并将细胞在10mM Tris-HCl(pH7.4)中重悬，从而从全细胞中制备总蛋白。在13,000x g的转速下离心2ml经诱导的培养物10分钟，并无菌过滤(0.22μm，Millipore公司，Billerica,Massachusetts,USA)，得到不含细胞的培养基中的蛋白。之后，在4℃下用10％三氯乙酸(TCA)沉淀上清1小时。在以13,000x g的转速在4℃下离心15分钟后，加入1ml的100％乙醇洗涤细胞团两次，加入1ml的70％乙醇洗涤细胞团一次。将最终的细胞团溶于10mM的Tris-HCl(pH7.4)中，加入各样品的四分之一体积的SDS-PAGE样品缓冲液(12％SDS、6％巯基乙醇、30％甘油、0.05％考马斯蓝(G-250(Roth,Karlsruhe,德国)、150mM Tris-HCl，pH7.0)，然后在95℃下煮沸样品持续5分钟。使用SDS-tricine PAGE(12％丙烯酰胺)在还原条件下检验重组防卫素肽的表达(Schagger，2006)。电泳后，使用半干印迹装置，在0.8mA/cm²下，在蛋白质印迹缓冲液(阳极缓冲液I：0.3M Tris、20％甲醇、0.1％Tween20；阳极缓冲液II：25mM Tris、20％甲醇；阴极缓冲液：25mMTris、20％甲醇、40mMε-氨基-n-己酸(capronic acid))中将蛋白转印至Immobilon PS-Q膜(Millipore公司)上，持续1小时。将膜在含有0.01％的戊二醛的Tris-缓冲盐(TBS)中固定20分钟，用5％脱脂牛奶封闭18小时，并用相应的抗体进行检测。本研究中使用抗HBD2兔多克隆抗血清(1:2,000，Tomas Ganz，UCLA，洛杉矶，USA)、抗HD5兔多克隆抗血清(1:1,000，Edith Porter，加利福尼亚州立大学，洛杉矶，USA)、抗β-半乳糖苷酶单克隆抗体(1:1,000，Cell signaling公司，Beverly，Massachusetts，USA)和抗麦芽糖结合蛋白兔多克隆抗血清(1:5,000，NEB)。对印记进行化学发光检测(0.1M Tris pH8.5，0.2mM香豆酸，1.25mM Luminol和0.06％H₂O₂)。

通过镍亲和层析法分离HBD2与N端组氨酸标签的可溶性成熟融合蛋白(HisMHBD2)

在6,000x g的转速下离心20分钟以收集经诱导的细胞。在LEW缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，pH7.8)中超声(15秒脉冲，10次，各次脉冲之间冷却15秒)裂解细胞。在10,000x g的转速下离心30分钟将经裂解的提取物与细胞碎片分开，然后过滤上清(0.22μm，Millipore)。滤液含有可溶性蛋白质和肽。为了得到不可溶蛋白，进一步将小团溶于8M脲中。由于含有组氨酸标签，可以通过镍亲和层析法富集相应的防卫素肽。使用Protino Ni-TED2000-packed柱(Macherey-Nagel,Düren,德国)进行防卫素肽的亲和层析纯化。柱子用8ml LEW缓冲液平衡，然后通过重力排水。对细胞蛋白的可溶性组分进行镍亲和层析，并且用9ml洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl，250mM咪唑，pH7.8)洗脱带有组氨酸标签的肽。在4℃下用水透析进行脱盐9小时。在此期间换水两次，然后用Spectra Absorbent(Spectrum Laboratories公司，Rancho Domingouez，加利福尼亚，USA)浓缩样品。利用Bradford蛋白质检验进行之后的蛋白质定量(Bradford，1976)。

抗菌活性检测

如上所述，通过镍亲和层析分离制备细胞可溶性HisMHBD2以进行活性检测。为了制备分泌的YebF-蛋白质，在37℃下孵育4小时后，在6,000x g的转速下离心20分钟以除去细胞，然后无菌过滤(0.22μm，Millipore)上清以得到不含细胞的上清中的分泌的蛋白质。之后，进行如上所述的透析、浓缩和蛋白质定量。

