CN110914386A - 用于生产生物分子的组合物、系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于使用微生物生产生物分子的组合物、系统和方法。具体地，本公开提供了生物分子生产平台，其包括具有遗传回路的遗传工程化的微生物，所述遗传回路在功能上与由响应培养条件的材料形成的微胶囊偶联。本文公开的生物分子生产平台促进任何目标生物分子的有效且稳健的生产、纯化和/或分析。

Description

用于生产生物分子的组合物、系统和方法
政府资助
本发明在分别由NIH和NSF授予的联邦拨款号R 01 GM098642和CBET-0953202的政府支持下完成。联邦政府拥有本发明的某些权利。
相关申请
本申请要求于2017年6月12日提交的美国临时专利申请号62/518,075的优先权和权益，其以其整体通过引用并入本文用于所有目的。
领域
本公开提供了涉及使用微生物生产生物分子的组合物、系统和方法。具体地，本公开提供了生物分子生产平台，其包括具有遗传回路的遗传工程化的微生物，所述遗传回路在功能上与由响应培养条件的材料形成的微胶囊偶联。本文公开的生物分子生产平台促进任何目标生物分子的有效且稳健的生产、纯化和/或分析。
背景
已经发现刺激敏感的生物材料的不同应用，包括由于其相变能力的受控药物释放和可注射的植入物。并行地，用合成基因回路程序化的工程化细菌已经显示出作为“智能”传感和促动(actuating)剂的巨大潜能。迄今为止，对于这两个方面的整合进行的工作很少。然而，很多天然系统的功能从细胞与其改变的环境之间的相互影响而形成。
“智能”水凝胶、或刺激-响应的水凝胶，可以在物理(例如温度、光)或化学(例如pH、离子)环境的微小变化后，经历可逆的体积相变。部分由于它们的独特特性，已经需要智能水凝胶用于将化学或物理能量转导至作为传感器的机械工作中；在用于治疗药物递送的适当条件下受控的药物释放；和在组织工程化中的原位溶胶-凝胶转变。并行地，在过去二十年，已经看到合成生物学的巨大进展，产生基于细胞的系统的工程化，其用于传感以及响应不同信号并且也响应其物理界限。这允许工程化的系统不仅作为生物传感器或生物标志物发挥作用，而且也应用于靶向的药物递送和按需的蛋白合成。
概述
本公开的实施方案包括用于生物分子生产的系统。根据这些实施方案，所述系统包括多种遗传工程化的微生物，其包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具，其中所述遗传回路促进所述目标生物分子的自主生产；和
包封材料，其中所述包封材料能够形成微胶囊以包含所述多种遗传工程化的微生物，并且其中所述微胶囊在功能上与所述遗传回路偶联。
在一些实施方案中，多种遗传工程化的生物包括细菌或酵母。在一些实施方案中，多种遗传工程化的生物包括大肠杆菌(E. coli)的一种或多种菌株。在一些实施方案中，大肠杆菌的一种或多种菌株包括MC4100、MG1655、BL21、NISSLE1917，及其任何衍生物或变体(variations)。在一些实施方案中，遗传回路包括细胞裂解模块和细胞密度传感模块。在一些实施方案中，细胞裂解模块包括编码来自噬菌体phiX174的E蛋白的基因，并且细胞密度传感模块包括突变的luxR基因和缺少Rom/Rop蛋白的ColE1复制起点。在一些实施方案中，目标生物分子是肽、多肽、蛋白、核酸、多聚核酸、DNA分子、RNA分子，或其任何衍生物或组合中的至少一种。在一些实施方案中，目标生物分子是多肽，并且用于生产目标生物分子的工具包括质粒，所述质粒包含在诱导启动子的控制下编码所述多肽的基因。在一些实施方案中，目标生物分子是细胞质多肽。在一些实施方案中，目标生物分子是多肽，所述多肽包含标签以促进与基底结合。在一些实施方案中，包封材料包括壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、聚乙二醇聚合物、聚氧化乙烯聚合物、弹性蛋白样多肽(ELP)、节肢弹性蛋白样多肽(resilin-like polypeptides, RLP)，或其任何衍生物或组合。在一些实施方案中，包封材料响应微胶囊中的一种或多种条件。在一些实施方案中，微胶囊与遗传回路的功能偶联包括多种微生物改变所述微胶囊中的一种或多种条件。在一些实施方案中，微胶囊中的一种或多种条件包括pH或离子强度。在一些实施方案中，微生物以约102个至约1010个的浓度存在于微胶囊中。在一些实施方案中，系统还包括微流体平台，以促进目标生物分子的生产、纯化和/或分析。在一些实施方案中，微流体平台包括输入通道、生产室和测定室。
本公开的实施方案还包括用于生物分子生产的微流体平台。根据这些实施方案，所述平台包括：微流体装置，其包括输入通道、生产室和测定室；多种遗传工程化的微生物，其包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具，其中所述遗传回路促进所述目标生物分子的自主生产；和包封材料，其中所述包封材料能够形成微胶囊以包含所述多种遗传工程化的微生物，并且其中所述微胶囊在功能上与所述遗传回路偶联。
在一些实施方案中，生产室与输入通道和测定室流体偶联。在一些实施方案中，多种遗传工程化的微生物包含在生产室中。在一些实施方案中，装置还包括输出通道，其与测定室或生产室流体偶联。在一些实施方案中，装置还包括第二输入通道，其与测定室流体偶联。在一些实施方案中，生产室与纯化芯片流体偶联。在一些实施方案中，纯化芯片的内表面经修饰以结合所述目标生物分子。
本公开的实施方案还包括用于生产目标生物分子的方法。根据这些实施方案，所述方法包括：将包含在微胶囊中的多种遗传工程化的微生物加载到微流体装置中，其中所述多种遗传工程化的微生物包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具；向多种微生物提供营养物；和生产所述目标生物分子。
在一些实施方案中，多种遗传工程化的生物包括细菌或酵母。在一些实施方案中，目标生物分子是肽、多肽、蛋白、核酸、多聚核酸、DNA分子、RNA分子、或其任何衍生物或组合中的至少一种。在一些实施方案中，微胶囊包含包封材料，所述包封材料包括壳聚糖、藻酸盐，或其任何衍生物或组合。在一些实施方案中，微流体装置包括输入通道、生产室和测定室。
附图简述
图1包括根据本公开的用于生物分子生产的微生物集群机器人(Microbial swarmbot,MSB)平台的设计构思的代表性示意图。每个集群机器人包括包封在聚合物微胶囊中的工程化细菌的小群体。如所示的，可以使细菌工程化以在足够高的局部密度下经历部分裂解。相反，包封材料可以响应由细胞生长导致的化学环境变化而收缩。随着细菌经历程序化自溶，它们释放细胞内蛋白。交联的聚合物胶囊将活细胞和大的碎片捕获在内部，并且相应的收缩促进蛋白产物从胶囊输出。通过补充新鲜培养基重置系统。
图2A-2C包括MSB的模块的基本功能的代表性结果。
图2A：通过ePop回路的程序化自主裂解(上部：回路逻辑；下部：实验数据)。质粒拷贝数的密度依赖性增加导致毒素表达增加(来自噬菌体phiX174的E蛋白)。在足够高的浓度下，E蛋白致使细胞裂解，导致细胞密度降低。在启动(红色曲线)时，回路产生MC4100Z1(ePop)的培养密度的振荡。可以通过添加1%蔗糖关闭(绿色曲线)回路。
图2B：响应包封细菌生长的胶囊收缩(上部：示意图；下部：实验数据)。将携带ePop回路和组成型GFP回路的MC4100Z1细胞(MC4100Z1(ePop/GFP))包封在壳聚糖胶囊中，并在M9培养基中培养。通过时间零处的值，将所有数据标准化。插图：MSB在时间0 (左)和48(右)小时的显微镜图片。
图2C：生长介导的胶囊收缩促进大分子从胶囊的输出(上部：示意图；下部：实验数据)。将MG1655细胞和葡聚糖-罗丹明(Mw约70000 g/mol)包封在壳聚糖胶囊中，并在M9培养基中培养。使用或不用氨苄青霉素(100 μg/mL)处理胶囊。24小时后，与含有不生长的细菌(被抗生素抑制)的无收缩胶囊相比，在抗生素不存在的情况下的细菌生长引起的收缩胶囊，导致罗丹明荧光增加约2.25倍。实验进行一式三份。
图3A-3F包括证实微包封介导的回路稳定性增强的代表性结果。
图3A：通过程序化细菌裂解的蛋白生产可以被突变体接管。如所示，在高密度下，野生型细胞(W)将自主裂解，并释放产物。突变体(M)可以自发产生。M不裂解，因此不促成蛋白生产。在每种环境下，M将最终在培养物占优势。
图3B：如所示，批量培养物倾向于完全被突变体接管。一旦产生突变体，它可以进入整个培养物。
图3C：包封-介导的隔离延迟突变体接管。如所示，每个微胶囊中的小群体大小，降低了在每个微胶囊中可以出现突变体的可能性。当突变体出现时，其被限制在胶囊内并且不污染其他包封的群体。
图3D：结果确认隔离增强回路稳定性。将等量的MC4100Z1(ePop)细胞接种在液体培养物中或包封在胶囊内部，具有相同的营养物供应(M9培养基)。在24、48或72小时后，从任一培养物收集细胞，并铺板在琼脂平板上。挑取约10个克隆，并在不含葡萄糖的LB培养基中测试ePop功能的维持。对于每种条件，将遗传稳定性计算为维持ePop功能的细胞的百分比(野生型的百分比)。实验进行一式三份。
图3E：裂解率的增加(通过降低葡萄糖浓度)导致遗传稳定性降低。将MC4100Z1(ePop)细胞接种在液体培养物中或包封在胶囊内部，具有相同的营养物供应量(M9培养基)。通过控制M9培养基中的葡萄糖浓度调整裂解率。分别在72小时收集细胞，重新铺板并随后测试裂解功能。挑取约10个克隆，并在不含葡萄糖的LB培养基中测试ePop功能的维持。对于每种条件，将遗传稳定性计算为维持ePop功能的细胞的百分比(野生型的百分比)。实验进行一式三份。
图3F：结果确认来自MSB平台的更大的蛋白产率。将MC4100Z1(ePop/BlaM)细胞接种在液体培养物中或包封在胶囊内部，具有相同的营养物供应量(M9培养基)，进行72小时。对于MSB培养，补充葡萄糖以调整裂解率。基于其与fluorocilin的反应，计算BlaM的产率。通过批量培养条件，将所有值标准化。实验进行一式三份。
图4A-4D包括证实BlaM的持续合成和量化的代表性结果。
图4A：用于控制和分析蛋白合成和从MSB释放的微流体平台。如所示，生产室含有包封携带ePop回路和诱导型BlaM的MC4100Z1 (M4100Z1(ePop/BlaM))的MSB。通过供应fluorocilin（其被BlaM转化成荧光产物），在测定室中量化BlaM。
图4B：流动模式。如所示，蓝色条指示流动开。程序设计如下：前8小时中没有流动，随后将流动在循环中开启(0.5 μL/分钟，0.5小时)/关闭(0μL/min，1.5小时)。培养基是LB。
图4C：MSB的大小振荡。通过8小时，使MSB大小标准化。
图4D：测定室中的荧光。通过显微镜在不同时间点记录反应室中的荧光。对数据进行背景校正。
图5A-5H包括证实整合的蛋白生产和纯化的代表性结果。
图5A：在微流体芯片上的整合操作。将生产室代替测定室连接至纯化芯片，其包括与载玻片粘合的蛇形通道。对载玻片的表面进行修饰以结合His-标签化的蛋白。当从生产室释放时，His-标签化的蛋白通过结合修饰的玻璃表面而被捕获在纯化芯片中。用PBS洗涤后，可以通过流过洗脱缓冲液而回收蛋白。
