JP2021522250A - T細胞受容体ペプチドライブラリーの作製のための自動化された機器 - Google Patents
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Abstract
本開示は、細胞表面ディスプレイライブラリーを作製するための機器及び自動化された方法を提供し、ライブラリーの細胞は、Τ細胞受容体に結合する抗原の同定のため、それらの細胞表面に操作されたペプチドを提示する。操作されたペプチドは、推定上の抗原又はT細胞受容体の結合領域であり得る。
Description
本開示は、ゲノム編集技術を使用して細胞表面ディスプレイライブラリーを作製する自動化マルチモジュール機器及び多重化された方法に関する。
以下の説明では、背景及び導入のために特定の物品及び方法を説明する。ここに含まれる内容は、従来技術の「承認」と解釈されるべきではない。出願人は、必要に応じて、ここで参照されている物品及び方法が、適用される法定条項の下で先行技術を構成しないことを実証する権利を明示的に留保する。
特定の抗原へのT細胞受容体(TCR)の結合及び活性化は、主要組織適合遺伝子複合体の多様性、潜在的な抗原の多様性、及びヒト及び動物におけるT細胞の多様性のために、ハイスループットシステムで特定することが困難であった。HPLCなどの従来の技術では、TCRターゲットに関する事前情報が必要であり、同定プロセスは時間と手間がかかる可能性がある。
したがって、当技術分野では、TCRの特定の抗原をハイスループットの多重化された方法で同定するための、より優れた、より確かな手段が必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
この概要は、以下の詳細な説明でさらに説明される簡略化された形で概念の選択を紹介するために提供されている。この概要は、請求される主題の重要な又は本質的な特徴を特定することを意図しておらず、請求される主題の範囲を制限するために使用されることも意図していない。請求される主題の他の特徴、詳細、有用性、及び利点は、添付の図面に示され、添付の請求項に定義された態様を含む、以下に記載された詳細な説明から明らかであろう。
本開示は、細胞集団の表面上に操作されたペプチドの多重化された提示を提供するための組成物、機器、及び自動化された方法を提供する。操作されたペプチドは、好ましくは、細胞表面上での操作されたペプチドの分泌及び提示の両方を提供する条件下で細胞内で発現され、したがって、潜在的な結合標的への操作されたペプチドのアクセスを提供する。細胞集団は、細胞ごとに1つ以上のターゲット編集を提供する自動編集システムを使用して操作でき、それぞれの表面に提示された操作されたペプチドを有する細胞のライブラリーの合理的な設計を可能にする。したがって、本開示は、細胞上に操作されたペプチドを発現及び提示するための様々な自動化された方法を記載している。
いくつかの実施形態において、本開示は、T細胞受容体(TCR)−抗原結合の同定のために操作されたペプチドを発現する細胞ライブラリーを作製する方法を提供し、この方法は、細胞の集団を提供し、導入された核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼを使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための機器を使用して細胞の集団を処理し、細胞の表面に提示されるように構成された操作されたペプチドをコードする核酸を含む細胞を作成すること、処理された細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすることを含み、ここで、編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供し、細胞がその表面上に操作されたペプチドを発現及び提示することを可能にする。
いくつかの態様において、操作されたペプチドは、推定上のTCR結合抗原である。他の態様において、操作されたペプチドは、予測されるTCR結合領域を含む。いくつかの態様において、操作されたペプチドは、標的ゲノム配列に由来し、挿入されたN末端又はC末端の細胞表面ディスプレイ付与タグを含む。
他の実施形態では、本開示は、細胞の表面上に操作された推定T細胞受容体(TCR)抗原を発現する細胞ライブラリーを作製する方法を提供し、この方法は、細胞の集団を提供し、導入された核酸及びヌクレアーゼを使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための機器を使用して細胞の集団を処理し、細胞の表面に提示されるように構成された操作されたペプチド抗原をコードする核酸を含む細胞を作成すること、処理された細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすることを含み、ここで、編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供し、細胞がその表面上に、推定TCR抗原である操作されたペプチド抗原を発現及び提示することを可能にする。
編集された細胞の集団における操作されたペプチド抗原は、好ましくは、抗原が既知のTCR及び/又はオーファンTCRのいずれかであるTCR標的に結合するために利用可能である態様で細胞表面に提示され得る合理的に設計されたペプチドを含む。いくつかの態様において、操作されたペプチド抗原は、1つ以上のTCRの既知の抗原である。
特定の実施形態では、抗原は、ペプチド抗原を含むMHC(HLAなど)の一部として細胞表面に提示されることによりTCRリガンドを形成する。したがって、いくつかの態様において、細胞は、リガンドの一部として操作されたペプチド抗原を提示する。いくつかの態様において、細胞は推定TCR抗原及びMHC分子を共発現する。
本開示のシステム及び方法で使用するためのペプチド抗原には、1つ又は複数のTCRの既知の抗原、1つ又は複数のTCRの予測抗原、又は本開示の自動細胞編集機器でヌクレアーゼを使用して作成されたランダムペプチドが含まれる。実施形態によっては、提示されるペプチドは、フォワードエンジニアリングを使用して作成され、特定のTCRにどの抗原が有用であるかという予測に基づいてペプチド配列を作成する。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞の表面上に、細胞のゲノムに由来する操作されたペプチドを発現する細胞ライブラリーを作製する方法を提供し、この方法は、細胞の集団を提供すること、導入された核酸及びヌクレアーゼを使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための機器を使用して細胞の集団を処理し、細胞の表面に提示されるように構成された、N末端又はC末端の細胞表面ディスプレイ付与タグを有する操作されたタンパク質をコードする核酸を含む細胞を作成すること、処理された細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすることを含み、ここで、編集は、細胞内に操作されたN末端又はC末端の細胞表面ディスプレイ付与タグをコードする核酸を提供し、細胞がその表面上に操作されたタンパク質を発現及び提示することを可能にする。
いくつかの実施形態において、本開示は、1つ以上のTCRに選択的に結合するペプチドを同定するための多重化された方法を提供し、この方法は、細胞の集団を提供すること、多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための自動化されたシステムを使用して細胞の集団を処理することを含み、このシステムは、操作されたペプチド抗原及びヌクレアーゼをコードする核酸を細胞の集団に導入するステップ、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にするステップ、編集された細胞が操作されたペプチド抗原を編集された細胞の表面上に発現及び提示することを可能にするステップ、1つ又は複数のTCRに対して操作されたペプチド抗原を提示する編集された細胞をスクリーニングするステップ、及び1つ又は複数のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原を発現する編集された細胞を同定するステップを含む。
いくつかの態様において、本開示はさらに、1つ以上のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原をコードする核酸を細胞から単離することを提供する。いくつかの態様において、本開示はさらに、1つ以上の推定TCR抗原に選択的に結合する操作されたペプチドをコードする核酸を細胞から単離することを提供する。
いくつかの態様において、特定のペプチドをコードする細胞は、操作されたペプチドに関連するバーコードの検出によって識別される。いくつかの態様において、特異的をコードする細胞は、1つ以上のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原に関連するバーコードの検出によって識別される。いくつかの実施形態では、バーコードは、さらなる分析のためにペプチドをコードする細胞及び核酸を単離及び/又はさらに同定又は処理するために使用される。そのような実施形態では、バーコードは、さらなる分析のために目的の細胞を引き出すための「ハンドル」として使用することができる。
特定の態様において、本開示は、細胞の集団を提供すること、目的のゲノム領域及びヌクレアーゼに選択的に結合するドナーDNA(例えば、相同性アーム)に共有結合したガイドRNAを含む1つ又は複数の導入された核酸を使用して細胞の集団を編集すること、細胞をインキュベートして、細胞内での核酸編集を容易にすることであって、上記編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供すること、及び、編集された細胞の表面に操作されたペプチド抗原を発現及び表示させることにより、細胞の表面上に操作されたペプチド抗原を発現する細胞ライブラリーを作製する方法を提供する。
他の特定の態様において、本開示は、細胞の集団を提供すること、編集及びヌクレアーゼを含む導入された核酸を使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための自動化された機器を使用して細胞の集団を編集すること、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすること、及び、編集された細胞の表面に操作されたペプチド抗原を発現及び提示させることにより、細胞の表面上に操作されたペプチド抗原を発現する細胞ライブラリーを作製する方法を提供し、ここで、上記編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供する。
編集された細胞の集団における操作されたペプチド抗原は、好ましくは、抗原がT細胞受容体(「TCR」)標的に結合するために利用可能な態様で細胞表面に提示され得る合理的に設計されたペプチドを含む。本開示のいくつかの態様において、操作されたペプチドは、標的ゲノム配列に由来する。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、TALENS、及び核酸誘導型ヌクレアーゼ(例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ)を含む、様々なヌクレアーゼを本開示の編集方法と共に使用することができる。好ましくは、編集方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼ、より好ましくはRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実施される。
特定の実施形態において、本開示は、細胞の集団を提供すること、多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための自動化された機器及び導入された核酸及びヌクレアーゼを使用して細胞の集団を編集し、細胞内の推定TCR抗原をコードする核酸を作成すること、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすること、細胞がその表面に操作された推定TCR抗原を発現及び提示できるようにすること、標的に対して操作された推定TCR抗原を提示する細胞をスクリーニングすること、及び標的に選択的に結合する操作された推定TCR抗原を発現する細胞を同定することを含む、それらの表面上に操作された推定TCR抗原を発現する細胞を同定するための多重化された方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、細胞の集団を提供すること;多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集用の自動化された機器及び導入された核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して細胞の集団を編集することにより、操作された推定TCR抗原をコードする核酸を含む細胞を作成すること、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすること、編集された細胞の表面に操作された推定TCR抗原を発現及び提示させること、標的に対して操作された推定TCR抗原を提示する細胞をスクリーニングすること、1つ又は複数のTCR標的に選択的に結合する操作された推定TCR抗原を発現する細胞を選択すること、及び抗原をコードする核酸を検出又は単離することを含む、それらの表面上に操作された推定TCR抗原を発現する細胞を同定するための多重化された方法を提供する。あるいは、条件を変更して、様々な条件下での選択性を決定することもできる。
目的の細胞中の特定のペプチドの検出は、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、配列決定、ハイブリダイゼーション、抗原配列を示すバーコードの同定などを使用して達成することができる。バーコード及び他の特徴はまた、例えば、TCR結合の解明のために同定されたペプチドをコードする目的の細胞を同定及び/又は単離するための基礎を提供することによって、さらなる分析に使用することができる。
一態様では、本開示は、酵母細胞表面上に1つ以上の操作されたペプチド抗原を提示するための融合タンパク質を提供することによって、細胞表面上に1つ以上の操作されたペプチド抗原を固定化するための方法を提供する。一実施形態では、本開示は、細胞表面上のMHC抗原(例えば、HLA)の一部として操作されたペプチド抗原を提示するための方法を提供する。特定の実施形態では、細胞は、単一の操作された抗原の複数のコピーを提示する。
特定の実施形態では、本開示は、細胞上に受容体又はその結合領域を提供するための方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、細胞の集団を提供すること、多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のために自動化された機器及び導入された核酸及びヌクレアーゼを使用して細胞の集団を編集し、細胞内にTCR結合領域をコードする核酸を作成すること、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすること、細胞がその表面に、操作されたTCR結合領域を発現及び提示できるようにすること、標的に対して操作されたTCR結合領域を提示する細胞をスクリーニングすること、及び推定抗原に選択的に結合する操作されたTCR結合領域を発現する細胞を同定することを含む、それらの表面上に操作された予測TCR結合領域(例えば、オーファンTCRの予測結合領域)を発現する細胞を同定するための多重化された方法を提供する。
特定の実施形態では、本開示は、細胞の集団を提供すること、多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のために自動化された機器及び導入された核酸及びヌクレアーゼを使用して細胞の集団を編集し、細胞内にTCR結合領域をコードする核酸を作成すること、細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすること、細胞がその表面に、操作されたTCR結合領域を発現及び提示できるようにすること、標的に対して操作されたTCR結合領域を提示する細胞をスクリーニングすること、及び推定抗原に選択的に結合する操作されたTCR結合領域を発現する細胞を同定することを含む、それらの表面上に操作された予測TCR結合領域(例えば、オーファンTCRの予測結合領域)を発現する細胞を同定するための多重化された方法を提供する。
一実施形態では、本開示は、表面上のTCR(例えば、オーファンTCR)から操作された予測結合領域を発現する細胞を同定するための多重化された方法を提供し、この方法は、細胞の集団を提供すること、多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための自動化された機器及び核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して細胞の集団を編集することにより、操作されたTCR結合領域をコードする核酸を含む細胞を作成すること、細胞をインキュベートして細胞内での核酸編集を容易にすること、編集された細胞が操作されたTCR結合領域を表面に発現及び提示できるようにすること、標的に対して操作されたTCR結合領域を提示する細胞をスクリーニングすること、及び1つ又は複数の推定TCR結合抗原に選択的に結合する操作されたTCR結合領域を発現する細胞を同定することを含む。あるいは、条件を変更して、様々な条件下での選択性を決定することもできる。
本発明のこれらの態様及び他の特徴及び利点を、以下により詳細に説明する。
本発明の前述の及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて取られる例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
TCRα及びTCRβ遺伝子座の構造を示す概略図である。
T細胞の発達中にTCR遺伝子セグメントがどのように再配列して完全なVドメインエキソンを形成するかを示す概略図である。
TCRα遺伝子座内のδ鎖をコードする遺伝子セグメントのクラスターを示す概略図である。
本開示の細胞表面ライブラリーを作製するための自動化マルチモジュール機器及びその構成要素を示す。
本開示の細胞表面ライブラリーを作製するための自動化マルチモジュール機器及びその構成要素を示す。
本開示の細胞表面ライブラリーを作製するための自動化マルチモジュール機器及びその構成要素を示す。
本開示の細胞表面ライブラリーを作製するための自動化マルチモジュール機器及びその構成要素を示す。
本明細書に記載の細胞成長モジュールと共に使用するための回転成長バイアルの一実施形態を示す。
細胞成長モジュール内の回転成長バイアルの一実施形態の斜視図を示す。
図5Bからの細胞成長モジュールの断面図を示す。
LED、検出器、及び温度調整コンポーネントに結合された図5Bの細胞成長モジュールを示す。
本明細書に提示されるTFFデバイスで使用されるタンジェンシャルフロー濾過のモデルである。
例示的なTFFデバイスの一実施形態の下側部材の上面図を示す。
例示的なTFFデバイスの上側部材及び下側部材ならびに膜の上面図を示す。
例示的なTFFデバイスの上側部材及び下側部材ならびに膜の底面図を示す。
TFFデバイスを含み、保持液、濾液、及び交換緩衝液用のリザーバを連通させたTFFモジュールの実施形態の図を示す。
TFFデバイスを含み、保持液、濾液、及び交換緩衝液用のリザーバを連通させたTFFモジュールの実施形態の図を示す。
TFFデバイスを含み、保持液、濾液、及び交換緩衝液用のリザーバを連通させたTFFモジュールの実施形態の図を示す。
TFFデバイスを含み、保持液、濾液、及び交換緩衝液用のリザーバを連通させたTFFモジュールの実施形態の図を示す。
TFFデバイスを含み、保持液、濾液、及び交換緩衝液用のリザーバを連通させたTFFモジュールの実施形態の図を示す。
フロースルー型エレクトロポレーションデバイスの上面斜視図である(ここでは、6つのそのようなデバイスが一緒に結合されている)。
フロースルー型エレクトロポレーションデバイスの底面斜視図である。
例示的なフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの一実施形態の上面図である。
図7Cのエレクトロポレーションデバイスの断面の上面図を示す。
図7C及び7Dのエレクトロポレーションデバイスの下側部の側面断面図である。
固体壁デバイスにおける核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集後の細胞を分離、編集、及び正規化するためのワークフローの簡略化された図を示す。
固体壁デバイスの一実施形態の写真である。
(ポアソン分布を介して)分離され、低度の透過性の底を有する固体壁デバイス内のマイクロウェル内のコロニーに成長した大腸菌細胞の写真である。
(ポアソン分布を介して)分離され、中程度の透過性の底を有する固体壁デバイス内のマイクロウェル内のコロニーに成長した大腸菌細胞の写真である。
(ポアソン分布を介して)分離され、高度の透過性の底を有する固体壁デバイス内のマイクロウェル内のコロニーに成長した大腸菌細胞の写真である。
核酸誘導型ヌクレアーゼ編集を介して編集された生細胞を富化するための方法の簡略化されたブロック図であり、分離又は分離デバイスを含まず、代わりに液体中での細胞増殖及び編集の誘導を利用する。
培養中の細胞の典型的な増殖曲線を示している。
細胞集団中の編集された細胞を増殖、誘導、編集、富化、及びスクリーニングするための方法の図解である。
自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な試薬カートリッジを示す。
自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用するための例示的な試薬カートリッジを示す。
本明細書に記載の細胞ライブラリーを作製するための自動化マルチモジュール細胞編集のための例示的な方法のフローチャートである。
分離デバイスを含む自動化マルチモジュール細胞編集機器によって実行され得る2つの例示的な方法(1100a及び1100b)の簡略化されたフローチャートである。
固体壁の分離/成長/編集/正規化モジュールを含む、例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器の実施形態の簡略化されたブロック図である。
固体壁の分離/成長/編集/正規化モジュールを含む、例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器の代替実施形態の簡略化されたブロック図である。
例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器の実施形態の簡略化されたプロセス図である。
EC23細胞培養物を増殖させるための、本明細書に記載の2パドル回転成長バイアル及び細胞成長デバイスの有効性を、従来のセルシェーカーと比較して示すグラフである。
EC23細胞培養物を増殖させるための、本明細書に記載の3パドル回転成長バイアル及び細胞成長デバイスの有効性を、従来のセルシェーカーと比較して示すグラフである。
EC138細胞培養物を増殖させるための、本明細書に記載の4パドル回転成長バイアル及び細胞成長デバイスの有効性を、従来のオービタルセルシェーカーと比較して示すグラフである。
EC138細胞培養物を増殖させるための、本明細書に記載の2パドル回転成長バイアル及び細胞成長デバイスの有効性を、従来のオービタルセルシェーカーと比較して示すグラフである。
2パドル回転成長バイアルを使用した、本明細書に記載の細胞成長デバイスを使用する、OD600までのEC138細胞培養物の増殖のリアルタイムモニタリングを示すグラフである。
2パドル回転成長バイアルを使用した、本明細書に記載の細胞成長デバイスを使用するs288c酵母細胞培養物OD600の増殖のリアルタイムモニタリングを示すグラフである。
本明細書に記載の細胞濃縮デバイス/モジュールで処理された大腸菌培養物のフィルタ処理時間に対する濾液の導電率をプロットしたグラフである。
本明細書に記載の細胞濃縮デバイス/モジュールで処理された酵母培養物のフィルタ処理時間に対する濾液の導電率をプロットしたグラフである。
本開示のデバイス及びコンパレーターエレクトロポレーションデバイスを使用した大腸菌のエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。
コンパレーターエレクトロポレーションデバイスに対してベンチマークされた、本明細書に記載のFTEPを介して形質転換された大腸菌細胞の取り込み、切断、及び編集効率を示す棒グラフである。
本開示のFTEPデバイス及びコンパレーターエレクトロポレーション法を使用したS.セレビシエのエレクトロポレーションの結果を示す棒グラフである。
図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、同様の参照番号は同様の特徴を指すことを理解されたい。
本明細書に記載の方法、デバイス又は機器の1つの実施形態に関連して説明されるすべての機能は、本明細書に記載の方法、デバイス及び機器の追加の実施形態に適用可能であることが意図されている。ただし、明示的に述べられている場合、又はその特徴又は機能がその追加の実施形態と互換性がない場合を除く。例えば、特定の機能又は機能が1つの実施形態に関連して明示的に説明されているが、代替実施形態に関連して明示的に言及されていない場合、その特徴又は機能は、代替実施形態と互換性がない場合を除き、代替実施形態に関連して展開、利用、又は実装できるものと理解されるべきである。
本明細書に記載の方法、デバイス又は機器の1つの実施形態に関連して説明されるすべての機能は、本明細書に記載の方法、デバイス及び機器の追加の実施形態に適用可能であることが意図されている。ただし、明示的に述べられている場合、又はその特徴又は機能がその追加の実施形態と互換性がない場合を除く。例えば、特定の機能又は機能が1つの実施形態に関連して明示的に説明されているが、代替実施形態に関連して明示的に言及されていない場合、その特徴又は機能は、代替実施形態と互換性がない場合を除き、代替実施形態に関連して展開、利用、又は実装できるものと理解されるべきである。
本明細書に記載の技術の実践は、そうでないことが特に明記されない限り、当業者の実務の範囲内である分子生物学(組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学、及び遺伝子工学技術の従来の技術及び説明を使用し得る。そのような従来の技術及び説明は、以下のような標準的実験室マニュアルに記載されている:Green and Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.,(2014);Current Protocols in Molecular Biology,Ausubelら編、(2017);Neumannら、Electroporation and Electrofusion in Cell Biology,Plenum Press,New York,1989;及びChangら、Guide to Electroporation and Electrofusion,Academic Press,California(1992)。これらはすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。核酸誘導型ヌクレアーゼ技術は、例えば、Genome Editing and Engineering from TALENs and CRISPRs to Molecular Surgery,Appasani and Church(2018);及びCRISPR:Methods and Protocols,Lindgren and Charpentier(2015)に記載されており、両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「1つ」及び「その」、「前記」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「1つの細胞」への言及は、1つ又は複数の細胞を指し、「システム」への言及には、当業者に知られている同等のステップ、方法及びデバイスへの言及などが含まれる。さらに、本願で使用する「左」、「右」、「上」、「下」、「前」、「後」、「側方」、「高さ」、「長さ」、「幅」、「上部」、「下部」、「内部」、「外部」、「内側」、「外側」などの用語も、単に参照する場所を説明するものであり、本開示の実施形態を特定の向き又は構成に必ずしも限定するものではないことを理解されたい。さらに、「第1」、「第2」、「第3」などの用語も同様に、本明細書で開示されるいくつかの部分、構成要素、ステップ、操作、機能、及び/又は参照点の1つを単に特定するものであり、本開示の実施形態を特定の構成又は向きに必ずしも限定するものではない。
別様に定義されない限り、本願で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、本発明に関連して使用され得るデバイス、処方物、及び方法論を説明及び開示する目的で参照により組み込まれる。
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の各介在値、及びその記載された範囲内の他の記載された値又は介在値は、本発明に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、その小さい範囲に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の具体的に除外された制限を条件として、本発明内に含まれる。記載された範囲に境界値の一方又は両方が含まれる場合、それらの含まれる境界値のいずれか又は両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するために、多くの特定の詳細が示されている。しかしながら、本発明がこれらの特定の詳細のうちの1つ又は複数なしで実施され得ることは当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを回避するために、当業者に周知の特徴及び手順は記載されていない。本願で使用される用語は、当業者によって理解されるような明白で通常の意味を有することを意図している。
本願で使用される「相補的」という用語は、ヌクレオチド間のワトソン−クリック塩基対形成を指し、具体的には、チミン又はウラシル残基が2つの水素結合によってアデニン残基に連結し、シトシン及びグアニン残基が3つの水素結合によって連結している、互いに水素結合したヌクレオチドを指す。一般に、核酸は、特定の第2のヌクレオチド配列に対して「パーセント相補性」又は「パーセント相同性」を有すると説明されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第2のヌクレオチド配列に対して80%、90%、又は100%の相補性を有し得、これは配列の10分の8、10分の9、又は10分の10のヌクレオチドが特定の第2のヌクレオチド配列に相補的であることを示す。例えば、ヌクレオチド配列3’−TCGA−5’はヌクレオチド配列5’−AGCT−3’に100%相補的であり;ヌクレオチド配列3’−TCGA−5’はヌクレオチド配列5’−TTAGCTGG−3’の一領域に100%相補的である。
DNA「制御配列」という用語は、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位、核局在化配列、エンハンサーなどを集合的に指し、これらは集合的に、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供する。選択されたコード配列を適切な宿主細胞で複製、転写、及び(一部の構成要素について)翻訳することができる限り、これらの種類の制御配列のすべてが存在する必要はない。
本願で使用される場合、「ドナーDNA」又は「ドナー核酸」という用語は、核酸誘導型ヌクレアーゼを使用する相同組換えによって遺伝子座にDNA配列変更(挿入、欠失、置換)を導入するように設計された核酸を指す。相同性依存修復の場合、ドナーDNAは、「切断部位」又はゲノム標的配列で編集される部位に隣接する領域に対して十分な相同性を有しなければならない。相同性アームの長さは、例えば、行われる変更の種類及びサイズに依存する。多くの場合、好ましくは、ドナーDNAは、ゲノム標的遺伝子座に対して配列相同性の2つの領域(例えば、2つの相同性アーム)を有するであろう。好ましくは、「挿入」領域又は「DNA配列変更」領域(細胞内のゲノム標的遺伝子座に導入されることを望む核酸改変)は、相同性の2つの領域の間に位置するであろう。DNA配列変更は、1つの特定の部位又は複数の特定の部位で標的ゲノムDNA配列の1つ又は複数の塩基を変更し得る。変更には、標的配列の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500以上の塩基対の変更が含まれ得る。欠失又は挿入は、標的配列の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、300、400、又は500以上の塩基対の欠失又は挿入であり得る。
「操作されたペプチド抗原」という用語は、様々なエレメント、例えば、ペプチドのMHC提示用ペプチド、固定化ペプチド、レポーターペプチド又は分泌ペプチドなどに関連する合成ポリペプチド又は天然に存在するペプチドを含む、天然に存在する、及び合成のポリペプチド及びタンパク質構築物を包含する。操作されたペプチド抗原は、配列変異体、組換えプロモーター、転写制御エレメント、融合ペプチド、他の変更、又はそれらの2つ以上の任意の組み合わせを含むように操作され得る組換え核酸からコードされ、及び/又は発現される。ペプチド提示は、目的のタンパク質の全部又は一部の提示を含み得る。いくつかの実施形態において、操作されたペプチド抗原は、カップリング酵素によって改変される結合モチーフを含み、その結果、第2の結合標的が結合モチーフに結合する。いくつかの実施形態において、第2の結合標的は、細胞内で操作されたペプチド抗原に結合される。
本願で使用される場合、「富化」は、編集された細胞の分離による富化を指し、任意選択で、編集を誘導すること、及び分離された細胞の、最終サイズのコロニーへの増殖(例えば、コロニー増殖の飽和又は正常化)を含む。
「ガイド核酸」又は「ガイドRNA」又は「gRNA」という用語は、1)ゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズすることができるガイド配列、及び2)核酸誘導型ヌクレアーゼと相互作用し又は複合体を形成することができるスキャフォールド配列を含むポリヌクレオチドを指す。
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、2つのペプチド間の、又は本開示の文脈においてより多くの場合、2つの核酸分子間の配列類似性を指す。「相同領域」又は「相同性アーム」という用語は、標的ゲノムDNA配列とある程度の相同性を有するドナーDNA上の領域を指す。相同性は、比較の目的で整列され得る各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、配列が共有する一致する又は相同の位置の数の関数である。
本願で使用される場合、「リーダーペプチド」、「分泌ペプチド」又は分泌リーダーペプチドという用語は、細胞膜を通過して分泌される融合ペプチドをもたらすシグナル配列を含む、合成された融合タンパク質を翻訳部位から遠ざけるように方向づける任意のシグナル配列を指す。
「作動可能に連結された」とは、そのように記述された構成要素がそれらの通常の機能を実行するように構成される要素の配置を指す。したがって、コード配列に作動可能に連結された制御配列は、コード配列の転写、場合によっては翻訳に影響を与えることができる。制御配列は、それらがコード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列がプロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」と見なすことができる。実際、そのような配列は、同じ隣接するDNA分子(すなわち染色体)上に存在する必要はなく、それでも相互作用があり、調節が変化する可能性がある。
本願で使用される場合、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は交換可能に使用される。タンパク質は完全にアミノ酸で構成されている場合とされていない場合がある。
「プロモーター」又は「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼに結合し、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、小核又は核RNA、ガイドRNA、又は、任意の種類のRNAポリメラーゼI、II又はIIIによって転写される任意の種類のRNAなどのポリヌクレオチド又はポリペプチドコード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。プロモーターは構成型でも誘導性でもよく、いくつかの実施形態、特に選択が使用される多くの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムの少なくとも1つの構成要素の転写は、誘導性プロモーターの制御下にある。
本願で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、細胞に導入された遺伝子を指し、これは、人工的な選択に適した形質を付与する。一般的な選択マーカーの使用は、当業者によく知られている。アンピシリン/カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、リファンピシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、及びG418などの薬物選択マーカーを使用することができる。他の実施形態では、選択マーカーには、限定するものではないが、ラムノースなどの糖、ヒト神経成長因子受容体(米国特許第6,365,373号に記載されているようなMAbで検出される);トランケートされたヒト成長因子受容体(MAbで検出);変異型ヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR;蛍光MTX基質が利用可能);分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP;蛍光基質が利用可能);ヒトチミジル酸シンターゼ(TS;抗がん剤フルオロデオキシウリジンに対する耐性を付与する);ヒトグルタチオンS−トランスフェラーゼアルファ(GSTA1;グルタチオンを幹細胞選択的アルキル化剤ブスルファンに結合させる;CD34+細胞における化学防御選択マーカー);造血幹細胞におけるCD24細胞表面抗原;N−ホスホンアセチル−L−アスパラギン酸(PALA)に対する耐性を付与するヒトCAD遺伝子;ヒト多剤耐性−1(MDR−1;薬剤耐性の増加によって選択可能な又はFACSによって富化されたP糖タンパク質の表面タンパク質);ヒトCD25(IL−2α;Mab−FITCで検出可能);メチルグアニン−DNAメチルトランスフェラーゼ(MGMT;カルムスチンで選択可能);及びシチジンデアミナーゼ(CD;Ara−Cで選択可能)が含まれる。本願で使用される「選択培地」は、選択マーカーを選択するか、又はそれに対抗する化合物又は生物学的部分が添加された細胞成長培地を指す。