通过径向扩散检验(Lehrer等,1991)，用大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)SL1344和单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)EGO作为指示菌株，检测细胞可溶性HisMHBD2和分泌的YebFMHBD2的抗菌活性。对于径向扩散检验，细菌在37℃下在5ml的TSB液体培养基(Difco,Lawrence,Kansas,USA)中生长18小时。为了得到中期对数期细菌，将5μl(大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)SL1344)或50μl(单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes))的过夜培养物接种到5ml新鲜的TSB中，并在37℃再孵育2.5小时。细菌在900x g的转速和4℃下离心10分钟，用冷的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)洗涤一次，并在2.5ml冷的10mM磷酸钠缓冲液中重悬。将含有4x10⁶细菌细胞的等分试样加入10ml的之前经高压蒸汽处理的温暖的(42℃)10mM磷酸钠缓冲液(含有1％TSB培养基和1％低电内渗型琼脂糖)中。将琼脂倒入有盖培养皿中并使其凝固。之后，使用灭菌玻璃管(直径5mm)在琼脂中产生孔。向每孔中加入样品后，平板在37℃下孵育4小时，然后用10ml的灭菌琼脂覆盖，保持在42℃下来维持液体状态。覆盖用琼脂由双倍(6％w/v)TSB溶液和1％琼脂糖组成。在37℃下孵育18小时后，检测到围绕所述孔的抑制区。

此外，在液体培养基中检测分泌的融合HBD2的生物活性。具体而言，将2.5μg的来自不含细胞的上清的总蛋白加入对数期大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655(10⁷cfu/ml)。每种检测混合物的体积为300μl，并且在10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)以及1％TSB培养基中包含分泌的蛋白质/肽和细菌。将样品中的所有成分混合在一起后，对各样品取100μl试样以检测其初始值(时间点为零)。剩余200μl样品在37℃下孵育4小时。系列稀释各样品，取100μl试样铺在LB琼脂平板上。所述平板在37℃下孵育18小时，然后对菌落数计数。

结果

对人β-防卫素2和人α-防卫素5基因的密码子优化以在大肠杆菌中的表达

物种之间使用密码子的差异会影响通过重组技术表达的蛋白的数量和质量。因此，分析人β-防卫素2(HBD2)的cDNA和人α-防卫素5(HD5)的cDNA的密码子中很少出现的密码子。

HBD2(GeneBank登录号No AF040153)由64个氨基酸组成，其中27个氨基酸(42.2％)是由大肠杆菌中很少使用的密码子编码的。此外，6个密码子(编码R2、I13、I25、I37、R45和R46)在对大肠杆菌表达异源蛋白的不利影响中起到重要的作用(Kane，1995)。特别地，R2、R45和R46是由大肠杆菌的少数密码子中的最少使用的密码子(AGG和AGA)编码的(图1)。已经发现，存在单个AGG或AGA以及它们的随机重复极大地降低了蛋白质合成的最高水平，并且还可能引起高频率的移码(Spanjaard等，1990)。

HD5(GeneBank登录号No M97925)由94个氨基酸组成，其中29个氨基酸(30.9％)是由大肠杆菌中低使用的密码子编码的。在这29个氨基酸中，6个氨基酸是由可能对大肠杆菌蛋白质表达引起不利影响的密码子(编码R2、R25、R55、R62、R68和R90)编码的(图1)。

为了避免这些稀有密码子对大肠杆菌表达HBD2和HD5的潜在的问题，根据大肠杆菌的密码子使用表(http://www.kazusa.or.jp/codon/)，设计相应的新基因nHBD2(EMBL HE583189)和nHD5(EMBLHE583188)(图1)，其中很少使用的密码子被常用的替代。为了提高大肠杆菌的翻译终止信号，原始终止子TGA用连续的两个终止子TAATGA替代，这是大肠杆菌中最有效的翻译终止序列(Hannig和Makrides，1998)。