图5B：使用微流体芯片整合的模型蛋白的生产和纯化。将含有携带ePop回路和ELPs-GFP-His的BL21(DE3) (BL21(DE3)(ePop/ELPs-GFP-His))的MSB与LB培养基一起加载在生产芯片的培养室中。通过Teflon管，直接将粗品从生产芯片运输(输出)到纯化芯片(输入)。结合前的总培养时间为24小时。用于结合的流速是0.5 μL/min。通过荧光显微镜监测纯化步骤。图像呈现了结合前、结合后和洗脱后的蛇形通道的GFP通道图像(激发 = 488nm，发射 = 520 nm)。
图5C：使用注射器的工作台上的整合操作。使用注射器作为培养室，并加载MSB和培养基。将0.45 μm亲水膜滤器附接在注射器的尖端，以避免泄露和蒸发培养基。在特定时间段后，通过流过Ni-NTA树脂填充柱直接纯化粗品。
图5D：使用ELPson在工作台上的纯化模块的整合。将含有BL21(DE3)(ePop/ELPs-GFP-His)的MSB与10 mL培养基(LB或M9 培养基)一起加载在注射器中，并培养24小时。将粗品推过注射器滤器用于His-标签色谱纯化。所得蛋白在SDS-PAGE凝胶上测试。从左至右，样品为：LB和M9培养基中的粗品，没有(-)和具有(+) IPTG诱导；LB和M9培养基中的纯化蛋白，没有和具有IPTG诱导。
图5E：定期给料导致蛋白产率增加。(左侧：示意图；右侧：实验数据)。将含有BL21(DE3)(ePop/ELPs-GFP-His)的MSB加载在注射器中，并培养24小时。总营养物和培养时间为3 mL LB培养基和72小时。营养物以定期方式分配(每次的营养物 × 给料次数)。对于样品3 × 1，在时间0补充3 mL培养基并在72小时收集。对于样品1.5 × 2，在时间0补充1.5 mL培养基并在36小时收集；并且在时间36补充另1.5 mL且在72小时收集。给料按如下程序进行。注射器水平放置，并允许MSB停留于壁上。将粗品推过滤器。随后，除去滤器，并将新培养基抽入注射器中。最后，再次附接滤器。将所得洗脱液分别在SDS-PAGE上测试。两个不同给料模式之间的洗脱体积和加载样品体积类似。
图5F：微滤纯化。在室温下触发LCST (低临界溶液温度)相变。加载混合物并过滤通过与0.2μm HT Tuffryn®膜偶联的注射器。在室温下，ELP或ELP-标签化蛋白的聚集物被微滤膜保留，同时使用高盐缓冲液洗去溶液中的其他组分。为了洗脱聚集的ELP，将D.I.水注射通过滤器以逆转ELP的LCST相变。
图5G：通过微滤纯化，来纯化ELP-标签化蛋白。添加外源ELP (5μM)和NaCl (2 M)，以触发粗品的LCST相变。加载粗品并过滤通过与0.2μm HT Tuffryn®膜偶联的注射器。为了洗脱聚合物，将D.I.水注射通过滤器。左侧条带显示His-标签纯化前的洗脱样品。右侧条带显示His-标签纯化后的洗脱样品。
图5H：通过整合的微滤和亲和色谱，从粗品纯化两种His-标签化蛋白。添加外源ELP (5μM)和NaCl (2 M)，以触发含有ELPs-GFP-His (POI1)和His-AAA (POI2)的粗品的LCST相变。随后，将粗品通过微滤纯化。POI1作为聚集物保留，同时POI2作为可溶组分过滤通过。随后，溶解聚集的ELP，并通过添加D.I.水以逆转ELP的LCST相变而洗脱。对洗脱部分(含有POI1)和过滤部分(含有POI2)二者，进行His-标签纯化。纯化结果在SDS-PAGE凝胶上测试，其中左侧条带显示POI1，且右侧条带显示POI2。
图6包括图示说明本公开的MSB平台的模块性和灵活性的代表性示意图。平台的核心是MSB。为了编程自主裂解，可以将ePop回路替换成其他回路，并在各种宿主训练(trains)中优化，并且可以表达通用POI (右侧)。通过基于壳聚糖的微胶囊获得分离，其可以替换成具有不同物理和化学特性的其他包封材料，包括不同的交联密度，电荷特性和适当的表面修饰(左侧)。
图7A-7D包括表征本公开的MSB平台的不同模块的代表性结果。
图7A：ePop动力学的实验测量。当在LB培养基中在37℃培养时，遗传回路在MC4100Z1细胞中产生群体水平的振荡。如所示，可以通过补充各种葡萄糖浓度(w/v)调整裂解率，如所指示的。
图7B：多种细胞株中的ePop动力学。当在LB培养基中在37℃培养时，遗传回路在多个株中产生群体水平的振荡，如所指示的。
图7C：在细菌生长期间，微胶囊大小作为时间的函数。将包封MG1655的壳聚糖胶囊在37℃下，在LB (红色)或M9 (绿色)培养基中培养。在时间零处，将大小标准化。
图7D：壳聚糖胶囊由于细胞生长而收缩，增加大分子的输出。将MG1655细胞和葡聚糖-罗丹明(Mw约70000 g/mol)包封在壳聚糖胶囊或藻酸盐胶囊中，并在37℃下，在LB或M9培养基中培养。使用或不用氨苄青霉素(100 μg/mL)处理胶囊。具有非生长细菌(被抗生素抑制)的胶囊的培养基中的罗丹明荧光被认为是基础水平的运输，其与胶囊的结构高度相关。因此，两种不同胶囊的运输能力计算为24小时后，具有或没有细胞生长的培养基中罗丹明荧光的比率(标准化)。实验进行一式三份。
图8A-8D包括证实微包封-介导的回路稳定性增强的代表性示意图(图8A和8B)和图片(图8C和8D)。
图8A：通过说明突变体产生，对目标蛋白(POI)的ePop-介导生产建模。在包封后，将生长体积分散到k个胶囊。假定所有胶囊的携带能力等于批量培养和相同的总营养物。一个胶囊中的初始细胞密度为批量培养的值除以k。在模型中，给予k 100的值。
图8B：用于比较ePop回路在批量培养和MSB培养中的遗传稳定性的实验方案。将等量的细胞接种在批量培养物中或包封在胶囊中，并补充具有相同量的营养物。在特定时间段后，从任一培养物收集细胞，并评估ePop回路功能。维持回路功能的细胞百分比，指示ePop回路对所述条件的遗传稳定性。
图8C：模拟预测隔离增强ePop回路的稳定性。X-轴显示不同的裂解率。Y-轴呈现基因稳定性。设定突变体群体的阈值。基因稳定性计算为当突变体群体超过阈值时的时间与整个时间跨度的比率。红色和绿色数据点分别呈现批量(bulk)和隔离的状态。
图8D：模拟预期，由于更高的回路稳定性，从相同量的培养基，来自MSB的蛋白产率大于来自批量培养的产率。显示了在不同的裂解率，对于批量或隔离状态，具有突变体的蛋白生产的模拟结果。当裂解率太小时，释放的蛋白太少；当裂解率太大时，群体快速地被突变体支配，再次导致蛋白产率降低。红色和绿色数据点分别呈现批量和隔离的状态。
图9A-9B包括证实BlaM生产作为用于平台功能测试的示例性蛋白的代表性结果。
图9A：与ePop回路偶联的BlaM的功能测试。将对羧苄青霉素敏感的MC4100细胞平铺在含羧苄青霉素的琼脂平板顶部。将大肠杆菌MC4100过夜培养物的上清液添加在不同的孔中：1 – 来自没有携带ePop回路且不表达BlaM的细胞的样品(阴性对照)；2 – 来自表达BlaM但不携带ePop的细胞；3 – 来自携带ePop且表达BlaM的细胞。如所示，只有放置在孔3中的样品导致平铺在琼脂上的敏感性细胞的援救，这是由于效应子BlaM的存在，其降解抗生素并由此允许敏感性MC4100细胞存活(孔3周围的晕环)。
图9B：β-内酰胺酶和fluorocilin的反应产生荧光信号。诱导MC4100Z1 (ePop/BlaM)细胞用于基因表达。向培养基补充0% (裂解回路开)或2%葡萄糖(裂解回路关)。将约20 μL收集的上清液通过PBS稀释10倍，并且随后通过酶促反应与底物(2 μM)混合。Y-轴显示对两种样品的荧光读出。当底物是饱和的时，荧光的初始斜率与BlaM的活性成比例。
图10A-10C包括证实弹性蛋白样多肽(ELP)由于其热敏感性可以作为用于纯化的热标签发挥作用的代表性结果。
图10A：ELP (ELP4-80, 5 μM)在约33℃经历热转化。
图10B：典型的逆转变循环涉及多轮的温度调整和离心。
图10C：在高盐浓度(NaCl 2 M)下，通过添加外源ELP (左侧)，在室温下发生粗品的相变。在相同盐浓度(NaCl 2 M)下，没有外源ELP (5 μM)，溶液是澄清的(右侧)。
图11A-11F包括证实在MSB平台中表达和纯化宽泛范围的蛋白的代表性结果。
图11A：在MSB平台中表达与Spytag/Spycatcher融合的多种ELP。从左至右它们为：AAA (SpyTag-弹性蛋白-SpyTag-弹性蛋白-SpyTag)、BBB (SpyCatcher-弹性蛋白-SpyCatcher-弹性蛋白-SpyCatcher)、AA-mcherry (SpyTag-弹性蛋白-mCherry-弹性蛋白-SpyTag)和BB (SpyCatcher-弹性蛋白-RGD-弹性蛋白-SpyCatcher)，其在T5启动子和p15A复制起点下表达。
图11B：在MSB平台中表达多种RLP标签化蛋白。从左至右它们为：RLPs-GFP-His(p15A/T7)、RLP-2-GFP-His (p15A/T5)和RLP-3-GFP-His (p15A/T5)。
图11C：在MSB平台中表达和纯化的超铀酰结合蛋白(SUP)。
图11D：在MSB平台中表达和纯化的色素-蛋白(PrancerPurple)。
图11E：在MSB平台中表达和纯化的酶(3A-BlaM)。
图11F：在MSB平台中表达和纯化多种治疗蛋白。左侧小图显示GLP-1-ELPs-His，且右侧小图显示格瑞弗森-His (GRFT)。
图12A-12B包括证实MSB平台是通用、灵活且方便的并且包含简单的组分和操作程序的代表性结果。
图12A：MSB可以长期储存而没有显著的性能损失。将等量的MSB在4℃或-80℃储存从1周至8周范围的不同时段。储存后，将其重悬在LB培养基中并培养48小时。与新鲜制备并培养48小时的对照相比，在-80℃储存的MSB即便在储存8周后仍具有可比的产率。实验进行一式三份。通过对照，将所有值标准化。
图12B：MSB平台的操作是简单且方便的。将胶囊(在-80℃储存)在室温下解冻并重悬在营养物中。将培养物转移到注射器，其具有附接在尖端上以避免泄露和蒸发培养基的0.45 μm亲水膜滤器。为了纯化，将His-标签结合柱连接在下游，并将培养物直推用于结合。
图13A-13C包括证实表面修饰可以进一步提高分离效率且对产量的影响几乎可以忽略的代表性结果。
图13A：通过逐层涂层方法修饰胶囊的表面。壳聚糖颗粒带正电。因此，通过首先沉积带负电的藻酸盐，随后沉积带正电的壳聚糖，以及其间的洗涤步骤，实施修饰。
图13B：在修饰后，胶囊表面从平滑变得粗糙。这些微胶囊在明场视野中成像。从左至右它们为：修饰前，仅沉积藻酸盐，和LbL修饰胶囊。
图13C：分离效率大大改进，并且对产量的影响可以忽略。逃逸率定义为逃逸细胞就总细胞数而言的百分比。将其作为24小时孵育后，MSB培养物的周围培养基中的细胞(MC4100Z1(ePop/BlaM))数量除以批量培养物中的细胞数量，来计算。在LbL修饰后，细胞的逃逸率与未-修饰相比降低约1000倍(左侧)。为了比较产率，使用PBS将MSB培养物(48小时)中的20 μL培养基稀释至200 μL并与Fluorocillin™ Green (Thermo Fisher)混合以获得2 μM的最终底物浓度。LbL修饰MSB显示与未-修饰MSB相比相当的产率(右侧)。测量进行一式三份。
图14A-14C包括证实通过电喷雾方法在壳聚糖微胶囊中包封细菌的代表性结果。
图14A：包封和处理后方案。将壳聚糖和细胞/溶液的均质混合物转入具有附接钝头的注射器中。将注射器放入装备有注射器泵的电喷雾系统中。将电喷雾系统的阳极(anode)连接至针头，并将阴极(cathode)连接至具有交联溶液(5% TPP)的无菌金属接收容器。在温和振荡下，以高电压将溶液喷雾到接收容器。