本願で使用される「特異的に結合する」という用語は、約10−7M、約10−8M、約10−9M、約10−10M、約10−11M、約10−12M、約10−13M、約10−14M、又は約10−15Mの解離定数によって表される結合親和性を有する、2つの分子間、例えば、操作されたペプチド抗原と結合標的との間の相互作用を含む。。
「標的ゲノムDNA配列」、「標的配列」、又は「ゲノム標的遺伝子座」という用語は、インビトロ又はインビボの、あるいは細胞又は細胞集団の核酸(例えば、ゲノム)内の任意の、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムを使用して、少なくとも1つのヌクレオチドの変更が望まれる遺伝子座を指す。標的配列は、ゲノム遺伝子座又は染色体外遺伝子座であり得る。
「バリアント」という用語は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは異なるが、本質的な特性を保持しているポリペプチド又はポリヌクレオチドを指し得る。ポリペプチドの典型的なバリアントは、アミノ酸配列が別の参照ポリペプチドとは異なる。一般に、参照ポリペプチドとバリアントの配列が全体的に非常に類似しており、多くの領域で同一であるように、差異は制限されている。バリアント及び参照ポリペプチドは、1つ又は複数の変更(例えば、置換、付加、及び/又は欠失)によってアミノ酸配列が異なり得る。ポリペプチドのバリアントは、保存的に変更されたバリアントであり得る。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされたものである場合とそうでない場合がある(例えば、非天然アミノ酸)。ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものである場合もあれば、天然に存在することが知られていないバリアントである場合もある。
「ベクター」は、細胞に送達され及び/又は細胞内で発現される所望の配列又は複数の配列を含む様々な核酸のいずれかである。ベクターは通常DNAで構成されているが、RNAベクターも利用できる。ベクターには、限定するものではないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、人工染色体などが含まれる。本願で使用される場合、「エンジンベクター」という句は、本開示の核酸誘導型ヌクレアーゼシステム及び方法で使用されるヌクレアーゼのコード配列を含む。エンジンベクターはまた、細菌系において、λレッドリコンビニアリングシステム又はそれに相当するものを含み得る。エンジンベクターはまた、通常、選択マーカーを含む。本願で使用される場合、「編集ベクター」という句は、編集が行われた後に標的配列のPAM又はスペーサーでのヌクレアーゼ結合を防ぐ標的配列への変更、及びgRNAのコード配列を任意選択で含む、ドナー核酸を含む。編集ベクターはまた、選択マーカー及び/又はバーコードを含み得る。いくつかの実施形態では、エンジンベクターと編集ベクターを組み合わせることができる。つまり、すべての編集及び選択コンポーネントを1つのベクターに見つけることができる。さらに、エンジン及び編集ベクターは、例えば、ヌクレアーゼコード配列、リコンビニアリングシステムコード配列(存在する場合)、ドナー核酸、ガイド核酸、及び選択マーカーに作動可能に連結された制御配列を含む。
細胞ライブラリー、スクリーニング及び編集方法
本開示は、細胞表面ディスプレイを有する細胞集団を作成するための多重化された方法及び自動化された機器を提供し、上記方法は編集技術を用いる。本開示の多重化及び自動化された機器を使用して編集された細胞集団は、細胞の表面に提示され、結合標的への結合に利用可能な1つ又は複数の推定受容体抗原を含む。本開示に従って編集及び使用することができる細胞には、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞が含まれる。さらに、編集される細胞は、宿主に対して異種である配列を含み得る(例えば、酵母又は細菌ゲノムに挿入された哺乳動物配列の編集)。
本開示は、細胞表面ディスプレイを有する細胞集団を作成するための多重化された方法及び自動化された機器を提供し、上記方法は編集技術を用いる。本開示の多重化及び自動化された機器を使用して編集された細胞集団は、細胞の表面に提示され、結合標的への結合に利用可能な1つ又は複数の推定受容体抗原を含む。本開示に従って編集及び使用することができる細胞には、限定するものではないが、細菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞が含まれる。さらに、編集される細胞は、宿主に対して異種である配列を含み得る(例えば、酵母又は細菌ゲノムに挿入された哺乳動物配列の編集)。
特に、上記細胞を作成するために使用される方法及び自動化された機器は、T細胞受容体(TCR)に特異的に結合する抗原を同定するのに役立つ。抗原、例えばオーファンTCRの推定抗原標的を迅速かつ容易に特定する能力は、免疫学、例えば免疫療法の研究開発において非常に有用であり得る。
本開示はまた、TCR標的に結合する抗原(例えば、リガンドの成分として)の多重ディスプレイ及びスクリーニングのための方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗原は、本明細書に記載の細胞ディスプレイ法のいずれかを使用して細胞表面に提示される。いくつかの実施形態において、抗原は、MHC複合体において複合体化され、細胞集団表面上に提示される。
T細胞受容体(TCR)に特異的に結合する抗原は、細胞の単離及び導入された抗原配列の配列決定又はハイブリダイゼーションによる、例えばアレイ上での同定を含む様々な検出方法を使用して同定することができる。他の態様では、特定の提示された抗原に関連するバーコードを識別し、TCRに選択的に結合する抗原を識別するために使用することができる。バーコードは、例えば、配列決定及び/又はアレイハイブリダイゼーションを使用して識別され得る。
いくつかの実施形態では、細胞から目的の1つ又は複数の標的に選択的に結合する操作されたペプチド抗原をコードする細胞は、ペプチドに関連するバーコードを使用して識別及び/又は単離される。特定の実施形態において、バーコードは、TCRへの抗原の結合を潜在的に明らかにするものとして同定されたペプチドを発現する細胞をさらに単離及び/又は分析するために使用される。そのような実施形態では、バーコードは、さらなる分析のために目的の細胞を引き出すための「ハンドル」として使用することができる。
いくつかの実施形態では、この方法は、ゲノム編集を介して、それぞれがその表面に単一の操作されたペプチド抗原を提示する編集細胞の集団又はライブラリーを作製することを含み、異なる操作されたペプチド抗原は、ヌクレアーゼ編集を使用して作成され、その後、異なる細胞の表面に提示される。他の実施形態では、編集方法は、編集された細胞の集団又はライブラリーをもたらし、編集された各細胞は、その表面上に複数の異なる操作されたペプチド抗原を提示する。したがって、細胞は、集団の単一細胞の細胞表面に、場合により1つ又は複数のMHC(例えば、HLA)において提示される1つ又は複数の操作されたペプチド抗原を発現することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたペプチド抗原を細胞表面に提示するための方法を提供し、この方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して細胞を編集して、操作された推定HLAをコードする核酸を作成すること、及び、編集された細胞を、操作されたHLAを発現させるのに十分な条件下でインキュベートすることを含む。
いくつかの実施形態では、ライブラリーの細胞は、少なくとも102個の操作されたペプチド抗原を提示する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも103個の操作されたペプチド抗原を提示する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも104個の操作されたペプチド抗原を提示する。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも105個の操作されたペプチド抗原、少なくとも106個以上の操作されたペプチド抗原を提示する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の細胞のいずれかのライブラリーを提供する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも108個の異なるメンバーを有する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、又は少なくとも1011個の細胞を有する。
いくつかの実施形態において、本開示は、編集された細胞の集団又はライブラリーを提供し、ここで、細胞は、異なる操作されたペプチド抗原及びそのバリアントをコードし、バリアントはまた、結合標的を結合することができる結合モチーフを含む。いくつかの実施形態では、結合モチーフはビオチン化モチーフである。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも108個の異なるメンバーを有する。いくつかの実施形態では、ライブラリーは、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、又は少なくとも1011個のメンバーを有する。
細胞のライブラリー又は集団を作製するために使用できる編集方法、及びヌクレアーゼによるゲノム編集を実行するために使用される細胞処理モジュール及び機器を以下に詳細に説明する。
ライブラリーの編集された細胞に提示される抗原は、3〜50アミノ酸の間の任意の長さとすることができ、好ましくは5〜20アミノ酸の間である。特定の態様では、アミノ酸ペプチドは、ペプチドの抗原性領域、例えば、細胞表面上のMHCで利用可能であることが知られている8〜11個のアミノ酸の適切な提示を可能にする方法で提示される。
T細胞受容体
T細胞受容体(TCR)は、免疫グロブリンと構造的に類似しており、相同遺伝子によってコードされ、免疫グロブリン遺伝子の組換えと同様の遺伝子セグメントのセットからの体細胞組換えによって構築される。TCR遺伝子座はほぼ同じ数のV遺伝子セグメントを有するが、より多くのJ遺伝子セグメントを有し、遺伝子再配列中の遺伝子セグメント間の接合部の多様化が進んでいる。さらに、機能的TCRは、体細胞超変異による再配列後にV遺伝子を多様化することは知られていない。これは、リガンドの結合抗原と接触する受容体の中央部分に最も高い多様性があるTCRをもたらす。
T細胞受容体(TCR)は、免疫グロブリンと構造的に類似しており、相同遺伝子によってコードされ、免疫グロブリン遺伝子の組換えと同様の遺伝子セグメントのセットからの体細胞組換えによって構築される。TCR遺伝子座はほぼ同じ数のV遺伝子セグメントを有するが、より多くのJ遺伝子セグメントを有し、遺伝子再配列中の遺伝子セグメント間の接合部の多様化が進んでいる。さらに、機能的TCRは、体細胞超変異による再配列後にV遺伝子を多様化することは知られていない。これは、リガンドの結合抗原と接触する受容体の中央部分に最も高い多様性があるTCRをもたらす。
TCRα及びβ鎖はそれぞれ、可変(V)アミノ末端領域及び定常(C)領域から構成されている。TCRα及びTCRβ遺伝子座の構成を図1に示す。免疫グロブリン軽鎖の遺伝子座と同様に、TCRα遺伝子座はV及びJ遺伝子セグメント(Vα及びJα)を含む。免疫グロブリン重鎖の場合と同様に、TCRβ遺伝子座は、Vβ及びJβ遺伝子セグメントに加えてD遺伝子セグメントを含む。
TCR遺伝子セグメントは、T細胞の発達中に再配列して、完全なVドメインエクソンを形成する(図2)。TCR遺伝子セグメントには、隣接する免疫グロブリン遺伝子と相同なヘプタマー及びノナマー組換えシグナル配列(RSS)が隣接している。
免疫グロブリンとTCR遺伝子の再配列のさらに共通の特徴は、再配列されたTCRβ遺伝子のV、D、及びJ遺伝子セグメント間の接合部にPヌクレオチドとNヌクレオチドが存在することである。T細胞では、再構成されたすべてのTCRα遺伝子のV遺伝子セグメントとJ遺伝子セグメントの間にPヌクレオチドとNヌクレオチドも追加されるが、免疫グロブリン軽鎖遺伝子のV−J接合部の約半分だけがNヌクレオチドの追加によって変更され、これらには多くの場合、Pヌクレオチドも含まれていない。
TCRのリガンドは通常、MHC分子に結合したペプチドである。したがって、TCRリガンドの変動性のほとんどは、受容体と接触している表面の中心を占める結合した抗原性ペプチドにある。実際、TCRの抗原認識部位の三次元構造は、抗体分子の三次元構造によく似ている。
TCRの構造的多様性は、主に遺伝子再配列の過程で生成される組合せ及び接合部の多様性に起因する。TCR鎖の変動性は、V、D、及びJ遺伝子セグメントによってコードされ、P及びNヌクレオチドによって修飾された接合領域に集中している。TCRα遺伝子座は、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座のいずれよりもはるかに多くのJ遺伝子座を含む。ヒトでは、61個のJα遺伝子セグメントが約80kbのDNAにわたって分布しているが、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座には最大で5個のJ遺伝子セグメントしかない。TCRα遺伝子座には非常に多くのJ遺伝子セグメントがあるため、この領域で生成される変動性は、免疫グロブリンよりもTCRの方がさらに大きくなる。この領域は、抗原結合部位の中心を形成する免疫グロブリン及びTCRのCDR3ループをコードしている。したがって、TCRの中心は大きく変動するが、周辺部は比較的わずかな変動しか受けない。
少数のT細胞はγ鎖とδ鎖で構成されたTCRを有する。δ鎖をコードする遺伝子セグメントのクラスターは、完全にTCRα遺伝子座内、Vα遺伝子セグメントとJα遺伝子セグメントとの間に見られる。図3を参照されたい。すべてのVα遺伝子セグメントは、再配列によって介在するDNAが削除されるように向けられているため、α遺伝子座での再配列により、δ遺伝子座が失われる。TCRγ及びTCRδ遺伝子座には、TCRα又はTCRβ遺伝子座、あるいは免疫グロブリン遺伝子座のいずれよりも実質的に少ないV遺伝子セグメントがある。δ鎖の接合部の変動性の増加は、少数のV遺伝子セグメントを補うことができ、γ:δ受容体における変動性のほぼすべてを接合部領域に集める効果がある。これまで見てきたように、接合領域によってコードされたアミノ酸は、TCR結合部位の中心にある。ヒトでは、TCRα及びTCRβ遺伝子座と同様に、TCRγ及びTCRδ遺伝子座は、個別のV、D、及びJ遺伝子セグメント、及びC遺伝子を有する。
γ:δ受容体を有するT細胞は、機能が現時点で知られていないT細胞の別個の系統である。これらの受容体のリガンドもほとんど知られていない。一部のγ:δTCRは、抗体と同じように、MHC分子による提示や抗原の処理を必要とせずに抗原を直接認識できるようである。したがって、MHC分子と推定抗原との共発現は任意である。
細胞表面ディスプレイ
酵母表面ディスプレイ技術、哺乳動物細胞表面ディスプレイ技術、及び細菌表面ディスプレイ技術を含む、様々なディスプレイ技術を、本明細書に記載の方法及び機器によって作製された細胞ライブラリー及び集団と共に使用することができる。細胞表面ディスプレイ技術には、限定するものではないが、米国特許第8,883,692号;8,685,893号;及び6,699,658号;米国特許出願公開第20170218382号;20170088611号;20150307560号;20150203834号;20140221621号;20140031292号;20140235476号、20140221621号;20130184177号;20110008883号;第20100233195号;20100210473号;20100216659号;20090280560号;20090111126号;及び20040146976号に開示されているものが含まれる。細菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞はすべて細胞表面ディスプレイに使用できる。
酵母表面ディスプレイ技術、哺乳動物細胞表面ディスプレイ技術、及び細菌表面ディスプレイ技術を含む、様々なディスプレイ技術を、本明細書に記載の方法及び機器によって作製された細胞ライブラリー及び集団と共に使用することができる。細胞表面ディスプレイ技術には、限定するものではないが、米国特許第8,883,692号;8,685,893号;及び6,699,658号;米国特許出願公開第20170218382号;20170088611号;20150307560号;20150203834号;20140221621号;20140031292号;20140235476号、20140221621号;20130184177号;20110008883号;第20100233195号;20100210473号;20100216659号;20090280560号;20090111126号;及び20040146976号に開示されているものが含まれる。細菌細胞、酵母細胞、及び哺乳動物細胞はすべて細胞表面ディスプレイに使用できる。
特定の実施形態において、細胞表面への操作されたペプチド抗原の固定化は、操作されたペプチド抗原と操作されたペプチド抗原上の結合モチーフとの間の特定の相互作用を含み得る。
本発明の操作されたペプチド抗原は、編集及び表面ディスプレイに適した任意の細胞で発現させることができ、本発明は、細菌細胞、酵母細胞(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces)及び/又はピキア(Picchia)種)、昆虫細胞、ゼノパス(Xenopus)細胞、及び哺乳動物細胞を含む、任意の原核生物細胞又は真核生物細胞を包含する。本発明の融合タンパク質の発現に特に適している細胞は、大腸菌、S.セレビシエ(cerevisiae)、CHO及び293T細胞である。細胞は「野生型」細胞であってもよく、又は細胞は、特定の特徴又はタンパク質発現を助け得る特定の酵素機能のために最適化されてもよい。最適化又は操作された細胞には、核酸を取り込み、維持するための最適化された能力を有する細胞、タンパク質合成能力が高められた細胞、及び/又はタンパク質分泌能力が高められた細胞が含まれる。編集された核酸及び合成されたタンパク質の完全性を維持する細胞は特に有用である。
特定の態様では、編集された細胞はそれらの表面に結合標的を含み、細胞は、操作ペプチド抗原の分泌をもたらす条件下でインキュベートされ、操作されたペプチド抗原は結合標的に結合し、それにより操作されたペプチド抗原を細胞表面に提示する。
タンパク質の提示に一般的に使用される生物は酵母である。酵母は、効率的なフォールディングと活性のために小胞体(ER)固有の翻訳後プロセシングを必要とするタンパク質をプロセシングできるという点で、酵母ディスプレイは細菌を用いた技術に勝る利点を提供する。哺乳動物細胞ディスプレイも翻訳後プロセシングを容易にするが、酵母はベクターがより単純であるため、核酸ライブラリーの作製が容易であるという利点を提供し、酵母は細胞への編集機構(例えば、編集ベクター)のより簡単な導入を可能にする。ほとんどの酵母発現融合タンパク質は、GPI(グリコシル−ホスファチジル−イノシトール)アンカータンパク質をベースとしており、これは細胞表面タンパク質の表面発現に重要な役割を果たし、酵母の生存に不可欠である。そのようなアンカータンパク質の1つであるα凝集素は、AGA1によってコードされるコアサブユニットからなり、AGA2によってコードされる小さい結合サブユニットにジスルフィド架橋を介して連結されている。本明細書に記載の核酸ライブラリーによってコードされるタンパク質は、AGA1のN末端領域又はAGA2のC末端又はN末端領域に導入することができる。これらの融合パターンは、酵母細胞表面のポリペプチド提示をもたらす。
いくつかの実施形態において、酵母ディスプレイ用の融合タンパク質は、真核生物の細胞壁(例えば、α凝集素、AGA1、Flo1又は下等真核生物の主要な細胞壁タンパク質;参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,027,910号及び6,114,147号を参照)に固定することができるタンパク質のN末端又はC末端部分に融合した操作されたペプチド抗原、例えば、Flo1のGPIフラグメント又はFlo1機能ドメインに融合したタンパク質(Kondoら、Appl.MicroBiol.Biotech.,64:28−40(2004))を含む。
GPIアンカーモチーフを含む確立された融合タンパク質に基づく表面ディスプレイ法に加えて、本発明はまた、改変されたGPIアンカーモチーフを含む新規な融合タンパク質に基づくディスプレイ法を包含する。本発明の融合タンパク質は、提示されるタンパク質(例えば、1つ以上の操作されたペプチド抗原、結合標的、分子標的、基質など、又はそれらの任意の組み合わせ)、GPIアンカー、及び、融合タンパク質が酵母で発現されると翻訳後修飾され得る適切なシグナル配列を含み得る。GPIアンカー及びC末端シグナル配列を含むタンパク質がERを介して輸送されると、GPIアンカーに隣接するC末端シグナル配列の疎水性領域がER膜に埋め込まれ、そこでERプロテアーゼによって切断される。ERプロテアーゼはこのC末端シグナル配列を切断すると同時に、予め形成されたGPIアンカーを操作されたペプチド抗原(例えば、結合標的、分子標的、基質など、又はそれらの任意の組み合わせ)の新しいC末端に結合させ、その結果、細胞表面にタンパク質(例えば、結合標的、分子標的、基質など、又はそれらの任意の組み合わせ)が提示される(例えば、上記のKondoらを参照)。本発明は、改善されたプロセシング特性を有するC末端配列を包含し、GPIアンカータンパク質を含む融合タンパク質の改善された提示をもたらす。改善された提示は、提示されるタンパク質の数の増加及び/又は正しく発現されるタンパク質の数の増加を含む。いくつかの実施形態において、改善されたプロセシング特性を有するC末端配列は、当技術分野で知られている技術に従って、バリアントC末端配列を含むライブラリーをスクリーニングすることによって発展される。
いくつかの実施形態において、本開示は、操作されたペプチド抗原を細胞に提示するための方法を提供し、この方法は、第1の核酸によってコードされる操作されたペプチド抗原を発現するのに十分な条件下で、第1の核酸を含む編集された細胞をインキュベートすることを含み、ここで、細胞は第1の結合標的を提示し、操作されたペプチド抗原は結合モチーフを含み、第2の結合標的は、操作されたペプチド抗原が発現されるときに結合モチーフに結合され、発現された操作されたペプチド抗原は、細胞から分泌され、第2の結合標的の第1の結合標的への結合を介して細胞表面に提示される。いくつかの実施形態において、第1の結合標的は、アビジン様タンパク質である。いくつかの実施形態では、第2の結合標的はビオチンである。いくつかの実施形態では、結合モチーフはビオチン化ペプチドである。いくつかの実施形態において、第2の結合標的の結合は、カップリング酵素によって行われる。いくつかの実施形態では、カップリング酵素はビオチンリガーゼである。
いくつかの実施形態において、本開示は、上記細胞の細胞表面に提示される操作された(編集された)ペプチド抗原を含む編集された細胞のライブラリーを作製するための方法を提供し、この方法は、複数の編集ベクターを細胞の集団に導入すること、編集ベクターが細胞内の核酸を編集できるようにする条件を作り出すこと、及び、編集された細胞が操作されたペプチド抗原を発現し、操作されたペプチド抗原を細胞表面に提示する条件を作り出すことを含み、上記ベクターはヌクレアーゼと、操作される抗原のコード領域における編集を含むドナー核酸配列とを含む。特定の態様では、コードされた操作ペプチド抗原は、固定化ペプチドに連結された固有のポリペプチドを含み、固定化ペプチドは、編集された細胞の細胞表面に存在する第2の結合モチーフに選択的に結合する第1の結合モチーフを含み、操作されたペプチド抗原は、第1の結合モチーフが細胞表面上の第2の結合モチーフに結合するのに十分な条件下で発現される。固定化ペプチドはまた、又は代替的に、例えば、膜貫通ポリペプチド、ポリペプチド膜アンカー、GPI連結ポリペプチド又は天然表面ポリペプチドを含み得る。
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞表面に提示される操作されたペプチド抗原を発現する編集された細胞のライブラリーを作製するための方法を提供し、この方法は、複数のベクターを細胞の集団に導入することを含み、ベクターは、核酸誘導型ヌクレアーゼ、ガイドRNA、及び操作されるタンパク質のコード領域における編集を含むドナー核酸を含む。特定の態様では、編集される抗原は、固定化ペプチドに連結された固有のポリペプチドを含むコードされた操作ペプチド抗原であり、固定化ペプチドは、編集された細胞の細胞表面に存在する第2の結合モチーフに選択的に結合する第1の結合モチーフを含み、操作されたペプチド抗原は、細胞表面上の第2の結合モチーフへの第1の結合モチーフの結合に十分な条件下で発現される。
固定化ペプチド又は結合モチーフを含む他の部分の使用を含む態様では、ペプチド又はモチーフは、操作されたペプチド抗原のC末端又はN末端に連結することができる。
いくつかの実施形態において、操作されたペプチド抗原は、リーダーペプチドをさらに含む。リーダーペプチド又は分泌ペプチドは、分泌経路に沿って細胞内区画の内腔への輸送に付随して、又はその直後に、成熟タンパク質からタンパク質分解的に除去することができる。リーダーペプチドは、天然に存在する配列又は合成配列であり得る。
いくつかの実施形態において、操作されたペプチド抗原は、リーダーペプチドをさらに含む。リーダーペプチド又は分泌ペプチドは、分泌経路に沿って細胞内区画の内腔への輸送に付随して、又はその直後に、成熟タンパク質からタンパク質分解的に除去することができる。リーダーペプチドは、天然に存在する配列又は合成配列であり得る。
編集された細胞ライブラリーは、1つ又は複数の操作されたペプチド抗原を含む、少なくとも2個、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも1000個、少なくとも10,000個、少なくとも100,000個、少なくとも1,000,000個、少なくとも107個、少なくとも108個、少なくとも109個、少なくとも1010個、又は少なくとも1011個の細胞を有する。
いくつかの実施形態において、細胞における操作されたペプチド抗原の発現は、誘導性又は一過性である。いくつかの実施形態において、誘導ステップは必須ではなく、細胞をインキュベートすることで、操作されたペプチド抗原の発現がもたらされる。いくつかの実施形態において、第1の結合モチーフを含む操作されたペプチド抗原は、分泌され、細胞表面に存在する第2の結合モチーフに結合し、それにより、操作されたペプチド抗原を細胞表面に提示する。いくつかの実施形態において、第1の結合モチーフは、アビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンであり、第2の結合モチーフはビオチンである。いくつかの実施形態において、アビジンは、細胞表面に共有結合される(例えば、直接的又は間接的に)。しかし、いくつかの実施形態では、第1の結合標的は、細胞によって発現され、細胞表面に提示される。例えば、結合標的の1つは、細胞壁又は膜融合タンパク質などの融合タンパク質として細胞によって発現され得、細胞の表面に提示され得る。
スクリーニング方法
本開示の方法は、TCRに選択的に結合する1つ又は複数のペプチドを同定するために有用であり得る。それらが発現される細胞の表面に提示される操作されたペプチド抗原を有する細胞ライブラリーを作成するシステムを提供することにより、操作されたペプチド抗原を発現する細胞は、細胞表面に対して(例えば、細胞表面に提示される1つ又は複数の分子を検出するために細胞調製物に対して)実施できる任意のアッセイを使用して同定することができる。本開示の方法を使用して、操作されたペプチド抗原バリアントを発現するライブラリーをスクリーニングし、抗原に選択的に結合する1つ又は複数のTCRを同定することができる。
本開示の方法は、TCRに選択的に結合する1つ又は複数のペプチドを同定するために有用であり得る。それらが発現される細胞の表面に提示される操作されたペプチド抗原を有する細胞ライブラリーを作成するシステムを提供することにより、操作されたペプチド抗原を発現する細胞は、細胞表面に対して(例えば、細胞表面に提示される1つ又は複数の分子を検出するために細胞調製物に対して)実施できる任意のアッセイを使用して同定することができる。本開示の方法を使用して、操作されたペプチド抗原バリアントを発現するライブラリーをスクリーニングし、抗原に選択的に結合する1つ又は複数のTCRを同定することができる。
本開示の一実施形態は、標的TCR、例えば、既知のTCR又はオーファンTCRに対して望ましい親和性又は特異性を有する操作されたペプチド抗原を提示する細胞を選択するための方法を提供する。本発明のいくつかの態様は、特定の標的分子(例えば、既知のTCR又はオーファンTCR)と所望の特異性で相互作用することができる抗原を発現する細胞をスクリーニングする方法に関する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ヌクレアーゼを使用して編集された細胞において操作されたペプチド抗原を発現させること、及び、1つ又は複数のTCRへのリガンドの結合を評価することを含む抗原スクリーニング方法を提供し、ここで、発現された操作されたペプチド抗原は、分泌され、TCRに特異的なリガンドの成分として細胞表面に提示される。特定のTCR及び/又はペプチドが同定されると、例えば、イルミナHiSeqやMiSeqなどの次世代シーケンシングを使用して、配列を決定することができる。他の態様において、特定のTCR及び/又はペプチドは、特定のTCR及び/又はペプチドに関連するバーコードの検出を通じて同定することができる。
いくつかの実施形態において、本開示は、核酸誘導型ヌクレアーゼ(例えば、CRISPRヌクレアーゼなどのRNA誘導型ヌクレアーゼ)を使用して編集された細胞において操作されたペプチド抗原を発現させることを含む抗原スクリーニング方法を提供する。発現された操作されたペプチド抗原は分泌され、TCRに特異的なリガンドの成分として細胞表面に提示され、1つ又は複数のTCRへのリガンドの結合を評価する。
編集されたタンパク質の発現
本発明の編集された細胞における操作されたペプチド抗原は、当技術分野で知られている方法を使用して、編集された核酸から発現され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質発現は構成的である。構成的発現は、ゲノムに組み込まれた核酸からの発現と、エピソームベクター上に位置する核酸からの発現の両方をカバーする。いくつかの実施形態において、発現は、誘導性事象によって開始される。いくつかの実施形態において、操作されたペプチド抗原をコードする編集された核酸は、操作されたペプチド抗原の発現を調節するイニシエーター配列に作動可能に連結されている。発現を誘導することができるイニシエーター配列は当技術分野で知られており、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現が誘導される。いくつかの実施形態において、タンパク質発現は、タンパク質をコードする核酸を含む細胞がインキュベートされ、別個の誘導ステップが必要とされない場合に起こる。
本発明の編集された細胞における操作されたペプチド抗原は、当技術分野で知られている方法を使用して、編集された核酸から発現され得る。いくつかの実施形態において、タンパク質発現は構成的である。構成的発現は、ゲノムに組み込まれた核酸からの発現と、エピソームベクター上に位置する核酸からの発現の両方をカバーする。いくつかの実施形態において、発現は、誘導性事象によって開始される。いくつかの実施形態において、操作されたペプチド抗原をコードする編集された核酸は、操作されたペプチド抗原の発現を調節するイニシエーター配列に作動可能に連結されている。発現を誘導することができるイニシエーター配列は当技術分野で知られており、誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現が誘導される。いくつかの実施形態において、タンパク質発現は、タンパク質をコードする核酸を含む細胞がインキュベートされ、別個の誘導ステップが必要とされない場合に起こる。
細胞ライブラリー
本発明のライブラリーは、固有の操作されたペプチド抗原を発現する編集された細胞のライブラリーを含む。ライブラリーの細胞は、好ましくはヌクレアーゼを使用して編集され、より好ましくは、本明細書でより詳細に説明されるように、自動化マルチモジュール細胞編集機器において1つ以上のヌクレアーゼ(例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ)を使用して編集される。
本発明のライブラリーは、固有の操作されたペプチド抗原を発現する編集された細胞のライブラリーを含む。ライブラリーの細胞は、好ましくはヌクレアーゼを使用して編集され、より好ましくは、本明細書でより詳細に説明されるように、自動化マルチモジュール細胞編集機器において1つ以上のヌクレアーゼ(例えば、核酸誘導型ヌクレアーゼ)を使用して編集される。
いくつかの実施形態では、ライブラリーは、編集された細胞に、細胞表面に固定化された高密度の操作されたペプチド抗原を提供する。いくつかの実施形態において、高密度は、細胞において発現される複数の操作されたポリペプチドを細胞表面結合標的に結合させることによって達成される。いくつかの実施形態において、提示される操作されたペプチド抗原の数は、1細胞あたり103超、104超、105超、106超、107超、又は108超である。いくつかの実施形態において、固定化ペプチドは、ビオチン化ペプチドである。提示される抗原は、細胞のディスプレイ戦略に応じて、単一のペプチド抗原又は2つ以上のペプチド抗原であり得る。いくつかの実施形態において、固定化ペプチドは膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態では、固定化ペプチドはGPIアンカーを含む。いくつかの実施形態では、固定化ペプチドは細胞表面に自然に存在するペプチドである。いくつかの実施形態において、固定化ペプチドは細胞表面に天然に存在する1つ以上の分子(例えば、細胞表面の表面炭水化物又はタンパク質)に結合するペプチドである。
いくつかの実施形態において、結合タンパク質のライブラリーは、1つ以上のTCR標的に結合するバリアントを同定及び/又は単離するために評価又はスクリーニングされ得る。本発明の方法は、約10−7M、約10−8M、約10−9M、約10−10M、約10−11M、約10−12M、約10−13M、約10−14M、又は約10−15Mの解離定数で表される結合親和性よりも大きい特定のTCRに対する親和性を有する操作されたペプチド抗原を同定するように設計され得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、約10−7M、約10−8M、約10−9M、約10−10M、約10−11M、約10−12M、約10−13M、約10−14M、又は約10−15Mの解離定数で表される結合親和性よりも大きいTCRに対する親和性を有する標的ペプチド配列を同定するように設計され得る。
ヌクレアーゼによるゲノム編集
実施形態によっては、本明細書に記載される自動化機器は、細胞表面ディスプレイのためのタンパク質の操作を可能にする、細胞の集団に編集を導入するためのヌクレアーゼによるゲノム編集システムを利用する。生物のゲノムへの編集を提供するための複数の異なるヌクレアーゼベースのシステムが存在し、それぞれを単一の編集システム、連続的編集システム(例えば、細胞内で2つ以上のゲノム編集を提供するために異なるヌクレアーゼによるシステムを連続して使用する)及び/又は再帰的編集システム(例えば、細胞に2つ以上のゲノム編集を導入するために単一のヌクレアーゼによるシステムを利用する)のいずれかで使用することができる。例示的なヌクレアーゼによるゲノム編集システムが本明細書に記載されているが、当業者は、本開示を読めば、他のそのような編集機器もまた、操作されたペプチド抗原の細胞表面ディスプレイのための細胞集団の作成に有用であることを認識するであろう。
実施形態によっては、本明細書に記載される自動化機器は、細胞表面ディスプレイのためのタンパク質の操作を可能にする、細胞の集団に編集を導入するためのヌクレアーゼによるゲノム編集システムを利用する。生物のゲノムへの編集を提供するための複数の異なるヌクレアーゼベースのシステムが存在し、それぞれを単一の編集システム、連続的編集システム(例えば、細胞内で2つ以上のゲノム編集を提供するために異なるヌクレアーゼによるシステムを連続して使用する)及び/又は再帰的編集システム(例えば、細胞に2つ以上のゲノム編集を導入するために単一のヌクレアーゼによるシステムを利用する)のいずれかで使用することができる。例示的なヌクレアーゼによるゲノム編集システムが本明細書に記載されているが、当業者は、本開示を読めば、他のそのような編集機器もまた、操作されたペプチド抗原の細胞表面ディスプレイのための細胞集団の作成に有用であることを認識するであろう。
本明細書に記載の自動化された編集機器は、ヌクレアーゼを使用してゲノムを切断するか、標的領域に編集を導入するか、又はその両方を行うことができることに留意すべきである。
本発明の特定の態様において、ヌクレアーゼ編集システムは、編集のタイミングの制御を可能にする誘導型システムである。ヌクレアーゼ活性を調節する能力は、オフターゲット切断を減らし、正確なゲノムエンジニアリングを容易にすることができる。本開示を読めば当業者には明らかであるように、多数の異なる誘導型システムを本開示の機器及びシステムと共に使用することができる。
特定の態様において、ヌクレアーゼによる切断は、標的領域にゲノム編集を有する細胞を選択するために、本発明の機器及びシステムで使用することができる。例えば、特定のヌクレアーゼ認識部位を除去するゲノム編集(例えば、相同組換えを介して)を行った細胞は、その編集に続いて細胞をヌクレアーゼに曝露することにより、例示的な実施形態の本明細書に記載の機器を用いて選択することができる。ゲノム編集のない細胞内のDNAは切断され、その後、成長が制限され、かつ/又は消滅するが、ヌクレアーゼ認識部位を除去するゲノム編集を受けた細胞は、その後のヌクレアーゼへの曝露の影響を受けない。
他の態様において、編集用の細胞は、細胞を機器に導入する前にゲノムを切断するために何らかの方法で処理され得、機器は、そのような細胞への所望のゲノム編集の自動導入に使用される。最初の切断は、最初の切断イベントに使用されたものと同じ又は異なる酵素によって実施することができる。
DNAをコードする核酸誘導型ヌクレアーゼを含む細胞又は細胞の集団がインデューサー分子の存在下にある場合、ヌクレアーゼの発現が起こり得る。例えば、CRISPR−ヌクレアーゼの発現は、リプレッサー分子の存在下で抑制できる。DNAをコードする核酸誘導型ヌクレアーゼを含む細胞又は細胞集団が、CRISPR−ヌクレアーゼの発現を抑制する分子が存在しない場合、CRISPR−ヌクレアーゼの発現が起こり得る。