构建重组质粒以用于防卫素的表达

质粒载体pET-28a(+)(Novagen)(图2)编码两个组氨酸标签并且允许基因在T7启动子的控制下表达，该载体用于构建编码融合蛋白的重组质粒，所述融合蛋白由N端组氨酸标签和防卫素构成。将合成的全长nHBD2-基因、或编码HBD2成熟部分(nMHBD2：氨基酸G24至P64，图1A)的nHBD2-基因序列分别与经酶切的pET-28a(+)连接，从而构建表达质粒pEAS101和pEAS102(图3、4)。质粒pEAS101含有nHBD2-基因，pEAS102编码nMHBD2-基因。这两个基因均受到T7启动子的控制，并且所得的各防卫素(HisHBD、HisMHBD2)含有N端组氨酸标签。构建质粒pEAS103和pEAS104以表达HD5的前体和HD5的成熟部分(nMHD5：氨基酸A63至R94，图1B)。所得防卫素也含有N端组氨酸标签。由pEAS103编码的基因产物为HisHD5，由pEAS104编码的基因产物为HisMHD5(图5、6)。

大肠杆菌中HBD2和HD5融合蛋白的表达

利用抗HBD2兔多克隆抗血清，对经诱导的重组菌株EcN100、EcN101和EcN102的全细胞蛋白进行蛋白质印迹分析，以检测HisHBD2和HisMHBD2的表达。细胞裂解后，还通过蛋白质印迹分析用HBD2兔多克隆抗血清检测可溶的和不可溶的蛋白质组分。在生长、诱导、样品制备、SDS-PAGE和蛋白质印迹方面，对阴性对照EcN100的处理始终按照对EcN101和EcN102的处理进行。

在37℃诱导后的若干时间点检测HisHBD2的表达，这是由于在临床环境中，口服产生防卫素的EcN菌株后，防卫素的表达在人的消化道的生理体温下进行。然而，在37℃诱导后的任意时间点都未检测到HisHBD2(数据未示出)。在20℃诱导6小时后观察到HisHBD2，并且其存在于全细胞蛋白质的不可溶小团中(图7)。相比之下，在37℃诱导HisMHBD2的表达1小时和2小时后，在上清(可溶蛋白组分)中以及细胞裂解后的小团(不可溶蛋白组分)中检测到HisMHBD2(图8)。在阴性对照(EcN100)的相应样品中未检测到防卫素肽。

用HD5特异性兔多克隆抗血清，通过全细胞蛋白、可溶和不可溶蛋白组分的蛋白质印迹，检测EcN103和EcN104中HisHD5和HisMHD5的表达。

在37℃诱导4小时后检测到HisHD5，然而其存在于总细胞蛋白的不可溶组分中(图9)。还检测到HisMHD5，但是在37℃诱导1小时和2小时后仅产生非常少量的HisMHD5(图10)。在蛋白酶抑制剂混合物的存在下，在37℃诱导大于2小时后，完全不能检测到HisMHD5(数据未示出)。

利用镍亲和层析分离以及HisMHBD2的抗菌活性

将在EcN103中表达的HisMHBD2融合蛋白从镍柱上洗脱，然后如材料和方法中所述进行透析和蛋白质定量。所得物质用于抗菌活性检测。按照HisMHBD2样品的洗脱物的方式对EcN100样品(阴性对照)的镍柱洗脱物进行处理。通过径向扩散检验，用大肠杆菌K-12MG1655、鼠伤寒沙门氏菌SL1344和单核细胞增多性李斯特氏菌EGO作为指示菌株，检测洗脱的蛋白/肽的抗菌活性。

用来自编码HisMHBD2的菌株EcN102(阳性对照)的洗脱蛋白能够检测到抑制区，而阴性对照(来自EcN100的洗脱蛋白)未显示任何抗菌效果(图11)。

在使用“Protein Refolding kit”(Novagen)进行重新折叠步骤后，检测来自EcN101的不可溶HisHBD2和由EcN103编码的HisHD5的生物活性，然而，这些蛋白组分未显示任何活性。来自EcN104的HisMHD5以非常低的产量表达。因此，不能得到足够的材料以获得浓度相当的溶液以进行活性检测。