图14B：壳聚糖胶囊的形态和大小。细菌的直径约1 μm。微胶囊的直径约300-400 μm。
图14C：MG1655细胞的包封组成型表达GFP。在37℃，在M9培养基中孵育24小时后，在同相和GFP通道对这些微胶囊成像。
详述
本公开提供了涉及使用微生物生产生物分子的组合物、系统和方法。具体地，本公开提供了生物分子生产平台，其包括具有遗传回路的遗传工程化的微生物，所述遗传回路在功能上与由响应培养条件的材料形成的微胶囊偶联。本文公开的生物分子生产平台促进任何目标生物分子的有效且稳健的生产、纯化和/或分析。
生物制剂的小规模生产具有促进个体化药物以及增强生物制造的可达性的巨大潜力。通过利用细胞-材料反馈，开发了实现不同蛋白的通用生产、分析和纯化的简明平台。本公开中所描述的技术的核心在于微生物集群机器人(swarmbot)，其包括包封工程化细菌的刺激敏感的聚合物微胶囊。通过感知界限，在高局部密度下，细菌经历程序化的部分裂解。相反，包封材料响应由于细胞生长和死亡而导致的化学环境变化而收缩，挤出由细菌裂解释放的蛋白产物。随后，将这个平台与下游的酶促动力学量化和不同的蛋白纯化模式整合。本文呈现的实施方案证实了使用活细胞和材料之间的反馈，来工程化具有复杂程序化功能的模块化且灵活的平台。
细菌是用于生产不同生物制剂(占约30%的生物药物)的常见宿主。使用细菌宿主合成重组蛋白需要多个步骤，包括培养，通过物理或化学方式破坏细菌，并且随后分离和纯化期望的产物。对于工业操作，这些步骤通常大规模进行；因此，每个步骤需要复杂且精细的基础设施以确保效率和产物质量。尽管这对于生产大量分子可能是重要的，但在仅需要少量每种生物制剂时，这种形式对于生产不同生物制剂是不灵活且在经济上不适合的。此外，在缺少基本基础设施(例如运输、装备或电力)和具有必要的技术训练的人员的偏远或不发达地区，标准生物制造不是可达到的。由于高生产成本、运输和存储的冷链需要、以及生物制剂的短保存期，常规的某些产物的预先制造也可导致人力和资源的浪费。因此，存在技术开发的需要，用于通用且可规模扩展的不同生物制剂的按需生产，以及随后的分析和纯化。
这种需要推动了用于生物制造的单次使用技术(SUT)的开发和采用。然而，迄今为止，SUT关注于将常规的不锈钢基固定反应器替换为灵活且一次性部件，或反应器的直接小型化，而没有改变制造方法的基本结构。具体地，将生物制剂的生产分成多个步骤是标准规程，并且对于实施作为单元操作的生产和纯化是重要的，其中每个单元操作可以被单独地优化用于大规模生物制造。然而，每个步骤都可导致损失产物的机会，并且因此导致效力降低，特别是对于小规模操作。在生物药物制造运营成本中，75%-80%的总成本花费在下游处理上，包括细胞破坏，目标产物的后续分离、澄清和纯化。对于某些蛋白，工程化的分泌可促进提取处理。然而，细菌的不同分泌机制使得选择对每种重组蛋白适当的分泌途径非常复杂且耗时。此外，细菌宿主中的分泌效率通常受限，并且一些大的细胞质蛋白可能物理上是不能转移的。诱导的裂解可允许有效地释放不同的蛋白，但这没有简化细胞碎片分离的处理和下游纯化。
为了克服这些局限，我们将合成生物学和刺激-响应的生物材料的方面组合，以将生产、破碎和分离的多个步骤整合成简洁的形式。本公开的实施方案将工程化细菌的程序化裂解与受控的周期性胶囊相变偶联。当胶囊内部的局部细胞密度足够高时，将发生自主的部分裂解，并允许细胞释放其内容物，包括目标蛋白产物。细菌生长可改变局部环境条件(例如pH和离子强度)，驱动包封材料的相变。因此，在一些实施方案中，使用生长-敏感的胶囊的收缩，将释放的蛋白从内部运输到外部，同时将细胞和大的碎片捕获在胶囊内部。根据这些实施方案，可以使用营养物补充作为信号，以允许胶囊再次膨胀同时重置胶囊环境，并且还允许细胞密度在下跌至某一水平后开始增加。工程化细菌的持续部分裂解与包封材料的周期性相变之间的相互影响，使得能够持续产物合成和分离。
本公开的生物分子生产系统证实了通过工程化细菌和刺激-响应的材料之间的相互影响介导的主动反馈控制的用途，并且促成整合的蛋白合成、分离和下游处理。这种设计使得能够开发全新形式的SUT，用于分布式生物制造。通过设计，本公开的生物分子生产系统是模块化且可规模拓展的：取决于应用背景，可以将工程化基因回路、宿主株、靶产物、包封材料和下游处理(参见图6)分开优化，且随后整合。还可以将ePop回路替换成能够按程序自溶或与基于无细胞的系统整合的其他回路。在不同的细菌和酵母宿主中，可以使用适当基因回路执行类似设计构思。与无细胞系统相比，活细胞的使用具有更高的表达效率的优点。由于构建至MSB中的释放机制，本公开的生物分子生产平台不限于必须通过活细胞分泌的蛋白。
聚合物胶囊为活细胞提供物理支持，并且限制细胞和大碎片的自由扩散。在本研究中使用壳聚糖，部分是由于其充分确定的刺激响应性。其稳定性促进MSB的预先制备，并且使得能够长期储存且性能减低可忽略不计。通常，可以采用其他刺激-响应的材料，以微调生物相容性、耐久性和分离能力。例如，具有不同孔径或电荷特性的胶囊可以使得能够更有选择性地纯化大分子。此外，通过在聚合物胶囊上的表面修饰，可以进一步增强分离和澄清功能(图13)。如本文所述，应用逐层涂层技术以使用多聚阳离子的薄层修饰胶囊的表面。这种修饰使细胞的逃逸率显著降低约1000倍，而没有LB培养基中产率的显著损失(图13C)。对于修饰的MSB，在M9培养基中24小时后，细胞的逃逸率接近零。
在本章中使用的章节标题，以及本文的全部公开内容仅用于组织目的，并且不旨是限制性的。
1. 定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有如本领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本文件、包括定义为准。下文描述了优选的方法和材料，但在本公开的实施或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以其整体通过引用并入。本文公开的材料、方法和实施例仅为说明性的，并且不旨是限制性的。
如本文使用的术语“包含”、“包括”、“具有(“having”, “has”)”、“可以”，“含有”及其变式，旨在是开放式的过渡短语、术语或词语，其不排除其他行为或结构的可能性。除非上下文另有清楚指示，单数形式“一(“a”, “and”)”和“该”包括复数的指代物。本公开还预期“包含”本文呈现的实施方案或元件，“由本文呈现的实施方案或元件组成”和“基本由本文呈现的实施方案或元件组成”的其他实施方案，无论是否明确阐述。
对于本文记载的数值范围，明确地预期其间具有相同精确度每个中间数值。例如，对于6-9的范围，除6和9外，还预期数值7和8，并且，对于6.0-7.0的范围，明确预期数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文使用的“相关于”是指相比于。
如本文在两条或更多条多肽或多核苷酸序列的上下文中使用的“相同”或“同一性”，可以意指氨基酸或核苷酸序列在指定区域具有指定百分比的相同残基。百分比可以如下计算：通过两条序列的最佳比对，将两条序列在指定区域上比较，确定在两条序列上出现相同残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以指定区域中位置的总数量，并将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两条序列的长度不同或比对产生一个或多个交错末端且指定的比对区域仅包括单条序列的情况下，单条序列的残基包括在计算的分母而不是分子中。
如本文使用的“分离的多核苷酸”可意指(例如，基因组、cDNA，或合成来源或其组合的)多核苷酸，其由于其来源，分离的多核苷酸不缔合与“分离的多核苷酸”一起天然发现的全部或部分多核苷酸；可操作地连接至它不天然连接的多核苷酸；或不作为较大序列的一部分天然存在。
“肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的寡聚物至短聚合物。与其他氨基酸聚合物(例如蛋白、多肽等)不同，肽的长度为约50个氨基酸或更少。肽可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物，和/或修饰的氨基酸。肽可以是天然存在的蛋白或非天然(人工)序列的子序列。
“多肽”是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物，其长度大于约50个氨基酸。多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、氨基酸类似物和/或修饰的氨基酸，并且可以是天然存在的序列，或非天然(人工)序列，或天然存在的蛋白或非天然(人工)序列的子序列。“人工”是指由人设计或制备且不是天然存在的组合物和系统。例如，人工序列是指不是天然存在的氨基酸或核苷酸序列(例如，与天然存在的蛋白或其片段没有100%同一性的多肽)。“保守的”氨基酸取代是指肽或多肽中的氨基酸被具有类似化学特性(例如大小或电荷)的另一氨基酸取代。出于本公开的目的，以下八个组中的每一个中含有的氨基酸彼此为保守取代：
1)丙氨酸(A)和甘氨酸(G);
2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；
3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；
4)精氨酸(R)和赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；
6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)；
7)丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；和
8)半胱氨酸(C)和甲硫氨酸(M)。
天然存在的残基可以基于共同的侧链特性分成以下类别，例如：极性正电(或碱性)(组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R))；极性负电(或酸性)(天冬氨酸(D)、谷氨酸(E))；极性中性(丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q))；非极性脂肪族(丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M))；非极性芳族(苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W))；脯氨酸和甘氨酸；和半胱氨酸。如本文使用的，“半保守的”氨基酸取代是指肽或多肽中的氨基酸被相同类别内的另一氨基酸取代。