例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼを使用して編集するための誘導型システムが記載されており、これは、化学誘導を使用して、細胞のRNA誘導型ヌクレアーゼへの一時的な曝露を制限する。Dowら、Nature Biotechnology,33:390−394(2015);Dharmacon,GE Life Sciences、コロラド州ラファイエットから入手可能な誘導性レンチウイルス発現ベクターも参照されたい。追加の技術については、例えば、Campbell,Biochem J.,473(17):2573−89(2010)を参照されたい。
他の例では、ウイルス誘導型ヌクレアーゼを使用して、細胞における遺伝子編集を誘導することができる。例えば、Don,Antiviral Res.,130:50−57(2016)を参照されたい。別の例では、核酸誘導型ヌクレアーゼの誘導性発現のために、ヌクレアーゼをエストロゲン受容体(ERT2)のホルモン結合ドメインと融合させることにより、バリアントをヒト細胞において4−ヒドロキシタモキシフェン(4−HT)でオン及びオフに切り替えることができる。Liuら、Nature Chemical Biology,12:980−87(2016)。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることにより生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、生物のゲノム内の特定の標的領域を標的とするように作ることができる。例えば、Urnovら、Nature Reviews Genetics,11:636−646(2010)を参照されたい。生物の内因性DNA修復機構を用いると、ゲノムの標的領域をZFNを用いて正確に変更できる。ZFNを用いて、変異型対立遺伝子のDNAに二本鎖切断(「DSB」)を生成することにより、ヘテロ接合体の優性変異を無効にすることができる。これは、相同テンプレートがない場合、非相同末端結合(NHEJ)によって修復される。NHEJは、2つの端部を結合することでDSBを修復し、切断部が整っていて複雑でない限り、通常は突然変異を発生させない。Duraiら、Nucleic Acids Res.33(18):5978−90(2005)。この修復メカニズムを使用して、インデル又は染色体再配列を介してゲノムにエラーを誘発させることができ、これはしばしば、その場所にコード化された遺伝子産物を機能させなくする。
これに代えて、相同性依存修復(HDR)を使用して、外因性の二本鎖DNA断片の存在下でDNAをゲノムに導入することができる。DSBを修復するための相同配列へのHDRの依存性は、DSBの隣接配列と相同である配列内に所望の配列を挿入することによって利用でき、HDRシステムによってテンプレートとして使用されると、関心のあるゲノム領域内に望ましい変化を生み出すことにつながり得る。
ZFNの複数のペアを使用して、ゲノム配列の大きなセグメント全体を完全に除去することもできる(Leeら、Genome Res.,20(1):81−89(2009)。CAG/CTGリピートトラクトの拡大は、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー、及びいくつかの脊髄小脳性運動失調を含む12を超える遺伝性神経障害の遺伝的基盤である。ZFNがCAGリピートにDSBを誘導し、リピートを長い病的な長さから、短い、毒性の少ない長さに縮小できることがヒト細胞で実証されている(Mittelmanら、PNAS USA,106(24):9607−12(2009))。
メガヌクレアーゼは1990年代に同定され、その後の研究により、メガヌクレアーゼは相同組換えを効率的に誘導し、ゲノムのコーディング領域又は非コーディング領域に突然変異を生成し、ゲノムのコーディング領域のリーディングフレームを変更できるため、ゲノム編集に特に有望なツールであることが示された。例えば、Epinatら、Nucleic Acids Research,31(11):2952−62(2003)を参照されたい。メガヌクレアーゼの高い特異性により、他の天然の制限酵素よりも高い精度及びはるかに低い細胞毒性が得られる。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、特定のDNA配列を切断するように作ることができる制限酵素である。それらは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメイン(DNA鎖を切断するヌクレアーゼ)に融合させることによって作られる。転写活性化因子様エフェクター(TALEN)は、実際に任意のDNA配列に結合するように作ることができるため、ヌクレアーゼと組み合わせると、特定の位置でDNAを切断できる。(例えば、Millerら、Nature Biotechnology,29(2):143−48(2011);Boch,Nature Biotechnology,29(2):135−36(2011)を参照)。
ZFNと同様に、TALENはDSBを誘導することでゲノムを編集することができる。標的領域でTALENが生じさせた部位特異的DSBは、NHEJ又はHDRを介して修復され、標的のゲノム編集がもたらされる。TALENは、インデル、再編成の導入、又は外因性二本鎖DNA断片の存在下でのNHEJを介したゲノムへのDNAの導入に使用することができる。
生細胞を編集するための最近の発見は、核酸誘導型ヌクレアーゼ(例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ)編集を含む。細胞内の適切な合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼは、細胞のゲノムを所望の位置で切断することができる。ガイド核酸は、核酸誘導型ヌクレアーゼが特定の標的配列でDNAを認識して切断するのに役立つ。ガイド核酸のヌクレオチド配列を操作することにより、適切なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)が近くにある限り、核酸誘導型ヌクレアーゼは、切断のために任意のDNA配列を標的とするようにプログラムされ得る。特定の態様において、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムは、ガイド核酸として機能するために結合する2つの別個のガイド核酸分子、例えば、CRISPR RNA(crRNA)及びトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を使用し得る。他の態様において、ガイド核酸は、crRNA及びtracrRNA配列の両方を含む単一のガイド核酸であり得る。
一般に、ガイド核酸(例えば、gRNA)は、適合性のある核酸誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、次いで、標的配列とハイブリダイズすることができ、それにより、ヌクレアーゼを標的配列に向ける。ガイド核酸はDNA又はRNAであり得る。あるいは、ガイド核酸は、DNA及びRNAの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、ガイド核酸は、修飾された又は天然に存在しないヌクレオチドを含み得る。ガイド核酸がRNAを含む場合、gRNAは、プラスミド、線状構築物などのポリヌクレオチド分子上のDNA配列によってコードされ得るか、又はコード配列は、編集カセット内に存在し、構成的プロモーターの制御下にあり得るか、又は、いくつかの実施形態において、好ましくは、以下に記載されるような誘導性プロモーターの制御下にあり得る。
ガイド核酸は、ガイド配列を含み、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズするのに十分な標的配列との相補性を有し、複合核酸誘導型ヌクレアーゼの配列特異的結合を標的配列へ向けるポリヌクレオチド配列である。ガイド配列と対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインメントされた場合、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、又はそれ以上である。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、又はそれ以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20ヌクレオチド長未満である。好ましくは、ガイド配列は、10〜30又は15〜20ヌクレオチド長、又は15、16、17、18、19、又は20ヌクレオチド長である。
本発明の方法及び組成物において、ガイド核酸は、プラスミド又はベクターから発現される配列として提供され、プロモーター、いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下の単一の転写物としてガイド配列及びスキャフォールド配列の両方を含む。ガイド核酸は、ガイド配列が所望の標的配列に相補的であるようにガイド配列を変更することによって所望の標的配列を標的とするように操作することができ、それによりガイド配列と標的配列との間のハイブリダイゼーションを可能にする。大抵の場合、標的配列の編集を生成するために、gRNA/ヌクレアーゼ複合体は、ガイドRNAによって決定される標的配列に結合し、ヌクレアーゼは、標的配列に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列を認識する。標的配列は、原核生物又は真核生物の細胞に対して内因性又は外因性の、又はインビトロの任意のポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的配列は、真核細胞の核に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的配列は、遺伝子産物(例えば、タンパク質)をコードする配列又は非コード配列(例えば、調節ポリヌクレオチド、イントロン、PAM、又は「ジャンク」DNA)であり得る。
ガイド核酸は、ドナー核酸をコードする編集カセットの一部であり得る。あるいは、ガイド核酸は編集カセットの一部ではなく、代わりにエンジン又は編集ベクター骨格にコードされ得る。例えば、ガイド核酸をコードする配列は、最初にアセンブリされるか、又はベクター骨格に挿入され、続いて、例えば、編集カセットにドナー核酸が挿入され得る。他の場合において、例えば、編集カセット内のドナー核酸は、最初にベクター骨格に挿入又はアセンブリされ、その後、ガイド核酸をコードする配列が挿入され得る。さらに他の場合において、ガイド核酸及びドナー核酸(例えば、編集カセットに挿入される)をコードする配列は、同時に、しかし別々に、ベクターに挿入又はアセンブリされる。さらに他の実施形態では、ガイド核酸をコードする配列及びドナー核酸をコードする配列は両方とも編集カセットに含まれる。
標的配列は、gRNA/ヌクレアーゼ複合体によって認識される短いヌクレオチド配列であるプロトススペーサー変異(PAM)に関連している。核酸誘導型ヌクレアーゼによって、正確な好ましいPAM配列及び長さの要件は異なる。ただし、PAMは通常、標的配列に隣接又は近接した2〜7塩基対の配列であり、ヌクレアーゼに応じて、標的配列の5’又は3’になる。核酸誘導型ヌクレアーゼのPAM相互作用ドメインの操作は、PAM特異性の変更を可能にし、標的部位認識忠実度を改善し、標的部位認識忠実度を低下させ、又は核酸誘導型ヌクレアーゼの多様性を増加させ得る。特定の実施形態において、標的配列のゲノム編集は、標的配列、例えば、細胞のゲノムDNAに所望のDNA変化を導入し、そして、標的配列中のプロトスペーサー突然変異(PAM)領域を除去し、突然変異させ、又は不活性にする。標的配列でPAMを不活性にすると、例えば後の編集ラウンドで合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼへのその後の曝露時の、その標的配列での細胞ゲノムのさらなる編集が不可能になる。したがって、所望の標的配列編集及び変更されたPAMを有する細胞は、標的配列に相補的な合成ガイド核酸と複合体を形成した核酸誘導型ヌクレアーゼを使用して選択することができる。最初の編集イベントを受けなかった細胞は切断され、二本鎖DNAが切断されるため、生存し続けることはできない。目的の標的配列の編集及びPAMの変更を含む細胞には必要なPAM部位が含まれなくなり、成長及び増殖し続けるため、これらの編集された細胞は切断されない。
核酸誘導型ヌクレアーゼが認識できる標的配列の範囲は、特定のPAMを所望の標的配列の近くに配置する必要性によって制約される。その結果、ゲノム編集に必要な精度で編集を標的とすることが難しい場合がある。ヌクレアーゼは、いくつかのPAM(例えば、標準的な(canonical)PAM)を非常によく認識し、他のPAM(例えば、非標準的なPAM)をあまり又はほとんど認識できないことがわかっている。本明細書に開示される方法は、編集されていない細胞のバックグラウンドにおける編集された細胞の識別を可能にするので、この方法は、PAMが最適ではない編集された細胞の識別を可能にする。すなわち、本明細書における編集された細胞を識別するための方法は、編集効率が非常に低くても、編集された細胞の識別を可能にする。さらに、本発明の方法は、ゲノム編集が機能性の低いPAMに関連している細胞を含め、編集がより容易に識別されるため、編集され得る標的配列の範囲を拡大する。
核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムのヌクレアーゼ成分に関して、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、古細菌、原核生物又は真核細胞などの特定の細胞種における発現のためにコドン最適化することができる。真核細胞は、酵母、真菌、藻類、植物、動物、又はヒトの細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物などの特定の生物のものであるか、又はそれらに由来し得る。使用する核酸誘導型ヌクレアーゼの選択は、標的配列でどのタイプの編集を行うか、適切なPAMが目的の標的配列の近くにあるかどうかなど、多くの要因に依存する。本明細書に記載の方法で使用されるヌクレアーゼには、Cas9、Cas12/CpfI、MAD2、又はMAD7又は他のMADzymeが含まれるが、これらに限定されない。ガイド核酸と同様に、ヌクレアーゼは、ベクター(例えば、エンジンベクター)上のDNA配列によってコードされ得、構成的又は誘導性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼをコードする配列は、誘導性プロモーターの制御下にあり、誘導性プロモーターは、ガイド核酸の転写を制御する誘導性プロモーターから分離され得るが、それと同じであってもよい。すなわち、別個の誘導性プロモーターがヌクレアーゼ及びガイド核酸配列の転写を駆動するが、2つの誘導性プロモーターは同じタイプの誘導性プロモーターであり得る(例えば、両方ともpLプロモーターである)。あるいは、ヌクレアーゼの発現を制御する誘導性プロモーターは、ガイド核酸の転写を制御する誘導性プロモーターとは異なり得る。すなわち、例えば、ヌクレアーゼはpBAD誘導性プロモーターの制御下にあり、ガイド核酸はpL誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。
核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの別の構成要素は、ドナー核酸である。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は、ガイド核酸と同じポリヌクレオチド(例えば、編集ベクター又は編集カセット)上にあり、(必ずしもではないが)ガイド核酸と同じプロモーター(例えば、ガイド核酸とドナー核酸の両方の転写を駆動する単一のプロモーター)の制御下にあり得る。ドナー核酸は、gRNA/ヌクレアーゼ複合体の一部として核酸誘導型ヌクレアーゼによって傷つけられ又は切断された標的配列との相同組換えのテンプレートとして機能するように設計されている。ドナー核酸ポリヌクレオチドは、約20、25、50、75、100、150、200、500、又は1000ヌクレオチド長などの任意の適切な長さのものであり得る。特定の好ましい態様において、ドナー核酸は、20〜300ヌクレオチド、より好ましくは50〜250ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドとして提供され得る。ドナー核酸は、標的配列の一部(例えば、相同性アーム)に相補的な領域を含む。最適に整列されると、ドナー核酸は、例えば、約20、25、30、35、40、50、60、70、80、90又はそれ以上のヌクレオチドが標的配列と重複する(相補的である)。多くの実施形態において、ドナー核酸は、ドナー核酸と標的テンプレートとの間の突然変異又は差異に隣接する2つの相同性アーム(標的配列に相補的な領域)を含む。ドナー核酸は、標的配列と比較した挿入、欠失、修飾、又はそれらの任意の組み合わせなど、標的配列と比較した少なくとも1つの突然変異又は変化を含む。
多くの場合、ドナー核酸は編集カセットとして提供され、これはベクター骨格に挿入され、このベクター骨格は、gRNAの転写を駆動するプロモーターを含み得、gRNAのコード配列、又はベクター骨格は、gRNA自体ではなく、gRNAの転写を駆動するプロモーターを含み得る。さらに、エンジンベクターには複数、例えば、2、3、4、又はそれ以上のガイド核酸/ドナー核酸カセットが挿入されてもよく、各ガイド核酸は、別々の異なるプロモーター、分離様プロモーターの制御下にあり、又は、すべてのガイド核酸/ドナー核酸ペアが単一のプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態において、gRNA及びドナー核酸の転写を駆動する(又は2つ以上のgRNA/ドナー核酸対を駆動する)プロモーターは誘導性プロモーターであり、ヌクレアーゼの転写を駆動するプロモーターも誘導性プロモーターである。編集カセットに関する追加情報については、米国特許第9,982,278号、及び米国特許出願第15/948,789号;15/116,616号;15/948,785号;16/056,310号;16,275,439号;及び16/275,465号を参照されたい。
誘導性編集は、編集を開始する前に、分離された細胞を数倍以上に増殖させることができるという利点がある。アクティブな編集によって引き起こされる二本鎖切断は細胞に大きな毒性があるため、これにより、編集された細胞が生き残る可能性が高くなる。この毒性は、編集されたコロニーでの細胞死と、おそらく生き残るが編集後に修復及び回復されなければならない編集された細胞の成長の遅れの両方をもたらす。ただし、編集された細胞が回復する機会があれば、編集された細胞のコロニーのサイズは、最終的には編集されていない細胞のコロニーのサイズに追いつくであろう。さらに、ガイド核酸は、例えば目的の編集が標的配列内で互いに近い場合、編集カセット内の複数のドナー核酸の編集を指示するのに効果的であり得る。
ドナー核酸に加えて、編集カセットは、1つ以上のプライマー部位を含み得る。プライマー部位は、例えば、プライマー部位が編集カセットの他のコンポーネントの1つ又は複数に隣接している場合、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して編集カセットを増幅するために使用できる。
また、上記のように、ドナー核酸は、標的配列に対する少なくとも1つの突然変異に加えて、標的配列中のPAM部位を突然変異させ、削除し、又は不活性にする1つ又は複数のPAM配列変化を含み得る。標的配列におけるPAM配列の変更は、PAM部位を核酸誘導型ヌクレアーゼに対して「免疫」にし、同じヌクレアーゼが使用される場合、その後の編集ラウンドでのさらなる編集から標的配列を保護する。
さらに、編集カセットはバーコードを含み得る。バーコードは、対応する標的配列に対して行われた編集をバーコードが識別できるように、ドナーDNA配列に対応する固有のDNA配列である。バーコードは通常、4つ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、編集カセットは、例えば、ドナー核酸の遺伝子全体又はゲノム全体のライブラリーを表すドナー核酸のコレクションを含む。編集カセットのライブラリーは、例えば、それぞれの異なるドナー核酸が異なるバーコードに関連付けられているベクター骨格にクローン化されている。
さらに、いくつかの実施形態では、核酸誘導型ヌクレアーゼシステムの構成要素をコードする発現ベクター又はカセットは、1つ又は複数の核局在化配列(NLS)、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はそれ以上のNLSを含む核酸誘導型ヌクレアーゼをさらにコードする。いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、アミノ末端又はその近くのNLS、カルボキシ末端又はその近くのNLS、又はそれらの組み合わせを含む。
エンジン及び編集ベクターは、転写される構成要素配列に作動可能に連結された制御配列を含む。上記のように、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムの1つ又は複数の構成要素の転写を駆動するプロモーターは、誘導性であり得る。植物、微生物、及び哺乳類細胞を含む動物細胞における遺伝子の発現を制御するために、pLプロモーター(CI857リプレッサーの熱不活性化により誘導される)、pBADプロモーター(細胞成長培地へのアラビノースの添加により誘導される)、及びラムノース誘導性プロモーター(細胞成長培地へのラムノースの添加により誘発される)を含む多くの遺伝子調節制御システムが開発されている。その他のシステムには、テトラサイクリン制御性転写活性化システム(Tet−On/Tet−Off、Clontech,Inc.(カリフォルニア州パロアルト);Bujard and Gossen,PNAS,89(12):5547−5551(1992))、Lacスイッチ誘導性システム(Wyborskiら、Environ Mol Mutagen,28(4):447−58(1996);DuCoeurら、Strategies 5(3):70−72(1992);米国特許第4,833,080号)、エクジソン誘導性遺伝子発現システム(Noら、PNAS,93(8):3346−3351(1996))、Cumate遺伝子スイッチシステム(Mullick etal.,BMC Biotechnology,6:43(2006))、及びタモキシフェン誘導性遺伝子発現(Zhangら、Nucleic Acids Research,24:543−548(1996))他が含まれる。本明細書に記載のモジュール及び機器で使用される本発明の方法では、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集コンポーネント(例えば、ヌクレアーゼ及び/又はgRNA)の少なくとも1つは、温度の上昇によって活性化されるプロモーターの制御下にあることが好ましく、そのようなプロモーターは、温度の上昇によって活性化され、温度の低下によって非活性化されることにより、編集プロセスを「オフにする」ことを可能にする。したがって、温度の低下によって非活性化されるプロモーターのシナリオでは、培地を変更することなく、編集を誘発するために使用される培地中の誘導性生化学物質などを除去することなく、細胞内の編集をオフにすることができる。
細胞表面ディスプレイライブラリーを作成するための自動細胞編集機器及びモジュール
自動細胞編集機器
図4Aは、例えば、上記の例示的なワークフローの1つを実行するための例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器400、ならびに追加の例示的なモジュールを示す。機器400は、例えば、実験室環境内で使用するためのデスクトップ機器として設計されてもよく、そう設計されることが好ましい。機器400は、細胞内での自動化されたゲノム切断及び/又は編集を実施する際に様々な段階的プロセスを実行するための再利用可能要素及び使い捨て要素の組合せを組み込むことができる。示されているのはガントリー402であり、これは、XYZ軸モーションコントロールを、例えば、空気置換ピペットならびに自動化マルチモジュール細胞処理装置400のモジュールを含む自動液体ハンドリングシステム458に供給する自動化機械的モーションシステム(アクチュエータ)(図示略)を提供する。いくつかの自動化マルチモジュール細胞処理機器では、空気置換ピペッター432はガントリー402によって動かされ、様々なモジュール及び試薬カートリッジは静止したままである。しかしながら、他の実施形態では、液体ハンドリングシステムは、様々なモジュールが動かされている間、静止したままであり得る。自動化マルチモジュール細胞処理機器400には、リザーバ412及び形質転換モジュール430を含む試薬カートリッジ410、ならびにリザーバ406を含む洗浄カートリッジ404も含まれる。洗浄カートリッジ404は、大きなチューブ、例えば、洗浄溶液、又は反復プロセス全体を通して頻繁に使用される溶液を収容するように構成され得る。一例では、洗浄カートリッジ404は、2つ以上の試薬カートリッジ410が連続して使用され、交換されたときに所定の位置に留まるように構成され得る。試薬カートリッジ410及び洗浄カートリッジ404は、別個のカートリッジとして図4Aに示されているが、洗浄カートリッジ404の内容物は、試薬カートリッジ410に包含され得る。この実施形態では、形質転換モジュール430は、試薬カートリッジ410内に含まれているが、代替の実施形態では、形質転換モジュール430は、それ自体のモジュール内に含まれるか、又は成長モジュールなどの別のモジュールの一部であり得ることに留意されたい。
自動細胞編集機器
図4Aは、例えば、上記の例示的なワークフローの1つを実行するための例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器400、ならびに追加の例示的なモジュールを示す。機器400は、例えば、実験室環境内で使用するためのデスクトップ機器として設計されてもよく、そう設計されることが好ましい。機器400は、細胞内での自動化されたゲノム切断及び/又は編集を実施する際に様々な段階的プロセスを実行するための再利用可能要素及び使い捨て要素の組合せを組み込むことができる。示されているのはガントリー402であり、これは、XYZ軸モーションコントロールを、例えば、空気置換ピペットならびに自動化マルチモジュール細胞処理装置400のモジュールを含む自動液体ハンドリングシステム458に供給する自動化機械的モーションシステム(アクチュエータ)(図示略)を提供する。いくつかの自動化マルチモジュール細胞処理機器では、空気置換ピペッター432はガントリー402によって動かされ、様々なモジュール及び試薬カートリッジは静止したままである。しかしながら、他の実施形態では、液体ハンドリングシステムは、様々なモジュールが動かされている間、静止したままであり得る。自動化マルチモジュール細胞処理機器400には、リザーバ412及び形質転換モジュール430を含む試薬カートリッジ410、ならびにリザーバ406を含む洗浄カートリッジ404も含まれる。洗浄カートリッジ404は、大きなチューブ、例えば、洗浄溶液、又は反復プロセス全体を通して頻繁に使用される溶液を収容するように構成され得る。一例では、洗浄カートリッジ404は、2つ以上の試薬カートリッジ410が連続して使用され、交換されたときに所定の位置に留まるように構成され得る。試薬カートリッジ410及び洗浄カートリッジ404は、別個のカートリッジとして図4Aに示されているが、洗浄カートリッジ404の内容物は、試薬カートリッジ410に包含され得る。この実施形態では、形質転換モジュール430は、試薬カートリッジ410内に含まれているが、代替の実施形態では、形質転換モジュール430は、それ自体のモジュール内に含まれるか、又は成長モジュールなどの別のモジュールの一部であり得ることに留意されたい。
洗浄及び試薬カートリッジ404及び410は、いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器400で使用するために提供される使い捨てキットである。例えば、ユーザは、細胞処理を起動する前に、自動化マルチモジュール細胞編集機器の筐体内に試薬カートリッジ410及び洗浄カートリッジ404のそれぞれを開封して配置することができる。
また、ガントリー402及び空気置換ピペッター432を含むロボットハンドリングシステム458も示されている。いくつかの例では、ロボットハンドリングシステム458は、スイス、マンネドルフのTecan Group Ltd.、ネバダ州リノのHamilton Company(例えば、国際公開第2018015544号を参照)、又はコロラド州フォートコリンズのBeckman Coulter Inc.(例えば、米国特許出願公開第20160018427号を参照)によって製造されるものなどの自動液体ハンドリングシステムを含み得る。ピペットチップは、空気置換ピペッター432で使用するためのピペット移送チップ供給部(図示略)で提供され得る。
いくつかの実装形態では、カートリッジ404、410の構成要素は、ロボットハンドリングシステム458による認識のために、バーコードなどの機械可読表示でマークされている(図示略)。例えば、ロボットハンドリングシステム458は、各カートリッジ404、410内の容器をスキャンして、内容物を確認することができる。他の実装形態では、機械可読表示は各カートリッジ404、410にマークされ、自動化マルチモジュール細胞編集機器400の処理システム426(図4Dに示す)が、機械可読表示に基づいて保存された材料マップを識別してもよい。図4Aの例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器400は、細胞成長モジュール434をさらに含む。(ここで簡単に説明されているすべてのモジュールについて、以下で詳しく説明する。)図4Aに示される実施形態では、細胞成長モジュール434は、2つの細胞成長バイアル418、420(図5A〜5Dに関して以下でより詳細に説明する)及び細胞濃縮モジュール422(図6A〜6Fに関して詳述する)を含む。代替の実施形態では、細胞濃縮モジュール422は、例えば、別個の専用モジュールにおいて、細胞成長モジュール434から分離され得る。また、図4Aの自動化マルチモジュール細胞処理機器400の一部として示されているのは、例えば、ロボットハンドリングシステム458及び空気置換ピペッター432によって提供される任意選択の富化モジュール440である。また、反応チャンバー又はチューブレセプタクル(図示略)と、例えば、磁性固相可逆固定化(SPRI)ビーズ(Applied Biological Materials Inc.、ブリティッシュコロンビア州リッチモンド)を使用して核酸の精製を可能にする磁石416とを含む任意選択の核酸アセンブリ/脱塩モジュール414も示されている。細胞成長モジュール、細胞濃縮モジュール、形質転換モジュール、富化モジュール、試薬カートリッジ、及び核酸アセンブリモジュールは、以下でより詳細に説明する。
図4Bは、図4Aに示される例示的なマルチモジュール細胞処理機器400の正面の平面図である。例えば、カートリッジベースの原料(試薬カートリッジ410など)は、ロボットハンドリング器具(この図には示されない)によるアクセスのために、機器400のデッキ402上の指定された領域に配置され得る。図4Bに示されるように、デッキ402は、機器400のモジュールのいずれかからこぼれ出る、滴下する、又は溢れ出る汚染物質が保護シンクの縁部内に含まれるように、保護シンクを含み得る。試薬カートリッジ410に加えて、図4Bにさらに見られるのは、洗浄カートリッジ404、任意選択の富化モジュール440、及び成長モジュール434の一部である。この図には、タッチスクリーンディスプレイ450、形質転換モジュール制御部438、電子機器ラック436、及び処理システム426も見られる。
図4C〜4Dは、デスクトップ式の細胞編集機器480で使用するための筐体490を備えるマルチモジュール細胞処理機器480を示す。例えば、筐体490は、約61〜122cm(約24〜48インチ)の幅、約61〜122cm(約24〜48インチ)の高さ、及び約61〜122cm(約24〜48インチ)の深さを有し得る。筐体490は、自動細胞処理で使用される複数のモジュール及び使い捨て消耗品を保持するように設計されてもよく、そのように設計されることが好ましい。さらに、筐体490は、モジュール間で材料を移動させるためのロボットハンドリングシステム458を搭載してもよい。
図示のように、筐体490は、カバーを持ち上げて筐体490の内部にアクセスするためのハンドル454及びヒンジ456a〜456cを有するカバーを含む。冷却格子464は、内部ファン(図示略)を介した空気の流れを可能にする。さらに、筐体490は、調節可能な足470(足470a〜cが示されている)によって持ち上げられる。例えば、足470a〜470cは、筐体490の下に追加の空気流を提供し得る。いくつかの実施形態では、制御ボタン466は、筐体490内での細胞処理を単一のボタンで自動的に開始及び/又は停止することを可能にする。
いくつかの実装形態では、筐体490の内部において、ロボットハンドリングシステム458が材料カートリッジ404及び410の上方にガントリー402に沿って配置される。いくつかの実施形態では、制御回路要素、液体ハンドリングチューブ、空気ポンプ制御器、バルブ、熱ユニット(例えば、加熱及び冷却ユニット)、及び他の制御機構が、筐体490のデッキの下の制御ボックス領域468に配置される。図4Dには、磁石416を含む富化モジュール440及び核酸アセンブリモジュール414も見られる。
図示されていないが、いくつかの実施形態では、ディスプレイ画面が、筐体490の前面に配置され、例えばカバーの一部を覆ってもよい(例えば、図4Bを参照)。ディスプレイ画面は、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理状況に関する情報をユーザに提供してもよい。別の例では、ディスプレイ画面は、細胞処理を行うためのユーザからの入力を受け入れてもよい。
回転細胞成長モジュール
図5Aは、本明細書に記載の細胞成長デバイスと共に使用するための回転成長バイアル500の一実施形態を示す。回転成長バイアルは、液体培地及び細胞を受け入れるための開口端504、細胞を成長させるための主要な容器を画定する中央バイアル領域506、少なくとも1つの光路510を画定する先細ないし狭窄領域518、閉端部516、及び駆動係合機構512を有する光学的に透明な容器である。回転成長バイアルは、バイアルがその周りを回転する中心縦軸520を有し、光路510は、バイアルの縦軸に対しほぼ直角である。第1の光路510は、先細ないし狭窄領域518の下側狭窄部に配置されている。任意選択で、回転成長バイアル500のいくつかの実施形態は、先細ないし狭窄領域518の先細領域に第2の光路508を有する。この実施形態における両方の光路は、細胞培養物(細胞+成長培地)で常に満たされ、成長バイアルの回転速度の影響を受けない回転成長バイアルの領域に配置される。第1の光路510は第2の光路508よりも短く、バイアル内の細胞培養物のOD値が高レベル(例えば、細胞成長過程の後期)にあるときにOD値の高感度測定を可能にし、一方、第2の光路508は、バイアル内の細胞培養物のOD値が低レベル(例えば、細胞成長過程の初期)にあるときにOD値の高感度測定を可能にする。また、リップ502も示されており、これは、回転する成長バイアルを成長モジュール(図示略)に装着することを可能にし、さらに、ユーザにとって容易な取り扱いを可能にする。
図5Aは、本明細書に記載の細胞成長デバイスと共に使用するための回転成長バイアル500の一実施形態を示す。回転成長バイアルは、液体培地及び細胞を受け入れるための開口端504、細胞を成長させるための主要な容器を画定する中央バイアル領域506、少なくとも1つの光路510を画定する先細ないし狭窄領域518、閉端部516、及び駆動係合機構512を有する光学的に透明な容器である。回転成長バイアルは、バイアルがその周りを回転する中心縦軸520を有し、光路510は、バイアルの縦軸に対しほぼ直角である。第1の光路510は、先細ないし狭窄領域518の下側狭窄部に配置されている。任意選択で、回転成長バイアル500のいくつかの実施形態は、先細ないし狭窄領域518の先細領域に第2の光路508を有する。この実施形態における両方の光路は、細胞培養物(細胞+成長培地)で常に満たされ、成長バイアルの回転速度の影響を受けない回転成長バイアルの領域に配置される。第1の光路510は第2の光路508よりも短く、バイアル内の細胞培養物のOD値が高レベル(例えば、細胞成長過程の後期)にあるときにOD値の高感度測定を可能にし、一方、第2の光路508は、バイアル内の細胞培養物のOD値が低レベル(例えば、細胞成長過程の初期)にあるときにOD値の高感度測定を可能にする。また、リップ502も示されており、これは、回転する成長バイアルを成長モジュール(図示略)に装着することを可能にし、さらに、ユーザにとって容易な取り扱いを可能にする。
回転成長バイアルのいくつかの構成では、回転成長バイアルは、回転成長バイアルの内壁から中央バイアル領域の中心に向かって延びる、回転成長バイアル内に配置された2つ以上の「パドル」又は内部特徴を有する。いくつかの態様において、上記パドル又は特徴の幅は、回転成長バイアルのサイズ又は体積によって異なり、回転成長バイアルの直径の1/20から1/3強、又は回転成長バイアルの直径の1/15から1/4、又は回転成長バイアルの直径の1/10から1/5の範囲であり得る。いくつかの態様において、パドルの長さは、回転成長バイアルのサイズ又は体積にによって異なり、回転成長バイアルの本体の長さの4/5から1/4、又は回転成長バイアルの本体の長さの3/4から1/3、又は回転成長バイアルの本体の長さの1/2から1/3の範囲であり得る。他の態様では、水平又は垂直に配置された回転成長バイアルの本体の内面に配置された隆起した特徴の同心円状の列があり得る。他の態様において、回転成長バイアルの本体の内面に配置された隆起した特徴のらせん構成があり得る。別の態様では、隆起した特徴の同心円状の列又はらせん状の構成を、回転成長バイアルの支柱又は中央構造上に配置することができる。上記では2つのパドルを有すると説明したが、回転成長バイアルは、3、4、5、6又はそれ以上の数のパドル、かつ最大20個のパドルを含み得る。パドルの数は、例えば、回転成長バイアルのサイズ又は容量に依存する。パドルは、バイアルの内壁からバイアルの内部に延びる単一のパドルとして対称的に配置されてもよいし、パドルは、2、3、4又はそれ以上の数のパドルの群において、バイアルの内壁からバイアルの内部に伸びるパドルの群として対称的に配置されてもよい(例えば、別のパドルのペアの反対側のパドルのペア)。別の実施形態では、パドルは、回転成長バイアルの中央から、回転成長バイアルの壁に向かって外側に、例えば、回転成長バイアルの内部の支柱又は他の支持構造から延びることができる。
駆動係合機構512は、モータ(図示略)と係合してバイアルを回転させる。いくつかの実施形態では、モータは、回転成長バイアルが一方向にのみ回転するように駆動係合機構512を駆動し、他の実施形態では、回転成長バイアルは、第1の時間又は周期で第1の方向に回転し、第2の時間又は周期で第2の方向(すなわち、反対方向)に回転する。この工程を繰り返して、回転成長バイアル(及び細胞培養内容物)を振動させることができる。第1の時間と第2の時間は、同じであっても異なっていてもよい。上記時間は、1、2、3、4、5秒以上、又は1、2、3、4分以上であり得る。別の実施形態において、細胞成長の初期段階において、回転成長バイアルは、第1の周期で(例えば、60秒ごとに)振動され、次いで、細胞成長の後期段階において、回転成長バイアルは、最初の周期とは異なる第2の周期で(例えば、1秒ごとに)振動され得る。