由重组大肠杆菌菌株分泌MHBD2融合蛋白

大肠杆菌蛋白YebF(10.8kDa)是分泌到培养基中的可溶性内源蛋白，并且其用作基因改造蛋白的载体(Zhang等，2006)。已经表明，连接到YebF的羧基端的乘客蛋白被相应的重组大肠杆菌K-12菌株高效地分泌。因此，发明人决定设计由融合到YebF的C端的HBD2的成熟部分构成的融合蛋白，从而实现所得融合蛋白YebFMHBD2被相应的重组大肠杆菌菌株分泌(图12、14)。将含有质粒pAR1219和仅编码yebF(NCBI(B1847))的pEAS105的EcN105用作阴性对照，并且按照编码防卫素基因的重组菌株的方式对其进行处理(图13)。

通过蛋白质印迹法，分析经诱导的EcN105和EcN106的全细胞蛋白和不含细胞的上清样品，从而检测YebFMHBD2的分泌。由于培养基中存在融合蛋白可能是由YebF所实现的分泌、细胞裂解、外膜泄露、自然的细胞分泌过程或它们的组合导致的结果，因此，发明人不仅用抗HBD2兔多克隆抗血清通过蛋白质印迹分析了细胞和生长培养基，还使用了对细胞质β-半乳糖苷酶特异的单克隆抗体以及对周质麦芽糖结合蛋白(MBP)特异的兔多克隆抗血清进行了分析(图15)。

在对经诱导的EcN106培养物离心和灭菌过滤后，在不含细胞的上清中发现YebFMHBD2，这与EcN105培养物相反。图15示出了诱导期间YebFMHBD2在培养基中的积累。在不含细胞的上清中，在诱导后的2小时和4小时清楚地检测到了YebFMHBD2。诱导20小时后，大部分YebFMHBD2存在于培养基中。在代表细菌细胞的样品中，已经检测到β-半乳糖苷酶、MBP和HBD2，然而，在分析的任何时间点都完全没有在培养基中观察到β-半乳糖苷酶。

在诱导后1.5小时，在培养基中未检测到MBP。在诱导后3小时和6小时，在培养基中检测到痕量的MBP，这表示开始了一定程度的不可避免的细胞裂解。

此外，通过蛋白质印迹分析，比较了EcN106中所合成的YebFMHBD2的位置以及来自EcN102的HisMHBD2的位置(图16)。在细菌细胞和培养基中检测到了YebFMHBD2，而HisMHBD2仅存在于代表总细胞蛋白的组分中而不存在于不含细胞的上清(即培养基)中。在蛋白质印迹分析中，观察到融合蛋白防卫素的迁移慢于所期望的理论分子量(HisMHBD2：8.2kDa；YebFMHBD2：17.3kDa；分泌的YebFMHBD2：15.1kDa)(图16)。小的肽通常不符合质量与SDS-PAGE迁移率的标准关系(Faurschou等，2005；Huang和Matthews，1990；Weber等，1972)。此外，由于在分泌过程中YebF在21个氨基酸的分泌导肽(sec-leader)之后被切除(Zhang等，2006)，因此，与来自细胞蛋白质池的YebFMHBD2(图16，第5泳道)相比，检测到来自用过的培养基中的分泌的YebFMHBD2为更小的蛋白质(图16，第6泳道)。这些结果表明，YebFMHBD2被分泌入培养基而不只通过细胞裂解而释放。

分泌的YebFMHBD2融合蛋白的抗菌活性

首先，通过径向扩散检验由EcN106编码的YebFMHBD2的抗菌活性。然而，在阴性对照、EcN105分泌的蛋白中观察到了抑制区。其原因可能是EcN产生和分泌两种小菌素，M和H47(Patzer等，2003)。