“变体”在本文中用于描述通过氨基酸的插入、删除或保守取代而在氨基酸序列中不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“SNP”是指作为单核苷酸多态性的变体。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫响应的能力。变体在本文中也用于描述具有与参考蛋白基本相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。本领域将氨基酸的保守取代（即将氨基酸替换为具有类似特性(例如亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸）公认为通常涉及微小的改变。如本领域中所理解的，可以通过考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)，部分地鉴定这些微小的改变。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域中已知，可以取代亲水指数类似的氨基酸且仍保留蛋白功能。一方面，取代具有±2的亲水指数的氨基酸。也可以使用氨基酸的亲水性揭示将产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性，允许计算该肽的最大局部平均亲水性，已报道这是与抗原性和免疫原性良好相关的有用的量度。美国专利号4,554,101，通过引用全文并入本文。如本领域中所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可以使用具有彼此在±2以内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受到该氨基酸的具体侧链的影响。与该观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸并且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。
“载体”在本文中用于描述核酸分子，其可以运输与其连接的另一核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可连接其他DNA区段的圆形双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接至病毒基因组中。某些载体可以在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常为质粒的形式。“质粒”和“载体”可互换地使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，可以使用达到等同功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。在此方面，RNA形式的载体(包括RNA病毒载体)也可以在本公开的背景下得到应用。
除非本文另有定义，与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学以及杂交相关使用的任何术语及其技术，是本领域中熟知且常用的那些。术语的含义和范围应当是清楚的；然而，在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。进一步地，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
2. 微生物
本公开的实施方案包括微生物用于生物分子生产的用途。根据这些实施方案，用于生物分子生产的系统和平台包括多种遗传工程化的微生物，其包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具。在一些实施方案中，微生物包括细菌和酵母的各种菌株(包括益生菌和非益生菌菌株)。在一些实施方案中，考虑到它们的遗传多样性以及在生物分子生产中的稳健应用，使用各种大肠杆菌菌株。可以在本公开的生物分子平台和系统中使用的细菌菌株包括但不限于大肠杆菌菌株，例如MC4100 (例如MC4100Z1)、MG1655、BL21 (例如BL21(DE3))、NISSLE1917，及其各种变体或衍生菌株。可以使用的其他细菌菌株包括在下表1中。
表1：大肠杆菌表达菌株。
Figure 286999DEST_PATH_IMAGE001
。
在一些实施方案中，各种酵母菌株可以用于本公开的生物分子生产平台和系统。这些包括例如来自属酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、汉逊酵母属(Hansenula)和耶氏酵母属(Yarrowia)的菌株。
也可以使用其他微生物，如本领域普通技术人员基于本公开所认识到的。
3. 遗传回路
本公开的实施方案包括微生物用于生物分子生产的用途，所述微生物包括一个或多个遗传回路。遗传回路可以包括一个或多个用于实施各种功能(例如生物分子生产)的模块。例如，如本文所述，ePop遗传回路包括细胞裂解模块(例如基于编码来自噬菌体phiX174的E蛋白的基因)，和细胞密度传感模块(例如，基于突变的luxR基因和缺少Rom/Rop蛋白的ColE1复制起点)，其促进自主的生物分子生产。根据这些实施方案，工程化的ePop回路可以用于程序化的自主裂解。可以配置回路以利用ColE1型质粒中的细胞密度依赖性拷贝数控制，其与毒素的泄露表达偶联(参见例如图2A)。高细胞密度可以导致质粒拷贝数增加和更多的E蛋白表达，其随后导致细菌亚群的裂解。通过外源控制培养基的一种或多种条件，可容易地调节回路动力学。
遗传回路可以包括实施期望功能的任何数量的模块，包括但不限于，细胞密度的传感，以及细胞密度-依赖性细胞裂解(例如，任何细胞裂解基质的触发表达，包括可以导致细胞裂解的任何基因/蛋白的表达)，如本文所述。在一些实施方案中，细胞密度传感和相关的功能可以基于群体传感系统(quorum sensing system)，并且可以用于产生遗传回路的一个或多个模块。群体传感系统是本领域中熟知的，并且可以是产生根据本文所述的方法和系统的遗传回路的基础(参见例如，You, L.等人，Nature, 428: pp. 868–871 (2004年4月22日))。
如本文所述，很多其他遗传回路可以用作本公开的生物分子生产平台和系统的部分。如本领域普通技术人员可在本公开的基础上认识到的，可以通过利用微生物中的各种生物过程，创造各种遗传回路，如下表2中所概述的(参见例如Bradley等人，Tools andPrinciples for Microbial Gene Circuit Engineering, J. of Mol. Biol. (2016):428(5B), pp. 862-888)。
表2：创造遗传回路的基础
Figure 735298DEST_PATH_IMAGE002
Figure 46193DEST_PATH_IMAGE003
Figure 238140DEST_PATH_IMAGE004
4. 生物分子
本公开的实施方案提供了使用遗传工程化的微生物(例如MSB)生产生物分子的系统和平台，如本文所述。根据这些实施方案，可以使用本文所述的方法、系统和平台生产的生物分子包括但不限于：肽、多肽、蛋白、核酸、多聚核酸、DNA分子(双链或单链)、RNA分子(双链或单链)、小分子化合物，及其任何衍生物或组合。
在一些实施方案中，目标生物分子是多肽是由氨基酸制成的基于蛋白的分子。此类蛋白/肽包括但不限于：酶、抗体、肽激素、治疗性生物制剂/生物仿制剂、免疫调节蛋白、抗原蛋白、免疫原性蛋白、细胞质蛋白、核蛋白、融合蛋白、标签化的蛋白、嵌合抗原受体蛋白、转录因子、受体、受体结合配体、病毒蛋白、包含癌表位的蛋白、抗微生物蛋白、糖蛋白、合成蛋白、天然蛋白、生物聚合物、支架蛋白等。
在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法、系统和平台生产的蛋白包括ELP(其中一些与spytag和spycatcher融合)、RLP、配体结合蛋白、色素蛋白和酶(参见例如图11A-11E和表3)。在一些实施方案中，可以使用本文所述的方法、系统和平台生产的蛋白包括多种治疗性生物制剂，包括用于治疗2型糖型的胰高血糖素样肽1 (GLP-1)，以及HIV和Zika感染的有效抑制剂格瑞弗森(griffithsin)(参见例如图11F)。
除了遗传回路，本文所述的微生物可以包括用于生产目标生物分子(例如蛋白/肽)的工具。根据这些实施方案，用于生产目标生物分子的工具可以包括包含编码蛋白/肽的基因的质粒。在一些实施方案中，此类质粒包括控制其表达的调控元件，例如启动子。在其他实施方案中，此类质粒插入到微生物的基因组中，使得可以通过相邻的调控元件控制其表达。如本文所述，大肠杆菌菌株MC4100Z1包括ePop回路以及在IPTG诱导型启动子控制下表达BlaM的质粒；大肠杆菌菌株BL21(DE3)包括ePop回路以及在T7启动子控制下表达ELPs-GFP-His或RLPs-GFP-His的质粒；并且大肠杆菌菌株MC4100Z1包括ePop回路以及具有T5启动子调控的其他回路(参见例如表3)。
5. 包封材料
本公开的实施方案包括使用包含在包封材料(例如形成含有所述微生物的微胶囊)中的微生物生产生物分子的平台和系统。根据这些实施方案，包封材料可以与微生物内的遗传回路功能性偶联，使得包封材料响应可以由微生物改变的一种或多种环境(例如培养)条件。
例如，如本文所述，微生物生长可以影响培养条件的局部pH和离子强度，其随后可以导致包封材料(例如，壳聚糖网络)中的相变。随着微生物在微胶囊中的生长，培养条件的pH和离子强度改变，这导致微胶囊大小的收缩，因此将目标生物分子释放到培养基中，可以对其进行分析/收集/纯化。将包封材料与微生物中的遗传回路功能性偶联的其他工具可以基于遗传回路的各种特性，如本领域普通技术人员基于本公开所认识到的。例如，可以将包封材料工程化，以响应其他培养条件，例如但不限于温度和光，或任何其他条件，其中可以将微生物工程化以可以由包封材料感测的方式改变所述条件。
如本文所述，可以使用各种包封材料，包括但不限于能够形成聚合物的任何天然和/或合成材料，例如壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、聚乙二醇聚合物、聚氧化乙烯聚合物、弹性蛋白样多肽(ELP)、节肢弹性蛋白样多肽(RLP)，或其任何衍生物或组合。也可以使用其他包封材料，如本领域普通技术人员基于本公开所认识到的。
包封材料通常包括形成微胶囊的能力和特性，从而含有本文所述的微生物。在一些实施方案中，微胶囊经配制而具有特定的大小或直径，例如以实施给定的功能或减缓突变微生物的发展。在一些实施方案中，微胶囊的直径可以在约50 μm至约5000 μm，直径在约50 μm至约4000 μm，直径在约50 μm至约3000 μm，直径在约50 μm至约2000 μm，直径在约50μm至约1000 μm，直径在约50 μm至约500 μm，或直径在约50 μm至约250 μm的范围。在一些实施方案中，微胶囊的直径可以在约100 μm至约5000 μm，直径在约250 μm至约4000 μm，直径在约500 μm至约3000 μm，直径在约500 μm至约2000 μm，或直径在约1000 μm至约1500 μm的范围。在一些实施方案中，微胶囊的直径可以在约100 μm至约500 μm，直径在约200 μm至约500 μm，直径在约300 μm至约500 μm，或直径在约300 μm至约400 μm的范围。因此，微胶囊内的微生物浓度可以在约102至约1010，约102至约108，或约102至约106的范围，取决于微生物的菌株，可得的营养物，以及各种培养条件。
生产、制造或制作含有微生物(例如MSB)微胶囊的方法是本领域中通常已知的，并且包括但不限于电喷雾、电流体喷雾、PDMS压印以及使用产生液滴的微流体装置的方法，等。
6. 微流体