回転成長バイアル500は再利用可能とすることができ、又は好ましくは、回転成長バイアルは消耗品である。いくつかの実施形態では、回転成長バイアルは消耗品であり、成長培地を事前に充填してユーザに提示され、バイアルは、開放端504をホイルシールで密閉されている。このような方法で包装された培地充填回転成長バイアルは、自立型細胞成長デバイス、又は自動化マルチモジュール細胞処理機器の一部である細胞成長モジュールと共に使用するキットの一部であり得る。バイアルに細胞を導入するために、ユーザは所望の量の細胞をピペットで採取し、ピペットチップでバイアルのホイルシールを打ち抜くだけで済む。開放端504は、任意選択で細胞成長デバイス(図示略)と重なって係合する延長リップ502を含むことができる。自動システムにおいて、回転成長バイアル500は、自動システム(図示略)の一部であるスキャナ又はカメラによって読み取ることができるバーコード又は他の識別手段でタグ付けされてもよい。
回転成長バイアル500の容積及び細胞培養物(成長培地を含む)の体積は大きく異なる場合があるが、回転成長バイアル500の容積は、成長バイアルでの細胞培養において、バイアルが回転している間に適切な通気を得るために十分な大きさでなければならない。実際には、回転成長バイアル500の容積は、1〜250ml、2〜100ml、5〜80ml、10〜50ml、又は12〜35mlの範囲であり得る。同様に、細胞培養物(細胞+成長培地)の体積は、回転成長バイアルで適切な通気を可能にするのに適したものでなければならない。したがって、細胞培養物の体積は、成長バイアルの容積の約10〜85%、又は成長バイアルの容積の20〜60%とすべきである。例えば、35mlの成長バイアルの場合、細胞培養物の体積は約4ml〜約27ml、又は7ml〜約21mlになるであろう。
回転成長バイアル500は、好ましくは生体適合性の光学的に透明な材料から製造されるか、又は光路を含むバイアルの少なくとも一部が透明である。加えて、回転成長バイアルが製造される材料は、温度ベースの細胞アッセイ及び低温での長期保存の両方に対応するように、約4℃以下に冷却可能であり、約55℃以上に加熱可能でなければならない。さらに、バイアルの製造に使用される材料は、回転中に変形することなく55℃までの温度に耐えられるものでなければならない。適切な材料には、ガラス、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリスルホン、ポリウレタン、及びこれら及び他のポリマーのコポリマーが含まれる。好ましい材料には、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又はポリスチレンが含まれる。いくつかの実施形態では、回転成長バイアルは、例えば射出成形又は押出成形によって安価に製造される。
図5B〜5Dは、回転成長バイアル500を含む細胞成長モジュール550の実施形態を示す。図5Bは、細胞成長デバイス550の一実施形態の斜視図である。図5Cは、図5Bからの細胞成長デバイス550の破断図を示す。両方の図において、回転成長バイアル500は、メインハウジング526の内側に配置され、回転成長バイアル500の延長リップ502がメインハウジング526の上に延在するように示されている。さらに、端部ハウジング522、下部ハウジング532、及びフランジ524が両方の図に示されている。フランジ524は、細胞成長デバイスを加熱/冷却手段又は他の構造(図示略)に取り付けるために使用される。図5Cは、追加の詳細を示している。図5Cでは、上部ベアリング542及び下部ベアリング530は、メインハウジング526内に配置されている。上部ベアリング542及び下部ベアリング530は、回転成長バイアル500の垂直荷重を支持する。下部ハウジング532は、駆動モーター536を含む。図5Cの細胞成長デバイスは、一次光路534及び二次光路530の2つの光路を含む。光路534は、回転成長バイアルの先細ないし狭窄部の狭窄部に配置された光路510に対応し、光路530は、回転成長バイアルの先細ないし狭窄部の先細部における光路508に対応する。光路510及び508は図5Cには示されていないが、例えば図5Aに見られる。光路534及び530に加えて、光路を照明するための放射ボード528、及び光が回転成長バイアル内の細胞培養液を通過した後の光を検出するための検出器ボード546が存在する。
回転成長バイアル500を回転させるために使用されるモータ536は、いくつかの実施形態では、0から約3000RPMの間の一定の毎分回転数(RPM)を維持するように設定可能な駆動制御器を内蔵したブラシレスDCタイプの駆動モータである。あるいは、ステッパー、サーボ、又はブラシ付きDCなど、他のタイプのモータを使用することもできる。任意選択で、モータ506は、回転方向の反転を可能にする方向制御器、及び実際のRPMを感知して報告する回転速度計も備えている。モータは、例えば、プロセッサにプログラムされた標準プロトコル及び/又はユーザー入力に従ってプロセッサ(図示略)によって制御され、モータは、RPMを変化させて細胞培養物の軸方向歳差運動を引き起こし、それにより混合を促進して、例えば細胞の凝集を防ぎ、通気を増やし、細胞呼吸を最適化するように構成され得る。
細胞成長デバイス550のメインハウジング526、端部ハウジング522及び下部ハウジング532は、アルミニウム、ステンレス鋼、及びプラスチックを含む他の熱伝導性材料を含む任意の適切で頑丈な材料から製造され得る。これらの構造又はその一部は、様々な技術、例えば、金属加工、射出成形、融合された構造層の作成などによって作成できる。回転成長バイアルは、いくつかの実施形態では再利用可能であることが想定されているが、好ましくは消耗品であり、細胞成長デバイス550の他のコンポーネントは、再利用可能であることが好ましく、自立型ベンチトップデバイスとして、又はここでは、マルチモジュール細胞処理システムとして機能することができる。
細胞成長システムのプロセッサ(図示略)は、成長させている細胞培養物の「ブランク」又は対照として使用される情報でプログラムされてもよい。「ブランク」又は対照は、細胞成長培地のみを含む容器であり、100%の透過率と0ODをもたらすのに対し、細胞試料は光線を偏向させ、透過率を低くしODを高くする。細胞が培地で成長し、密度が高くなると、透過率が低下し、ODが上昇する。細胞成長システムのプロセッサは、細胞培養で通常使用される成長培地(例えば、哺乳類細胞、細菌細胞、動物細胞、酵母細胞など)に見合った波長の値をブランクに使用するようにプログラムされ得る。あるいは、第2の分光光度計及び容器を細胞成長システムに含めることができ、第2の分光光度計を使用して指定された間隔でブランクを読み取る。
図5Dは、光源590、検出器592、及び熱部品594に結合された図5Bの細胞成長デバイスを含むアセンブリの一部としての細胞成長デバイスを示す。回転成長バイアル500は細胞成長デバイスに挿入される。光源590及び検出器592の構成要素(例えば、5−logをカバーするゲイン制御を備えたフォトダイオードなど)は、細胞成長デバイスのメインハウジングに結合される。細胞成長デバイスをアセンブリに固定するフランジ524の1つと同様に、回転成長バイアルを回転させるモータを収容する下部ハウジング532が示されている。また、ペルチェデバイス又は熱電冷却器594も示されている。この実施形態では、熱制御は、細胞成長デバイス500を、下部ハウジング532のベース上のフランジ504を介して熱デバイス594に取り付け、電気的に統合することによって達成される。熱電冷却器は、電流の流れの方向に応じて、接合部のいずれかの側に熱を「送り(pumping)」、表面を冷却するか、表面を加熱することができる。一実施形態では、サーミスタを使用してメインハウジングの温度を測定し、次に、標準的な電子的比例−積分−微分(PID)制御ループを介して、回転成長バイアル500を約+/−0.5℃に制御する。
特定の実施形態では、後部に取り付けられた電源入力モジュールは、安全ヒューズ及びオンオフスイッチを含み、これらは、オンにされると、プロセッサを起動する内部AC及びDC電源(図示略)に電力を供給する。プログラムされた時間間隔での光学密度(OD)の測定は、目的の細胞を含む回転成長バイアルの下側狭窄部に光学部品を介してカラム化された600nm発光ダイオード(LED)(図示略)を使用して行われる。光は、収集光学系を通って、(デジタル)ゲイン制御されたシリコンフォトダイオードからなる検出システムへ進む。大抵の場合、光学密度は通常、光減衰器のパワー伝達係数の10を底とする対数の絶対値として示される:OD=−log10(パワーアウト/パワーイン)。ODは光減衰の尺度、つまり吸収、散乱、及び反射の合計であるため、細胞成長デバイスのOD測定は全体的なパワー伝達を表し、細胞が成長して密度が高くなるにつれてOD(信号の損失)は増加する。ODシステムは、OD標準に対して事前に較正されており、これらの値は、測定プログラムによってアクセス可能なオンボードメモリに保存される。
使用中、細胞は、ホイルシールを打ち抜くことにより、回転成長バイアルに事前に充填された成長培地に接種される(例えば、自動液体ハンドリングシステムから、又はユーザによって、細胞をピペットで移すことができる)。細胞成長デバイスのプログラムされたソフトウェアは、成長の制御温度(通常は30℃)を設定し、回転成長バイアルの回転をゆっくりと開始する。細胞/成長培地混合物は、遠心力により壁をゆっくりと垂直に上に移動し、回転成長バイアルが混合物の大きな表面積を通常の酸素環境にさらすことを可能にする。成長監視システムは、ODの連続読み取りを行うか、あるいは事前に設定された、又は事前にプログラムされた時間間隔でOD測定を行う。これらの測定値は内部メモリに保存され、要求された場合、ソフトウェアは測定値と時間の関係をプロットして増殖曲線を表示する。強化された混合が必要な場合、例えば、成長条件を最適化するために、バイアルの回転速度を変化させて液体の軸方向歳差運動を引き起こすことができ、及び/又は完全な方向変更をプログラムされた間隔で実行することができる。増殖モニタリングは、所定のODで増殖段階を自動的に終了し、その後、混合物をより低い温度に急速に冷却して、さらなる増殖を抑制するようにプログラムすることができる。
細胞成長デバイス550の1つの用途は、増殖中の細胞培養物の光学密度を絶えず測定することである。説明した細胞成長デバイスの1つの利点は、光学密度を連続的に(動的モニタリング)又は特定の時間間隔で、例えば、5、10、15、20、30、45、又は60秒ごとに、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10分ごとに測定できることである。増殖中の細胞培養物の光学密度(OD)を測定するという文脈で細胞成長デバイスを説明してきたが、しかしながら、本明細書の教示を与えられた当業者は、細胞培養物ODに加えて、又はそれに代えて、他の細胞増殖パラメータを測定できることを理解すべきである。例えば、可視光、UV、又は近赤外(NIR)光を使用する分光法により、細胞培養中の栄養素及び/又は老廃物の濃度をモニタリングできる。さらに、分光測定を使用して、複数の化学種を同時に定量化することができる。非対称化学種は、NIRの特徴的な吸光度の特徴を特定することで定量化できる。逆に、対称化学種は、ラマン分光法を使用して簡単に定量化できる。グルコース、グルタミン、アンモニア、乳酸塩などの多くの重要な代謝物は、IRにおける特徴のあるスペクトル特性を持っているため、簡単に定量化できる。サンプルによって吸収される光の量及び頻度は、サンプルに存在する化学種の種類及び濃度と相関させることができる。これらの測定の種類にはそれぞれ特定の利点がある。FT−NIRは、最大の光侵入深さを提供し、より厚いサンプルに使用できる。FT−mid−IR(MIR)は、これらの波長が基本的なIR吸収に近いため、特定の分析対象物に固有であることより簡単に識別できる情報を提供する。FT−ラマンは、水による干渉を最小限に抑える場合に有利である。他のスペクトル特性は、例えば、誘電インピーダンス分光法、可視蛍光、蛍光偏光、又は発光を介して測定することができる。さらに、細胞成長デバイスは、例えば、溶存酸素、二酸化炭素、pH、導電率などを測定するための追加のセンサーを含み得る。
細胞濃縮モジュール
図6A〜6Iは、タンジェンシャルフロー濾過を利用する細胞濃度/緩衝液交換カセット及びモジュールの一実施形態のバリエーションを示す。本明細書に記載の細胞濃縮デバイスの一実施形態は、クロスフロー濾過としても知られるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を使用して動作し、TFFでは供給物の大部分がフィルタの表面上を接線方向に流れるため、供給物がフィルタに流れ込む全量濾過と比較して、ケーキ(保持液)の形成を低減する。主供給物に対する二次流れも、フィルタケーキの形成及び膜のファウリングを防ぐためのせん断力を生成するのに利用され、以下に説明するように、粒子の回収率を最大化する。
図6A〜6Iは、タンジェンシャルフロー濾過を利用する細胞濃度/緩衝液交換カセット及びモジュールの一実施形態のバリエーションを示す。本明細書に記載の細胞濃縮デバイスの一実施形態は、クロスフロー濾過としても知られるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)を使用して動作し、TFFでは供給物の大部分がフィルタの表面上を接線方向に流れるため、供給物がフィルタに流れ込む全量濾過と比較して、ケーキ(保持液)の形成を低減する。主供給物に対する二次流れも、フィルタケーキの形成及び膜のファウリングを防ぐためのせん断力を生成するのに利用され、以下に説明するように、粒子の回収率を最大化する。
本明細書で説明するTFFデバイスは、2つの主要な設計上の考慮事項を考慮して設計される。第1に、TFFデバイスの形状により、処理時間を最小限に抑えるために、大きな表面積で細胞培養物を濾過する。第2に、TFFデバイスの設計は、フィルタファウリングを最小限に抑えるように構成されている。図6Aは、タンジェンシャルフロー濾過の通常のモデル150である。TFFデバイスは、クロスフロー濾過としても知られるタンジェンシャルフロー濾過を使用して動作する。図6Aは、膜124上を流れる細胞を示し、培地又は緩衝液中の細胞152の供給流は、膜124に平行である。TFFは、供給流と圧力損失の両方が膜又はフィルタに垂直である全量濾過とは異なる。
図6Bは、タンジェンシャルフロー濾過を提供するTFFデバイス/モジュールの一実施形態の下側部材の上面図を示す。図6BのTFFデバイスの実施形態に見られるように、TFFデバイス600は、細胞培養物が流れるフローチャネル602bを含むチャネル構造616を備える。チャネル構造616は、緩衝液又は培地は流れることができるが細胞が流れることができない膜(図示略)によって水平に分岐された単一のフローチャネル602bを含む。この特定の実施形態は、波状の蛇行した形状614(すなわち、流路602内の小さな「小刻みのくねり」)と、蛇行した「ジグザグ」パターンとを含み、これらのパターンにおいて流路602は、デバイスの左側の一端からデバイスの右側の他端まで、デバイスを縦横に走る。蛇行したパターンは、デバイスのサイズと総チャネル容積に対して高い表面積での濾過を可能にし、波状の寄与は二次慣性流を生成して、膜のファウリングを防ぐ効果的な膜再生を可能にする。ここでは波状の形状と蛇行したパターンが例示されているが、チャネルが膜によって分岐できる限り、及びチャネル構成がTFFモジュールを通る交互の方向の流れを提供する限り、他のチャネル構成を使用することができる。フローチャネル602bに加えて、チャネル構造616の一部としてのポータル604及び606、ならびに凹部608が見られる。ポータル604は、膜(図示略)の一方の側のチャネルを通過する細胞を収集し(「保持液」)、ポータル606は、膜の反対側のチャネル(図示略せず)を通過する培地(「濾過物」又は「透過物」)を収集する。この実施形態では、凹部608は、TFFデバイスの構成要素を互いに固定することを可能にするねじ又は他の締結具(図示略)を収容する。
チャネル構造616の長さ610及び幅612は、増殖させる細胞培養物の体積及び濃縮させる細胞培養物の光学密度に応じて変化し得る。チャネル構造616の長さ610は、典型的には、1mmから300mm、又は50mmから250mm、又は60mmから200mm、又は70mmから150mm、又は80mmから100mmである。チャネル構造616の幅は、典型的には、1mmから120mm、又は20mmから100mm、又は30mmから80mm、又は40mmから70mm、又は50mmから60mmである。フローチャネル102の断面構成は、円形、楕円形、長円形、正方形、長方形、台形、又は不規則であり得る。正方形、長方形、又はほぼ真っ直ぐな辺を有する別の形状の場合、断面は、約10μmから1000μmの幅、又は200μmから800μmの幅、又は300μmから700μmの幅、又は400μmから600μmの幅;及び約10μmから1000μmの高さ、又は200μmから800μmの高さ、又は300μmから700μmの高さ、又は400μmから600μmの高さであり得る。フローチャネル602の断面が概してに円形、長円形、又は楕円形である場合、チャネルの半径は、水力半径で約50μmから1000μm、又は水力半径で5μmから800μm、又は水力半径で200μmから700μm、又は水力半径で300μmから600μmの幅、又は水力半径で約200から500μmであり得る。
図6BのTFFデバイス/モジュールの上面図を見ると、2つの保持液ポータル604及び2つの濾液ポータル606があり、デバイス600の両端(例えば、狭い縁)に各タイプのポータルのうちの1つが存在することに留意されたい。他の実施形態では、保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じ部材(例えば、上側又は下側部材)の同じ表面上に配置することができ、又はそれらは、アセンブリの側面に配置することができる。連続的に動作する他のTFFデバイスとは異なり、ここで説明するTFFデバイス/モジュールは、細胞を濃縮するために交互の方法を使用する。TFFデバイス/モジュールを使用した細胞濃縮の全体的なワークフローには、細胞培養物又は細胞サンプルをチャネル構造に接線方向に流すことが含まれる。フローチャネルを分岐する膜は、膜の片側に細胞を保持し、不要な培地又は緩衝液が膜を横切ってデバイスの濾液側(例えば、下側部材620)に流れることを可能にする。このプロセスでは、細胞サンプルが保持液ポータル604の1つに収集されるまで、培地又は緩衝液中の一定体積の細胞がデバイスを通して駆動され、膜を通過した培地/緩衝液は、濾液ポータル606の一方又は両方を通じて収集される。付着細胞及び非付着細胞の両方のすべてのタイプの原核細胞及び真核細胞をTFFデバイスで増殖させることができる。付着細胞は、TFFデバイスを流れる培地に懸濁されたビーズ又は他の細胞スキャフォールド上で増殖させることができる。
細胞濃縮プロセスにおいて、細胞サンプルをTFFデバイスに通し、濾液ポータル606の1つに培地を収集しながら、保持液ポータル604の1つに細胞を収集することは、細胞サンプルの「ワンパス」と見なされる。保持液リザーバ間の移動は培養物を「反転(flip)」させる。所定のパスで細胞と培地をそれぞれ収集する保持液ポータルと濾液ポータルは、TFFデバイス/モジュール600の同じ端にあり、保持液側及び濾液側に2つの異なるフロー層があるが、保持液ポータル604がデバイス/モジュール600の上側部材上にある場合(すなわち、細胞は膜の上のチャネルを通って駆動され、濾液(培地)は、膜の下のチャネルの部分を通過する)、濾液ポータル606は、デバイス/モジュール100の下側部材上に存在し、逆もまた同様である(すなわち、細胞サンプルが膜の下のチャネルを通って駆動される場合、濾液(培地)は膜の上のチャネルの部分を通過する)ように流体接続が配置されている。この構成は図6C〜6Dでより明確に見ることができ、ここで、保持液は、保持液ポータル604から660に流れ、濾液は、濾液ポータル606から670に流れる。
増殖濃縮プロセスにおける「パス」の終わりに、細胞サンプルを、保持液ポータル604を通して保持液リザーバ(図示略)に入れることによって収集する。別の「パス」を開始するために、細胞サンプルは再びTFFデバイスを通過する。今回は、最初のパスとは逆の流れ方向になる。細胞サンプルは、保持液ポータル604に通し、最初のパス中に細胞を収集するために使用された保持液ポータル604からデバイス/モジュールの反対側の端にある保持液リザーバ(図示略)に通すことによって収集される。同様に、第2のパスで膜を通過する培地/緩衝液は、第1のパスの間に濾液を収集するために使用された濾液ポータル606からデバイス/モジュールの反対側の端にある濾液ポータル606を通して、又は両方のポータルを通して収集される。保持液(濃縮細胞サンプル)をデバイス/モジュールに通すこの交互のプロセスは、細胞が目的の体積に濃縮されるまで繰り返され、パス中に両方の濾液ポータルを開いて操作時間を短縮できる。さらに、緩衝液交換は、別の「パス」を開始する前に、保持液リザーバ内の細胞サンプルに所望の緩衝液(又は新鮮な培地)を追加し、古い培地又は緩衝液が希釈されて濾別され、細胞が新鮮な培地又は緩衝液中に存在するまでこのプロセスを繰り返すことによって行うことができる。緩衝液交換と細胞濃縮は同時に行われる可能性がある(そして通常は行われる)ことに注意されたい。
図6Cは、例示的なTFFモジュールの上側(622)及び下側(620)部材の上面図を示す。ここでも、ポータル604及び606が示されている。上記のように、図6Bに見られる凹部608などの凹部は、例えば、ねじ又は他の同様の締結具を介して、動作中にTFFデバイス/膜の構成要素(上側部材622、下側部材620、及び膜624)を互いに固定する手段を提供する。しかしながら、代替の実施形態では、感圧接着剤などの接着剤、又は超音波溶接、又は溶剤接着を使用して、上側部材622、下側部材620、及び膜624を一緒に結合することができる。実際、本開示のガイダンスを与えられた当業者は、例えばクランプ;上側及び下側部材に配置された嵌合フィッティング;接着剤、溶接、溶剤接着、及び嵌合フィッティングの組み合わせ;及び他のそのような締結具及びカップリングなどのTFFデバイスの構成要素を結合するためのさらに他の構成を見出すことができる。
TFFデバイス/モジュールの各「端部」(狭いエッジなど)に1つの保持液ポータル及び1つの濾液ポータルがあることに留意されたい。デバイス/モジュールの左側にある保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じパスでそれぞれ細胞(660の流路)及び培地(670の流路)を収集する。同様に、デバイス/モジュールの右側にある保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じパスでそれぞれ細胞(660の流路)及び培地(670の流路)を収集する。この実施形態では、保持液は、TFFデバイスの上面のポータル604から収集され、濾液は、デバイスの底面のポータル606から収集される。細胞は、膜624の上のTFFフローチャネル内に維持され、一方、濾液(培地)は、膜624を通って、次にポータル606を通って流れる。したがって、上部/保持液ポータルと下部/濾過ポータルの構成が実用的である。ただし、保持液ポータルと濾液ポータルの両方をTFFデバイスの側面(上面と下面ではなく)に配置するなど、保持液ポータルと濾液ポータルの他の構成を実装できることを認識すべきである。図6Cでは、チャネル構造602bを、TFFデバイス600の下側部材620上に見ることができる。しかしながら、他の実施形態では、保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じTFFデバイス上に存在することができる。
図6Cには、膜又はフィルタ624も見られる。TFFデバイス/モジュールでの使用に適したフィルタ又は膜は、耐溶剤性があり、濾過中に汚染がなく、目的の細胞の種類及びサイズを保持できるものである。例えば、細菌細胞などの小さい細胞種を保持するために、孔径は0.2μmまで小さくすることができるが、他の細胞種の場合、孔径は5μmまで大きくすることができる。実際、TFFデバイス/モジュールで有用な孔径には、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以上のサイズのフィルタが含まれる。フィルタは、セルロース混合エステル(硝酸セルロース及び酢酸セルロース)(CME)、ポリカーボネート(PC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ガラス繊維、又はレーザ又は電気化学エッチングの場合のような金属基板を含む任意の適切な非反応性材料から製造できる。図6C及び6Dに示されているTFFデバイスは、フィルタ624を装着又は固定できる上側部材612及び下側部材620の座部を示していない(例えば、上側部材612及び下側部材620のそれぞれのフィルタの半分の厚さの座部)。しかしながら、そのような座部は、いくつかの実施形態で企図されている。
図6Dは、図6Cに示される例示的なTFFモジュールの上側及び下側構成要素の底面図を示す。図6Dは、例示的なTFFモジュールの上側(622)及び下側(620)構成要素の底面図を示す。ここでも、ポータル604及び606が見られる。デバイス/モジュールの両端に1つの保持液ポータルと1つの濾液ポータルがあることに再度留意されたい。デバイス/モジュールの左側にある保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じパスでそれぞれ細胞(660の流路)及び培地(670の流路)を収集する。同様に、デバイス/モジュールの右側にある保持液ポータル及び濾液ポータルは、同じパスでそれぞれ細胞(660の流路)及び培地(670の流路)を収集する。図6Dでは、チャネル構造602aは、TFFデバイス600の上側部材622上に見ることができる。したがって、図6C及び6Dを見ると、上側及び下側部材の両方にチャネル構造602(602a及び602b)があり、チャネル構造の上部及び下部の間に膜624があることに留意されたい。上側622及び下側620部材のチャネル構造602(それぞれ602a及び602b)は、嵌合して、フローチャネルの上側及び下側部材の間に水平に配置された膜624と共にフローチャネルを作成し、それによってフローチャネルを分岐させる。
培地交換(細胞増殖中)又は緩衝液交換(細胞濃縮中又は細胞のコンピテントセル化中)は、TFFデバイス/モジュールで、増殖中の細胞に新鮮な培地を、又は所望の体積に濃縮された細胞、例えば、細胞が少なくとも20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍又はそれ以上に濃縮された後に所望の緩衝液を加えることによって実施される。保持液リザーバに添加するか、又は濾液側から膜を完全に通過させることにより、所望の交換培地又は交換緩衝液を細胞に添加し、細胞が所望の光学密度に増殖するまで、又は交換培地又は緩衝液中の目的の体積に濃縮されるまで、細胞をTFFデバイス600に通すプロセスを繰り返す。このプロセスは、緩衝液の所望のレベルの交換及び所望の体積の細胞を達成するために、任意の所望の回数で繰り返すことができる。交換緩衝液は、例えば、グリセロール又はソルビトールを含んでもよく、それにより、細胞サンプルの全体積を減少させることに加えて、細胞を形質転換に適格にする。
TFFデバイス600は、ステンレス鋼、シリコン、ガラス、アルミニウム、又は環状オレフィンコポリマー(COC)、シクロオレフィンポリマー(COP)、ポリスチレン、ポリビニルクロリド、ポリエチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、アクリロニトリルブタジエン、ポリカーボネート、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、ポリ(メチルメチルアクリレート)(PMMA)、ポリスルホン、及びポリウレタン、及びこれらと他のポリマーのコポリマーを含むプラスチックを含む、チャネル(及びチャネル分岐)をミリング形成することができる任意の頑丈な材料から製造することができる。TFFデバイス/モジュールが使い捨ての場合はプラスチック製であることが好ましい。いくつかの実施形態では、TFFデバイス/モジュールを製造するために使用される材料は熱伝導性であり、そのため、細胞培養物は、所望の温度に加熱又は冷却され得る。特定の実施形態では、TFFデバイスは、精密機械加工、レーザ加工、放電加工(金属デバイスの場合);ウェット又はドライエッチング(シリコンデバイスの場合);ドライ又はウェットエッチング、粉末又はサンドブラスト、光構造化(photostructuring)(ガラスデバイスの場合);又は、この大量生産技術に適した上記の材料を使用した熱成形、射出成形、ホットエンボス加工、又はレーザ加工(プラスチックデバイスの場合)によって形成される。
図6Eは、組み立てられたTFFデバイスの例示的な構成を示し、他の構成と同様に、上側部材と下側部材が組み合わさって、上側部材と下側部材との間に配置された膜と共にチャネル構造を形成する。しかしながら、この構成では、保持液リザーバに加えて、保持液リザーバの間に配置された任意選択の緩衝液又は培地リザーバ、及び下側の濾液又は透過液リザーバがさらに存在する。図6Eに示されるTFFデバイス6000構成では、6044は、TFFデバイス6000の上部又はカバーであり、3つのポート6046を有し、右端のポート6046に配置されたピペットチップ6048がある。TFFデバイス6000の上部6044は、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050に隣接し、動作中はそれと結合する。リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050は、TFFデバイスの上部又はカバー6044に隣接する上面と、TFFデバイスの上側部材6022を含む底面とを含み、ここで、TFFデバイスの上側部材6022は、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050の上側部材6022の底面に配置されたフローチャネル(図示略)の上部を画定する。さらに、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050は、2つの保持液リザーバ6080及び任意選択の緩衝液又は培地リザーバ6082を含む。保持液リザーバは、フローチャネルの上部に連通しており、緩衝液又は培地リザーバは、保持液リザーバに連通している。TFFデバイス6000のこの組み立てられた図には膜6024も見られ、下側部材6020は、前述のように、その上面にタンジェンシャルフローチャネル(図示略)の下部を含み、上側部材6022及び下側部材6020のチャネル構造(いずれもこの図には示されていない)は、嵌合して単一のフローチャネルを形成する。下側部材6020の下方及びこれに隣接してガスケット6040があり、これは、下側部材6020と任意の濾液(又は透過液)リザーバ6042との間に挿入される。濾液リザーバ6042は、細胞培養物から除去される濾液又は透過液の容器として、フローチャネルの下部と連通している。動作中、上部6044、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050、膜6024、下側部材6020、ガスケット6040、及び濾液リザーバ6042は、液密及び気密になるように一緒に結合及び固定される。組み立てられたTFFデバイス1100は、通常、高さ4〜25cm、又は高さ5〜20cm、又は高さ7〜15cmであり;長さ5〜30cm、又は長さ8〜25cm、又は長さ10〜20cmであり;深さ3〜15cm、又は深さ5〜10cmである。例示的なTFFデバイスは、高さ11cm、長さ12cm、及び深さ8cmである。保持液リザーバ、緩衝液又は培地リザーバ、及びタンジェンシャルフローチャネル形成構造は、細胞の維持のために4℃に冷却されるように構成することができる。上記の蛇行チャネルの寸法、ならびにフィルタ及びTFFデバイスの仕様及び材料は、図6E〜6Iに示されるデバイスの実施形態に適用される。本実施形態を含む実施形態では、最大120mLの細胞培養物を増殖及び/又は濾過することができ、又は最大100mL、90mL、80mL、70mL、60mL、50mL、40mL、30mL又は20mLの細胞培養物を増殖及び/又は濾過することができる。
図6Fは、TFFデバイス6000の分解斜視図を示す。この構成では、6044はTFFデバイス6000の上部又はカバーであり、3つのポート6046を有し、左端のポート6046に配置されたピペットチップ6048がある。TFFデバイス6000の上部6044は、動作中、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050と結合される。リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050は、動作中、TFFデバイスの上部又はカバー6044に隣接する上面と、TFFデバイスの上側部材6022を含む底面とを含み、ここで、TFFの上側部材6022は、デバイスは、タンジェンシャルフローチャネルの上部を画定する(図示略)。リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050は、2つの保持液リザーバ6080及び任意選択の緩衝液又は培地リザーバ6082を含む。保持液リザーバは、フローチャネルの上部に連通しており、任意選択の緩衝液又は培地リザーバは、保持液リザーバに連通している。TFFデバイス6000のこの分解図には、下側部材6020も見られ、これは、前述のように、その上面に、タンジェンシャルフローチャネル6002bの下部(下側部材6020の上面に見られる)を含み、ここで、上側部材6022及び下側部材6020のチャネル構造の上部及び下部は、それぞれ、単一の流路を形成するように係合された場合(動作中の上側部材6022と下側部材6020との間に挿入される膜は示されていない)。下側部材6020の下方にはガスケット6040があり、これは、動作中、下側部材6020と濾液(又は透過液)リザーバ6042との間に挿入される。動作中、上部6044、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050、膜(図示略)、下側部材6020、ガスケット6040、及び濾液リザーバ6042は、液密及び気密になるように一緒に結合及び固定される。図6Fには、様々な構造(上部6044、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050、膜(図示略)、下側部材6020、ガスケット6040、及び濾液リザーバ6042)を一緒に結合するために使用できる締結具が示されている。しかしながら、ねじ又は他の同様の締結具の代替として、TFFデバイス6000の様々な構造は、感圧接着剤などの接着剤;超音波溶接;又は溶剤接着を使用して結合することができる。さらに、締結具、接着剤、及び/又は溶接タイプの組み合わせを使用して、TFFデバイスの様々な構造を結合することができる。本開示のガイダンスを与えられた当業者は、例えば、クランプ、嵌合フィッティング、及び他のそのような締結具など、TFFデバイス6000の構成要素を結合するためのさらに他の構成を見出すことができる。
図6Gは、2つの保持液リザーバ6080及び任意選択の緩衝液又は培地リザーバ6082を含むリザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050、ならびにリザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050の底部に配置された上側部材6020を示す。TFFデバイスの上側部材6022は、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050の底面に配置されたタンジェンシャルフローチャネル(図示略)の上部を画定する。図6Hは、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050の上面を上から見た図であり、保持液リザーバ6080及び緩衝液又は培地リザーバ6082の上部、ならびに流体又は真空ポート6046を示している。保持液リザーバは、フローチャネルの上部に連通しており、緩衝液又は培地リザーバは、保持液リザーバに連通している。図6Iは、リザーバ及び上側部材の組み合わせ構造6050の下面を下から見た図であり、タンジェンシャルフローチャネル6002aの上部が上側部材6020の底面に配置された上側部材6020を示している。動作中の上側部材6020の底面に配置されたフローチャネル6002aは、下側部材の上面に配置されたタンジェンシャルフローチャネルの底部に嵌合される(この図には示されていないが、図6Fを参照)。フローチャネル構造の上部と下部が結合して、単一のフローチャネルを形成する。
上記のTFFモジュールの代替として、中空フィルタを含む細胞濃縮モジュールを使用することができる。本発明での使用に適したフィルタの例には、膜フィルタ、セラミックフィルタ、及び金属フィルタが含まれる。フィルタは任意の形状で使用できる。フィルタは、例えば、円筒形又は本質的に平坦であってもよい。好ましくは、使用されるフィルタは、膜フィルタ、好ましくは中空繊維フィルタである。用語「中空繊維」とは、管状の膜を意味する。管の内径は少なくとも0.1mm、より好ましくは少なくとも0.5mm、最も好ましくは少なくとも0.75mmであり、好ましくは管の内径は最大10mm、より好ましくは最大6mm、最も好ましくは最大1mmである。中空繊維を含むフィルタモジュールは、様々な会社から、例えばG.E.Life Sciences(マサチューセッツ州マールボロ)及びInnovaPrep(ミズーリ州ドレクセル)から購入できる。本発明の方法及びシステムで使用するために使用、変更、又は適合させることができる中空繊維フィルタシステムの特定の例には、限定するものではないが、米国特許第9,738,918号;9,593,359号;9,574,977号;9,534,989号;9,446,354号;9,295,824号;8,956,880号;8,758,623号;8,726,744号;8,677,839号;8,677,840号;8,584,536号;8,584,535号;及び8,110,112号が含まれる。
核酸アセンブリモジュール
本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器の特定の実施形態は、任意選択で核酸アセンブリモジュール器具を含む。核酸アセンブリモジュールは、所望のゲノム編集イベントを促進するために必要な核酸を受け入れてアセンブリするように構成されている。一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている所望の核酸を細胞内に輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子;1つ以上の自由端を含む核酸分子、自由端を含まない核酸分子(例、環状);DNA、RNA、又はその両方を含む核酸分子;及び当技術分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの1種は「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のDNAセグメントを挿入できる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターは、ウイルス由来のDNA又はRNA配列がウイルスにパッケージングするためにベクターに存在するウイルスベクターである(例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及び哺乳類エピソーマルベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類非エピソーマルベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」又は「編集ベクター」と呼ばれる。組換えDNA技術で有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をしている。追加のベクターには、フォスミド、ファージミド、及び合成染色体が含まれる。