因此，为了检测分泌的YebFMHBD2蛋白的抗菌活性，采用了具有pAR1219和pEAS106的小菌素-阴性等基因SK22D菌株的上清。经过离心和无菌过滤，得到来自SK22D105和SK22D106的经诱导的培养物的不含细胞的上清。在通过径向扩散进行抗菌检测、以及在液体培养基中进行杀伤试验以前，对相应的不含细胞的上清进行透析和浓缩。

在径向扩散试验中，仅来自SK22D106的上清显示出对大肠杆菌K-12MG1655、鼠伤寒沙门氏菌SL1344和单核细胞增多性李斯特氏菌EGO的杀伤效应(图17)。相同的上清在液体培养基中引起对大肠杆菌K-12MG1655的生长抑制(图18)。由于在只有1％TSB培养基的存在下进行了在液体培养基中的杀伤试验，因此在诱导4小时后，在阴性对照(SK22D105分泌的蛋白)的存在下大肠杆菌K-12MG1655的生长也发生了降低。

讨论

本发明公开了一种利用公知的益生大肠杆菌(E.coli)菌株(大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)(Sonnenborn和Schulze，2009))的防卫素微生物输送载体。发明人选择EcN是因为该益生菌具有优异的生物安全性，并且从1917年开始便用于医学实践中。此外，其在8个欧洲国家以及海外(伊朗、黎巴嫩、秘鲁和南韩)作为许可药物而上市。

为了实现具有抗菌活性的小阳离子肽在细菌中表达，必须克服两个主要的障碍。这些包括阳离子肽可能会杀伤生产用菌株，以及阳离子肽对蛋白水解降解的敏感性。Piers及同事发现，他们可以使用融合蛋白表达系统来克服这些障碍(Piers等，1993)。因此，发明人使用了低拷贝数载体(pET-28a(+)表达载体)来克隆防卫素基因。防卫素基因在该载体中以这样的方式连接，所述方式能够产生编码由具有组氨酸标签的N端肽和防卫素构成的蛋白的融合基因。另外，以这样的方式克隆相应的防卫素基因，所述方式允许融合基因的表达受到phi10T7-聚合酶特异性启动子的控制。在诱导T7DNA-依赖性RNA聚合酶合成后，表达能够被检测到。T7聚合酶基因的表达可被IPTG诱导，所述基因由质粒pAR1219提供。质粒pAR1219和重组pET-28a(+)均被引入EcN中。为了降低带有组氨酸标签的防卫素对生产用菌株的杀伤风险，在含有86mM NaCl的Turbo培养基中诱导表达。如Xu及其同事等报道(Xu等，2006)，该NaCl浓度使得产生HBD2的大肠杆菌(E.coli)D31培养物具有80％的存活率，与此形成对比的是，不含NaCl的培养物仅有40％的存活率。在本文中，这些措施有助于重组EcN菌株生长，即使在表达重组防卫素的情况下也是如此。

另一个可能的问题(防卫素的降解)可通过孵育期间加入蛋白酶抑制剂混合物来避免。在蛋白酶抑制剂混合物不存在的情况下，阻碍蛋白质降解的另一个方法是删除EcN中编码蛋白酶的基因(如OmpT和Lon)，从而构建与大肠杆菌(E.coli)K-12菌株BL21(DE3)和KRX相比适合蛋白质表达的菌株(Derbise等，2003)。这是正在进行的优化EcN生产防卫素的研究的一部分。

在本研究中，第一个在EcN中克隆和制备的防卫素是人α-防卫素5(HD5)，其与人α-防卫素6一起在小肠克罗恩氏病中特异地减少(Wehkamp和Stange，2010)。发明人选择了HD5，这是由于其以无活性的前体的形式被编码，该无活性的HD5前体的产生不会影响EcN的活力。所选择的其它通过EcN产生的防卫素为HBD2。EcN通过鞭毛蛋白在Caco-2细胞中诱导该防卫素，在克罗恩氏病结肠炎中，其诱导通常被减弱(Schlee等，2007；Gersemann等，2008)。