本公开的实施方案还包括使用如本所述的微生物(例如MSB)生产生物分子的微流体装置和平台。根据这些实施方案，微流体装置和平台可以用于促进所生产的生物分子的生产、分离、收集、纯化和分析。在一些实施方案中，微流体装置和平台包括输入通道、生产室和测定室。生产室通产含有包含在微胶囊内的微生物，并且其可以与输入通道流体偶联，使得来自来源的培养基和营养物流入到输入通道中，且随后到生产室中以达到微生物。可以包括超过一个输入通道，这取决于期望的营养物流和培养条件。在一些实施方案中，测定室流体偶联到生产室的下游，以促进通过生产室中的微生物生产并释放的目标生物分子的收集和分析。
在一些实施方案中，微流体装置或平台包括与测定室或生产室流体偶联的输出通道，通过生产室中的微生物生产并释放的这样的目标生物分子将流到所述输出通道用于收集和/或纯化。在一些实施方案中，微流体装置或平台包括与测定室或生产室流体偶联的纯化芯片，通过生产室中的微生物生产并释放的这样的目标生物分子将流到所述纯化芯片中，用于收集和/或纯化。在一些实施方案中，可以修饰纯化芯片，以促进目标生物分子的结合，包括包被纯化芯片的内表面以促进目标生物分子与基底的结合，随后可以处理基底以洗脱目标生物分子(例如，PEG包被的螯合Cu2+)。
如本文所述，为了促进目标生物分子与其他组分的分离、收集和/或纯化，本公开的微流体装置和平台可以包括配制目标生物分子以包括用于与微流体装置的基底或部分连接或结合的标签或其他工具。连同具体标签，微流体装置可以包括用于结合所述标签的工具，使得可以将目标生物分子与其他组分分离(例如His-标签纯化)。
7. 蛋白生产的方法
本公开的实施方案包括使用遗传工程化的微生物(例如MSB)生产目标生物分子的方法，如本文所述。根据这些实施方案，所述方法包括将包含在微胶囊中的多种遗传工程化的微生物加载到微流体装置中。所述多种遗传工程化的微生物可以包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具。所述方法还包括向多种微生物提供营养物；并且允许生产所述目标生物分子。在一些实施方案中，所述方法还包括分离、收集、纯化和/或分析正在生产的生物分子。
本文所述的方法能够以各种产率生产目标生物分子。在一些实施方案中，当目标生物分子是蛋白/肽时，产率可以是约10 mg/L至约100 mg/L，约10 mg/L至约90 mg/L，约10mg/L至约80 mg/L，约10 mg/L至约70 mg/L，约10 mg/L至约60 mg/L，约10 mg/L至约50 mg/L，约10 mg/L至约40 mg/L，约10 mg/L至约30 mg/L，或约10 mg/L至约20 mg/L。
如本文所述，自主的生物分子生产可以基于与刺激-响应的包封材料功能性偶联的遗传回路之间的相互作用，例如与导致微胶囊收缩的pH/离子强度改变偶联的微生物生长/裂解，由此将生物分子释放到培养物中。此外，生物分子生产可以独立于微生物生长/裂解(或与微生物生长/裂解脱偶联)。在一些实施方案中，可以发生生物分子生产，但生物分子被主动或被动地运输出微胶囊而没有裂解。在一些实施方案中，可以开发或设计遗传回路以促进独立于生长的生物分子生产。
8. 材料和方法
细菌菌株。使用大肠杆菌菌株MC4100Z1以单独携带ePop回路，或具有在IPTG诱导型启动子控制下表达BlaM的质粒。使用大肠杆菌菌株BL21(DE3)以携带ePop回路和在T7启动子控制下表达ELPs-GFP-His或RLPs-GFP-His的质粒。使用大肠杆菌菌株MC4100Z1以携带ePop回路和具有T5启动子的其他回路。本文使用的构建体提供在下表3中。
表3：构建体
构建体 细胞株 蛋白表达质粒 启动子
BlaM MC4100Z1 BlaM (模型蛋白) pLacI/ara-1
ELPs-GFP-His BL21(DE3) (E4-80)-GFP-His (模型蛋白) (GVGVP)80 T7
RLPs-GFP-His BL21(DE3) (RLP-1)-GFP-His (模型蛋白) (GRGDSPYQ)20 T7
RLP-2-GFP-His MC4100Z1 (RLP-2)-GFP-His (GRGDQPYQ)20 T5
RLP-3-GFP-His MC4100Z1 (RLP-3)-GFP-His (GRGDSPYS)80 T5
pAAA MC4100Z1 His-SpyTag-弹性蛋白-SpyTag-弹性蛋白- SpyTag T5
pBBB MC4100Z1 His-SpyCatcher-弹性蛋白-SpyCatcher-弹性蛋白-SpyCatcher T5
pAA-mcherry MC4100Z1 His-SpyTag-弹性蛋白-mCherry-弹性蛋白-SpyTag T5
pBB MC4100Z1 His-SpyCatcher-弹性蛋白-RGD-弹性蛋白-SpyCatcher T5
GLP-1 BL21(DE3) GLP-1-ELP4-80-His (GVGVP)80 (治疗剂) T7
格瑞弗森 BL21(DE3) 格瑞弗森-His (治疗剂) T7
SUP MC4100Z1 His-SpyTag-弹性蛋白-SpyTag-弹性蛋白- SpyTag-SUP T5
3A-BlaM MC4100Z1 His-SpyTag-弹性蛋白-SpyTag-弹性蛋白- SpyTag-BlaM T5
3A-PrancerPurple MC4100Z1 His-SpyTag-弹性蛋白-SpyTag-弹性蛋白- SpyTag- PrancerPurple T5
*除非另有指明，每种构建体包括p15A复制起点并且与ePop回路共表达。
回路和质粒。ePop (ColE1起点)在此前公开。简而言之，它使用来自pluxGFPuv的luxbox区(费氏弧菌(V. fischeri)中luxI上游的140 bp)和来自φX174的E基因编码序列(NEB)构建。将每个区域PCT扩增，且随后在重叠PCR反应中连接在一起。将“lux box-E基因”片段插入到宿主载体pLuxRI2的AatII位点中。
BlaM (p15A起点)在此前公开。简而言之，它通过将来自pSND-1的没有前66个碱基对的bla基因PCR扩增，并将其插入到pPROLar.A122的Plac/ara-1 (Clonetech)之下而构建。
ELPs-GFP-His (模型蛋白)、RLPs-GFP-His、GLP-1-ELPs-His和其他ELPs/RLP变体在此前构建。将片段克隆到具有T7或T7启动子和p15A起点的载体中。
使用此前描述的质粒，构建His-AAA、His-BBB、His-AA-mcherry和His-BB。将片段克隆到具有T5启动子和p15A起点的载体中。
使用此前描述的质粒构建3A-SUP。将片段克隆到具有T5启动子和p15A起点的载体中。
使用来自ATUM (CPB-37-441)的质粒和His-AAA构建3A-PrancerPurple。将PrancerPurple克隆到His-AAA的下游。
使用来自GENEWIZ的合成片段(3A-BlaM)构建3A-BlaM。将片段克隆到具有T5启动子和p15A起点的载体中。
使用此前描述的质粒构建格瑞弗森-His。将片段克隆到具有T7启动子和p15A起点的载体中。
生长培养基。LB培养基：将25 g LB培养液粉末(MO BIO Laboratories, Inc)添加到1 L去离子H2O中。在高压灭菌45分钟后，将LB培养基在室温下储存。适当时，向培养基补充适合的抗生素(100 μg/mL氯霉素，50 μg/mL 卡那霉素，100 μg/mL氨苄青霉素)。
M9培养基：将1X M9盐(48 mM Na2HPO4、22 mM KH2PO4、862 mM NaCl、19 mMNH4Cl)、0.4%葡萄糖、0.2%酪蛋白氨基酸(Teknova)、0.5%硫胺素(Sigma)、2 mM MgSO4、0.1mM CaCl2)添加到1 L去离子H2O中。通过VWR Symphony SB70P pH计，将M9培养基调节至pH= 7并通过0.22 μm滤器过滤。
液体培养。将携带ePop回路的细胞划线到补充2% (w/v)葡萄糖的琼脂平板上，并在37℃孵育16小时。随后，挑取单菌落并接种在3 mL LB培养基中。适当时，向琼脂和液体培养基补充适合的抗生素。对于携带ePop回路的细胞，在过夜培养物中补充2% (w/v)葡萄糖。使用1 mM IPTG诱导携带所有蛋白表达回路的细菌。
程序化裂解的评估。将携带ePop回路的工程化细菌(MC4100Z1(ePop))接种在含有抗生素和2%葡萄糖的3 mL LB培养基中，并在37℃以250 rpm的振荡速度培养过夜。随后，将校准的培养物稀释到补充了抗生素和各种浓度的葡萄糖的LB培养基中。将200 μL培养物等分到96孔板中，随后将其用50 μL矿物油密封以防止蒸发。使用读板器(Tecan infiniteM200 pro)测量培养物的光密度(OD600)。对于数据分析，对测量的OD600值进行背景校正。在长期分批培养期间观察到群体振荡的多个周期时，认为裂解回路是功能性的。
为了观察微流体装置上的细胞的振荡性行为，将20 μL过夜培养物(MC4100Z1(ePop/GFP))接种到2 mL LB培养基中，并培养8小时。随后，将细胞重悬浮在M9培养基中，并将其加载到培养室中。M9培养基以120 μL/小时连续补充。微流体装置的设计在此前公开，同时装置的高度为约1.5 μm。将整个装置在37℃培养，并且采用具有100X物镜的Nikon Ti-E显微镜用于长期监测。
藻酸盐和壳聚糖微胶囊的生产。通过电喷雾制作含有细菌细胞的壳聚糖微胶囊(图14)。将2% (w/v，于1%乙酸溶液中)壳聚糖(Sigma-Aldrich)溶液和细胞的均质混合物转入具有附接钝头的注射器中。将注射器放入装备有注射器泵的电喷雾系统中。将电喷雾系统的阳极连接至针头，并将阴极连接至具有交联溶液(5% w/v 三聚磷酸盐)的无菌金属接收容器。在搅拌下，以高电压(5 kV)将溶液喷雾到接收容器。通过在500g离心5分钟收集微胶囊，并使用PBS清洗两次。制备藻酸盐胶囊的程序和设备与本文所述相同。作为代替，使用2% (w/v，D.I.水中)藻酸钠(Sigma-Aldrich)溶液，且交联溶液为1.5% (w/v)氯化钙。
蛋白输出的效率。使用与罗丹明缀合的高分子量(约70000 g/mol)葡聚糖作为模型蛋白。将约30 μL葡聚糖-罗丹明(20 mg/mL)和30 μL的MG1655细胞(对氨苄青霉素敏感)的过夜培养物混合，并使用300 μL壳聚糖或藻酸盐溶液将其包封。首先，通过PBS/CaCl2(1.5% w/v)清洗壳聚糖/藻酸盐胶囊三次，且随后在3 mL LB或M9培养基中培养。作为对照，将胶囊在具有氨苄青霉素的LB或M9培养基中培养，消除细胞生长。在不同的时间点取100 μL的培养基，并且通过读板器(Tecan infinite M200 pro)测量来自培养基的荧光信号。测量进行一式三份并背景校正。
β-内酰胺酶活性的量化。使用1 mM IPTG诱导携带ePop回路和BlaM-表达质粒的细菌MC4100Z1 (MC4100Z1 (ePop/BlaM))。使用PBS，将约20 μL上清液稀释至200 μL并与Fluorocillin™ Green (Thermo Fisher)混合以获得2 μM的最终底物浓度。在通过BlaM切割后，Fluorocillin™ Green试剂可以被转化成荧光产物。使用读板器(Tecan infiniteM200 pro)测量所得的荧光。测量进行一式三份并背景校正。
