CN114854720A - 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法 - Google Patents

用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114854720A
CN114854720A CN202210174158.5A CN202210174158A CN114854720A CN 114854720 A CN114854720 A CN 114854720A CN 202210174158 A CN202210174158 A CN 202210174158A CN 114854720 A CN114854720 A CN 114854720A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
editing
nucleic acid
module
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210174158.5A
Other languages
English (en)
Inventor
菲利普·贝尔格莱德
唐·马斯魁勒
布鲁斯·查班斯基
豪尔赫·贝尔纳特
安德鲁·加斯特
理查德·福克斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inscripta Inc
Original Assignee
Inscripta Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US16/024,816 external-priority patent/US10253316B2/en
Application filed by Inscripta Inc filed Critical Inscripta Inc
Publication of CN114854720A publication Critical patent/CN114854720A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/08—Flat membrane modules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D63/00—Apparatus in general for separation processes using semi-permeable membranes
    • B01D63/08—Flat membrane modules
    • B01D63/082—Flat membrane modules comprising a stack of flat membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D69/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by their form, structure or properties; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D69/06—Flat membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/02—Inorganic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D71/00—Semi-permeable membranes for separation processes or apparatus characterised by the material; Manufacturing processes specially adapted therefor
    • B01D71/02—Inorganic material
    • B01D71/0213—Silicon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/44—Multiple separable units; Modules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/07—Means for pre-treatment of biological substances by electrical or electromagnetic forces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/04—Cell isolation or sorting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2201/00—Details relating to filtering apparatus
    • B01D2201/04—Supports for the filtering elements
    • B01D2201/0407—Perforated supports on both sides of the filtering element
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2313/00—Details relating to membrane modules or apparatus
    • B01D2313/50—Specific extra tanks
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2315/00—Details relating to the membrane module operation
    • B01D2315/10—Cross-flow filtration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor

Abstract

本申请涉及用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法。本公开内容提供了用于在核酸引导的核酸酶基因组编辑之后改善对经编辑的细胞的检测的仪器、模块和方法。本公开内容提供了改进的自动化仪器，该自动化仪器进行用于筛选已经经受编辑的细胞并鉴定经正确编辑的细胞的方法，包括高通量方法在内。