本開示の自動化マルチモジュール細胞編集機器の特定の実施形態は、任意選択で核酸アセンブリモジュール器具を含む。核酸アセンブリモジュールは、所望のゲノム編集イベントを促進するために必要な核酸を受け入れてアセンブリするように構成されている。一般に、「ベクター」という用語は、それが連結されている所望の核酸を細胞内に輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、限定するものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的二本鎖の核酸分子;1つ以上の自由端を含む核酸分子、自由端を含まない核酸分子(例、環状);DNA、RNA、又はその両方を含む核酸分子;及び当技術分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれる。ベクターの1種は「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって追加のDNAセグメントを挿入できる環状二本鎖DNAループを指す。別の種類のベクターは、ウイルス由来のDNA又はRNA配列がウイルスにパッケージングするためにベクターに存在するウイルスベクターである(例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス)。ウイルスベクターには、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及び哺乳類エピソーマルベクター)。他のベクター(例えば、哺乳類非エピソーマルベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」又は「編集ベクター」と呼ばれる。組換えDNA技術で有用な一般的な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形をしている。追加のベクターには、フォスミド、ファージミド、及び合成染色体が含まれる。
組換え発現ベクターは、転写に適した形態の核酸を含むことができ、一部の核酸配列については、宿主細胞におけるその核酸の翻訳及び発現に適した形態の核酸を含むことができる。これは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結された1つ以上の調節要素(発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される)を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、転写を可能にする態様で、及び一部の核酸配列については、(例えば、in vitroの転写/翻訳システムで、又はベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞で)そのヌクレオチド配列の翻訳及び発現を可能にする態様で調節要素に連結されているという意味である。適切な組換え及びクローニング方法は、米国特許出願公開第2004/0171156号に開示されており、その内容はすべての目的で参照により全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、調節要素は、転写を駆動するために、及び一部の核酸配列については、標的化可能なヌクレアーゼシステムの1つ以上のコンポーネントの翻訳及び発現を駆動するために、標的化可能なヌクレアーゼシステムの1つ以上の要素に作動可能に連結される。
さらに、核酸誘導型ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列は、原核細胞又は真核細胞などの特定の細胞での発現のためにコドン最適化することができる。真核細胞は、酵母、真菌、藻類、植物、動物、又はヒト細胞であり得る。真核細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト霊長類を含む非ヒト哺乳類を含むがこれらに限定されない哺乳類などの特定の生物のもの又はそれに由来するものであり得る。それに加えて、又はそれに代えて、ベクターは、転写されるとガイドRNAを形成するポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節要素を含んでもよい。
核酸アセンブリモジュールは、自動化された方法で多種多様な異なる核酸アセンブリ技術を実行するように構成することができる。開示された自動化マルチモジュール細胞編集機器の核酸アセンブリモジュールで実行できる核酸アセンブリ技術には、限定するものではないが、PCR、BioBrickアセンブリ(米国特許第9,361,427号)、Type IISクローニング(例えば、GoldenGateアセンブリ、欧州特許出願公開第2395087号)、及びリガーゼサイクリング反応(de Kok S,ACS Synth Biol.,3(2):97−106(2014);Englerら、PLoS One,3(11):e3647(2008);及び米国特許第6,143,527号)を含む、制限エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ方法が含まれる。他の実施形態では、開示された自動化マルチモジュール細胞編集機器によって実行される核酸アセンブリ技術は、ギブソンアセンブリ(商標)、CPEC、SLIC、リガーゼサイクリングなどの核酸の隣接部分間の重複に基づいている。さらなるアセンブリ方法には、酵母のギャップ修復(Bessa,Yeast,29(10):419−23(2012))、ゲートウェイクローニング(Ohtsuka,Curr Pharm Biotechnol,10(2):244−51(2009);米国特許第5,888,732号;及び6,277,608号)、及びトポイソメラーゼを介したクローニング(Udo,PLoS One,10(9):e0139349(2015);及び米国特許第6,916,632号)が含まれる。これら及び他の核酸アセンブリ技術は、例えば、Sands and Brent,Curr Protoc Mol Biol.,113:3.26.1−3.26.20(2016)に開示されている。
核酸アセンブリモジュールは、自動化マルチモジュール細胞編集機器で使用される核酸アセンブリの種類に応じて温度制御される。例えば、PCRが核酸アセンブリモジュールで利用される場合、モジュールは、変性ステップ、アニーリングステップ、及び伸長ステップの間で温度を循環させることができるサーモサイクリング機能を有する。核酸アセンブリモジュールで単一温度アセンブリ法(例えば、等温アセンブリ法)が利用される場合、モジュールは実行される特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に到達させ、保持する能力を提供する。これらの温度ならびにこれらの温度を維持する期間は、スクリプトによって実行されるパラメータの事前設定されたセットによって決定されるか、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムを使用してユーザが手動で制御することができる。
一実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、図3に示されるような単一の等温反応を使用してアセンブリを実行するモジュールである。特定の等温アセンブリ法は、配列同一性に基づいて最大15個の核酸フラグメントを同時に組み合わせることができる。アセンブリ法は、いくつかの実施形態では、隣接する核酸フラグメントとの約20〜40塩基の重複を含むアセンブリされる核酸を提供する。フラグメントは、3つの酵素すなわちエキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、及びリガーゼのカクテルと、緩衝液成分と共に混合される。このプロセスは等温であり、単一の反応容器を用いて1ステップ法又は2ステップ法で実行できるため、等温アセンブリ反応は自動化マルチモジュール細胞編集機器での使用に最適である。1ステップ法では、1ステップの等温プロセスを使用して、最大5つの異なるフラグメントをアセンブリすることができる。フラグメントと酵素のマスターミックスを組み合わせて、50℃で最大1時間インキュベートする。15フラグメントまでのより複雑な構築物の作成、又は100bpから10kbまでのフラグメントの組み込みには、通常2ステップが使用される。2ステップ反応では、マスターミックスを2回別々に追加する必要がある:1つはエキソヌクレアーゼ及びアニーリングのステップ、2回目はポリメラーゼ及びライゲーションのステップである。
細胞形質転換モジュール
細胞成長、細胞濃度、及び核酸アセンブリのためのモジュールに加えて、図7A〜7Eは、細胞成長/濃縮/形質転換機器に含まれ得る細胞形質転換モジュール(この場合、フロースルー型エレクトロポレーションデバイス)の一実施形態のバリエーションを示す。図7A及び7Bは、それぞれ、6つの共結合されたフロースルー型エレクトロポレーションデバイス750の上面斜視図及び底面斜視図である。図7Aは、単一の基板756上に配置された6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を示す。6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750のそれぞれは、細胞サンプル入口を画定するウェル752と、細胞サンプル出口を画定するウェル754とを有する。図7Bは、図7Aの6つの共結合されたフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの底面斜視図である。図7Aはまた、単一の基板4156上に配置された6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を示す。6つの入口ウェル4152が見られ、各フロースルー型エレクトロポレーションユニット750に1つ、そして1つの出口ウェル754が見られる(左端のフロースルー型エレクトロポレーションユニット750の出口ウェル)。さらに図7Bには、各フロースルー型エレクトロポレーションユニット750のフローチャネル706の狭窄部のいずれかの側にある入口702、出口704、フローチャネル706及び2つの電極708が見られる。6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750が製造されると、それらは互いに分離され(例えば、「スナップ式」)、一度に1つずつ使用され得るか、あるいは実施形態によっては、2つ以上のフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を分離せずに並行して使用することができる。
細胞成長、細胞濃度、及び核酸アセンブリのためのモジュールに加えて、図7A〜7Eは、細胞成長/濃縮/形質転換機器に含まれ得る細胞形質転換モジュール(この場合、フロースルー型エレクトロポレーションデバイス)の一実施形態のバリエーションを示す。図7A及び7Bは、それぞれ、6つの共結合されたフロースルー型エレクトロポレーションデバイス750の上面斜視図及び底面斜視図である。図7Aは、単一の基板756上に配置された6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を示す。6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750のそれぞれは、細胞サンプル入口を画定するウェル752と、細胞サンプル出口を画定するウェル754とを有する。図7Bは、図7Aの6つの共結合されたフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの底面斜視図である。図7Aはまた、単一の基板4156上に配置された6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を示す。6つの入口ウェル4152が見られ、各フロースルー型エレクトロポレーションユニット750に1つ、そして1つの出口ウェル754が見られる(左端のフロースルー型エレクトロポレーションユニット750の出口ウェル)。さらに図7Bには、各フロースルー型エレクトロポレーションユニット750のフローチャネル706の狭窄部のいずれかの側にある入口702、出口704、フローチャネル706及び2つの電極708が見られる。6つのフロースルー型エレクトロポレーションユニット750が製造されると、それらは互いに分離され(例えば、「スナップ式」)、一度に1つずつ使用され得るか、あるいは実施形態によっては、2つ以上のフロースルー型エレクトロポレーションユニット750を分離せずに並行して使用することができる。
フロースルー型エレクトロポレーションデバイスは、低毒性で高効率の細胞エレクトロポレーションを実現する。本開示のフロースルー型エレクトロポレーションデバイスは、空気置換ピペッターなどの自動システムで通常使用されるロボット液体ハンドリング機器との特に容易な統合を可能にする。このような自動化機器には、限定するものではないが、Tecan(スイス、マンネドルフ)、Hamilton(ネバダ州リノ)、Beckman Coulter(コロラド州フォートコリンズ)などの既製の自動液体ハンドリングシステムが含まれる。
一般的に、マイクロ流体エレクトロポレーション(約10ml未満かつ1μmほどの少なさの細胞懸濁液を使用)は、トランスフェクション又は形質転換プロセスをより正確に制御でき、ベンチスケールのエレクトロポレーションデバイスよりも、他の細胞処理ツールと柔軟に統合できる。したがって、マイクロ流体エレクトロポレーションは、例えば、単回の細胞形質転換、処理、及び分析;マルチユニットエレクトロポレーションデバイス構成;ならびに統合された自動化マルチモジュール細胞処理及び分析に独自の利点を提供する。
本開示のフロースルー型エレクトロポレーションデバイスの特定の実施形態では、形質転換の毒性レベルは、細胞の種類及び細胞に導入される核酸に応じて、エレクトロポレーション後に10%を超える生存細胞、好ましくは形質転換後に15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、さらには95%を超える生存細胞をもたらす。
図7A〜7Eに関連して記載されたフロースルー型エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーションチャンバ、電気パルス発生器と係合するように構成された第1の電極及び第2の電極を備えたハウジングを含み、これにより、電気接点がエレクトロポレーションデバイスの電極と係合する。特定の実施形態において、エレクトロポレーションデバイスは、オートクレーブ可能及び/又は使い捨てであり、試薬カートリッジ内の試薬と共に包装され得る。エレクトロポレーションデバイスは、1μlから2ml、10μlから1ml、25μlから750μ1、又は50μlから500μlの間の細胞サンプル量をエレクトロポレーションするように構成することができる。開示されたエレクトロポレーションデバイスでエレクトロポレーションされ得る細胞には、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)、植物細胞、酵母、他の真核細胞、細菌、古細菌、及び他の細胞種が含まれる。
1つの例示的な実施形態では、図7Cは、細胞及び細胞にエレクトロポレーションされる外因性試薬(「細胞サンプル」)を導入するための入口702及びエレクトロポレーション後の細胞サンプルのための出口704を有するフロースルー型エレクトロポレーションデバイス750の上面図を示す。電極708は、デバイスの電極チャネル(図示略)を通して導入される。図7Dは、フローチャネル706の狭窄部に対して配置された入口702、出口704、及び電極708を備えた、フロースルー型エレクトロポレーションデバイス750の上部からの破断図を示す。図7Eのフロースルー型エレクトロポレーションデバイス750の底部の側面破断図は、この実施形態の電極708が電極チャネル710に配置され、フローチャネル706に対して垂直に配置され、細胞サンプルが入口チャネル712からフローチャネル706を通って出口チャネル714に流れ、その過程で細胞サンプルが電極708と接触するように電極チャネル710に流れ込むことを示す。この態様では、入口チャネル、出口チャネル、及び電極チャネルはすべて、デバイスの上面側から生じる。しかしながら、図7C〜7Eに示されるフロースルー型エレクトロポレーションの構造は、本明細書に記載の試薬カートリッジで有用な1つの構造にすぎない。さらなる電極の構造は、例えば、2018年9月24日に出願された米国特許出願第16/147,120号;2018年9月30日に出願された米国特許出願第16/147,865号;及び2018年9月30日に提出された米国特許出願第16/147,871号に記載されている。
細胞富化モジュール
1つの任意選択の態様は、ゲノムが適切に編集された細胞の富化技術を実装する、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集用の自動化モジュール及び機器を提供する。富化モジュールは、細胞の分離及び正規化を使用して、編集された細胞と編集されていない細胞との間の増殖競合を低減する方法を実行する。分離は、編集されていない細胞あるいは増殖に有利又は不利になる編集を含む細胞からの増殖バイアスを克服する。上記方法、モジュール及び器具は、古細菌、原核生物、及び真核生物(例えば、酵母、真菌、植物及び動物)細胞を含むすべての細胞種に適用することができる。
1つの任意選択の態様は、ゲノムが適切に編集された細胞の富化技術を実装する、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集用の自動化モジュール及び機器を提供する。富化モジュールは、細胞の分離及び正規化を使用して、編集された細胞と編集されていない細胞との間の増殖競合を低減する方法を実行する。分離は、編集されていない細胞あるいは増殖に有利又は不利になる編集を含む細胞からの増殖バイアスを克服する。上記方法、モジュール及び器具は、古細菌、原核生物、及び真核生物(例えば、酵母、真菌、植物及び動物)細胞を含むすべての細胞種に適用することができる。
分離、任意選択の編集の誘導、及び細胞コロニーの正規化は、従来技術よりも編集された細胞を識別する際に、2〜250倍、10〜225倍、25〜200倍、40〜175倍、50〜150倍、60〜100倍、又は5〜100倍の利益をもたらし、ゲノムライブラリーを含むアレイ又はプールされた編集済み細胞を作製するための新しいアプローチを提供する。さらに、上記方法、モジュール、及び機器を活用して、反復編集システムを作成し、コンビナトリアルライブラリーを作製し、稀な細胞編集を識別し、ハイスループットの富化アプリケーションで編集活性を識別できるようにすることができる。
本明細書に記載の組成物及び方法は、核酸誘導型ヌクレアーゼ(例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ)を使用して生物のゲノム内の特定の標的領域を編集する、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システムを改善する。図8Aは、固体壁デバイス850、及び固体壁デバイスのマイクロウェル内の細胞を分離するためのワークフローを示し、このワークフローでは、gRNA及びヌクレアーゼの一方又は両方が誘導性プロモーターの制御下にある。左上の図(i)には、マイクロウェル852を備えた固体壁デバイス850が描かれている。(ii)には基板850のセクション854が示され、マイクロウェル852も示されている。(iii)には、固体壁デバイス850の側面断面が示され、マイクロウェル852には注入がされており、この実施形態では、ポアソンローディングが行われている。すなわち、各マイクロウェルには細胞が1つあるか、まったくなく、複数の細胞を有するマイクロウェルがある確率は低い。(iv)にはワークフロー840が示され、マイクロウェル852を有する基板850は、1つのマイクロウェルにつき1つの細胞を有するマイクロウェル856、マイクロウェル内に細胞を有さないマイクロウェル857、及びマイクロウェル内に2つの細胞を有する1つのマイクロウェル260を示す。ステップ851で、マイクロウェル内の細胞を約2〜50回倍増させてクローンコロニーを形成し(v)、続いて基板を加熱するか(例えば、温度誘導編集の場合)又は基板の下又は上に化学物質(例えば、化学物質による編集のための糖、抗生物質)を流すことによって、又は固体壁デバイスを別の培地に移動させることによって編集を誘導する853;これは、固体壁デバイスがマイクロウェル852の底部を形成する流体透過性膜上に配置される場合、特に容易である。編集の導入後853、編集された細胞のコロニー内の多くの細胞は、アクティブな編集によって引き起こされた二本鎖切断の結果として死に、編集後に生き残るが修復され回復されるべき編集を受けた細胞には、おそらく増殖に遅れがある(マイクロウェル858)。編集を受けていない細胞は繁殖する(マイクロウェル859)(vi)。すべての細胞は、コロニーを確立し、正規化するために増殖させることができ、マイクロウェル858内の編集された細胞のコロニーは、編集されていない細胞が静止期に達すると、細胞老化のために、編集を受けていないマイクロウェル859内の細胞にサイズ及び/又は細胞数が追いつく(vii)。細胞コロニーを正規化したら、マイクロウェル内のすべての細胞のプールを行うことができる。この場合、非編集細胞からのバイアス及び編集からの適合性効果を排除することにより、編集細胞について細胞が富化される。あるいは、編集後にマイクロウェル内のコロニーの成長をモニタリングし、成長の遅いコロニー(例えば、マイクロウェル858内の細胞)を特定して選択し(例えば、良いものだけを選択し(cherry picked))、編集細胞をさらに富化する。
細胞を増殖させる際に使用される培地は、当然、編集される細胞の種類(例えば、細菌、酵母、又は哺乳動物)に依存する。例えば、細菌増殖用の培地には、LB、SOC、M9最少培地、及びマジック(Magic)培地が含まれる。酵母細胞増殖用の培地には、TPD、YPG、YPAD、及び合成最少培地が含まれる。哺乳動物細胞増殖用の培地には、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、及びハンクス(Hanks)が含まれる。
図8Bは、細胞を分離するためのマイクロウェルを含む固体壁デバイスの一実施形態の写真である。写真からわかるように、固体壁デバイスの直径は約2インチ(約47mm)である。この写真に見られる固体デバイスは、本質的に816ステンレス鋼の穿孔ディスクであり、穿孔がマイクロウェルの壁を形成し、フィルタ又は膜がマイクロウェルの底を形成するために使用される。フィルタ又は膜(0.22μPVDF Duropore(商標)織メンブレンフィルタなど)を使用すると、培地や栄養素がマイクロウェルに入ることができるが、細胞がマイクロウェルから流れ落ちるのを防ぐ。固体壁の分離/成長/編集/正規化デバイス及びモジュールで使用できるフィルタ又は膜部材は、耐溶剤性で、濾過中に汚染がなく、目的の細胞の種類及びサイズを保持できるものである。例えば、細菌細胞などの小さい細胞種タイプを保持するために、孔径は0.2μmまで小さくすることができるが、他の細胞種の場合、孔径は0.5μmまで大きくすることができる。実際、細胞濃縮デバイス/モジュールで有用な孔径には、0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm以上のサイズのフィルタが含まれる。フィルタは、セルロース混合エステル(硝酸セルロース及び酢酸セルロース)(CME)、ポリカーボネート(PC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、又はガラス繊維を含む任意の適切な材料から製造できる。
図8Bに示す写真では、穿孔は直径約152nMであり、その結果、マイクロウェルの容積は約2.5nLになり、合計で約30,000ウェルになる。マイクロウェル間の距離は、中心から中心までが約279nMである。ここでは、マイクロウェルは約2.5nLの容積を有するが、マイクロウェルの容積は、1から25nL、又は好ましくは2から10nL、さらにより好ましくは2から4nLであり得る。マイクロウェルの好ましいサイズ/容積は、細胞の種類(例えば、細菌、酵母、哺乳動物)によって異なる。ここに示されている穿孔ディスクは316ステンレス鋼でできている。しかしながら、他の生体適合性の金属及び材料が使用され得る。固体壁デバイスは、使い捨てであっても、再利用可能であってもよい。図8Bに示されている固体壁デバイスは円形であるが、正方形、長方形、楕円形などの任意の形状とすることができる。円形の固体壁デバイスは、ペトリ皿を使用して固形培地を介して固体壁デバイスに栄養素を供給する場合に有用である。固体壁デバイスのウェルの底を形成するために使用されるフィルタは、0.22μPVDF Duropore(商標)織メンブレンフィルタを含む。さらに、直径2インチ(約47mm)の固体壁デバイスが示されているが、固体壁デバイスは、必要に応じて小さくても大きくてもよく、固体壁デバイスの構成は、栄養素をどのように固体壁デバイスに供給するか、及び培地交換をどのように行うかに依存する。ここでは円形の固体壁デバイスについて説明するが、固体壁デバイスは、多重化された、例えば積み重ねられた固体壁デバイス及びカセットの構成に加えて、100,000個、200,000個、又はそれ以上のウェルを備えた長方形の固体壁デバイスを含む任意の形状及び大きさであり得る。
図8C〜8Eは、膜底部を備えた固体壁デバイスのマイクロウェル内のポアソン分布を介して分離された大腸菌細胞の、それぞれ低倍率、中倍率、高倍率での写真である。図8Cは、低倍率でのデジタル成長を示しており、暗いマイクロウェルは、細胞が増殖しているマイクロウェルである。図8Dは、固体壁デバイスのマイクロウェルの上面図であり、暗いマイクロウェルは細胞が増殖しているマイクロウェルである。図8Eは、膜(例えば、マイクロウェルの底を形成する透過性膜)が除去されたマイクロウェルの写真であり、パターン化されていない(滑らかな)マイクロウェルは、細胞が増殖していないマイクロウェルであり、不規則な色素/パターン化されたマイクロウェルは、細胞が増殖しており、この写真では、増殖した細胞で満たされたマイクロウェルである。これらの写真では、0.2μmフィルタ(膜)が、図8Bに示す円形固体壁デバイスなどの穿孔金属固体壁デバイスに押し付けられている。穿孔金属固体壁デバイスがマイクロウェルの壁を形成し、0.2μmフィルタがマイクロウェルの底を形成した。固体壁デバイスにロードするために、真空を使用して大腸菌細胞をマイクロウェルに引き込んだ。次に、固体壁デバイス+フィルタを膜側を下にしてLB寒天プレート上に置き、細胞を30℃で一晩、次に室温で2日間増殖させた。膜を取り除き、底のないマイクロウェルを光学顕微鏡で写真に撮った。様々な選択培地を使用して特定の細胞表現型を簡単に選択できることに注意されたい。すなわち、固体壁デバイス+フィルタを、所望の選択培地を含む別のプレート又はペトリ皿に移すか、又は所望の選択培地を、固体壁デバイス及び結合膜が配置される基板に流すだけでよい。
図8A〜8Eに関連して説明された固体壁細胞分離デバイスに加えて、寒天上でのプレーティングによる分離、機能化されたアイランドの細胞の単離による分離、疎水性担体液で運ばれる水性液滴内への分離、又は重合アルギナートスキャフォールド内の分離(分離のこの実施形態については、2018年11月20日に出願され、「バルク細胞培養を介した自動化モジュール及び機器におけるヌクレアーゼ編集配列の検出の改善」と題された米国特許出願第62/769,805号も参照のこと)も含め、他の細胞分離デバイスが、例えば、2018年9月24日に出願され、「自動化モジュール及びシステムにおけるヌクレアーゼ編集配列の検出」と題された米国特許出願第62/735,365号、2018年12月18日に出願され、「自動化モジュール及びシステムにおけるヌクレアーゼ編集配列の検出の改善」と題された米国特許出願第62/781,112号に記載されたものなどのマルチモジュール細胞処理機器に使用され得る。
分離の代替として、細胞増殖サイクルの特定の時間にgRNA及びヌクレアーゼの一方又は両方を駆動する誘導性プロモーターを介して編集を誘導することが採用され得る。図8Fは、編集された細胞を富化するための例示的な方法8000の簡略化されたフローチャートを示している。図8Fを見ると、方法8000は、編集カセットを設計及び合成すること8002から始まる。上記の核酸誘導編集に関連して説明したように、各編集カセットは、通常、gRNA、ドナーDNA、及びPAM又はスペーサー変異を含む。個々の編集カセットが合成されると、個々の編集カセットは、一緒に「連結」又は「アセンブリ」され、増幅され、編集ベクター骨格にアセンブリされ得る8004。次に、編集カセットを含む編集ベクターを使用して、細胞を形質転換し8006、それにより、形質転換された細胞のライブラリーを作成する。アセンブリされた編集カセットを含むベクターに加えて、細胞は、ヌクレアーゼのコード配列を含む別個のエンジンベクターで同時に形質転換され得る。あるいは、細胞はすでにヌクレアーゼを発現している可能性があり(例えば、細胞がエンジンベクターですでに形質転換されているか、又はヌクレアーゼのコード配列が細胞ゲノムに安定して組み込まれている可能性がある)、その場合は細胞を編集ベクターのみで形質転換すればよい。あるいは、細胞は、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集を実行するために必要なすべての要素(例えば、すべてのヌクレアーゼ及び編集カセット)を含む単一のベクターで形質転換されてもよく、これは、キュアリング及び再帰的編集ラウンドを採用する場合に有利である。
様々な送達システムを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システム構成要素を宿主細胞に導入する(例えば、形質転換又はトランスフェクトする)ことができる8008。これらの送達システムには、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、微粒子銃システム、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質:核酸コンジュゲート、ビリオン、人工ビリオン、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ナノワイヤー、エキソソームの使用が含まれる。あるいは、トロイの木馬リポソーム分子を使用して、血液脳関門を越えて核酸誘導型ヌクレアーゼ成分を送達することができる。特に興味深いのは、エレクトロポレーション、特にフロースルー型エレクトロポレーション(自立型機器として、又は自動化マルチモジュールシステムのモジュールとして)の使用である。これは、例えば、2018年6月30日に出願された米国特許出願第16/024,831号;2018年6月30日に出願された同第16/024,816号;2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年6月30日に出願された同第16/147,871号に記載されている。スクリーニング/選択モジュールが自動化マルチモジュール細胞編集システムの1つのモジュールである場合、細胞は自動化細胞形質転換モジュールで形質転換することができる。
形質転換されると8006、細胞は続いて、選択マーカーを使用して選択に供され得る8008。選択マーカーは、エンジンベクターと編集ベクターの両方を受け取った細胞、又は単一の組み合わされたエンジン及び編集ベクターで形質転換された細胞を選択するために使用される。一般的に使用される選択マーカーには、アンピシリン/カルベニシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ストレプトマイシン、ラムノース、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、及びG418などの薬物選択マーカーが含まれる。
適切に形質転換された細胞が選択されたら8008、方法8000の次のステップは、細胞が増殖の静止期に入る(又は入る寸前になる)まで、液体培地中で細胞を増殖させることである。細胞が静止期に入ると8010(又はほぼそうなると)、ヌクレアーゼ及びgRNAの一方又は両方の転写を誘導することにより、細胞内で編集が誘導される8012。編集が誘導されると8012、細胞は増殖し、エレクトロコンピテントにされ、編集の別のラウンドに供され得る8014。
図8Gは、培養中の細胞の典型的な増殖曲線8020を示す(光学密度対時間)。最初は誘導期8022があり、次に細胞は対数期8024に入り、そこで急速に増殖し、最後に細胞は静止期8028に到達し、そこで細胞は分裂しなくなる。本発明の方法は、細胞が時点8026又はそれ以降の増殖の静止期又はほぼそこにある時点で、ヌクレアーゼ及び/又はgRNAの一方又は両方の転写を誘導することを採用する。すなわち、細胞は、増殖の対数期に入って少なくとも60%、又は増殖の対数期に入って少なくとも65%、又は増殖の対数期に入って少なくとも70%、又は増殖の対数期に入って少なくとも少なくとも71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、79、98、又は99%の時点、及び増殖の静止期の間の任意の時点で誘導される。
図8Hは、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集を実施するための例示的なプロトコル8050を示す。図8Hは、細胞を編集するための図8Fに示したプロトコルを示す。最初に、編集ベクター8052(それぞれが編集カセットを含む編集ベクター)のライブラリー又はコレクションが、構成的又は誘導性プロモーター(好ましくは誘導性プロモーター)の制御下にあるヌクレアーゼのコード配列を含む培養細胞8054に導入される8053(例えば、エレクトロポレーションされる)。構成的又は誘導性プロモーターは、1)すでに細胞に形質転換されている「エンジンプラスミド」(ほとんどの場合、選択マーカーとともに)に含まれているか;2)形質転換される細胞のゲノムに組み込まれるか;又は3)ヌクレアーゼのコード配列は、編集ベクター上に位置している可能性がある。編集ベクター8052は、ドナーDNA、PAM又はスペーサー改変配列(ほとんどの場合、ゲノムの標的部位でPAMを無効にする配列)、誘導性プロモーターの制御下にあるgRNAのコード配列、及び選択マーカーを含む。
ステップ8059で、細胞を静止期に達するまで、又はほぼ静止期に達するまで増殖させる。細胞が静止期に達すると、編集が誘導され8067(例えば、ヌクレアーゼ、gRNA、又はその両方の転写が誘導される)、培養物8082内の細胞が編集され、その後、編集から回復させることができる。回復されたら、細胞をプレート播種し8069、増殖させ、プールすることができる8084。あるいは、培養8082からの細胞をプレート播種し8081、増殖の遅いコロニーを選択することにより8086、編集されたコロニーの良いものだけを選択することができる。さらに別の代替案では、細胞を液体培養で保持し、適切なODまで増殖させ、エレクトロコンピテントにし、別の編集ラウンドにかけることができる8088。編集された細胞を富化するこの方法は、ハイスループット方式で実行でき、細胞のプレート播種を必要とせず、自動化できるため、特に望ましい。ステップ8067での誘導は、例えば、pLプロモーターシステムを使用することによって行うことができ、ここで、pLプロモーターは、切断及び編集のためのヌクレアーゼ及びgRNAの発現を誘導するために、例えば、1〜数時間、培地中の細胞の温度を42℃に上げることによって誘導される。編集が誘導されると、培養物8082の温度は30℃に戻される。
1つの方法8081では、バルク液体培養からの細胞がプレート播種され、増殖の遅いコロニーが選択される8086。編集された細胞では、編集が誘発された後の期間中に細胞の生存率が損なわれる。図8Hに示される選択方法(例えば、増殖の遅いコロニーの選択8081)は、編集された細胞のコロニーにおける増殖の遅れを利用して、編集された細胞を識別する。いくつかの実施形態では、編集された細胞のコロニーサイズは、編集されていない細胞のコロニーよりも20%小さい。いくつかの態様において、編集された細胞のコロニーサイズは、編集されていない細胞のコロニーよりも30%、40%、50%、60%、70%、80%又は90%小さい。多くの実施形態では、編集された細胞のコロニーサイズは、編集されていない細胞のコロニーよりも30〜80%小さく、いくつかの実施形態では、編集された細胞のコロニーサイズは、編集されていない細胞のコロニーよりも40〜70%小さい。。
試薬カートリッジ
図9Aは、18本のチューブ又はバイアル940のセットを含む試薬カートリッジ922を示す。いくつかの実施形態では、チューブ又はバイアル940のうちの1つ又は複数は、シッパー又はピペッターなどの自動液体ハンドリングシステムによるアクセスのために、穿孔可能なホイルで密封される。他の実施形態では、チューブ又はバイアルのうちの1つ又は複数は、密封可能なアクセスガスケットを含み得る。小さいチューブ又はバイアルのそれぞれの上部は、いくつかの実施形態では、内容物の自動識別のために機械可読表示(図示略)でマークされる。機械可読表示は、バーコード、QRコード(登録商標)、又は他の機械可読コードを含み得る。特定の容器を識別する他の自動化された手段には、色分け、記号認識(例えば、文字列、画像、アイコンなど)、及び/又は形状認識(例えば、容器の相対的な形状)が含まれ得る。いくつかの実施形態では、入れ物自体をマークするのではなく、カートリッジ本体及び/又はカートリッジカバーの上面に、内容物を識別するための機械可読表示を含めてもよい。小さいチューブ又はバイアルは、それぞれ同じサイズにすることができる。あるいは、試薬カートリッジ922に複数の容積のチューブ又はバイアルを提供してもよい。例示的な例では、各チューブ又はバイアルは、2〜20mL、4〜10mL、又は約5mLを保持するように設計してもよい。少量のいくつかの試薬のみが必要ないくつかの実施形態では、チューブ挿入物を使用して、より大きいレセプタクル(図示略)に小さい(例えば、微量遠心管)チューブを収容することができる。