遗传稳定性。开发动力学模型以检查ePop回路在不同条件下的遗传稳定性，以及对整体蛋白生产效率的影响。表4和表5 (下文)提供了涉及模型开发、参数选择以及模拟的初始条件的细节。
表4：ODE建模中使用的定义和参数值
Figure 786933DEST_PATH_IMAGE006
表5：ODE建模中使用的初始条件
Figure 406134DEST_PATH_IMAGE007
为了实验测定基因稳定性对时间的依赖性，将30 μL MC4100Z1 (ePop)细胞的过夜培养物接种至3 mL M9培养基中，或使用300 μL壳聚糖溶液包封成胶囊，并补充额外的3mL M9培养基。在24、48和72小时后，从批量培养物或从MSB收集细菌(详细的释放程序参见下文)，并铺板在琼脂平板上。为了从MSB释放细菌，通过反复抽吸，使用2.5 M NaCl使胶囊不稳定(图8C)。从每个平板挑取10个克隆，并对每个克隆测试ePop回路动力学是否维持。如果回路功能维持，则将克隆视为在表型上等同于野生型。使用维持回路功能的克隆的百分比以生成图3D。测量进行一式三份。
为了测定回路稳定性对裂解率的依赖性，将30 μL MC4100Z1 (ePop)细胞的过夜培养物接种至3 mL M9培养基中，或使用300 μL壳聚糖溶液包封成胶囊，并补充3 mL M9培养基。每种培养物补充0%、0.05%或0.1% (w/v)葡萄糖，以调整裂解率，其随着葡萄糖浓度降低(图7B)。在72小时后，从批量培养物或从MSB培养物收集细胞，并铺板在琼脂平板上。从每个平板挑取10个克隆，并对每个克隆测试ePop回路动力学是否维持。使用维持回路功能的克隆的百分比以生成图3E。测量进行一式三份。
β-内酰胺酶活性。将等量(30 μL)的MC4100Z1(ePop/BlaM)细胞的过夜培养物接种至3 mL M9培养基中，或使用300 μL壳聚糖溶液包封成胶囊，并补充3 mL M9培养基。在培养器中以37℃培养72小时后，使用PBS，将20 μL上清液稀释至200 μL并与Fluorocillin™Green (Thermal fishier technology)混合以获得2 μM的最终底物浓度。使用读板器(Tecan infinite M200 pro)测量作为时间的函数的所得荧光。每个测量进行一式三份并背景校正。
可以通过Michaelis-Menten动力学描述Fluorocillin至荧光产物的转化：
Figure 204325DEST_PATH_IMAGE008
其中，v是荧光(F)增加的初始速率，k是催化常数，K是Michaelis-Menten常数，E 0 是BlaM的浓度，并且[S]是底物(Fluorocillin)的浓度。当底物饱和时([S] >>K)，v = kE 0，因此，v提供了酶活性的直接测量。在实验中，通过取F在初始时间窗口(F随时间线性增加时)的时间导数，确定v (图9)。
微流体装置制作。通过在硅晶片上旋涂两层SU8 3050 (MicroChem，1000 rpm进行30秒)来制作光刻胶主模，随后将其在95℃下预烘烤60分钟，并与预先设计的光掩膜(AutoCAD) UV交联。将UV暴露的晶片在95℃下后烘烤20分钟，使用SU8显影剂显影，并且最后在95℃下硬烘烤过夜。用于微流体装置的SU8模具的高度为约450 μm。随后，通过将混合的PDMS溶液(Dow Corning SYLGARD® 184, 单体：固化剂为10:1)倾倒在主模上，将溶液真空脱气，并将其在80℃下烘烤30分钟，制作含有设计结构的PDMS微流体装置。溶液固化后，使用组织环切刀钻孔用于输入和输出流。通过在40瓦特等离子处理30秒，将PDMS装置与盖片结合。
取决于其目的，制作两种不同的微流体装置。第一装置设计用于监测和量化BlaM生产。装置包括主通道(宽度 = 500 μm, 长度 = 5.3 mm)，圆形培养室(直径 = 1 mm)，两个捕获通道(宽度 = 60 μm, 长度 = 720 μm)，底物递送通道(宽度 = 150 μm, 长度 =2.2 mm)，测定室(直径 = 400 μm)，和输出通道(宽度 = 240 μm, 长度 = 2.2 mm)。胶囊被捕获在培养室中，因为它们的直径(200 – 400 μm)大于捕获通道的直径。使用底物递送通道，使fluorocillin溶液流入，以测定从培养室释放的BlaM活性。
第二装置设计用于证实整合的蛋白生产和纯化。它包括两个分离的芯片。第一、生产芯片与上文对第一装置描述的类似。生产芯片包括主通道(宽度 = 1200 μm, 长度 = 8mm)，培养室(直径 = 3 mm)，和三个捕获通道(宽度 = 90 μm, 长度 = 4.5 mm)。三个捕获通道合并成单个输出，通过Teflon管连接至第二芯片(纯化芯片)。纯化芯片包括重复的蛇形通道(宽度 = 1mm, 长度 = 17 mm, 外径 = 1.75 mm, 内径 = 0.75 mm)。将PDMS装置粘合到Cu-NTA (铜-次氮基三乙酸)包被的载玻片(MicroSurfaces Inc)，用于结合His-标签化的蛋白。
培养和检测MSB。在将微胶囊加载到培养室中之前，使微流体装置抽真空15分钟以防止气泡产生。除非另有说明，使用可编程的注射泵(Harvard Apparatus, Pump 11Elite)，以控制输入流模式。对于周期脉冲，每次灌注的流速设定为0.5 μL/min，进行30分钟，且随后在下一脉冲之前，延迟(0 μL/min) 90分钟。将营养物和底物(PBS中10 μMFluorocillin)的流动模式同步。对于粗品在纯化芯片中的结合，流速设定为0.5μL/分钟。对后续的洗涤(PBS)和洗脱步骤(100 mM EDTA)使用相同的流速。微流体装置安装在显微镜罩中，并在37℃培养。采用具有10X物镜的倒置荧光显微镜(Nikon Eclipse Ti)检测胶囊大小以及通过酶促反应生成的荧光信号的动力学。通过使用ImageJ，取整个测定室灰度水平的平均值，来量化荧光信号强度。
蛋白纯化。对于His-标签亲和纯化，使用Sigma-Aldrich建议的方案，将cOmplete™ His-标签纯化柱(Sigma-Aldrich)用于台式连续纯化。使用cOmplete™ His-标签纯化柱是由于其最少的镍离子泄露，这对于治疗剂相关蛋白的纯化会是重要的。
对于通过微过滤的ELPs-标签化蛋白纯化，首先，将来自MSB培养物的10 mL粗品用0.45 μm HT Tuffryn®膜过滤，且随后与外源ELPs (5 μM)和NaCl (2 M)混合，以触发LCST相变。加载含有聚集物(由触发ELPs和ELPs-标签化靶蛋白组成)的混合物，并过滤通过与0.2 μm HT Tuffryn®膜偶联的注射器。为了洗涤沉积在滤器上的聚集物，将5 mL的2 MNaCl注射通过滤器，以除去溶液中的蛋白，同时保留聚集物。为了洗脱聚集，使1 ml的D.I.水通过滤器，导致保留的聚集物的重新溶解。收集洗脱溶液用于下一步His-标签纯化。对于所有蛋白样品，将使用Coomassie蓝染料的SDS–PAGE用于验证目标蛋白的纯度。
使用MSB生产ELPs/RLPs标签化蛋白、治疗蛋白和其他蛋白。对于ELPs/RLPs标签化蛋白、治疗蛋白和其他蛋白的台式生产(bench production)，将375 μL携带裂解回路和蛋白表达回路的细胞的过夜培养物离心，并重悬在37.5 μL LB培养基中，并包封到375 μL壳聚糖溶液中，用于MSB培养。将胶囊加载到补充有10 mL LB培养基和适当的抗生素的20 mL注射器中，并在37℃培养24小时。将具有低蛋白结合特性的0.45 μm HT Tuffryn®膜附接在注射器的尖端，以避免泄露和蒸发培养基。通过使用Nanodrop分光光度计ND-1000，通过280 nm的吸光度测量纯化蛋白的浓度。
MSB平台性能的长期监测。为了评估MSB的长期性能，首先，使用如上所述的相同方案制备MSB。简而言之，将375 μL细胞BL21(DE3)(ePop/ELPs-GFP-His)的过夜培养物离心，并重悬在37.5 μL LB培养基中，并包封到375 μL壳聚糖溶液中，用于MSB培养。将MSB在7000rpm离心5分钟，且随后在4℃或-80℃储存。在不同的时间窗口后，取出MSB且随后使用3 mLLB培养基回收，并在37℃培养48小时。通过测量在280 nm的吸光度，量化纯化蛋白的量。以使用新鲜制备的和用3 mL LB在37℃培养48小时的MSB生产的蛋白量，对所有数据标准化。实验进行一式三份。
通过逐层涂层技术修饰胶囊的表面。将约375 μL细胞(MC4100Z1 (ePop/BlaM))的过夜培养物离心，并重悬在37.5 μL LB培养基中，并包封到375 μL壳聚糖溶液中。首先，用PBS洗涤胶囊，且随后在温和振荡下，在1.5 mL藻酸盐溶液(0.1%/(w/v))中孵育15分钟。将所得胶囊离心，收集，再次用PBS洗涤，且随后在温和振荡下，在1.5 mL壳聚糖溶液(0.4%/(w/v))中再孵育15分钟。再次用PBS洗涤所得胶囊，并收集。
为了计算逃逸细胞的百分比并比较产率，将等量的正常和表面修饰的胶囊接种到具有适当的抗生素和1 mM IPTG的3 mL LB中，并在37℃培养24小时。为了计算逃逸细胞的百分比，在MSB培养物中对两种情况(正常和修饰的)计数周围培养基中的CFU，并除以批量培养条件的CFU。为了比较产率，使用PBS将20 μL上清液稀释至200 μL并与Fluorocillin™Green (Thermo Fisher)混合以获得2 μM的最终底物浓度。在通过BlaM切割后，Fluorocillin™ Green试剂可以被转化成荧光产物。使用读板器(Tecan infinite M200pro)测量所得的荧光。测量进行一式三份并背景校正。
数学推导。群体定义为
Figure 137646DEST_PATH_IMAGE009
，其代表群体的密度。密度的单位定义为
Figure 603263DEST_PATH_IMAGE010
。在此，群体的总数可以是
Figure 331047DEST_PATH_IMAGE011
，其中
Figure 118000DEST_PATH_IMAGE012
是培养环境的体积。因为通过包封的空间隔离为每个群体提供了较小的体积，对于每个集群机器人胶囊的细胞总数
Figure 651749DEST_PATH_IMAGE013
将小于批量液体培养环境中的细胞总数。假设总细胞数的规模如下。
MSB胶囊：
Figure 909555DEST_PATH_IMAGE014
液体培养物：
Figure 870558DEST_PATH_IMAGE015
随后，可以通过数学推导隔离如何提高针对突变体数量增加的遗传稳定性。首先，
Figure 908921DEST_PATH_IMAGE016
是通过突变体频率
Figure 918466DEST_PATH_IMAGE017
，以及由生长率
Figure 358674DEST_PATH_IMAGE018
、细胞密度
Figure 428261DEST_PATH_IMAGE019
和体积
Figure 953921DEST_PATH_IMAGE012
定义的密度变化而计算的群体中突变体的平均数量。
Figure 563894DEST_PATH_IMAGE020
根据泊松分布的方程，我们可以推导如下。使用泊松分布，无突变体的可能性：
Figure 796292DEST_PATH_IMAGE021