然而，由于人和大肠杆菌(E.coli)中使用不同的密码子，用原始DNA序列无法有效地在大肠杆菌中表达防卫素基因。因此，为了在大肠杆菌(E.coli)中表达，对想要克隆的防卫素基因进行优化。已经示出密码子优化可显著地提高表达水平。如Peng及其同事报导，通过用大肠杆菌(E.coli)偏好的密码子优化HBD2基因，观察到细胞可溶性HBD2提高了约9倍(Peng等，2004)。因此，使用大肠杆菌(E.coli)偏好的密码子合成了编码人β-防卫素2(nHBD2)和人α-防卫素5(nHD5)的两条新序列。蛋白质印迹法证明在益生菌EcN中，在T7启动子的控制下，HBD2和HD5作为在N端具有组氨酸标签的融合蛋白而被成功地表达了。重组EcN菌株具有重组质粒pET-28a(+)和编码T7聚合酶的质粒pAR1219。全长HBD2融合蛋白(HisHBD2)主要存在于不可溶蛋白组分中，但是含有HBD2融合蛋白的成熟部分的融合蛋白(HisMHBD2)在可溶和不可溶蛋白组分中均有表达。这与之前的研究是一致的，该研究表明不具有信号肽的成熟HBD2比全长HBD2有更高的溶解性(Xu等，2006)。这是存在信号肽的结果，该信号肽与HBD2的成熟部分相比(34.1％)，富含疏水氨基酸(78.3％)。由于暴露的疏水部分可能引起聚集，信号肽的高疏水性导致HisHBD2蛋白的溶解性更低。信号肽还可能降低代表成熟HBD2的那部分分子中的的二硫键的折叠速率或准确率。

只在不可溶蛋白组分中发现了HD5融合蛋白(HisHD5)的前体，并且未显示出生物活性，所述前体除了具有组氨酸标签的融合伴侣部分之外，由HD5信号序列、前体片段、和代表成熟HD5的片段构成。在EcN中只检测到量非常低的具有成熟HD5的融合蛋白(HisMHD5)。由于HD5的信号肽也含有高百分比的疏水性氨基酸(78.9％)，因此这可能是HisHD5不溶性的原因。由于认为阴离子前体片段对阳离子肽的细胞毒性的抑制非常重要，因此认为制备重组成熟形式的α-防卫素有挑战性(Valore等，1996)。据报道，一些人α-防卫素(hNP-1、hNP-2、hNP-3、hD-5和hD-6)作为含有大肠杆菌(E.coli)色氨酸操纵子的一部分(包括组氨酸标签)(111AA)的成熟融合防卫素在细菌中表达不会产生可溶的蛋白质，因为它们主要发现于包涵体中(Pazgier和Lubkowski,2006)。此外，通过工程细菌系统，仅可产生低产量的α-防卫素，并且α-防卫素对细菌蛋白酶的快速降解是敏感的(Piers等，1993；Valore和Ganz,1997)。至今为止，未有报道在大肠杆菌(E.coli)中成功表达可溶和活性形式的人α-防卫素。

相比之下，在本发明中，成熟的融合HBD2(HisMHBD2)以可溶形式产生。已知可溶的重组蛋白通常正确折叠并且通常具有生物活性(Sorensen和Mortensen，2005)。因此，在细菌中异源表达产生可溶的蛋白是引人注目的。事实上，在径向扩散检验中，本发明得到的可溶HisMHBD2示出了对大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium)SL1344和单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)EGD的抗菌活性。根据防卫素作用的抗菌机制，肽的阳离子部分能够与细菌膜的带负电的结构相互作用，然后导致其透化(Ganz，1999；Peschel，2002)。HisMHBD2为阳离子的且含有融合伴侣(理论Pi9.50)，因此，即使是融合蛋白，HisMHBD2似乎也能够与细菌的细胞膜相互作用。然而，如所讨论的防卫素作用的其它模式，发明人不能排除HisMHBD2示出抗菌活性的其它机制(Yount等，2009)。