図9Aは、18本のチューブ又はバイアル940のセットを含む試薬カートリッジ922を示す。いくつかの実施形態では、チューブ又はバイアル940のうちの1つ又は複数は、シッパー又はピペッターなどの自動液体ハンドリングシステムによるアクセスのために、穿孔可能なホイルで密封される。他の実施形態では、チューブ又はバイアルのうちの1つ又は複数は、密封可能なアクセスガスケットを含み得る。小さいチューブ又はバイアルのそれぞれの上部は、いくつかの実施形態では、内容物の自動識別のために機械可読表示(図示略)でマークされる。機械可読表示は、バーコード、QRコード(登録商標)、又は他の機械可読コードを含み得る。特定の容器を識別する他の自動化された手段には、色分け、記号認識(例えば、文字列、画像、アイコンなど)、及び/又は形状認識(例えば、容器の相対的な形状)が含まれ得る。いくつかの実施形態では、入れ物自体をマークするのではなく、カートリッジ本体及び/又はカートリッジカバーの上面に、内容物を識別するための機械可読表示を含めてもよい。小さいチューブ又はバイアルは、それぞれ同じサイズにすることができる。あるいは、試薬カートリッジ922に複数の容積のチューブ又はバイアルを提供してもよい。例示的な例では、各チューブ又はバイアルは、2〜20mL、4〜10mL、又は約5mLを保持するように設計してもよい。少量のいくつかの試薬のみが必要ないくつかの実施形態では、チューブ挿入物を使用して、より大きいレセプタクル(図示略)に小さい(例えば、微量遠心管)チューブを収容することができる。
例示的な例では、チューブ又はバイアルはそれぞれ、次の材料の1つを保持してもよい:ベクター骨格、オリゴヌクレオチド、核酸アセンブリ用試薬、ユーザ提供の細胞試料、誘導剤、緩衝液中の磁気ビーズ、エタノール、細胞選択用の抗生物質、細胞及び核酸を溶出するための試薬、オイルオーバーレイ、その他の試薬、ならびに細胞増殖及び/又は回復培地。さらに、上記のフロースルー型エレクトロポレーションデバイスなどの細胞形質転換モジュールは、任意選択で、試薬カートリッジの一部であり得る。
いくつかの実装形態では、図9Bに見られるカバー924は、図9Aのカートリッジ本体922内にチューブ又はバイアル940を固定する。図9Bに移って、カバー924は、小さいチューブ又はバイアル940のそれぞれにアクセスするための開口部を含むことができる。3つの大きい開口部932は、ユーザ提供の材料を追加する位置を示すために太線で囲まれている。例えば、ユーザ提供の材料には、ベクター骨格、オリゴヌクレオチド、及び細胞試料が含まれる。さらに、カバー924は、カートリッジの種類を識別するための(例えば、カートリッジ内容物のマップにアクセスするための)機械可読表示930を含み得る。あるいは、各開口部に個々の内容物を別々にマークすることができる。いくつかの実装形態では、ユーザ提供の材料の配置を確実にするために、実験室環境で充填するために提供されるバイアル又はチューブは、細胞試料のバイアル又はチューブは細胞試料用の開口部にのみ収まり、オリゴヌクレオチドのバイアル又はチューブはオリゴヌクレオチド用の開口部にのみ収まるといったように、特定の形状又はサイズを有し得る。
細胞成長デバイスの使用
図10は、図4A〜4Dに示されるシステムなどの自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用するための例示的な方法1000のフローチャートである。処理システムは、例えば、方法1000の処理段階を指示する。例えば、ソフトウェアスクリプトは、各処理段階の設定と、方法1000のアクションを実行するためのロボットハンドリングシステムの動作のための指示を識別してもよい。いくつかの実施形態では、ソフトウェア命令スクリプトは、自動化マルチモジュール細胞編集機器に供給されるカートリッジによって識別されてもよい。例えば、カートリッジは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のメモリに格納されたスクリプトの識別を含む、バーコード又はQRコード(登録商標)などの機械可読表示を含み得る。別の例では、カートリッジは、無線周波数(RF)タグなどの機械可読表示に埋め込まれたダウンロード可能なスクリプトを含み得る。他の実施形態では、ユーザが、例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムへの有線又は無線接続を介してスクリプトをダウンロードすることにより、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを介して保存されたスクリプトを選択することにより、スクリプトを識別してもよい。特定の例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ユーザ設定を送信し、細胞処理をアクティブにするためのタッチスクリーンインターフェースを含んでもよい。
図10は、図4A〜4Dに示されるシステムなどの自動化マルチモジュール細胞編集機器を使用するための例示的な方法1000のフローチャートである。処理システムは、例えば、方法1000の処理段階を指示する。例えば、ソフトウェアスクリプトは、各処理段階の設定と、方法1000のアクションを実行するためのロボットハンドリングシステムの動作のための指示を識別してもよい。いくつかの実施形態では、ソフトウェア命令スクリプトは、自動化マルチモジュール細胞編集機器に供給されるカートリッジによって識別されてもよい。例えば、カートリッジは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のメモリに格納されたスクリプトの識別を含む、バーコード又はQRコード(登録商標)などの機械可読表示を含み得る。別の例では、カートリッジは、無線周波数(RF)タグなどの機械可読表示に埋め込まれたダウンロード可能なスクリプトを含み得る。他の実施形態では、ユーザが、例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムへの有線又は無線接続を介してスクリプトをダウンロードすることにより、又は自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを介して保存されたスクリプトを選択することにより、スクリプトを識別してもよい。特定の例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ユーザ設定を送信し、細胞処理をアクティブにするためのタッチスクリーンインターフェースを含んでもよい。
いくつかの実装形態では、方法1000は、細胞を細胞成長モジュールに移すことから始まる(1002)。成長モジュールは、自動化に修正可能な任意の成長モジュール、例えば、図5B〜5Dに関連して説明した細胞成長モジュール550とすることができる。特定の例では、処理システムは、細胞を成長モジュールに移すようにロボットハンドリングシステムに指示することができる。別の例では、ロボットハンドリングシステム108により、1つの試薬カートリッジから成長モジュールに細胞を移すことができる。いくつかの実施形態では、成長バイアルは成長培地を含み、例えばキットの一部として供給されてもよい。他の実施形態では、成長バイアルは、例えば液体ハンドリングデバイスを介して試薬容器から移送された培地で満たされてもよい。
いくつかの実施形態では、(例えば、試薬カートリッジ又は機器に追加されたバイアルから)細胞を移す前に、細胞用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル又は容器が細胞を含むものとしてマークされていることを確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される細胞の種類を示してもよい。いくつかの実施形態において、機器は、細胞の種類に応じて特定の処理スクリプト(例えば、ロボットハンドリングシステム及び設定及び様々なモジュールの起動のための一連の指示)を選択してもよい。
いくつかの実装形態では、細胞を成長モジュール内で所望の光学密度まで成長させる(1004)。例えば、処理システムは、成長サイクル中に細胞をインキュベートするための成長モジュールの温度設定を管理してもよい。処理システムはさらに、光学密度を示す成長モジュールからセンサ信号を受信し、センサ信号を分析して細胞の成長を監視してもよい。いくつかの実施形態では、ユーザは、細胞の成長を管理するための成長パラメータを設定してもよい。例えば、温度、及び細胞の攪拌の程度。さらに、いくつかの実施形態では、成長プロセスに関してユーザをアップグレードすることができる。いくつかの実施形態では、アップグレードには、自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースに表示されるメッセージ、ユーザの携帯電話番号へのテキストメッセージ、電子メールアカウントへの電子メールメッセージ、又はポータブル電子デバイス(携帯電話、タブレットなど)で実行するアプリに送られるメッセージが含まれ得る。メッセージに応答して、いくつかの実施形態では、ユーザは、温度などのパラメータを変更して、細胞成長を調整することができる。例えば、ユーザは、自動化マルチモジュール細胞編集機器のユーザインターフェースを通じて、又はユーザインターフェース(図4Bの要素450を参照)などの自動化マルチモジュール細胞編集機器と通信するポータブルコンピューティングデバイスアプリケーションを通じて、アップグレードされたパラメータを提示することができる。
光学密度に関連して説明したが、他の実装形態では、成長モジュール内の細胞成長は、いくつかの例では、pH、溶存酸素、放出酵素、音響特性、及び電気特性などの細胞密度及び生理学的状態の様々な測定値を使用して監視することができる。
いくつかの実装形態では、所望の光学密度に到達すると(1004)、細胞は成長モジュールから濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールに移される(1006)。ロボットハンドリングシステムは、例えば、細胞を成長モジュールから細胞濃縮モジュールに移すことができる。細胞濃縮モジュールは、例えば、細胞をエレクトロコンピテントにするように設計されてもよい(典型的には、そのように設計される)。上記のTFFデバイスに関連する図6A〜6Iを参照されたい。細胞はエレクトロコンピテントにされ、濾過モジュール又は細胞洗浄及び濃縮モジュールで溶出される(1008)。細胞は洗浄液を使用して溶出され得る。例えば、細胞は、試薬供給部からの試薬を使用して溶出され得る。
細胞がエレクトロコンピテントにされ、50μL〜10mL、又は100μL〜80mL、又は150μL〜8mL、又は250μL〜7mL、又は500μL〜6mL、又は750μL〜5mLなどの、形質転換に適切な体積に懸濁されたら(1006)、細胞は、例えばFTEPモジュールに移される(1018)。例えば、ロボットハンドリングシステムは、細胞を濾過モジュールからFTEPに移すことができる。濾過モジュールはFTEPデバイスに物理的に結合されていてもよいし、これらのモジュールは分離されていてもよい。
いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器の外部で核酸が用意される。例えば、方法1000の形質転換プロセス及び他のプロセスを実行する前に、アセンブリされたベクター又は他の核酸アセンブリがユーザによって試薬として含まれてもよい。
ただし、他の実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器によって核酸が用意される。いくつかの実施形態では、以下のステップ1010から1016の一部は、ステップ1002から1008の一部と並行して実行される。いくつかの実施形態では、以下のステップの少なくとも一部は、ステップ1002から1008の前及び/又は後に実行される。
いくつかの実装形態では、編集オリゴヌクレオチド及びベクター骨格などの核酸、ならびにいくつかの例では、酵素及び他の反応成分が、核酸アセンブリモジュールに移される(1010)。核酸アセンブリモジュールは、自動化された様式で多種多様な異なる核酸アセンブリ技術のうちの1つ以上を実行するように構成され得る。核酸アセンブリモジュールで実行できる核酸アセンブリ技術には、限定するものではないが、PCR、BioBrickアセンブリ、TypeIISクローニング、GoldenGateアセンブリ、及びリガーゼサイクリング反応などの制限エンドヌクレアーゼを使用するアセンブリ方法が含まれ得る。他の例では、核酸アセンブリモジュールは、上述のように、ギブソンアセンブリ(商標)、CPEC、SLIC、リガーゼサイクリングなどの、核酸の隣接部分間の重複に基づくアセンブリ技術を実行してもよい。核酸アセンブリモジュールによって実行され得る追加の例示的なアセンブリ方法には、酵母におけるギャップ修復、ゲートウェイクローニング及びトポイソメラーゼを介したクローニングが含まれる。特定の例では、処理システムは、核酸を核酸アセンブリモジュールに移すようにロボットハンドリングシステムに指示することができる。別の例では、核酸は、ロボットハンドリングシステムによって試薬カートリッジから核酸アセンブリモジュールに移され得る。
いくつかの実施形態では、(核酸試料、酵素、及び他の反応成分の各々を移す前に)機械可読表示がこれらの材料用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器上でスキャンされ、そのバイアル又は容器が想定される材料を含むものとしてマークされていることを確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される核酸試料、酵素、及び他の反応成分の1つ以上の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、材料の種類に応じて特定の処理スクリプト(例えば、さらなる材料及び/又は核酸アセンブリモジュールの設定及び起動を識別するためのロボットハンドリングシステムに対する一連の指示)を選択してもよい。
いくつかの実施形態では、核酸アセンブリモジュールは、使用される核酸アセンブリの種類に応じて温度制御される。例えば、PCRが核酸アセンブリモジュールで使用される場合、モジュールは、変性ステップ、アニーリングステップ、及び伸長ステップの間で温度を循環させることができるサーモサイクリング機能を有することができる。核酸アセンブリモジュールで単一温度アセンブリ法が利用される場合、モジュールは実行される特定のアセンブリプロセスを最適化する温度に到達させ、保持する能力を有することができる。
いくつかの実施形態では、温度制御は、処理システムなどの自動化マルチモジュール細胞編集機器の処理システムによって管理される。これらの温度及びこれらの温度を維持する期間は、事前にプログラムされた一連のパラメータ(例えば、処理スクリプト内又は処理システムからアクセス可能な別のメモリ空間内で特定される)によって決定されるか、処理システムとのインターフェースを通じてユーザが手動で制御することができる。
アセンブリ反応が起きるのに十分な時間が経過すると、いくつかの実装形態では、核酸アセンブリは精製モジュールに移され得る(1014)。処理システムは、例えば、反応の種類、材料の種類、及び自動化マルチモジュール細胞編集機器に提供されたユーザ設定のうちの1つ以上に基づいて、アセンブリ反応のタイミングを監視してもよい。ロボットハンドリングシステムは、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、核酸アセンブリを精製モジュールに移してもよい。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、核酸アセンブリを含むバイアルを、核酸アセンブリモジュールのチャンバから脱塩/精製モジュールのチャンバに移してもよい。
いくつかの実装形態では、核酸アセンブリは精製モジュールで脱塩され、溶出される(1016)。精製モジュールは、例えば、核酸アセンブリ混合物の不要な成分(例えば、塩、ミネラルなど)を除去し得る。いくつかの実施形態では、精製モジュールは、アセンブリされた核酸を、核酸アセンブリ体積よりも小さい体積に濃縮する。核酸アセンブリ後に液体を交換する方法の例には、磁気ビーズ(例えば、カリフォルニア州カールスバッドのInvitrogen Corp.のSPRI又はDynal(Dynabeads))、シリカビーズ、シリカスピンカラム、ガラスビーズ、(例えばエタノール又はイソプロパノールを用いた)沈殿、アルカリ溶解、浸透圧精製、ブタノールでの抽出、膜ベースの分離技術、濾過などが含まれる。例えば、様々な多孔度の異方性親水性セルロース膜を備えた1つ以上のマイクロ濃縮器を使用してもよい。別の例では、脱塩/精製モジュールは、混合物を不溶性リン酸塩を含むイオン交換体と接触させ、液体を除去し、イオン交換体から核酸を溶出することにより、核酸及びイオン塩を含む液体試料を処理することができる。
例示的な実施形態では、核酸アセンブリは、精製モジュールのチャンバ内で、SPRIビーズなどの磁気ビーズと組み合わせることができる。核酸アセンブリは、アセンブリされた核酸が磁気ビーズに結合するのに十分な時間、設定温度でインキュベートされてもよい。インキュベーション後、磁石をチャンバに近接させて、核酸アセンブリを洗浄及び溶出できるようにする。核酸アセンブリが溶出されると、核酸アセンブリは、形質転換モジュールに移される(1018)。ロボットハンドリングシステムは、例えば、上記のように、FTEPへのシッパー又はピペッターインターフェースを介して、アセンブリされた核酸を形質転換モジュールに移すことができる。例えば、脱塩されたアセンブリされた核酸は、移動中にステップ108からのエレクトロコンピテントセルと組み合わされてもよい。他の実施形態では、形質転換モジュールは、エレクトロコンピテントセル及び核酸アセンブリのそれぞれを別々に受け入れ、混合を可能にし得る(例えば、共有チャンバ内で材料を合わせるために1つ以上のチャネルを開く)。
細胞はFTEPモジュール(1020)で形質転換される。細胞がエレクトロポレーション中の細胞の生存に有利な緩衝液又は培地に懸濁されるように、緩衝液又は培地を形質転換モジュールに移し、細胞に加えてもよい。緩衝液又は培地を移す前に、緩衝液又は培地用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器又はリザーバ上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル又は容器の内容物を確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される緩衝液又は培地の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、緩衝液又は培地の種類に応じて特定の処理スクリプト(例えば、特定の緩衝液又は培地に適した形質転換モジュールの設定及び起動)を選択してもよい。細菌細胞のエレクトロポレーションでは、水やグリセロール溶液などの低コンダクタンスの培地を使用して、一時的な高電流による熱産生を減らすことができる。酵母細胞の場合はソルビトール溶液が用いられ得る。哺乳類細胞のエレクトロポレーションの場合、細胞は、MEM、DMEM、IMDM、RPMI、ハンクス、PBS、HBSS、HeBS及びリンゲル液などの高伝導性の培地又は緩衝液に懸濁され得る。特定の例では、ロボットハンドリングシステムは、試薬カートリッジからFTEPモジュールに緩衝液を移してもよい。図7A〜7Eに関連して説明したように、FTEPデバイスは使い捨てFTEPデバイスであってもよく、及び/又はFTEPデバイスは試薬カートリッジの一部として提供され得る。あるいは、図4Aに示すように、FTEPデバイスは別個のモジュールであってもよい。
形質転換されると、細胞は、図5A〜5Dに関連して説明した細胞成長モジュールなどの第2の成長/回復/編集モジュールに移される(1022)。ロボットハンドリングシステムは、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、形質転換された細胞を第2の成長モジュールに移してもよい。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、形質転換モジュールのチャンバから第2の成長モジュールのチャンバへ、形質転換された細胞を含むバイアルを移してもよい。
第2の成長モジュールは、いくつかの実施形態では、回復モジュールとして機能し、細胞が形質転換プロセスから回復することを可能にする。他の実施形態では、細胞は、第2の成長モジュールに移される前に別個の回復モジュールに提供されてもよい。回復中、第2の成長モジュールは、形質転換された細胞が導入された核酸を取り込み、特定の態様では、細胞のゲノムに組み込むのを可能にする。第2の成長モジュールは、細胞成長に最適な任意のユーザ設定温度、好ましくは25°、30°、又は37℃で細胞をインキュベートするように構成され得る。
いくつかの実施形態では、第2の成長モジュールは選択モジュールとして動作し、抗生物質又は他の試薬に基づいて形質転換細胞を選択する。一例では、RNA誘導型ヌクレアーゼ(RGN)タンパク質システムを使用して、目的の編集を受けていない細胞のゲノムを切断する。抗生物質選択剤の例では、選択を行うために抗生物質を第2の成長モジュールに追加してもよい。適切な抗生物質耐性遺伝子には、限定するものではないが、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナバニン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、又はクロラムフェニコール耐性遺伝子などの遺伝子が含まれる。ロボットハンドリングシステムは、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して抗生物質を第2の成長モジュールに移してもよい。いくつかの実施形態において、死細胞バックグラウンドの除去は、洗浄剤、低浸透圧洗浄による浸透圧ストレス、温度、酵素、プロテアーゼ、バクテリオファージ、還元剤、又はカオトロープなどの溶解エンハンサーの使用により補助される。処理システムは、例えば温度などの環境変数を変更して選択を誘導してもよく、ロボットハンドリングシステムは、選択を補助する追加の材料(例えば、洗浄剤、酵素、還元剤など)を送達してもよい。他の実施形態では、死細胞バックグラウンドを低減するために、細胞除去及び/又は濾過による培地交換が用いられる。
さらなる実施形態では、選択を適用することに加えて、又はそれに代えて、第2の成長モジュールは編集モジュールとして機能し、形質転換された細胞におけるゲノム編集を可能にする。あるいは、他の実施形態では、回復及び選択後(実行される場合)の細胞は、別個の編集モジュールに移される。編集モジュールとして、第2の成長モジュールは、例えば、導入された核酸の発現を促進することにより、細胞のゲノムの編集を誘導する。ヌクレアーゼ及び/又は編集カセット核酸の発現は、化学、光、ウイルス、又は温度による誘導法の1つ以上を伴い得る。第2の成長モジュールは、例えば、温度誘導プロセス中に細胞を加熱又は冷却するように構成されてもよい。特定の実例では、細胞は42℃〜50℃に加熱することにより誘導され得る。例示に加えて、誘導後、細胞を0〜10℃に冷却してもよい。化学的又はウイルスによる誘導の例では、誘導剤を第2の成長モジュールに移送して編集を誘導することができる。編集中に誘導性ヌクレアーゼ及び/又は編集カセットが細胞に導入された場合、誘導分子の導入により誘導することができる。誘導剤又は誘導剤分子は、いくつかの実装形態では、ロボットハンドリングシステムにより、例えば、ピペッター又はシッパーインターフェースを介して第2の成長モジュールに移される。
いくつかの実装形態において、追加の細胞編集が望まれない場合(1024)、細胞を細胞成長モジュールから保管ユニットに移しておき、後で自動化マルチモジュール細胞編集機器から取り出すことができる(1026)。ロボットハンドリングシステムは、例えば、シッパー又はピペッターインターフェースを介して、細胞を保管ユニットに移してもよい。別の例では、ロボットハンドリングシステムは、細胞を含むバイアルを、第2の成長モジュールのチャンバから保管ユニット内のバイアル又はチューブに移してもよい。
いくつかの実装形態では、追加の細胞編集が望まれる場合(1024)、細胞を同じ又は異なる濾過モジュールに移し、エレクトロコンピテントにすることができる(1008)。さらに、いくつかの実施形態では、この時点で核酸アセンブリモジュールによって新しいアセンブリ核酸試料を調製してもよく、あるいは、第2の完全にアセンブリされた核酸を細胞に直接導入してもよい。再帰的編集の前に、いくつかの実施形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、例えば1つ以上の別個の試薬バイアル又はカートリッジの導入を通じて、ユーザによる追加材料の供給を必要とし得る。
工程は、第2ラウンドの編集中に同じでも異なっていてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、ステップ1004の実行の後に、選択成長培地が成長モジュールに移送され、第1ラウンドの編集からの編集された細胞の選択が可能になる。ロボットハンドリングシステムは、選択成長培地用に指定された位置にある試薬カートリッジ内のバイアル又は容器から選択成長培地を移すことができる。選択成長培地を移す前に、選択成長培地用に指定された位置にあるバイアル又は他の容器又はリザーバ上の機械可読表示をスキャンして、そのバイアル、容器、又はリザーバの内容物を確認してもよい。さらに、機械可読表示は、機器に提供される選択成長培地の種類を示してもよい。いくつかの実施形態では、機器は、選択成長培地の種類に応じて特定の処理スクリプト(例えば、特定の選択成長培地に適切な成長モジュールの設定及び起動)を選択してもよい。再帰的編集ワークフローの特定の例については、図13に関連して説明されている。
いくつかの実装形態では、方法1000は、ユーザのスケジュールに合わせて材料を導入し、及び/又は編集サイクル又は成長サイクルを完了するようにタイミングを合わせることができる。例えば、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、1つ以上の細胞処理サイクル(例えば1つ以上の再帰的編集)の完了のスケジュールを決める能力をユーザに提供することができ、方法1000は、ユーザの希望する時間に完了することを目標に制定される。例えば、時間スケジュールは、ユーザインターフェースを介して設定されてもよい。例示のみを目的として、ユーザは最初のサイクルの完了を午後4:00に設定し、ユーザが追加の材料カートリッジを自動化マルチモジュール細胞編集機器に供給して、別のラウンドの細胞編集を一晩かけて処理できるようにすることができる。したがって、ユーザは、特定の期間、例えば24時間で2回以上のサイクルがプログラムされるように、プログラムの時間を設定することができる。
いくつかの実装形態では、方法1000全体を通して、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、ユーザに現在の状態を警告してもよい。例えば、ユーザインターフェースは、処理の現在の段階のグラフィック表示を提示し得る。特定の例では、自動化マルチモジュール細胞処理機器の前面に、細胞処理の現在の状態を表すアニメーション画像を表示するユーザインターフェース(例えばタッチスクリーン)を重ねることができる。ユーザインターフェースは、現在の処理段階に関連付けられたユーザ及び/又はデフォルト設定(例えば、温度設定、時間設定など)をさらに提示してもよい。特定の実装形態では、状況は、ワイヤレス通信コントローラを介してユーザに通信され得る。
特定の一連の動作として示されているが、他の実施形態では、より多くの又はより少ないステップが方法1000に含まれてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、編集の各ラウンドに入る前に、処理を進めるために適切な材料が利用可能であることを確認するために、リザーバ、カートリッジ、及び/又はバイアルの内容物がスクリーニングされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、1つ以上の画像センサ(例えば、バーコードスキャナ、カメラなど)が、自動化マルチモジュール細胞編集機器のハウジング内の様々な場所で内容物を確認し得る。一例では、自動化マルチモジュール細胞編集機器のハウジング内に複数の画像センサを配置することができ、各画像センサは1つ以上の材料(例えば、バーコードやQRコード(登録商標)などの機械可読表示、材料の形状/サイズなど)を検出するように構成されている。別の例では、ロボットハンドリングシステムによって少なくとも1つの画像センサを複数の場所に移動させて、1つ以上の材料を検出することができる。さらなる実施形態では、1つ以上の重量センサが、使い捨て又は交換可能な材料の有無を検出してもよい。例示的な例では、移送チップ供給ホルダは、チップが領域に装填されたか否かを検出するための重量センサを含んでもよい。別の例示的な例では、光学センサが、液体廃棄物のレベルが閾値レベルに達したことを検出し、細胞処理を続ける前に、又は続行の最低レベルに達していない場合は液体の添加前に、廃棄することを求めてもよい。いくつかの実装形態では、追加材料、廃棄物の除去、又は他のユーザの介入(例えば、1つ以上の要素の手動清掃など)の要求が、自動化マルチモジュール細胞編集機器のグラフィカルユーザインターフェースに表示される。いくつかの実装形態では、自動化マルチモジュール細胞編集機器は、例えばソフトウェアアプリ、電子メール、又はテキストメッセージを介して、新しい材料又は他の手動による介入の要求をユーザに連絡する。
図11は、富化(100a)及び選択(cherry picking)(1100b)のために細胞を分離するための2つの代替の例示的な方法1100a及び1100bの簡略化されたフローチャートを示す。図11を見ると、方法1100aは、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集を実行するために必要な要素で細胞を形質転換すること1110から始まる。例えば、細胞は、別個のエンジンベクター及び編集ベクターで同時に形質転換され得る。細胞はすでにヌクレアーゼを発現している可能性があり(例えば、細胞がエンジンベクターですでに形質転換されているか、又はヌクレアーゼのコード配列が細胞ゲノムに安定して組み込まれている可能性がある)、その場合は細胞を編集ベクターのみで形質転換すればよい。あるいは、細胞は、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集を実行するために必要なすべての要素を含む単一のベクターで形質転換されてもよい。
上述のように、様々な送達システムを使用して、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集システム構成要素を宿主細胞に導入する(例えば、形質転換又はトランスフェクトする)ことができる1110。これらの送達システムには、酵母システム、リポフェクションシステム、マイクロインジェクションシステム、微粒子銃システム、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン、脂質:核酸コンジュゲート、ビリオン、人工ビリオン、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、細胞透過性ペプチド、ナノ粒子、ナノワイヤー、エキソソームの使用が含まれる。あるいは、トロイの木馬リポソーム分子を使用して、血液脳関門を越えて核酸誘導型ヌクレアーゼ成分を送達することができる。特にマルチモジュール細胞編集機器との関連で興味深いのは、エレクトロポレーション、特にフロースルー型エレクトロポレーション(自立型機器として、又は自動化マルチモジュールシステムのモジュールとして)の使用である。これは、例えば、2018年9月28日に出願された米国特許出願第16/147,120号;2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年9月30日に出願された同第16/147,871号に記載されている。固体壁分離/成長/編集/正規化モジュールが自動化マルチモジュール細胞編集機器の1つのモジュールである場合、細胞は自動化細胞形質転換モジュールで形質転換される可能性がある。
細胞が、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集を行うために必要な要素で形質転換された後、細胞は、例えば、固体壁デバイスのマイクロウェル内に分離される1120。すなわち、細胞は、液体培地(いくつかの実施形態では、良好な分布をもたらすために0.1%以下の濃度でTween(登録商標)を含む)で希釈され(必要な場合)、その結果、細胞は、固体壁デバイスに送達されると、ポアソン分布又は実質的にポアソン分布で固体壁デバイスのマイクロウェルを満たす。分離は、各マイクロウェルに平均1/2の細胞が送られたとき、つまり、一部のマイクロウェルには1つの細胞が含まれ、他のマイクロウェルには細胞が含まれていないときに達成される。
この実施形態の細胞が1100aで分離されると、編集「機械」が構成的プロモーターの制御下にあるため、細胞は活発に編集を行う。細胞が編集を行っている間、それらは最終サイズのコロニーまで増殖する1130。つまり、分離された細胞から生じるコロニーは、細胞増殖がピークに達し、編集された細胞と編集されていない細胞の両方が正規化され又は飽和するポイントまでコロニーに成長する。正規化は、成長中の細胞コロニー周辺の培地中の栄養素が枯渇するか、増殖細胞がマイクロウェルを満たし、さらなる増殖が抑制されるときに生じる。この場合も、図11に示される実施形態1100aでは、編集コンポーネントは、構成的プロモーターの制御下にある。したがって、編集は形質転換後すぐに(又はほぼすぐに)開始される。しかしながら、以下に説明する1100bに示される実施形態などの他の実施形態では、ヌクレアーゼ及びガイド核酸の一方又は両方(ならびに、例えば、細菌系におけるλレッド組換えシステムコンポーネント)は、誘導性プロモーターの制御下にあってもよく、この場合、例えば、所望の数の細胞倍加の後に編集が誘導され得る。方法1100aに戻って、正規化された細胞コロニーからの細胞を混合するため、マイクロウェルからクローン細胞コロニーを洗い出すことにより、最終サイズのコロニーがプールされる1140。繰り返しになるが、分離は、編集されていない細胞や、編集の結果として適合性効果を示す細胞からの増殖バイアスを克服するので、分離/正規化だけで、編集された細胞の細胞総数が富化する。つまり、分離と正規化(例えば、コロニーを最終サイズまで成長させること)を組み合わせることで、編集された細胞のハイスループット富化が可能になる。
図11に示される方法1100bは、目的の細胞が、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集を行うために必要な要素で形質転換される1110という点で、方法1100aに類似している。上述したように、細胞は、エンジンベクター及び編集ベクターの両方で同時に形質転換され得る。細胞はすでにヌクレアーゼを発現している可能性があり(例えば、細胞がエンジンベクターですでに形質転換されているか、又はヌクレアーゼのコード配列が細胞ゲノムに安定して組み込まれている可能性がある)、その場合は細胞を編集ベクターのみで形質転換すればよい。あるいは、細胞は、核酸誘導型ヌクレアーゼゲノム編集を実行するために必要なすべての要素を含む単一のベクターで形質転換されてもよい。さらに、分離/成長/編集/正規化固体壁モジュールが自動化マルチモジュール細胞編集機器の1つのモジュールである場合、細胞の形質転換は上述したように自動形質転換モジュールで行われる可能性がある。
核酸誘導型ヌクレアーゼ編集を行うために必要な要素で細胞を形質転換した後、細胞を液体培地で希釈し(必要な場合)、細胞が固体壁デバイスに送達されると、ポアソン分布又は実質的にポアソン分布で固体壁デバイスのマイクロウェルを満たすようにする。
細胞が固体壁デバイスのマイクロウェル内に分離されると1120、細胞は、例えば、2〜150倍、又は5〜120倍、又は10〜100倍になるまで増殖することができ、クローンコロニー1150を確立する。コロニーが確立された後、この実施形態1100bでは、例えば、gRNA、ヌクレアーゼ、又は細菌の場合は組み換えシステムの転写などの、核酸誘導型ヌクレアーゼ編集に必要な1つ以上の要素の転写を制御する誘導性プロモーターを活性化することによって、編集が誘導される1160。編集が誘導されると1160、編集プロセス中に発生する二本鎖DNA切断により、クローンコロニー内の編集された細胞の多くが死ぬ。ただし、編集された細胞のうち一定の割合では、ゲノムが編集され、二本鎖切断が適切に修復される。これらの編集された細胞はその後増殖を開始し、コロニーを再確立する。ただし、編集されたコロニーの成長は、編集が行われていないクローンコロニーの成長よりも遅れる傾向がある。小さい又は成長の遅いコロニー(編集された細胞)を選択する1170。
図12は、編集された細胞を富化するための固体壁の分離/成長/編集/正規化モジュールを含む、例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器の実施形態の簡略化されたブロック図である。細胞処理機器1200は、ハウジング1244、形質転換又はトランスフェクトされる細胞1202のリザーバ、及び成長モジュール(細胞増殖デバイス)1204を含み得る。形質転換される細胞はリザーバから成長モジュールに移され、細胞が標的ODに到達するまで培養される。細胞が標的ODに達したら、成長モジュールは、後の処理のために細胞を冷却又は凍結するか、又は細胞を濾過モジュール1230に移し、そこで細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞形質転換に最適な体積に濃縮することができる。濃縮されると、細胞は次にエレクトロポレーションデバイス1208(例えば、形質転換/トランスフェクションモジュール)に移される。マルチモジュール細胞処理機器で使用するための自動化マルチモジュール細胞処理機器で使用される例示的なエレクトロポレーションデバイスには、2018年9月28日に出願された米国特許出願第16/147,120号、2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年9月30日に出願された同第16/147,871号に記載されているようなフロースルー型エレクトロポレーションデバイスが含まれ、これらの文献のすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
細胞を保存するためのリザーバに加えて、システム1200は、編集オリゴヌクレオチドカセット1216を保存するためのリザーバ及び発現ベクター骨格1218を保存するためのリザーバを含み得る。編集オリゴヌクレオチドカセット及び発現ベクター骨格の両方が、試薬カートリッジから核酸アセンブリモジュール1220に移され、そこで編集オリゴヌクレオチドカセットが発現ベクター骨格に挿入される。アセンブリされた核酸は、形質転換のためにアセンブリされた核酸を調製するために必要な脱塩及び/又は他の精製及び/又は濃縮手順のために、任意選択の精製モジュール1222に移され得る。あるいは、事前にアセンブリされた核酸、例えば、編集ベクターは、リザーバ1216又は1218内に保存され得る。精製モジュール1222によって実行されるプロセスが完了すると、アセンブリされた核酸は、例えば、標的ODまで増殖し、エレクトロコンピテントにされた細胞培養物を濾過モジュール1230を介してすでに含むエレクトロポレーションデバイス1205に移される。エレクトロポレーションデバイス1208において、アセンブリされた核酸は、細胞に導入される。エレクトロポレーションに続いて、細胞は、組み合わされた回復/選択モジュール1210に移される。