MSB胶囊无突变体的可能性(下标S代表小体积)。
定义。
Figure 364676DEST_PATH_IMAGE022
批量液体培养物无突变体的可能性(下标L代表大体积)。
Figure 347938DEST_PATH_IMAGE023
因此，定义为
Figure 964864DEST_PATH_IMAGE024
的MSB平台的收益(benefit)可以写为：
Figure 114086DEST_PATH_IMAGE025
其中
Figure 791055DEST_PATH_IMAGE026
定义
Figure 760148DEST_PATH_IMAGE027
则
Figure 977503DEST_PATH_IMAGE028
Figure 184493DEST_PATH_IMAGE029
的推导
Figure 94680DEST_PATH_IMAGE030
连同
Figure 754332DEST_PATH_IMAGE031
函数是单调衰减的。
Figure 509798DEST_PATH_IMAGE032
因此，
Figure 368033DEST_PATH_IMAGE033
特别地，收益随着隔离程度的程度增加(m增加)而增加。
模型方程和论证。开发动力学模型以检查空间隔离(经由细菌在微胶囊中的包封)如何调控ePop回路的遗传稳定性和目标蛋白的产率。模型包括描述五个组件的时间动力学的一组代数方程和常微分方程：野生型细胞密度(N)、营养物浓度(S)、E蛋白(E)、目标蛋白(P)和突变体密度(M)。
一个区室(例如批量培养物)的模型方程。通过莫诺方程对生产率(G)建模，其代表营养物的可得性。此外，它包括代表系统的携带能力的逻辑术语。携带能力可以依据环境(MSB对比培养室)调整。
Figure 386804DEST_PATH_IMAGE034
根据希尔函数，使用希尔指数(p)，对裂解率(L)依据E蛋白浓度建模：
Figure 596069DEST_PATH_IMAGE035
相对于生长和裂解率的细胞密度变化。假设由于突变体产生的密度降低是可以忽略的：
Figure 358488DEST_PATH_IMAGE036
通过消耗或在裂解后从细胞回收的营养物水平变化：
Figure 566835DEST_PATH_IMAGE037
假设E蛋白合成率与细胞密度成比例。假设E蛋白降解遵从一级动力学。有效降解率常数代表基础率常数
Figure DEST_PATH_IMAGE039A
和由于细胞生长的稀释。加权因子
Figure DEST_PATH_IMAGE041A
，调整E蛋白的衰减率：
Figure 146721DEST_PATH_IMAGE042
目标蛋白(POI)至环境中的释放率与裂解率成比例(简而言之，假设突变体细胞不裂解或促成POI的生产)：
Figure 780964DEST_PATH_IMAGE043
在产生后(参见下文)，假设突变体群体按照与野生型相同的动力学生长但不经历裂解:
Figure 143813DEST_PATH_IMAGE044
通过以下逻辑，实施突变体细胞的产生。首先，假设在特定时间窗口从群体产生的潜在突变体的平均数量与细胞密度增加成比例(即，突变体仅在存在活跃细胞生长的情况下产生)：
Figure 976639DEST_PATH_IMAGE046
，其中
Figure DEST_PATH_IMAGE048A
是转化因子，以将密度
Figure DEST_PATH_IMAGE050A
转化成指定环境中的细胞总数。假设是否确实产生突变体遵从泊松分布，其中无突变体的可能性是
Figure DEST_PATH_IMAGE052A
。也即，维持无突变体的可能性随着
Figure DEST_PATH_IMAGE054A
指数降低，
Figure DEST_PATH_IMAGE054AA
随着群体大小、有效生长率和目标时间窗口(
Figure DEST_PATH_IMAGE056A
)而增加。
在数值模拟中，通过在每个时间步骤期间产生0和1之间的随机数，实施上述的这种场景。如果随机数是
Figure DEST_PATH_IMAGE058A
，以
Figure DEST_PATH_IMAGE060A
的转化因子在模拟中添加突变体。使用这个转化因子将突变体的数量转化为细胞密度。这个数值为其后的突变体群体设定初始条件。假设突变体产生仅发生一次。
MSB动力学的两区室模型。通过说明区室之间的运输，扩展并应用方程以描述两区室中的动力学。
Figure DEST_PATH_IMAGE061
Figure 776362DEST_PATH_IMAGE062
Figure DEST_PATH_IMAGE063
Figure 694639DEST_PATH_IMAGE064
MSB内部(指数 = 1)。
Figure DEST_PATH_IMAGE065
Figure 330020DEST_PATH_IMAGE066
Figure DEST_PATH_IMAGE067
Figure 751774DEST_PATH_IMAGE068
Figure DEST_PATH_IMAGE069
MSB外部(指数 = 2)。
Figure 581452DEST_PATH_IMAGE070
Figure DEST_PATH_IMAGE071
Figure 518184DEST_PATH_IMAGE072
Figure DEST_PATH_IMAGE073
Figure 222835DEST_PATH_IMAGE074
假设从MSB胶囊至环境的单向细胞运输。假设微流体设置，开发方程用以模拟新鲜培养基向MSB平台中的静态和定期给料二者。
Figure DEST_PATH_IMAGE076A
指示新鲜培养基中的营养物浓度。P(t)是脉冲持续时间和时段的函数。
9. 实施例
对本领域技术人员显而易见的是，对于本文所述的本公开的方法的其他适合的修改和改变是可易于应用和可估量的，并且可以使用适合的等同方案进行，而不脱离本公开的范围或本文所公开的方面和实施方案。现已详细描述本公开，并且将参考以下实施例更清楚地理解本公开，所述实施例仅旨在说明本公开的一些方面和实施方案，且不应视为限制本公开的范围。本文引用的所有期刊文献、美国专利和出版物的公开内容均通过引用以其整体并入本文。
本公开具有通过以下非限定性实施例说明的多个方面。
实施例1
通过细胞-材料反馈的MSB平台的组装
两个基本模块，自主裂解细胞和生长敏感胶囊，可以用于整合本公开的系统的功能，如图1A-1D中所示。根据这些实施方案，工程化的ePop回路用于程序化自主裂解。回路利用ColE1型质粒中的细胞密度依赖性拷贝数控制，其与毒素的泄露表达偶联(图2A)。高细胞密度导致质粒拷贝数增加和更多的E蛋白表达，其随后导致细菌亚群的裂解(图2A)。通过外源控制葡萄糖水平(图7A)或使用不同的大肠杆菌菌株，包括益生菌菌株(图7B)，可容易地调整回路动力学。
由于其生物相容性和刺激响应性，使用多糖壳聚糖作为包封材料。聚合物胶囊内部的所得三维交联网络捕获活细胞和大的碎片，但允许小分子和蛋白的运输。在低pH下，胺基团的质子化由于带电基团之间的静电排斥延伸壳聚糖链，由此使网络膨胀。相反，高离子强度掩蔽电荷，导致由于聚合物链崩塌的网络的收缩。
细菌生长影响局部pH和离子强度，这随后可以导致壳聚糖网络中的相变。因此，胶囊大小的变化可以影响并提供包封细菌的动力学的可视读出。实际上，在M9培养基中共培养包封工程化细菌(MC4100Z1(ePop/GFP))的胶囊时，它们的生长导致壳聚糖网络的收缩(图2B)。在LB培养基中，随着包封细菌的生长，胶囊轻微膨胀随后收缩。
壳聚糖胶囊的相变是由于具有或没有ePop回路的细菌生长而改变的微环境的一般特性(图7C)。对于包封的ePop细菌，转变与回路介导的裂解时间上相关，其在足够高的局部细胞密度下发生。与对照相比，细菌生长驱动的胶囊崩塌增强包封的荧光大分子(图2C)的输出约2.25倍(M9培养基)，其中大分子被包封但细胞不生长。增强的输出可能是由于胶囊内部自由体积的减少。当大分子连同相同的细菌一起被包封在(相同大小的)藻酸盐珠粒时，与基础水平(胶囊内没有细胞生长的内容物输出)相比，细菌生长导致大分子输出增加约1.5倍(LB培养基)(图7D)，同时，在壳聚糖胶囊的情况下获得约2.6倍(LB培养基)增加。
实施例2
通过微包封和区室化增强回路稳定性
通过ePop回路程序化的密度依赖性裂解是本文公开的系统的功能方面，因为它在功能上将蛋白生产和释放偶联。然而，程序化裂解产生对于可以逃避灭杀的突变体的选择压力(图3A)。当此发生时，突变体接管群体，导致回路功能损失和自主蛋白释放效率的降低(图3B)。然而，通过设计，系统可以增强工程化回路的遗传稳定性(图3C)。首先，每个微胶囊中的小群体大小，降低了在每个微胶囊中可以出现突变体的可能性。这种设计构思此前在群体控制器的微流体分析中得到证实，其具有与ePop回路相同的逻辑。其次，当突变体出现时，其被限制在胶囊内并且不污染其他包封的群体。实际上，本文提供的建模分析(图8A、8C和8D)和试验结果(图3D-3F和图8B)证实，组合这两个因素显著延迟了突变体接管并且提高了蛋白产率。
实施例3
使用芯片上的MSB平台的流线化酶促量化
为了证实整合的蛋白合成和分析，使用β-内酰胺酶作为示例蛋白。简而言之，使用质粒转化ePop细菌(MC4100Z1(ePop/BlaM))，所述质粒编码在诱导型启动子下的修饰的β-内酰胺酶(BlaM)基因。与野生型Bla相比，BlaM不含周质-定位序列。因此，它是胞质型的，并且仅在生产细胞裂解时是功能性的(图9A)。这种特性允许MSB平台的评估。为了促进系统动力学的控制和分析，制作微流体装置，并且包括生产室和测定室。生产室与输入通道流体偶联，其允许MSB的加载和新鲜培养基的流入。从培养室的输出与测定室流体偶联(图4A)。在测定室中构建第二通道以供应fluorocillin，其可以被BlaM转化成荧光产物(图9B)。这个反应提供快速的定量读出，用于测量BlaM活性。
定期添加新鲜培养基(图4B)，其导致培养室中胶囊大小的同步振荡，以及测定室中具有相同周期性的定期荧光积累(图4C-4D)。这些结果证实由于我们的工程化MSB功能，以连续方式整合的BlaM的合成和释放。膨胀至收缩转变的多个周期还证实了MSB的稳健性。
实施例4
MSB平台与不同纯化形式的整合
含有MSB的培养室可以与纯化模块整合，而不损失操作连续性。作为例证，使用另一种示例蛋白ELPs-GFP-His，其包括His-标签和弹性蛋白样多肽(ELP)标签(BL21(DE3)(ePop/ELPs-GFP-His))。His-标签允许通过固定的金属亲和色谱(IMAC)纯化。ELP是重复的人工多肽，其经历下临界溶液温度相变行为(图10A)以响应温度和盐浓度的变化，其可以用于蛋白纯化作为IMAC的正交方法。
为了证实基于亲和力的在线纯化，制作含有蛇形通道的纯化芯片。在这个芯片中，使用PEG-包被的螯合Cu2+修饰载玻片的表面。随着挤出的裂解物从生产室运输到纯化芯片(图5A)，His-标签化蛋白可以结合玻璃表面上的螯合Cu2+，而其他蛋白被PEG刷排斥。随后，可以洗脱结合的His-标签化蛋白。纯化方法的显微镜图像(图5B)显示ELPs-GFP-His的结合和洗脱，其由生产室中的MSB生产并释放。