虽然EcN细菌在人消化道中可能发生泄漏或裂解，并且可能足以释放大量的HBD2，但发明人构建了编码由YebF和HBD2的成熟部分构成的融合蛋白的重组EcN菌株，从而实现了YebFMHBD2产物的分泌。由于已经报道了连接至YebF的C端的“乘载”(passenger)蛋白能够从大肠杆菌(E.coli)K-12菌株中有效地分泌(Zhang等，2006)，因此，使用载体蛋白YebF作为融合伴侣。如所期望的那样，可以证明YebFMHBD2从重组EcN菌株中分泌，并且发明人能够证明，该融合蛋白在不含细胞的上清中出现不是由于细胞在较早的时间点裂解造成的。在细菌细胞提取物样品中和不含细胞的培养物上清的样品中，用对细胞质β-半乳糖苷酶和周质麦芽糖结合蛋白特异的蛋白质印迹检测了细胞泄漏/裂解的发生。由YebF得到的结果非常类似于Zhang及其同事的公开出版物(Zhang等，2006)中报道的结果。他们比较了YebF和麦芽糖结合蛋白(MBP)的释放。在他们的研究中，在诱导后1.5和3小时，YebF存在于培养基中，然而在诱导后1.5小时，培养基中不存在MBP，并且在诱导后3小时培养基中也几乎检测不到MBP。诱导6小时后，虽然观察到有一些MBP泄漏到培养基中，但MBP主要定位于细胞组分中。与此形成对比，在诱导后6小时，YebF几乎完全存在于培养基中。作者相信，这些数据能够支持YebF是被分泌的，而非通过外膜而泄露的。发明人获得了可比的MBP定位的结果。此外，发明人观察到在诱导后2小时和4小时，YebFMHBD2存在于培养基中，并且在诱导后20小时，其以主要的量存在于培养基中。此外，在我们的研究中分析了细胞质β-半乳糖苷酶蛋白质的定位，该蛋白仅在细胞组分中被检测到，而在培养基中未检测到。此外，与YebFMHBD2的定位比较，HisMHBD2仅在诱导后2小时存在于细胞中，而YebFMHBD2在该时间点时存在于细胞以及培养基中。这些结果表明MHBD2融合到YebF的C端导致该融合蛋白从生产用细菌细胞中有效分泌。

Zhang及其同事发现，通过使用YebF，例如作为YebF-hIL2(人白介素-2,15kDa，非常疏水)、YebF-α-淀粉酶(α-淀粉酶，48kDa，亲水的)以及YebF-碱性磷酸酶(94kDa)，YebF可以将这些融合蛋白以活性形式从生产用细菌细胞中运输到培养基中(Zhang等，2006)。这些数据表明YebF能够将大小和疏水/亲水性不同的蛋白从大肠杆菌(E.coli)细胞的细胞质运输到培养基中。有趣的是，来自表达YebFMHBD2的细菌培养物的不含细胞的上清样品具有抗菌活性。与仅表达YebF的培养物的对照样品相比，上述样品抑制革兰氏阴性菌株大肠杆菌(E.coli)K-12MG1655和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Typhimurium)SL1344、以及革兰氏阳性的单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)菌株EGD的生长。由于YebFMHBD2是阳离子的且包含融合伴侣(理论pI8.93)，推测融合蛋白YebFMHBD2可与细菌膜上带负电的结构相互作用。显然，至少部分YebFMHBD2蛋白在分泌后以允许MHBD2-部分发挥其抗菌活性的方式折叠。可以推测，如无活性的proHD5的蛋白水解活性所示，MHBD2在人消化道中从YebFMHBD2中释放是由胰蛋白酶的活性导致的。胰蛋白酶在精氨酸和赖氨酸残基之后切割，并且两个精氨酸残基是YebFMHBD2中YebF-部分的最后两个氨基酸残基。