回復、及び任意選択の選択に続いて、細胞は、分離、編集、及び成長モジュール1240に移され、そこで細胞は、区画ごとに平均1つの細胞が存在するように希釈及び区画化される。分離させたら、細胞を予め決められた数の倍加のために増殖させる。これらの最初のコロニーが確立されると、編集が誘導され、編集された細胞にコロニーを確立させ、最終サイズまで増殖させる(例えば、コロニーは正規化される)。いくつかの実施形態では、編集は、誘導性プロモーターの制御下にある編集コンポーネントのうちの1つ又は複数によって誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは温度の上昇によって活性化され、温度を下げることによって「脱活性化」される。あるいは、分離デバイスがマイクロウェルの底部を形成するフィルタを含む固体壁デバイスである実施形態では、固体壁デバイスは、編集を活性化又は誘導し、編集を非アクティブ化する成分を含む培地を含むプレート(例えば、寒天プレート又は液体培地にさえ)に移し、その後、編集を脱活性化する培地に移すことができる。コロニーが最終サイズまで成長したら、コロニーはプールされる。繰り返しになるが、分離は、編集されていない細胞からの増殖バイアスと、様々な編集の適合性効果から生じる増殖バイアスを克服する。
回復、選択、分離、誘導、編集、及び成長モジュールは、すべて別個であるか、図12に示されるように配置及び組み合わされ得るか、又は他の構成で配置又は組み合わされ得る。特定の実施形態では、回復、選択、分離、成長、編集、及び正規化のすべてが、固体壁デバイスで実行される。あるいは、回復、選択、及び希釈は、必要に応じて、別の容器(モジュール)内の液体培地で実行され、次に、固体壁の分離/成長/誘導/編集/正規化モジュールに移される。
正規化された細胞コロニーがプールされると、細胞は、例えば、保管モジュール1212に保存されてもよく、ここで、細胞は、さらなる研究のために回収されるまで、例えば、4℃で維持されてもよい。あるいは、細胞を別の編集ラウンドで使用することもできる。マルチモジュール細胞処理機器は、ユーザ入力に基づいて、1つ又は複数のスクリプトによって指示されたように、あるいはユーザ入力又はスクリプトの組み合わせに従って機器を操作するように構成されたプロセッサ1242によって制御される。プロセッサ1242は、システム500の様々なモジュールのタイミング、持続時間、温度、及び動作、ならびに試薬の分配を制御することができる。例えば、プロセッサ1242は、編集が望まれるまで、形質転換後に細胞を冷却することができ、その時点で、温度は、ゲノム編集及び細胞増殖を助長する温度に上昇され得る。プロセッサは、ユーザが選択できる標準的なプロトコルパラメータでプログラムすることができ、ユーザは、1つ又は複数のパラメータを手動で指定することができ、又は試薬カートリッジに関連する1つ又は複数のスクリプトは、1つ又は複数の操作及び/又は反応パラメータを指定することができる。さらに、プロセッサは、細胞が標的ODに到達したことを(例えば、スマートフォン又は他のデバイスへのアプリケーションを介して)ユーザに通知し、ならびにマルチモジュールシステムの様々なモジュール内の細胞の進行に関してユーザを更新することができる。
自動化マルチモジュール細胞処理機器1200は、ヌクレアーゼによるゲノム編集システムであり、単回編集システム(例えば、1回の編集プロセスで細胞ゲノムに1つ又は複数の編集を導入する)で使用することができる。以下に説明する図13のシステムは、順次編集を実行するように構成されている。例えば、異なるヌクレアーゼ指向性システムを順次使用して、細胞内に2つ以上のゲノム編集を提供する;及び/又は再帰的編集、例えば単一のヌクレアーゼ指向性システムを利用して、細胞内に2つ以上のゲノム編集を順次導入する。
図13は、マルチモジュール細胞処理機器の別の実施形態を示している。この実施形態は、細胞集団に対して再帰的遺伝子編集を実行する例示的なシステムを示す。図12に示される実施形態と同様に、細胞処理機器1300は、ハウジング1344、形質転換又はトランスフェクトされる細胞1302を保存するためのリザーバ、及び細胞成長モジュール(例えば、回転成長バイアルを含む)1304を含み得る。形質転換される細胞は、細胞を標的ODに到達するまで培養するために、リザーバから細胞成長モジュールに移される。細胞が標的ODに達すると、成長モジュールは、後の処理のために細胞を冷却又は凍結するか、又は細胞を濾過モジュール1360に移し、そこで細胞を緩衝液交換に供し、エレクトロコンピテントにし、実質的に細胞の体積を減らすことができる。細胞が適切な体積に濃縮されると、細胞はエレクトロポレーションデバイス1308に移される。細胞を保存するためのリザーバに加えて、マルチモジュール細胞処理機器は、編集オリゴヌクレオチドカセット1352と事前にアセンブリされたベクターを保存するためのリザーバを含む。事前にアセンブリされた核酸ベクターは、標的ODまで増殖させた細胞培養物をすでに含むエレクトロポレーションデバイス1308に移される。エレクトロポレーションデバイス1308において、核酸は細胞にエレクトロポレーションされる。エレクトロポレーションに続いて、細胞は任意選択の回復モジュール1356に移され、そこで細胞は形質転換後に短時間回復することができる。
回復後、細胞は保管モジュール1312に移されてもよく、そこで細胞は、後の処理のために例えば4℃で保存され得るか、又は細胞は希釈され、選択/分離/成長/誘導/編集/正規化モジュール1358に移され得る。分離/編集/成長モジュール1358において、細胞は、マイクロウェルあたり平均1つの細胞が存在するように配列されている。配列された細胞は、編集ベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を選択するための選択培地にあってもよい。分離されると、細胞は2〜50倍に増殖し、コロニーを確立する。コロニーが確立されると、編集を誘導するための条件(例えば、温度、誘導又は抑制化学物質の添加)を提供することによって編集が誘導される。編集を開始し、継続させると、細胞はマイクロウェル内で最終サイズまで増殖し(例えば、コロニーの正規化)、マイクロウェルから洗い出されてプールされ、保管(又は回復)ユニット1314に移されるか、又は別の編集ラウンドのために成長モジュール1304に移され得る。プールしてから成長モジュールに移すまでの間に、例えば濾過による、細胞回復、培地交換、細胞濃縮などの1つ又は複数の追加のステップが存在し得る。選択/分離/成長/誘導/編集及び正規化モジュールは、すべてのプロセスが固体壁デバイスで実行される同じモジュールであってもよく、あるいは、選択及び/又は希釈は、細胞が固体壁の分離/成長/誘導/編集/正規化モジュール(固体壁デバイス)に移される前に別の容器で行われてもよいことに留意されたい。例えば、固体壁デバイスにおける分離の代替として、形質転換された細胞は、上記の図8F〜8Hに関連して上述したように、バルク液体中で増殖されてもよく、そして編集が誘導されてもよい。推定上編集された細胞がプールされると、それらは、増殖、細胞濃縮及びエレクトロコンピテントにする処理に始まり、エレクトロポレーションモジュール1308を介した別の編集カセット内のさらに別のドナー核酸による形質転換の別のラウンドの編集に供され得る。
エレクトロポレーションデバイス1308において、編集の第1のラウンドから選択された細胞は、第2のセットの編集オリゴ(又は他の種類のオリゴ)によって形質転換され、細胞が、所望の数の編集カセット等によって形質転換及び編集されるまで、サイクルが繰り返される。図13に例示されるマルチモジュール細胞処理機器は、ユーザ入力に基づいて機器を操作するように構成されたプロセッサ1342によって制御されるか、又は試薬カートリッジに関連する少なくとも1つのスクリプトを含む1つ又は複数のスクリプトによって制御される。プロセッサ1342は、様々なプロセスのタイミング、持続時間、及び温度、試薬の分配、及び機器1300の様々なモジュールの他の操作を制御することができる。例えば、スクリプト又はプロセッサは、細胞、試薬、ベクター、及び編集オリゴヌクレオチド(編集オリゴヌクレオチドは細胞編集に使用される)の分配、編集の順序、回復及び発現モジュールで使用される時間、温度、及びその他の条件、細胞成長モジュールでODを読み取る際の波長、細胞を増殖させる標的OD、及び細胞が標的ODに到達する標的時間を制御することができる。さらに、プロセッサは、自動化マルチモジュール細胞処理機器内の細胞の進行に関して(例えば、アプリケーションを介して)ユーザに通知するようにプログラムされ得る。
本開示を与えられた当業者には、記載されたプロセスが再帰的かつ多重化され得ることが明らかであるはずである。つまり、細胞は図13に関連して説明されているワークフローを経由し、結果として編集された培養物は、異なる編集ベクターを使用した別の(又は複数又は多数の)ラウンドの追加編集(再帰的編集など)を経由してもよい。例えば、ラウンド1の編集からの細胞を希釈し、編集ベクターAによって編集された編集細胞のアリコートを編集ベクターBと組み合わせることができ、編集ベクターAによって編集された編集細胞のアリコートを編集ベクターCと組み合わせることができ、編集ベクターAによって編集された編集された細胞のアリコートは、編集ベクターDと組み合わせることができ、第2ラウンドの編集についても同様である。第2ラウンドの後、二重編集された細胞のそれぞれのアリコートは、第3ラウンドの編集に供され得、ここで、例えば、AB、AC、AD編集細胞のそれぞれのアリコートは、編集ベクターX、Y、及びZなどの追加の編集ベクターと組み合わされる。つまり、二重編集された細胞ABを、ベクターX、Y、及びZと組み合わせてそれらにより編集し、三重編集された編集細胞ABX、ABY、及びABZを生成でき;二重編集細胞ACを、ベクターX、Y、及びZと組み合わせてそれらにより編集し、三重編集細胞ACX、ACY、及びACZを生成でき;二重編集された細胞ADを、ベクターX、Y、及びZと組み合わせて編集し、三重編集された細胞ADX、ADY、及びADZを生成することができる、等である。このプロセスでは、編集の多くの順列と組み合わせを実行でき、非常に多様な細胞集団と細胞ライブラリーをもたらすことができる。再帰的なプロセスでは、前のエンジンベクター及び編集ベクター(又は単一のベクターシステムにおける単一のエンジン+編集ベクター)を「キュア(cure)」することが有利である。「キュアリング」とは、ベクター、例えば、前のラウンドの編集で使用された1つ又は複数のベクターが、形質転換された細胞から除去されるプロセスである。キュアリングは、例えば、キュアリングプラスミドを使用してベクターを切断し、それにより編集及び/又はエンジンベクター(又は単一の組合せベクター)を機能させなくするか、細胞増殖により細胞集団内のベクターを希釈する(つまり、細胞がより多くの成長サイクルを経るほど、編集又はエンジンベクターを保持する娘細胞が少なくなる)か、又は、例えば編集ベクター又はエンジンベクター(又は組み合わされたエンジン+編集ベクター)上の熱感受性複製起点を利用することにより達成することができる。キュアリングの条件は、キュアリングに使用されるメカニズム、つまりこの例では、キュアリングプラスミドがどのように編集及び/又はエンジンプラスミドを切断するかに依存するであろう。
図14は、図8H〜8Fに関連して上記で説明したように、編集された細胞の誘導編集及び富化のためのバルク液体成長モジュールを含む例示的な自動化マルチモジュール細胞処理機器の実施形態の簡略化されたブロック図である。細胞処理機器1400は、ハウジング1444、形質転換又はトランスフェクトされる細胞1402のリザーバ、及び成長モジュール(細胞増殖デバイス)1404を含み得る。形質転換される細胞はリザーバから成長モジュールに移され、細胞が標的ODに到達するまで培養される。細胞が標的ODに達したら、成長モジュールは、後の処理のために細胞を冷却又は凍結するか、又は細胞を濾過モジュール1430に移し、そこで細胞をエレクトロコンピテントにし、細胞形質転換に最適な体積に濃縮することができる。濃縮されると、細胞は次にエレクトロポレーションデバイス1408(例えば、形質転換/トランスフェクションモジュール)に移される。マルチモジュール細胞処理機器で使用するための自動化マルチモジュール細胞処理機器で使用される例示的なエレクトロポレーションデバイスには、2018年9月28日に出願された米国特許出願第16/147,120号、2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年9月30日に出願された同第16/147,871号に記載されているようなフロースルー型エレクトロポレーションデバイスが含まれ、これらの文献のすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
細胞を保存するためのリザーバに加えて、システム1400は、編集カセット1416を保存するためのリザーバ及び発現ベクター骨格1418を保存するためのリザーバを含み得る。編集オリゴヌクレオチドカセット及び発現ベクター骨格の両方が、試薬カートリッジから核酸アセンブリモジュール1420に移され、そこで編集オリゴヌクレオチドカセットが発現ベクター骨格に挿入される。アセンブリされた核酸は、形質転換のためにアセンブリされた核酸を調製するために必要な脱塩及び/又は他の精製及び/又は濃縮手順のために、任意選択の精製モジュール1422に移され得る。あるいは、事前にアセンブリされた核酸、例えば、編集ベクターは、リザーバ1416又は1418内に保存され得る。精製モジュール1422によって実行されるプロセスが完了すると、アセンブリされた核酸は、例えば、標的ODまで増殖し、エレクトロコンピテントにされた細胞培養物を濾過モジュール1430を介してすでに含むエレクトロポレーションデバイス1408に移される。エレクトロポレーションデバイス1408において、アセンブリされた核酸は、細胞に導入される。エレクトロポレーションに続いて、細胞は、組み合わされた回復/選択モジュール1410に移される。マルチモジュール細胞編集機器の例については、2018年6月30日に出願された米国特許出願第16/024,816号及び同第16/024,831号を参照されたい。これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
回復、及び任意選択で選択に続いて、細胞は、成長、誘導、及び編集モジュール(バルク液体培養)1440に移される。細胞が定常増殖期に達するまで(又はほぼ定常増殖期に達するまで)細胞を増殖させ、その後、ヌクレアーゼ及びgRNAの一方又は両方の転写の誘導によって編集を誘導する。いくつかの実施形態において、編集は、誘導性プロモーターの制御下にあるヌクレアーゼ及びgRNAの一方又は両方の転写によって誘導される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、プロモーターが温度の上昇によって活性化され、温度を下げることによって「脱活性化」されるpLプロモーターである。
回復、選択、成長、誘導、編集、及び保管モジュールは、すべて個別にすることも、図14に示すように配置及び結合することも、他の構成で配置又は結合することもできる。特定の実施形態では、回復及び選択は1つのモジュールで実行され、増殖、編集、及び再増殖は別のモジュールで実行される。あるいは、回復、選択、増殖、編集、及び再増殖は単一のモジュールで実行される。
細胞が編集及び再増殖(例えば、編集から回復)されると、細胞は、例えば、保管モジュール1412に保存されてもよく、ここで、細胞は、さらなる研究のために回収されるまで、例えば、4℃で維持されてもよい。あるいは、細胞を別の編集ラウンドで使用することもできる。マルチモジュール細胞処理機器は、ユーザ入力に基づいて、1つ又は複数のスクリプトによって指示されたように、あるいはユーザ入力又はスクリプトの組み合わせに従って機器を操作するように構成されたプロセッサ1442によって制御される。プロセッサ1442は、システム1400の様々なモジュールのタイミング、持続時間、温度、及び動作、ならびに試薬の分配を制御することができる。例えば、プロセッサ1442は、編集が望まれるまで、形質転換後に細胞を冷却することができ、その時点で、温度は、ゲノム編集及び細胞増殖を助長する温度に上昇され得る。プロセッサは、ユーザが選択できる標準的なプロトコルパラメータでプログラムすることができ、ユーザは、1つ又は複数のパラメータを手動で指定することができ、又は試薬カートリッジに関連する1つ又は複数のスクリプトは、1つ又は複数の操作及び/又は反応パラメータを指定することができる。さらに、プロセッサは、細胞が標的ODに到達したことを(例えば、スマートフォン又は他のデバイスへのアプリケーションを介して)ユーザに通知し、ならびにマルチモジュールシステムの様々なモジュール内の細胞の進行に関してユーザを更新することができる。
実施例
以下の実施例は、当業者に本発明の実施及び使用の完全な開示及び説明を提供するために提示され、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。また、以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表したり暗示したりすることも意図していない。広く記載された本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の態様に示されるように、本発明に対して多数の変形及び/又は変更を行うことができることを当業者は認識するであろう。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
以下の実施例は、当業者に本発明の実施及び使用の完全な開示及び説明を提供するために提示され、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図するものではない。また、以下の実験が実施されたすべての又は唯一の実験であることを表したり暗示したりすることも意図していない。広く記載された本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の態様に示されるように、本発明に対して多数の変形及び/又は変更を行うことができることを当業者は認識するであろう。したがって、本態様は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
実施例1:細胞成長モジュールでの増殖
本明細書に記載の細胞成長デバイスの一実施形態を、細菌及び酵母細胞における細胞増殖を評価するために、5mlチューブを振とうする従来のセルシェーカー及び125mlバッフル付きフラスコを振とうするオービタルシェーカーに対して試験した。さらに、細菌細胞培養物及び酵母細胞培養物の増殖を、本明細書に記載の細胞成長デバイスの実施形態を使用してリアルタイムでモニタリングした。
本明細書に記載の細胞成長デバイスの一実施形態を、細菌及び酵母細胞における細胞増殖を評価するために、5mlチューブを振とうする従来のセルシェーカー及び125mlバッフル付きフラスコを振とうするオービタルシェーカーに対して試験した。さらに、細菌細胞培養物及び酵母細胞培養物の増殖を、本明細書に記載の細胞成長デバイスの実施形態を使用してリアルタイムでモニタリングした。
第1の例では、LB中の20mlのEC23細胞(大腸菌細胞)を、本明細書に記載の細胞成長デバイスを使用して、30℃で2パドル構成の35mlの回転成長バイアル中で増殖させた。回転成長バイアルを600rpmで回転させ、1秒ごとに振動させた(すなわち、回転方向を変えた)。並行して、LB中の5mlのEC23細胞を5mlのチューブ内で30℃で増殖させ、750rpmで振とうした。OD600は、NanoDrop(商標)分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を使用して間隔を置いて測定した。結果を図15に示す。回転成長バイアル/細胞成長デバイスは、4時間強で細胞をOD6002.6に増殖させる点で、セルシェーカーよりも優れた性能を発揮した。同じ条件(体積、細胞、振動)で別の実験を行ったが、唯一の違いは、3パドル回転成長バイアルを細胞成長デバイスで使用したことであり、結果を図16に示す。この場合も、回転成長バイアル/細胞成長デバイスは、細胞をOD6001.9まで増殖させる点でセルシェーカーよりも優れた性能を示した。
2つの追加の実験を行った。今回は、回転成長バイアル/細胞成長デバイスをバッフル付きフラスコ及びオービタルシェーカーと比較した。ある実験では、LB中の20mlのEC138細胞(大腸菌細胞)を、30℃で4パドル構成の35ml回転成長バイアルで増殖させた。回転成長バイアルを600rpmで回転させ、1秒ごとに振動させた(すなわち、回転方向を変えた)。並行して、LB中の20mlのEC138細胞を、オービタルシェーカーを使用して、125mlのバッフル付きフラスコ内で30℃で増殖させた。OD600は、NanoDrop(商標)分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を使用して間隔を置いて測定した。結果を図17に示し、回転成長バイアル/細胞成長デバイスが、細胞をOD6001.0に増殖させる際にオービタルシェーカーと同様に機能したことを示している。第2の実験では、LB中の20mlのEC138細胞(大腸菌細胞)を、本明細書に記載の細胞成長デバイスを使用して、30℃で2パドル構成の35mlの回転成長バイアル中で増殖させた。回転成長バイアルを600rpmで回転させ、1秒ごとに振動させた(すなわち、回転方向を変えた)。並行して、LB中の20mlのEC138細胞を、オービタルシェーカーを使用して、125mlのバッフル付きフラスコ内で30℃で増殖させた。OD600は、NanoDrop(商標)分光光度計(Thermo Fisher Scientific)を使用して間隔を置いて測定した。結果を図18に示し、回転成長バイアル/細胞成長デバイスが、細胞をOD6001.2に成長させる際にオービタルシェーカーと同等又はそれ以上に機能したことを示している。
さらに別の実験では、回転成長バイアル/細胞成長デバイスを使用して、OD600をリアルタイムで測定した。図19は、振動回転を使用し、2パドル回転成長バイアルを使用した、30℃でのEC138細胞培養物の増殖のリアルタイム測定の結果を示すグラフである。OD6002.6は4.4時間で到達したことに注意されたい。
別の実験では、回転成長バイアル/細胞成長デバイスを使用して、YPADの酵母s288c細胞のOD600をリアルタイムで測定した。細胞は、振動回転を使用し、2パドル回転成長バイアルを使用して30℃で増殖させた。図20は結果を示すグラフである。14時間でOD6006.0に到達したことに注意されたい。
実施例2:細胞濃縮
図6A〜6Iに関連して上記で説明したTFFモジュールを使用すると、大腸菌及び酵母の両方の培養物で緩衝液交換を正常に処理及び実施することができた。大腸菌培養物を濃縮する際に、以下のステップを実施した:
最初に、OD0.5〜0.62まで増殖させたLB中の大腸菌の20ml培養物を、TFFデバイスに一方向に通し、次にTFFデバイスに反対方向に通した。この時点で、細胞は約5mlの体積に濃縮された。次に、50mlの10%グリセロールを濃縮細胞に添加し、細胞をTFFデバイスに一方向、反対方向、そして最初の方向に戻し、合計3回通した。この場合も、細胞は約5mlの体積に濃縮された。再び、50mlの10%グリセロールを5mlの細胞に加え、細胞をTFFデバイスに3回通した。このプロセスを繰り返した。すなわち、再び50mlの10%グリセロールを5mlに濃縮された細胞に加え、細胞をTFFデバイスに3回通した。3回の50mlの10%グリセロール洗浄の3回目の通過の終わりに、細胞を再び約5mlの10%グリセロールに濃縮した。次に、細胞を交互の方向にTFFデバイスにさらに3回通し、細胞を約400μlの体積に濃縮した。
図6A〜6Iに関連して上記で説明したTFFモジュールを使用すると、大腸菌及び酵母の両方の培養物で緩衝液交換を正常に処理及び実施することができた。大腸菌培養物を濃縮する際に、以下のステップを実施した:
最初に、OD0.5〜0.62まで増殖させたLB中の大腸菌の20ml培養物を、TFFデバイスに一方向に通し、次にTFFデバイスに反対方向に通した。この時点で、細胞は約5mlの体積に濃縮された。次に、50mlの10%グリセロールを濃縮細胞に添加し、細胞をTFFデバイスに一方向、反対方向、そして最初の方向に戻し、合計3回通した。この場合も、細胞は約5mlの体積に濃縮された。再び、50mlの10%グリセロールを5mlの細胞に加え、細胞をTFFデバイスに3回通した。このプロセスを繰り返した。すなわち、再び50mlの10%グリセロールを5mlに濃縮された細胞に加え、細胞をTFFデバイスに3回通した。3回の50mlの10%グリセロール洗浄の3回目の通過の終わりに、細胞を再び約5mlの10%グリセロールに濃縮した。次に、細胞を交互の方向にTFFデバイスにさらに3回通し、細胞を約400μlの体積に濃縮した。
大腸菌の濾液導電率及びフィルタ処理時間を測定し、結果を図21Aに示す。フィルタの性能は、目標溶液導電率を得るのに必要なフィルタパスの時間及び回数を測定することによって定量化された。細胞の保持率は、濾過前後の細胞培養物の光学密度(OD600)を比較することによって決定した。フィルタの健全性は、各フィルタパス中の膜貫通流量を測定することによってモニタリングされた。目標導電率(約16μS/cm)は、50mlの10%グリセロール洗浄を3回行い、各洗浄で細胞をデバイスに3回通すことで、約30分で達成された。細胞の体積は20mlから400μlに減少し、細胞の約90%の回復が達成された。
同じプロセスを酵母細胞培養物で繰り返した。酵母培養物を、TFFデバイスに反対方向に2回通すことにより、最初に約5mlに濃縮した。細胞を50mlの1Mソルビトールで3回洗浄し、各洗浄後にTFFデバイスに3回通した。1Mソルビトールで最後に洗浄し、細胞を3回目に通した後、細胞をTFFデバイスに2回通し、酵母細胞培養物を約525μlに濃縮した。図21Bは、濾液導電率及びフィルタ処理時間を測定することによって決定された酵母細胞についてのフィルタ緩衝液交換性能を示している。目標導電率(約10μS/cm)は、50mlの1Mソルビトール洗浄を3回、及び各洗浄でTFFデバイスに3回通すことにより、約23分で達成された。細胞の体積は20mlから525μlに減少した。細胞の約90%の回復が達成された。
実施例3:エレクトロコンピテント大腸菌及びS.セレビシエの産生及び形質転換。
FTEPデバイスの形質転換を試験するために、エレクトロコンピテント大腸菌細胞を作成した。スターター培養物を作成するために、6mlのLBchlor−25(25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB)を14ml培養チューブに移した。大腸菌の25μlアリコートを使用して、LBchlor−25チューブに接種した。接種後、チューブを250RPM及び30℃に設定した振とうインキュベーター内に45°の角度で置き、12〜16時間一晩成長させた。OD600の値は2.0〜4.0である必要がある。1:100接種量の250mlのLBchlor−25チューブを、4本の滅菌500mlバッフル付き振とうフラスコ(すなわち250ml容量の振とうフラスコあたり2.5ml)に移した。フラスコを250RPM及び30℃に設定された振とうインキュベーターに入れた。1〜2時間ごとにOD600を測定することにより、成長を監視した。培養物のOD600が0.5〜0.6(約3〜4時間)になったら、フラスコをインキュベーターから取り出した。細胞を4300RPM、10分、4℃で遠心分離した。上清を除去し、氷冷した10%グリセロール100mlを各試料に移した。細胞を穏やかに再懸濁し、洗浄手順を3回実施し、そのたびに細胞を10%グリセロールに再懸濁した。4回目の遠心分離後、細胞の再懸濁物を50mlコニカルファルコンチューブに移し、氷冷した10%グリセロールを追加して体積を30mlにした。細胞を再度4300RPM、10分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを10mlの氷冷グリセロールに再懸濁した。細胞を、細胞懸濁液:氷冷グリセロールが1:100の希釈液のアリコートに分けた。
FTEPデバイスの形質転換を試験するために、エレクトロコンピテント大腸菌細胞を作成した。スターター培養物を作成するために、6mlのLBchlor−25(25μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB)を14ml培養チューブに移した。大腸菌の25μlアリコートを使用して、LBchlor−25チューブに接種した。接種後、チューブを250RPM及び30℃に設定した振とうインキュベーター内に45°の角度で置き、12〜16時間一晩成長させた。OD600の値は2.0〜4.0である必要がある。1:100接種量の250mlのLBchlor−25チューブを、4本の滅菌500mlバッフル付き振とうフラスコ(すなわち250ml容量の振とうフラスコあたり2.5ml)に移した。フラスコを250RPM及び30℃に設定された振とうインキュベーターに入れた。1〜2時間ごとにOD600を測定することにより、成長を監視した。培養物のOD600が0.5〜0.6(約3〜4時間)になったら、フラスコをインキュベーターから取り出した。細胞を4300RPM、10分、4℃で遠心分離した。上清を除去し、氷冷した10%グリセロール100mlを各試料に移した。細胞を穏やかに再懸濁し、洗浄手順を3回実施し、そのたびに細胞を10%グリセロールに再懸濁した。4回目の遠心分離後、細胞の再懸濁物を50mlコニカルファルコンチューブに移し、氷冷した10%グリセロールを追加して体積を30mlにした。細胞を再度4300RPM、10分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを10mlの氷冷グリセロールに再懸濁した。細胞を、細胞懸濁液:氷冷グリセロールが1:100の希釈液のアリコートに分けた。
説明したFTEPデバイスを使用して比較エレクトロポレーション実験を実施し、エレクトロコンピテント大腸菌の形質転換の効率を決定した。流量は圧力制御システムで制御した。DNAを含む細胞の懸濁液をFTEP入口リザーバに投入した。形質転換された細胞は、入口及び入口チャネルから直接、フローチャネルを通り、出口チャネルを通り、回復培地を含む出口へと流れた。細胞を追加の回復培地を含むチューブに移し、30℃のインキュベーターシェーカーに入れ、250rpmで3時間振とうした。細胞をプレート播種して、エレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位(CFU)及びエレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込んだCFUを決定した。プレートは30℃でインキュベートした。大腸菌コロニーを24時間後に数えた。
フロースルー型エレクトロポレーション実験は、in vitro高電圧エレクトロポレーター(NEPAGENE(商標)ELEPO21)を使用して、2mmエレクトロポレーションキュベット(Bull dog Bio)に対してベンチマークされた。DNAを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、NEPAGENE(商標)及びフロースルー型エレクトロポレーションを使用したサイドトゥサイド実験に使用した。結果を図22Aに示す。図22Aにおいて、左端の///でハッチングされたバーは細胞入力を示し、左寄りの\\\でハッチングされたバーは形質転換を生き延びた細胞の数を示し、右寄りの///でハッチングされたバーは実際に形質転換された細胞の数を示す。FTEPデバイスは、NEPAGENE(商標)エレクトロポレーターと比較して、様々な電圧でエレクトロコンピテント大腸菌細胞の同等の形質転換を示した。図から分かるように、形質転換生存率は少なくとも90%であり、いくつかの実施形態では少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%である。回復率(形質転換及び回復に成功した導入細胞の割合)は、特定の実施形態では、少なくとも0.001、好ましくは0.00001〜0.01である。図25Aでは、回復率は約0.0001である。
さらに、形質転換(取り込み)、切断、及び編集の効率に関してNEPAGENE(商標)ELEPO21とFTEPデバイスとの比較を行った。図22Bにおいて、トリプリケートの実験を実施した。ここで、///でハッチングされたバーは形質転換のために入力された細胞数を示し、\\\でハッチングされたバーは形質転換された(取り込みを行った)細胞数、細胞に形質転換されたベクターから転写及び翻訳されたヌクレアーゼによって細胞のゲノムが切断された細胞の数(切断)、及び編集が行われた細胞の数(細胞に形質転換されたベクターから転写及び翻訳されたヌクレアーゼを使用し、細胞に形質転換されたベクターから転写されたガイドRNA及びドナーDNA配列を使用した切断及び修復)を示す。ここでも、FTEPはNEPAGENE(商標)エレクトロポレーターと同等の形質転換、切断、編集効率を示したことが分かる。図22BにおけるFTEPの回復率は、0.001よりも大きい。
酵母におけるFTEPデバイスの形質転換を試験するために、S.セレビシエ細胞を、Bergkessel and Guthrie,Methods Enzymol.,529:311−20(2013)に概して記載されている方法を使用して生成した。簡単に説明すると、YFAP培地に3mlを接種して一晩成長させ、100mlの細胞を生産した。処理した培養物は100mlあたり約1mlのコンピテント細胞を生じた。細胞を、1.5+/−0.1のOD600に達するまで、振とうインキュベーターで30℃でインキュベートした。
室温で成長及び維持された細胞100mLごとに、100mMの酢酸リチウム、10mMのジチオトレイトール、及び50mLのバッファーを使用してコンディショニングバッファーを調製した。細胞を250mlボトルに4300rpmで3分間収集し、上清を除去した。細胞ペレットを100mlの冷1Mソルビトールに懸濁し、4300rpmで3分間回転させ、上清を再度除去した。細胞をコンディショニングバッファーに懸濁し、次いで懸濁液を適切なフラスコに移し、200RPM及び30℃で30分間振とうした。懸濁液を50mlコニカルバイアルに移し、4300rpmで3分間回転させた。上清を除去し、ペレットを冷1Mソルビトールに再懸濁した。これらのステップを3回繰り返し、合計3回の洗浄−スピン−デカントステップを行った。ペレットをソルビトールに懸濁して、最終ODを150+/−20にした。
FTEPデバイスを使用して比較エレクトロポレーション実験を実施し、エレクトロコンピテントS.セレビシエの形質転換の効率を決定した。流量はシリンジポンプ(Harvardの装置PHD ULTRA(商標)4400)で制御した。DNAを含む細胞の懸濁液を、1mLのガラス製シリンジ(Hamilton81320シリンジ、PTFEルアーロック)に装填し、ポンプに取り付けた。ファンクションジェネレータからの出力は、フローを開始した直後にオンにした。処理した細胞は、カルベニシリンを含む1Mソルビトールを含むチューブに直接流入した。NEPAGENE(商標)でエレクトロポレーションされたものと同じ体積が処理されるまで細胞を収集し、その時点でファンクションジェネレータからのフロー及び出力を停止した。30℃、250rpmのインキュベーターシェーカーで3時間回復させた後、細胞をプレート播種して、エレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込まなかったコロニー形成単位(CFU)及びエレクトロポレーションを生き延び、プラスミドを取り込んだCFUを決定した。プレートは30℃でインキュベートした。酵母コロニーは48〜76時間後にカウントされる。
フロースルー型エレクトロポレーション実験は、in vitro高電圧エレクトロポレーター(NEPAGENE(商標)ELEPO21)を使用して、2mmエレクトロポレーションキュベット(Bull dog Bio)に対してベンチマークされた。DNAを含む細胞懸濁液のストックチューブを準備し、NEPAGENE(商標)及びフロースルー型エレクトロポレーションを使用したサイドトゥサイド実験に使用した。結果を図23に示す。このデバイスは、NEPAGENE(商標)法と比較して、2.5kV電圧でエレクトロコンピテントS.セレビシエのより良好な形質転換及び生存を示した。入力は、処理された細胞の総数である。
実施例4:完全に自動化されたシングルプレックスRGNによる編集の実行
本開示の自動化マルチモジュール装置を使用して、MAD7ヌクレアーゼを使用したシングルプレックス自動ゲノム編集が正常に実行された。米国特許第9,982,279号;及び2018年6月30日に出願された米国特許出願第16/024,831号;2018年6月30日に出願された同第16/024,816号;2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年6月30日に出願された同第16/147,871号を参照されたい。
本開示の自動化マルチモジュール装置を使用して、MAD7ヌクレアーゼを使用したシングルプレックス自動ゲノム編集が正常に実行された。米国特許第9,982,279号;及び2018年6月30日に出願された米国特許出願第16/024,831号;2018年6月30日に出願された同第16/024,816号;2018年9月28日に出願された同第16/147,353号;2018年9月30日に出願された同第16/147,865号;及び2018年6月30日に出願された同第16/147,871号を参照されたい。
自動化機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内で、Gibson Assembly(商標)を介して、ampRプラスミド骨格及びlacZ_F172*編集カセットを「編集ベクター」にアセンブリした。lacZ_F172は、lacZ遺伝子を機能的にノックアウトする。「lacZ_F172*」は、lacZアミノ酸配列の172番目の残基で編集が生じることを示す。アセンブリに続いて、AMPureビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で生成物を脱塩し、80%エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。アセンブリされた編集ベクター及びリコンビニアリングに対応したエレクトロコンピテント大腸菌細胞を、エレクトロポレーションのため形質転換モジュールに移した。細胞と核酸を合わせて1分間混合し、エレクトロポレーションを30秒間行った。穿孔パルスのパラメータは次のとおりである:電圧、2400V;長さ、5ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、1;極性、+。トランスファーパルスのパラメータは次のとおりである:電圧、150V;長さ、50ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、20;極性、+/−。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール(別の成長モジュール)に移し、クロラムフェニコールを含むSOC培地で回復させた。1時間後にカルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに2時間回復させた。回復後、ユーザが回収するまで細胞を4℃で保持した。
自動化されたプロセス及び回復後、細胞のアリコートを、ラクトース(糖基質として)、クロラムフェニコール及びカルベニシリンを添加したMacConkey寒天ベースに播種し、コロニーが現れるまで成長させた。白いコロニーは機能的に編集された細胞を表し、紫色のコロニーは未編集の細胞を表した。すべての液体移送は、自動化マルチモジュール細胞処理機器の自動化された液体ハンドリングデバイスによって実行された。