本公开的MSB系统是模块化且可规模拓展的。在较大的规模上，可以使用加载MSB的注射器在台式机(bench top)上进行。具体地，使用10-mL注射器作为生产室，并且将注射器滤器与其附接。将约10,000个MSBs (含有总计约107个细菌)加载在注射器中，并在LB培养基中在37℃孵育24小时。随后，将注射器连同注射器滤器一起连接至Ni-NTA柱(图5C)。将细菌裂解物推过所述柱，允许His-标签化蛋白结合。MSB被注射器滤器阻断。洗涤后，洗脱His-标签化蛋白，并通过SDS-PAGE分析。图5D显示使用这个平台的成功的ELPs-GFP-His纯化。对于24小时的生产，使用单剂量的LB培养基中的10 mL培养物，获得299 μg POI (目标蛋白)的总产量(产率为约30 mg/L)。进一步的细节提供于下表6中。
表6：作为单剂量(前两行)或多剂量(后两行)的ELPs/RLP生产
ELPs-GFP-His RLPs-GFP-His
产率(mg/L) 29.9 ± 3.4 36.9 ± 7.3
3 mL x 1 1.5 mL x 2
产率(mg/L) 34.9 ± 2.9 40.6 ± 3.3
在24小时中，使用注射器的单剂量生产中的ELPs-GFP-His和RLPs-GFP-His的蛋白生产。总培养体积为10 mL LB培养基。通过以总产量除以总营养物计算产率。实验进行一式三份。
通过不同的给料频率和相同的总营养物，ELPs-GFP-His的蛋白产量。总营养物包括3 mL LB培养基。营养物以定期给料的方式分配。对于样品3 mL × 1，在时间0补充3 mLLB培养基并在72小时收集。对于样品1.5 mL × 2，在时间0补充1.5 mL LB培养基并在36小时收集；并且在时间36补充另1.5 mL且在72小时收集。实验进行一式三份。
在多个批次补充相同量的LB培养基时，进一步提高产率(图5E和表6)。这个提高的产率很可能是由于通过壳聚糖胶囊的膨胀和崩塌的多个循环，并且通过细菌生长和裂解的多个循环而增加的输出。
ELP和ELP-标签化蛋白可以在水溶液中经历LCST相变，导致微米大小的聚集物的形成。这种特性通常用于通过使用逆转变循环的蛋白纯化，其涉及温度改变和离心的多个循环(图10B)。为了使程序适合于用于连续且方便操作的系统，通过添加盐和外源ELP，在室温下等温触发ELP的LCST相变(图10C)。在室温下，通过微滤膜保留ELP或ELP-标签化蛋白的聚集物，同时使用高盐缓冲液洗去溶液中的其他组分(图5F)。随后，使用水洗脱ELP或ELP-标签化蛋白。实际上，SDS-PAGE凝胶指示ELPs-GFP-His和外源ELP二者在微滤的洗脱级分中的存在。在通过IMAC亲和纯化后，蛋白凝胶上仅可见ELPs-GFP-His，而外源添加的ELP被除去(图5G)。
将ELP-标签化蛋白的LCST相行为与亲和力His-标签组合，提供了两种正交方法，但对蛋白纯化高度互补，其能够分离蛋白，具有比可能通过任一单独方法更高的纯度。此外，这些方法能够从相同的粗品分离和纯化多种蛋白，提高纯化的通量。为了证实，将来自含有ELPs-GFP-His和另一His-标签化蛋白(His-AAA，其中A代表SpyTag肽)的两种MSB培养物的粗品混合。单独His-标签纯化的应用没有将其分离。然而，通过首先通过一轮基于ELP的纯化(诱导聚集+微滤)，ELPs-GFP-His(作为聚集物)保留在膜中，而His-AAA在溶液中。随后，通过IMAC单独纯化两种蛋白(图5H)。
本公开的MSB生物分子生产平台能够生产和分析或分离可以以足够高的水平表达的任何蛋白。本文提供的结果已经证实，宽广范围蛋白的生产，包括多种ELP (其中一些与spytag和spycatcher融合)、RLP、配体结合蛋白、色素蛋白和酶(图11A-11E和表3)。
此外，扩展这种方法以表达多种治疗性生物制剂，包括用于治疗2型糖型的胰高血糖素样肽1 (GLP-1)，以及HIV和Zika感染的有效抑制剂格瑞弗森(图11F)。这种能力可以拓展至其他目标生物制剂，例如抗微生物肽和糖蛋白疫苗。MSB生物分子生产平台还能够整合目标生物分子(例如蛋白)的筛选或表征(例如图4)，或纯化的多种且正交模式(图5)。可以预先制备MSB并在-80℃保持2个月，在分派前具有可忽略的性能降低(图12A)。这种操作简单且直接，并且不需要大型或昂贵的装备，或高级专业知识(图12B)。无论MSB如何制作，本公开的生物分子生产平台使用易于设置的现成配件。可以生产纯化蛋白，其中有限地或不使用离心机、超声仪器或电(表7)。操作简单并且可以在最少培训后进行。这些特性对于多种应用背景是高度有利的，例如偏远区域(包括战场)中个性化药物合成和可达到的生物制造。
表7：常规方法和MSB技术之间在蛋白合成、分离和纯化所需装备方面的比较。
常规方法 MSB技术
超声仪器
离心机
烧瓶/培养管 培养室
用于纯化的注射器、滤器等 注射器、滤器
亲和柱 亲和柱
应理解，上文的详细描述和所附实施例仅是说明性的，并且不用作限制本公开的范围，本公开的范围仅由所附的权利要求及其等同方案限定。
对于所公开的实施方案的各种改变和变化对本领域技术人员将是显而易见的。可以实施这种改变和变化而不脱离其精神和范围，所述改变和变化包括但不限于涉及本公开的化学结构、取代基、衍生物、中间物、合成、组合物、制剂或使用方法的那些。

Claims (29)

1.用于生物分子生产的系统，所述系统包括：
多种遗传工程化的微生物，其包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具，其中所述遗传回路促进所述目标生物分子的自主生产；和
包封材料，其中所述包封材料能够形成微胶囊以包含所述多种遗传工程化的微生物，并且其中所述微胶囊在功能上与所述遗传回路偶联。
2.根据权利要求1所述的系统，其中多种遗传工程化的生物包括细菌或酵母。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的系统，其中多种遗传工程化的生物包括大肠杆菌的一种或多种菌株。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述大肠杆菌的一种或多种菌株是MC4100、MG1655、BL21、NISSLE1917，及其任何衍生物或变体。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的系统，其中所述遗传回路包括细胞裂解模块和细胞密度传感模块。
6.根据权利要求5所述的系统，其中所述细胞裂解模块包括编码来自噬菌体phiX174的E蛋白的基因，并且其中所述细胞密度传感模块包括突变的luxR基因和缺少Rom/Rop蛋白的ColE1复制起点。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的系统，其中所述目标生物分子是肽、多肽、蛋白、核酸、多聚核酸、DNA分子、RNA分子、或其任何衍生物或组合中的至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的系统，其中所述目标生物分子是多肽，并且其中所述用于生产目标生物分子的工具包括质粒，所述质粒包含在诱导型启动子的控制下编码所述多肽的基因。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的系统，其中所述目标生物分子是细胞质多肽。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的系统，其中所述目标生物分子是多肽，其包含标签以促进与基底结合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的系统，其中所述包封材料包括壳聚糖、藻酸盐、透明质酸、聚乙二醇聚合物、聚氧化乙烯聚合物、弹性蛋白样多肽(ELP)、节肢弹性蛋白样多肽(RLP)，或其任何衍生物或组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的系统，其中所述包封材料响应所述微胶囊中的一种或多种条件。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述微胶囊与所述遗传回路的功能偶联包括多种微生物改变所述微胶囊中的一种或多种条件。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的系统，其中所述微胶囊中的一种或多种条件包括pH或离子强度。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的系统，其中所述微生物以约102个至约1010个的浓度存在于所述微胶囊中。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的系统，其中所述系统还包括微流体平台，以促进所述目标生物分子的生产、纯化和/或分析。
17.根据权利要求16所述的系统，其中所述微流体平台包括输入通道、生产室和测定室。
18.用于生物分子生产的微流体平台，所述平台包括：
微流体装置，其包括输入通道、生产室和测定室，
多种遗传工程化的微生物，其包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具，其中所述遗传回路促进所述目标生物分子的自主生产；和
包封材料，其中所述包封材料能够形成微胶囊以包含所述多种遗传工程化的微生物，并且其中所述微胶囊在功能上与所述遗传回路偶联。
19.根据权利要求18所述的微流体平台，其中所述生产室与所述输入通道和所述测定室流体偶联。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的微流体平台，其中所述多种遗传工程化的微生物包含在所述生产室中。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的微流体平台，其还包括输出通道，所述输出通道与所述测定室或所述生产室流体偶联。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的微流体平台，其还包括第二输入通道，所述第二输入通道与所述测定室流体偶联。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的微流体平台，其中所述生产室与纯化芯片流体偶联。
24.根据权利要求23所述的微流体平台，其中所述纯化芯片的内表面经修饰以结合所述目标生物分子。
25.生产目标生物分子的方法，所述方法包括：
将包含在微胶囊中的多种遗传工程化的微生物加载到微流体装置中，其中所述多种遗传工程化的微生物包含遗传回路和用于生产目标生物分子的工具；
向所述多种微生物提供营养物；和
生产所述目标生物分子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中多种遗传工程化的生物包括细菌或酵母。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述目标生物分子是肽、多肽、蛋白、核酸、多聚核酸、DNA分子、RNA分子、或其任何衍生物或组合中的至少一种。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述微胶囊包含包封材料，所述包封材料包括壳聚糖、藻酸盐，或其任何衍生物或组合。
29.根据权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述微流体装置包括输入通道、生产室和测定室。
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