总之，本发明成功地构建了益生大肠杆菌(E.coli)Nissle1917的重组菌株，其不仅能够产生HD5和HBD2防卫素，还能够产生具有抗菌活性的成熟的HBD2。此外，具有质粒pEAS106的小菌素-阴性EcN突变体将由YebF和HBD2成熟部分构成的融合蛋白分泌到培养基中，并且经分泌的融合蛋白显示出对大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)和单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的生长抑制作用。

与较早的关于在大肠杆菌(E.coli)K-12菌株中产生防卫素的报道(Huang等，2006；Pazgier和Lubkowski，2006；Xu等，2006)形成对比，本发明第一次报道了在益生大肠杆菌(E.coli)菌株(Nissle1917)中产生了活性的HBD2防卫素，所述菌株为用于治疗患有例如腹泻或溃疡性结肠炎的患者的许可药物。与不能在人消化通道内存活的大肠杆菌(E.coli)K-12菌株相反，所述益生菌株是人消化道内良好的暂时定居菌。此外，据我们所知，本发明还第一次证明了用大肠杆菌(E.coli)菌株不仅产生了成熟HBD2，还分泌了成熟HBD2，该成熟HBD2示出了抵抗病原性沙门氏菌(Salmonella)和李斯特式菌(Listeria)菌株的活性。

这些构建体和用它们实现的结果奠定了将EcN开发成用于将防卫素传递给缺乏这些抗菌肽的患者的传递载体的基础。在克罗恩氏病中，例如，防卫素分子(如HBD2)的诱导受损，这部分是由于导致消化道中HBD2的量降低的基因缺陷(Wehkamp和Stange,2006)。因此，在经口施用之后，通过产生HBD2防卫素的重组EcN-菌株在消化道中局部定向输送HBD2，能够对克罗恩氏病患者有治疗效果。

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Claims

1.一种利用编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸转化的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞。

2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述防卫素蛋白选自人α-或β-防卫素。

3.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述防卫素蛋白选自人α-防卫素HNP1-4、人α-防卫素5(HD5)、人α-防卫素6(HD6)以及人β-防卫素1-6(HBD1-6)，或选自所述蛋白的各自的成熟型。

4.根据权利要求1-3中一项或多项所述的重组细胞，其中所述防卫素蛋白或其衍生物被表达为融合蛋白，优选为与组氨酸标签融合的融合蛋白或与大肠杆菌(E.coli)YebF蛋白融合的融合蛋白。

5.根据权利要求1-4中一项或多项所述的重组细胞，其中所述编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸通过密码子优化而适合在大肠杆菌(E.coli)细胞中表达。

6.根据权利要求1-5中一项或多项所述的重组细胞，其中所述编码所述防卫素蛋白或其衍生物的核酸选自SEQ ID NO:1、2或3。

7.根据权利要求1-5中一项或多项所述的重组细胞，其中所述编码所述防卫素蛋白或其衍生物的核酸是表达载体的一部分，所述表达载体还包含一条或多条调控序列。

8.根据权利要求7所述的重组细胞，其中所述表达载体为质粒，并且所述调控序列包含T7启动子。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中一项或多项所述的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞和可药用的载体。

10.权利要求1-8中一项或多项所述的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞在治疗克罗恩氏病中的应用。

11.一种制备权利要求1-8中一项或多项所述的重组大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞的方法，包括以下步骤：提供编码防卫素蛋白或其衍生物的核酸以及大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞，以及用所述核酸转化所述细胞，其中经转化的大肠杆菌(E.coli)Nissle1917(EcN)细胞能够表达防卫素蛋白或其衍生物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中将所述核酸克隆到表达载体中，并通过电穿孔引入所述细胞中。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述防卫素蛋白或其衍生物被表达为具有N端组氨酸标签的融合蛋白。

14.根据权利要求11至13中一项或多项所述的方法，其中所述防卫素蛋白或其衍生物被表达为与大肠杆菌(E.coli)YebF蛋白融合的融合蛋白。