自動処理の結果、合計約1.0E−03の細胞が形質転換され(従来のベンチトップの結果と同等)、編集効率は83.5%であった。白いコロニーのlacZ_172の編集は、細胞のゲノムの編集された領域の配列決定によって確認された。さらに、自動細胞処理のステップはウェブカメラによってリモートで観察され、自動処理手順の状況を更新するためにテキストメッセージが送信された。
実施例5:完全に自動化された再帰的編集の実行
自動化マルチモジュール細胞処理システムを使用して、再帰的な編集が成功した。自動化機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内で、Gibson Assembly(商標)を介して、ampRプラスミド骨格及びlacZ_V10*編集カセットを「編集ベクター」にアセンブリした。lacZ_F172編集と同様に、lacZ_V10編集はlacZ遺伝子を機能的にノックアウトする。「lacZ_V10」は、lacZアミノ酸配列の10位のアミノ酸で編集が生じることを示す。アセンブリに続いて、AMPureビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で生成物を脱塩し、80%エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。最初にアセンブリされた編集ベクター及びリコンビニアリングに対応したエレクトロコンピテント大腸菌細胞を、エレクトロポレーションのために、形質転換モジュールに移した。細胞と核酸を合わせて1分間混合し、エレクトロポレーションを30秒間行った。穿孔パルスのパラメータは次のとおりである:電圧、2400V;長さ、5ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、1;極性、+。トランスファーパルスのパラメータは次のとおりである:電圧、150V;長さ、50ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、20;極性、+/−。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール(別の成長モジュール)に移し、クロラムフェニコールを含むSOC培地で回復させた。1時間後にカルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに2時間成長させた。次に、細胞を遠心分離モジュールに移してから培地交換を行った。細胞をクロラムフェニコール及びカルベニシリンを含むTBに再懸濁し、細胞を2.7のOD600まで成長させ、その後濃縮し、エレクトロコンピテントにした。
自動化マルチモジュール細胞処理システムを使用して、再帰的な編集が成功した。自動化機器に含まれる等温核酸アセンブリモジュール内で、Gibson Assembly(商標)を介して、ampRプラスミド骨格及びlacZ_V10*編集カセットを「編集ベクター」にアセンブリした。lacZ_F172編集と同様に、lacZ_V10編集はlacZ遺伝子を機能的にノックアウトする。「lacZ_V10」は、lacZアミノ酸配列の10位のアミノ酸で編集が生じることを示す。アセンブリに続いて、AMPureビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で生成物を脱塩し、80%エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。最初にアセンブリされた編集ベクター及びリコンビニアリングに対応したエレクトロコンピテント大腸菌細胞を、エレクトロポレーションのために、形質転換モジュールに移した。細胞と核酸を合わせて1分間混合し、エレクトロポレーションを30秒間行った。穿孔パルスのパラメータは次のとおりである:電圧、2400V;長さ、5ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、1;極性、+。トランスファーパルスのパラメータは次のとおりである:電圧、150V;長さ、50ミリ秒;間隔、50ミリ秒;パルス数、20;極性、+/−。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール(別の成長モジュール)に移し、クロラムフェニコールを含むSOC培地で回復させた。1時間後にカルベニシリンを培地に加え、細胞をさらに2時間成長させた。次に、細胞を遠心分離モジュールに移してから培地交換を行った。細胞をクロラムフェニコール及びカルベニシリンを含むTBに再懸濁し、細胞を2.7のOD600まで成長させ、その後濃縮し、エレクトロコンピテントにした。
細胞成長中に、第2の編集ベクターを等温核酸アセンブリモジュール内で準備した。第2の編集ベクターはカナマイシン耐性遺伝子を含み、編集カセットはgalK Y145*編集を含んでいた。成功した場合、galK Y145*編集は細胞にガラクトースを取り込み代謝する能力を与える。galK Y154*カセットによって生成された編集により、154番目のアミノ酸残基に終止コドンが導入され、チロシンアミノ酸が終止コドンに変わる。この編集により、galK遺伝子産物は機能しなくなり、細胞がガラクトースを代謝することができなくなる。アセンブリに続いて、AMPureビーズを使用して等温核酸アセンブリモジュール内で第2の編集ベクター生成物を脱塩し、80%エタノールで洗浄し、緩衝液に溶出させた。アセンブリされた第2の編集ベクター及びエレクトロコンピテント大腸菌細胞(第1の編集ベクターで形質転換され、選択されたもの)を、上記と同じパラメータを使用したエレクトロポレーションのために、形質転換モジュールに移した。エレクトロポレーション後、細胞を回復モジュール(別の成長モジュール)に移し、カルベニシリンを含むSOC培地で回復させた。回復後、細胞を回収するまで4℃で保持した後、細胞のアリコートをクロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したLB寒天に播種した。lacZ及びgalKの両方の編集を定量化するために、レプリカパッチプレートを2つの培地タイプで生成した:1)ラクトース(糖基質として)、クロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したMacConkey寒天ベース、及び2)ガラクトース(糖基質として)、クロラムフェニコール、及びカナマイシンを添加したMacConkey寒天ベース。すべての液体移送は、自動化マルチモジュール細胞処理システムの自動化された液体ハンドリングデバイスによって実行された。
この再帰的な編集実験では、スクリーニングされたコロニーの41%がlacZ及びgalKの両方の編集を有し、その結果は「ベンチトップ」又は手動のアプローチを使用して得られた二重編集効率に匹敵した。
実施例6:推定TCR抗原の酵母ディスプレイライブラリーの設計及び作成
ヒトMHC対立遺伝子HLA−A*02によって提示されるペプチドの結合モチーフは十分に特徴付けられている(Falk、K.ら、Nature,1991.351(6324):p.290−296;Glanville,J.ら、Nature,2017.547(7661):p.94−98)及び同定されたいくつかの制限された臨床的に関連するTCR(Johnson,L.A.ら、Blood,2009.114(3):p.535−546)。潜在的なHLA−A*02:0l制限TCRをスクリーニングするための酵母ディスプレイライブラリーは、次のように作成される。異なる配列の合成pMHC(Glanville,J、上記)ペプチドをS.セレビシエのゲノムに導入するための約10,000のオリゴヌクレオチド編集カセットのライブラリーは、Agilent(カリフォルニア州サンタクララ)から設計及び注文されている。
ヒトMHC対立遺伝子HLA−A*02によって提示されるペプチドの結合モチーフは十分に特徴付けられている(Falk、K.ら、Nature,1991.351(6324):p.290−296;Glanville,J.ら、Nature,2017.547(7661):p.94−98)及び同定されたいくつかの制限された臨床的に関連するTCR(Johnson,L.A.ら、Blood,2009.114(3):p.535−546)。潜在的なHLA−A*02:0l制限TCRをスクリーニングするための酵母ディスプレイライブラリーは、次のように作成される。異なる配列の合成pMHC(Glanville,J、上記)ペプチドをS.セレビシエのゲノムに導入するための約10,000のオリゴヌクレオチド編集カセットのライブラリーは、Agilent(カリフォルニア州サンタクララ)から設計及び注文されている。
簡潔に述べると、各オリゴカセットの構造要素は次のとおりである:プロモーター領域、CRISPRガイドRNA領域、任意選択のスペーサー領域、相同性アーム、及び任意選択で、特定の編集の選択及び/又は確認に使用される機能的アッセイに基づくさらなる分析に役立つ他の配列(例えば、バーコード)。カセットの長さは、導入される編集とオリゴの全体的な設計に応じて、180ntから230ntの範囲である。相同性アームの設計には、カセットの定常領域を挿入するために使用される制限部位を生成するための同義のコドン変更(必要な場合)が含まれる。これらの定常領域は、HLA−A*02:01重鎖及びAGA2P細胞表面ディスプレイ付与タンパク質を含む。定常領域はまた、選択における下流での使用を容易にするためのエピトープタグを含み得る。
簡潔に述べると、各オリゴカセットの構造要素は次のとおりである:プロモーター領域、CRISPRガイドRNA領域、任意選択のスペーサー領域、相同性アーム、及び任意選択で、特定の編集の選択及び/又は確認に使用される機能的アッセイに基づくさらなる分析に役立つ他の配列(例えば、バーコード)。カセットの長さは、導入される編集とオリゴの全体的な設計に応じて、180ntから230ntの範囲である。相同性アームの設計には、カセットの定常領域を挿入するために使用される制限部位を生成するための同義のコドン変更(必要な場合)が含まれる。これらの定常領域は、HLA−A*02:01重鎖及びAGA2P細胞表面ディスプレイ付与タンパク質を含む。定常領域はまた、選択及びさらなる分析における下流での使用を容易にするためのエピトープタグ又はバーコード「ハンドル」を含み得る。それに加えて、又はそれに代えて、カセット設計は、配列の将来の追加のための「ランディングパッド」の追加を含み得る。CRISPRガイドRNA領域は、高効率の切断及び組込み部位を標的にすることもできる。
任意選択で、オリゴヌクレオチド編集カセットは、縮重PCR反応でさらに処理されて、元のTCR抗原配列の107〜108の順列を生成することができる。このような縮重PCRは、細胞のゲノムへの導入前又は導入後に実施することができる。縮重PCR反応は、pMHCコンストラクトに表示されたペプチドを表す意図された編集の部分に配置されたプライマーを使用して実施される(例えば、Boder,E.T.及びK.D.Wittrup,Nature Biotechnology,1997.15(6):p.553−557;McMahon,C.ら、Nature Structual&Molecular Biology,2018.25(3):p.289−296を参照)。
重要なことに、コンビナトリアル配列の多様性は、HLA−A対立遺伝子を表す重鎖コンストラクトに沿ってどこにでも、ならびにペプチド領域で作成できる。次に、個々の酵母は、一定のHLA分子につながれたランダムペプチドを発現する。HLA−A*02:0lは通常、8〜11アミノ酸長のペプチドを提示する(Hassan,C.ら、The Journal of Biological Chemistry,2015.290(5):p.2593−2603及びペプチド長ライブラリーはこれらの範囲内の長さのペプチドを使用して生成される。ライブラリーは、ライブラリーの組成と長さによって決定される理論上のヌクレオチド多様性を有するが、8〜11アミノ酸の範囲の数百万の特有のペプチドを表す1つ以上のライブラリーをもたらすように設計される。細胞をインキュベートして編集プロセスを経た後、編集された細胞のプールが存在し、AGA2Pタンパク質に付着した細胞の表面にpMHC複合体が提示される。pMHC複合体を提示する編集された細胞の任意選択の初期選択は、提示されたエピトープタグを介して実施できる。
実施例7;酵母ディスプレイライブラリーを使用したTCR抗原の適切な同定の検証
実施例1のライブラリー中の細胞の表面上のHLA−A*02:0l複合体が適切にフォールディングされてペプチドを提示するか否かを決定するために、検証研究を実施する。検証では、既知の特異性を持つTCRの標的抗原を提示する細胞の同定を使用する。簡潔に述べると、システムは、実施例1のように作製されたライブラリーを使用して設計され、抗原の適切な発現についてライブラリーを検証する。このシステムでは、pMHCコンジュゲートを提示する酵母細胞は、既知のTCRを有する単一のT細胞から増殖したT細胞の集団に曝露される。このシステムを使用すると、ユーザはTCRを既知の予測抗原ターゲットに正しく一致させることができる。選択は、既知の抗原配列を有するTCRを使用して実施される。選択に続いて、選択されたサンプルが、例えばライブラリーの細胞内の選択された抗原に関連付けられたバーコードの配列決定を使用して決定される。本開示のシステムを使用して同定された上位のペプチド抗原は、実際のエピトープとの配列の違いにもかかわらず、TCR形質導入されたT細胞を刺激することができる。
実施例1のライブラリー中の細胞の表面上のHLA−A*02:0l複合体が適切にフォールディングされてペプチドを提示するか否かを決定するために、検証研究を実施する。検証では、既知の特異性を持つTCRの標的抗原を提示する細胞の同定を使用する。簡潔に述べると、システムは、実施例1のように作製されたライブラリーを使用して設計され、抗原の適切な発現についてライブラリーを検証する。このシステムでは、pMHCコンジュゲートを提示する酵母細胞は、既知のTCRを有する単一のT細胞から増殖したT細胞の集団に曝露される。このシステムを使用すると、ユーザはTCRを既知の予測抗原ターゲットに正しく一致させることができる。選択は、既知の抗原配列を有するTCRを使用して実施される。選択に続いて、選択されたサンプルが、例えばライブラリーの細胞内の選択された抗原に関連付けられたバーコードの配列決定を使用して決定される。本開示のシステムを使用して同定された上位のペプチド抗原は、実際のエピトープとの配列の違いにもかかわらず、TCR形質導入されたT細胞を刺激することができる。
実施例8:酵母ディスプレイライブラリーを使用した新しいTCR抗原の同定
自動化されたシステムが新規の抗原標的を同定するために機能するか否かを試験するために、既知のTCR及び/又はオーファンTCRを使用して、本開示の方法を使用して抗原を同定する。次に、これらの同定された抗原をバイオインフォマティクス手法によって使用し、予想される又は潜在的なペプチド抗原の母集団を照会することができる。これらのバイオインフォマティクス手法は、代表的なTCRにも結合するであろう既知のタンパク質配列に由来する一般的なペプチドの決定を試みるものである。次に、これらの予測されるペプチド配列を、実施例1のライブラリーの1つに設計するか、又は他のアッセイで直接試験することができる。次に、予測されたペプチドpMHC分子を提示しているこれらのライブラリーを、1つ又は複数のオーファンTCRに曝露して、オーファンTCRに特異的に結合する抗原を見つけることができる。次に、これらのペプチドは、TCRの推定抗原標的として識別される。
自動化されたシステムが新規の抗原標的を同定するために機能するか否かを試験するために、既知のTCR及び/又はオーファンTCRを使用して、本開示の方法を使用して抗原を同定する。次に、これらの同定された抗原をバイオインフォマティクス手法によって使用し、予想される又は潜在的なペプチド抗原の母集団を照会することができる。これらのバイオインフォマティクス手法は、代表的なTCRにも結合するであろう既知のタンパク質配列に由来する一般的なペプチドの決定を試みるものである。次に、これらの予測されるペプチド配列を、実施例1のライブラリーの1つに設計するか、又は他のアッセイで直接試験することができる。次に、予測されたペプチドpMHC分子を提示しているこれらのライブラリーを、1つ又は複数のオーファンTCRに曝露して、オーファンTCRに特異的に結合する抗原を見つけることができる。次に、これらのペプチドは、TCRの推定抗原標的として識別される。
実施例9:ゲノム全体のタンパク質間相互作用の同定
タンパク質間相互作用は、従来、酵母ツーハイブリッド(Y2H)に基づくアプローチを用いてハイスループットで研究されてきた(Rolland,T.ら、Cell,2014.159(5):p.1212−1226;.Huttlin,E.L.ら、2017.545(7655):p.505−509)又は質量分析ベースのアッセイ(Hein,Marco Y.ら、Cell,2015.163(3):p.712−723。フローサイトメトリーも、酵母表面ディスプレイの適用を可能にするために頻繁に使用されており、タンパク質間相互作用及び酵素特性の研究を容易にするために拡張されている(Lim,S.ら、Biotechnology Journal,2017.12(5):p.10;Cherf,G.M.及びJ.R.Cochran,Methods in Molecular Biology(ニュージャージー州クリフトン)、2015.1319:p.155−175。
タンパク質間相互作用は、従来、酵母ツーハイブリッド(Y2H)に基づくアプローチを用いてハイスループットで研究されてきた(Rolland,T.ら、Cell,2014.159(5):p.1212−1226;.Huttlin,E.L.ら、2017.545(7655):p.505−509)又は質量分析ベースのアッセイ(Hein,Marco Y.ら、Cell,2015.163(3):p.712−723。フローサイトメトリーも、酵母表面ディスプレイの適用を可能にするために頻繁に使用されており、タンパク質間相互作用及び酵素特性の研究を容易にするために拡張されている(Lim,S.ら、Biotechnology Journal,2017.12(5):p.10;Cherf,G.M.及びJ.R.Cochran,Methods in Molecular Biology(ニュージャージー州クリフトン)、2015.1319:p.155−175。
CREATEディスプレイを使用して、1対すべて又はすべて対すべてのタンパク質間相互作用の迅速なスクリーニングを容易にすることができる。まず、Agilent(カリフォルニア州サンタクララ)から約6,000のオリゴヌクレオチド編集カセットのセットを注文することにより、ゲノムワイドCREATEディスプレイライブラリーが作製される。これらのオリゴヌクレオチド編集カセットは、crRNA、スペーサー領域、及び相同性アームを備えた上記実施例で説明したように構成されている。これらの特定のオリゴヌクレオチドカセットはまた、標準的なクローニング方法を介して表面ディスプレイ付与タグの追加を助けるための反復配列を含む場合、最適に配置された制限酵素部位を任意選択で含むことができる。多くの表面ディスプレイ付与タグが存在する。McMahon,C.ら、前出;Cherf,G.M.及びJ.R.Cochran,Methods in molecular biology(ニュージャージー州クリフトン)、2015.1319:p.155−175;Uchanski,T.ら、Scientific Reports,2019.9(1):p.382。これらは、提示された目的のタンパク質又はペプチドのN末端に通常融合される酵母AGA2P接合タンパク質を使用する元の方法を含み、拡張することができる(Boder,E.T.及びK.D.Wittrup、前出)。細胞機能に重要な必須タンパク質の提示を容易にするために、非最適切断部位を、表面ディスプレイ付与タグと目的のタンパク質との間に任意に設計することができる。多くの切断付与配列が存在するが、1つの例はタバコエッチウイルス(TEV)切断部位であり、これを変更して最適以下の切断を、したがって、天然タンパク質の生存可能な細胞内濃度を維持しながら、所望のタンパク質の同時表面ディスプレイをもたらすことができる(Ioannou,M.ら、Mammalian expression vectors for metabolic biotinylation tandem affinity tagging by co−expression in cis of a mammalian codon−optimized BirA biotin ligase.BMC research note,2018.11(1):p.390−390)。オリゴヌクレオチドカセットが設計され、注文され、その後、細胞の表面への提示を付与する標準的な部品を含むように変更されたら、CREATEプロセスを進めることができる。簡潔に述べると、前述のように、細胞の集団はオリゴヌクレオチドカセットで形質転換され、自動化された機械を使用してインキュベートされて、編集された細胞の集団をもたらす。この細胞集団は、個々の細胞が1つ又は複数の編集を含み、その結果、ゲノムの周囲の目的の設計位置に細胞表面ディスプレイ付与タグが挿入されるようになっている。酵母ゲノム内のすべてのタンパク質を提示するゲノムワイドライブラリーを作成するには、酵母ゲノム内の6,572個の注釈付きタンパク質すべてのN末端に表面ディスプレイ付与タグを挿入するために約6,572回の編集が行われる(https://www.yeastgenome.org/genomesnapshot)。これにより、6,572個の異なる細胞のライブラリーが作成され、それぞれがその表面に6,572個のタンパク質のうちの1つを提示する。次に、この細胞のライブラリーを2つの集団に分割し、集団の一方は緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するコンストラクトで形質転換され得る。次に、2つの集団を一緒にインキュベートし、フローサイトメーターに通して、陽性のタンパク質間相互作用を示すダブレット形成(Wersto,R.P.ら、Cytometry,2001.46(5):p.296−306)を検出することができる。次に、ダブレットを標準の96又は384ウェルプレートの個々のパーティションに配置し、DNA配列バーコードをダブレットの各細胞にあるカセットから読み取って、タンパク質間相互作用を決定する。特に、この手法は、6,572個のGFP発現表面提示タンパク質すべてが6,572個の非GFP発現表面提示タンパク質すべてとインキュベートされる、すべて×すべての態様で実行できる。しかし、特定の目的のタンパク質の分離物を上記のようにフローサイトメトリーを使用してインキュベート及びソートする、1対すべて又は多数対すべての構成で実行することもできる。この1対すべて又は多数対すべては、個々のタンパク質の二体相互作用パートナーの決定に追加の特異性又は明確性を提供し得る。この同じ手順は、ファージ又は酵母のディスプレイで従来行われているように(Bradbury,A.R.M.ら、Nature Biotechnology,2011.29:p.245)複数ラウンドのスクリーニングを通じて行うことができ、最高の親和性結合パートナーを選択的に富化し、偽陽性率を低下させることができることにも注意すべきである。また、細胞表面ディスプレイ付与タグを導入する前に、細胞集団に編集された病原性又は他の目的の変異体を含む以前に編集されたゲノムで使用することもできる。以前に編集されたゲノムには、タンパク質間相互作用を破壊するように特別に設計されたバリアントのセットも含まれている可能性がある。特に、CREATEディスプレイは、細胞全体の複数の遺伝子座に複数のタグを導入することにより、単一の細胞の表面に複数のタンパク質を表示するためにも使用できる。
実施例10:創薬可能な標的の特定
薬物の標的とその後の作用機序を特定することは、依然として困難な取り組みである。Schenone,M.ら、Nature Chemical Biology,2013.9:p.232;Stockwell,B.R.,Exploring biology with small organic molecules.Nature,2004.432(7019):p.846−854;Xie,L.,L.Xie及びP.E.Bourne,Structure−based systems biology for analyzing off−target binding.Current opinion in structural biology,2011.21(2):p.189−199。
薬物の標的とその後の作用機序を特定することは、依然として困難な取り組みである。Schenone,M.ら、Nature Chemical Biology,2013.9:p.232;Stockwell,B.R.,Exploring biology with small organic molecules.Nature,2004.432(7019):p.846−854;Xie,L.,L.Xie及びP.E.Bourne,Structure−based systems biology for analyzing off−target binding.Current opinion in structural biology,2011.21(2):p.189−199。
逆方向遺伝子スクリーニングは、計算による又は他の合理的な方法を使用して、疾患に関連する可能性のある標的のリストを事前に選択する傾向がある。次に、これらの疾患関連標的の1つ又は複数に対して化合物のライブラリーを使用して生化学的スクリーニングを実施する。しかし、生化学的アッセイはしばしば費用又は時間がかかり、その後、一般的に少数の潜在的な標的に限定される。17.Wyatt,P.G.ら、Target validation:linking target and chemical properties to desired product profile.Current topics in medicinal chemistry,2011.11(10):p.1275−1283。
生化学的スクリーニングにおける実行可能な標的の数が少ないと、潜在的なオフターゲットを特定できなくなることが多く、その結果、作用機序を決定する際に、副作用及び必要な「デコンボリューション」ステップの理解が困難になる可能性がある。Knight,Z.A.,H.Lin,K.M.Shokat,Nature reviews.Cancer,2010.10(2):p.130−137。
対照的に、順方向遺伝子スクリーニングは通常、目的の表現型から始まり、モデルシステムに対して多数の分子をスクリーニングして、表現型が破壊されるかどうかを確認する。Stockwell,B.R.,Exploring biology with small organic molecules.Nature,2004.432(7019):p.846−854。
しかし、これはしばしば、分子がどのタンパク質又は経路を標的にしているのか分からない結果となる可能性があり、さらなる研究又は患者に投与されたときに意図しない副作用を引き起こす可能性もある。Xie,L.ら、上記。
順方向及び逆方向の両方の遺伝子スクリーニングは、簡素な費用効果の高いアッセイですべての細胞内タンパク質への薬物の結合を均等に評価する能力の利益を大いに受け得る。順方向スクリーニングの場合は実際の標的を識別でき、逆方向スクリーニングの場合はオフターゲットを識別できる。ここで説明するCREATEディスプレイ方法を使用すると、細胞集団の表面にすべての可能な細胞タンパク質を提示するライブラリーを効率的に作製し、続いてその集団をフルオロフォア又は他の検出ハンドルが付着した小分子に曝露して、すべてのタンパク質−薬物結合イベントを決定できる。最初に、実施例5で説明したように、CREATEディスプレイライブラリーが作製される。このディスプレイライブラリーは、任意選択で、ゲノム内のすべてのタンパク質、又は経路に固有のタンパク質のサブセット、又は計算によって決定された目的のセットを提示できる。このディスプレイライブラリーは、先験的に同定され、CREATEの前のラウンドを介して細胞集団にプログラムされた1つ以上の病原性バリアントをすでに有する細胞集団で作成することもできる。次に、このライブラリーは、有機フルオロフォアが付着した目的の単一分子に曝露することができる。目的の小分子とCREATEディスプレイライブラリーをインキュベートすると、小分子がタンパク質に結合できる場合に、タンパク質を提示する細胞に結合した小分子の複合体が得られる。フローサイトメトリーを使用すると、リガンドが結合したタンパク質を提示する細胞を分類し、CREATEカセットのバーコードを使用して、所与の小分子が結合しているタンパク質を特定できる。これにより、小分子対タンパク質のバイナリマッピングが行われ、所与の小分子のすべての可能な結合パートナーを一意に識別できる。任意選択で、DNAにコードされた化学ライブラリー又は他のコンビナトリアルスクリーニングアプローチを使用して(Zimmermann,G.及びD.Neri,Drug discovery today,2016.21(11):p.1828−1834;Szymanski,P.,M.Markowicz及びE.Mikiciuk−Olasik,International journal of molecular science,2011.13(1):p.427−452)、表面提示タンパク質のCREATEディスプレイライブラリーに対して、化合物のライブラリーのすべて対すべてのスクリーニングを実行できる。
実施例11:目的の経路への生物学的バインダーの親和性成熟
従来の抗体医薬品開発は、抗体が容易にアクセスできる細胞表面又は他の細胞外標的に注目してきた。しかし、医薬品として承認されている約700のタンパク質分子標的のうち、半分以上が細胞内タンパク質である。例えば、Carter,P.J.及びG.A.Lazar,Nature Reviews Drug Discovery,2017.17:p.197;Santos,R.ら、Drug discovery,2017.16(1):p.19−34;Wang,X.ら、Genome biology and evolution,2013.5(7):p.1291−1297を参照されたい。
従来の抗体医薬品開発は、抗体が容易にアクセスできる細胞表面又は他の細胞外標的に注目してきた。しかし、医薬品として承認されている約700のタンパク質分子標的のうち、半分以上が細胞内タンパク質である。例えば、Carter,P.J.及びG.A.Lazar,Nature Reviews Drug Discovery,2017.17:p.197;Santos,R.ら、Drug discovery,2017.16(1):p.19−34;Wang,X.ら、Genome biology and evolution,2013.5(7):p.1291−1297を参照されたい。
抗体又は小さいペプチド治療用分子の送達システムを開発するための相当の努力が進行中である。Stewart,M.P.ら、Nature,2016.538:p.183。細胞内抗体又はペプチド送達の可能性が実現した場合、1つ又は複数の細胞内タンパク質に結合する抗体を体系的に親和性成熟させる方法は非常に価値がある。CREATEディスプレイを使用すると、細胞内タンパク質の大規模なライブラリーを細胞集団の表面に提示し、酵母又はファージディスプレイライブラリーに体系的に曝露して、標的のセットに対する単一、二重、又は多重特異的バインダーを選択できる。まず、酵母ディスプレイライブラリーは、ここで説明されている方法又は他の場所で説明されている方法(McMahon,C.ら、前出;Lim S.ら、前出;Cherf,G.M.及びJ.R.Cochran,前出)によって作成され、多くの組み合わせでコード化されたタンパク質は、表面ディスプレイのために酵母細胞の集団にコード化される。この点で、ワークフローは実施例5で説明したのと同じ方法で進行する。特に、表面に表示された組み合わせてコードされたペプチドを有する細胞のライブラリーはまた、緑色蛍光タンパク質の発現を与えるDNA配列で形質転換されるであろう。次に、最大10^10個の異なる提示抗体、ナノボディ、又はペプチドフラグメントを含むこの細胞ライブラリーを、すべての細胞内タンパク質のCREATEディスプレイライブラリーとインキュベートする。フローサイトメトリーを使用し、ダブレットを選択すると、操作されたペプチドと1つ又は複数の表面に表示された細胞タンパク質との間の任意のペアワイズ結合相互作用の決定が可能になる。この手順は、抗体の従来の親和性成熟が酵母ディスプレイを介して行われるのと同じ方法で繰り返し実行することもできる(Cherf,G.M.及びJ.R.Cochran、前出)。所与の経路又はゲノムタンパク質のサブセットを表す表面に提示された細胞タンパク質のライブラリーで繰り返し実行すると、タンパク質の経路全体に対する高親和性バインダーが特定される。このようにして、経路全体の作用機序を阻害又は同定するために、多重特異性バインダーを決定することができる。重要なことに、ゲノムワイドCREATEディスプレイライブラリーには、他のすべての細胞内タンパク質が溶液中に存在することによるオフターゲット効果のネガティブコントロールが組み込まれている。したがって、経路内のタンパク質のサブセットのみへのバインダーを選択する一方で、望ましくない細胞内タンパク質への結合を最小化させながら、同時に1つ又は複数の所望の細胞内タンパク質への強い結合間の最適なパレートを見つけることができる。したがって、CREATEディスプレイの連続ラウンドを通じて、特定の標的に結合するために抗体を親和性成熟させると同時に、他の細胞内タンパク質へのオフターゲット結合の最小化を選択することができる。
本発明は、本発明の実施形態に関連して詳細に説明されるように、多くの異なる形態の実施形態によって満たされるが、本開示は、本発明の原理の例示と見なされるべきであり、本発明を本明細書に例示及び記載されている特定の実施形態に限定する意図はない。本発明の趣旨から逸脱することなく、当業者によって多数の変形を行うことができる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物によって定められる。要約及びタイトルは、適切な当局及び一般の人々が本発明の一般的な性質を迅速に決定できるようにすることを目的としているため、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。特許請求の範囲では、「手段」という用語が使用されない限り、そこに記載されている特徴又は要素のいずれも、35U.S.C.§112,¶6に基づくミーンズプラスファンクションの制限として解釈されるべきではない。
Claims (20)
- 機械を用いて、操作されたペプチドを発現する細胞ライブラリーを作製する自動化された方法であって、
細胞の集団を提供すること;
導入された核酸及び核酸誘導型ヌクレアーゼを使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための機器を使用して細胞の集団を処理し、細胞の表面に提示されるように構成された操作されたペプチドをコードする核酸を含む細胞を作成すること;
処理された細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすることであって、編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供するものであること;及び
細胞に、操作されたペプチドを細胞表面上に発現及び提示させること
を含む方法。 - 操作されたペプチドが推定上のTCR結合抗原である、請求項1に記載の方法。
- 操作されたペプチドが、予測されるTCR結合領域を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 細胞の集団が酵母細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレアーゼがRNA誘導型ヌクレアーゼである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞表面に操作された推定T細胞受容体(TCR)抗原を発現する細胞ライブラリーを作製する自動化された方法であって、
細胞の集団を提供すること;
導入された核酸及びヌクレアーゼを使用する多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための機器を使用して細胞の集団を処理し、細胞の表面に提示されるように構成された操作されたペプチド抗原をコードする核酸を含む細胞を作成すること;
処理された細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にすることであって、編集は、細胞内に操作されたペプチド抗原をコードする核酸を提供するものであること;及び
細胞に、推定TCR抗原である操作されたペプチド抗原を、細胞表面上に発現及び提示させること
を含む方法。 - 細胞の集団が酵母細胞である、請求項6に記載の方法。
- 細胞の集団が哺乳動物細胞である、請求項6に記載の方法。
- 細胞が提示する操作されたペプチド抗原が、細胞上にリガンドの一部として提示される、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞は推定TCR抗原及びMHC分子を共発現する、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレアーゼが核酸誘導型ヌクレアーゼである、請求項6〜10のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレアーゼがRNA誘導型ヌクレアーゼである、請求項11に記載の方法。
- 操作されたペプチド抗原のうちの1つ以上は、1つ以上のオーファンTCRの推定抗原である、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 操作されたペプチド抗原のうちの1つ以上は、1つ以上のTCRの既知の抗原である、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上のT細胞受容体(TCR)に選択的に結合するペプチドを同定するための自動化及び多重化された方法であって、前記方法は
細胞の集団を提供すること;
多重化されたヌクレアーゼによるゲノム編集のための自動化されたシステムを使用して細胞の集団を処理することを含み、前記システムは、
操作されたペプチド抗原及びヌクレアーゼをコードする核酸を細胞の集団に導入するステップ;
細胞をインキュベートして細胞内の核酸編集を容易にするステップ;及び
編集された細胞に、操作されたペプチド抗原を編集された細胞の表面上に発現及び提示させるステップ;
1つ以上のTCRに対して操作されたペプチド抗原を提示する編集された細胞をスクリーニングするステップ;及び
1つ以上のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原を発現する編集された細胞を同定するステップを含む、方法。 - 細胞から、1つ以上のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原をコードする核酸を単離することをさらに含む、請求項15に記載の方法。
- ヌクレアーゼが核酸誘導型ヌクレアーゼである、請求項15又は16に記載の方法。
- ヌクレアーゼがRNA誘導型ヌクレアーゼである、請求項17に記載の方法。
- 目的のペプチド抗原をコードする細胞は、1つ以上のTCRに選択的に結合する操作されたペプチド抗原に関連するバーコード 同定及び/又は単離される、請求項15〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を用いて作製された細胞ライブラリー。
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