Description

用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法
本申请是申请日为2019年04月30日、申请号为201980057181.2、 发明名称为“用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法”的 申请的分案申请。
相关申请
此国际PCT申请要求2018年8月14日提交的第62/718,449号、2018 年9月24日提交的第62/735,365号、2018年12月18日提交的第62/781,112 号和2018年12月13日提交的第62/779,119号美国临时申请以及2019年 4月9日发布的第10,253,316号美国专利的优先权。
发明领域
本发明涉及用于筛选、选择活细胞中的基因组编辑并因此优化基因组 编辑的检测的改进的仪器、模块和方法。
发明背景
在下面的讨论中，出于背景和介绍目的，将会描述到某些文章和方法。 本文中包含的任何内容均不得解释为对现有技术的“承认”。本申请人明 确地保留在适当的情况下证明本文所引用的方法在适用法律条文下不构 成现有技术的权利。
对活细胞基因组进行精确、靶向性改变的能力一直是生物医学研究和 开发中的长期目标。最近，已鉴定出多种核酸酶，它们允许操纵基因序列， 从而操纵基因功能。核酸酶包括核酸引导的核酸酶，使研究人员能够在活 细胞中产生永久性编辑。当前采用核酸引导的核酸酶系统的方案通常利用 组成型表达的核酸酶组分来驱动高效编辑。然而，在汇集(pool)或多重化形 式中，编辑组分的组成型表达可导致经编辑的细胞类型的快速消耗和未经 编辑的细胞的选择性富集。在大多数细胞类型中都会发生这种情况，因为 只有一小部分(<1-5％)的细胞在引入双链DNA(dsDNA)断裂后存活，并因 此这些细胞与没有经历dsDNA断裂的未经编辑的细胞相比对所得群体中 的存活细胞计数贡献较少的数量。
因此，在核酸引导的核酸酶基因编辑领域中需要用于产生基因组编辑 以及用于鉴定和富集经编辑的细胞的改进的仪器、模块和方法。本发明满 足了这种需求。
发明概述
本概述被提供用于以简化的形式介绍一些概念，这些概念将在下面的 详细描述中进一步描述。本概述并不意图用于标识所要求保护的主题的关 键特征或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。根据下 面的详细描述，包括在附图中示出并且在所附权利要求中定义的那些方面， 所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优点将变得明显。
本公开内容提供了用于严密调控核酸引导的核酸酶编辑系统组分的 表达以允许转化过程和基因组编辑过程分开的仪器、模块和方法。组合物 和方法采用可诱导的引导RNA(gRNA)构建体，从而提高了观察到的转化 效率和对编辑过程的时机和持续时间的自动化友好控制。此外，该仪器、 模块和方法能够实现自动化的高通量和极其灵敏的筛选，以鉴定经编辑的 细胞。该仪器、模块和方法利用了单一化或基本上单一化的优势，其中术 语“单一化”在本文中是指将细胞分离并使细胞生长为克隆分离形式的过 程。术语“基本上单一化”是指将细胞群体中的细胞分成2个至100个或 2个至50个，且优选2个至10个细胞的“组”的过程。单一化，然后是 初始阶段的生长，诱导编辑以及生长归一化导致经编辑的细胞的富集。此 外，本文描述的仪器、模块和方法有助于“择优挑选(cherry picking)”经 编辑的细胞集落，从而允许直接选择经编辑的细胞。单一化或基本上单一 化有助于克服在竞争性生长方案下(诸如在大量液体培养(bulk liquid culture)中)发生的未经编辑的细胞的生长偏倚。实际上，已经确定，与常 规方法相比，经由单一化或基本上单一化、诱导和归一化来消除生长速率 偏倚，使观察到的编辑效率提高高达4X(例如，以群体规模绝对效率从10％ 到40％)，并且进一步的，使用本文所述方法挑选樱桃的集落使观察到的编 辑效率提高高达8X(例如，以群体规模绝对效率从10％到80％)。因此，与 没有采用单一化或基本上单一化、生长、诱导编辑以及归一化或择优挑选 的传统方法相比，单一化或基本上单一化、生长、诱导编辑以及归一化或 择优挑选的组合使观察到的编辑效率提高高达8X。
一种用于单一化或基本上单一化的特别灵活(facile)的模块或装置为实 体壁装置(solidwall device)，其中细胞基本上被分离、以集落形式生长、 诱导编辑并且采用归一化或择优挑选。本文详细描述了实体壁装置或模块 及它们的用途。在一些实施方案中的仪器、模块和方法允许对经编辑的和 未经编辑细胞集落进行归一化。归一化是指使细胞集落(无论是经编辑的还 是未经编辑的)生长到最终尺寸；也就是说，使细胞生长直到集落中的细胞 由于例如营养耗尽或进一步生长的空间受限而进入衰老(senescence)。细胞 集落的归一化使经编辑的细胞富集，因为经编辑的细胞与未经编辑的细胞 受到“平等计费(equal billing)”。此外，该仪器、模块和方法有助于对集落 进行“择优挑选”。择优挑选允许通过利用经编辑的集落中的编辑诱导的 生长延迟来直接选择经编辑的细胞。由于单一化或基本上单一化的结果， 使用本文所述的仪器、模块和方法的择优挑选集落可以使观察到的编辑效 率达到多于两倍。
该仪器、模块和方法的某些实施方案提供了在核酸引导的核酸酶编辑 过程中富集经编辑的细胞，其中该方法包括：用一种或更多种载体转化细 胞，所述载体包含驱动核酸酶表达的启动子、驱动引导核酸转录的启动子 和供体DNA序列，其中驱动核酸酶或引导核酸的转录的启动子中的一个 或两者为诱导型启动子；将转化的细胞稀释至足以使转化的细胞在基底上 基本上单一化的细胞浓度；在基底上使基本上单一化的细胞生长；通过诱导诱导型启动子来启动编辑；以及(1)使经诱导的细胞产生的细胞集落生长 到最终尺寸的集落(例如，使细胞集落归一化)，并收获归一化的细胞集落； 或2)监测基底上细胞集落的生长，然后选择生长缓慢的集落。
因此，在一些实施例中，提供了一种用于实体壁单一化或基本上单一 化、生长、诱导编辑以及归一化或择优挑选模块(“实体壁分离/诱导/归一 化模块”或“SWIIN”)的单一化组件，包括：包含上表面和下表面的截留 物构件，其中，该截留物构件包括至少一个截留物分配通道，该截留物分 配通道从截留物构件的上表面到截留物构件的下表面穿过该截留物构件 并且横贯该截留物构件的大部分长度；其中，截留物的下表面包括截留物 脊，在截留物脊之间为截留物流动导向器；其中，该截留物构件进一步包 括一个或更多个截留物构件端口，该截留物构件端口被配置为向截留物构 件供应细胞和流体以及从截留物构件去除细胞和流体；并且其中，该截留 物构件端口流体地连接至截留物分配通道和截留物流动导向器；具有上表 面和下表面的穿孔构件，其中，该穿孔构件的上表面位于截留物构件的下 表面的下方并与截留物构件的下表面相邻，并且其中，该穿孔构件包括至 少25,000个穿孔；具有上表面和下表面的过滤器，其中，该过滤器的上表 面位于穿孔构件的下表面下方并与穿孔构件的下表面相邻，并且其中，该 过滤器的下表面位于渗透物构件的上表面上方并与渗透物构件的上表面 相邻；环绕穿孔构件和过滤器的垫圈；以及渗透物构件，渗透物构件包括 上表面和下表面，其中，渗透物构件包括至少一个渗透物分配通道，该渗 透物分配通道从渗透物构件的下表面到该渗透物构件的上表面穿过该渗 透物构件并且横贯该渗透物构件的大部分长度；其中，渗透物构件的上表 面包括渗透物脊，在渗透物脊之间为渗透物流动导向器；其中，渗透物构 件进一步包括一个或更多个渗透物构件端口，该渗透物构件端口被配置为 向该渗透物构件供应流体并从该渗透物构件去除流体；并且其中，该渗透 物构件端口流体地连接至渗透物分配通道和渗透物流动导向器；以及用于 联接截留物构件、穿孔构件、过滤器、垫圈和渗透物构件的装置。
在单一化组件实施例的一些方面，用于联接截留物构件、穿孔构件、 过滤器、垫圈和渗透物构件的装置包括超声焊接，而在其他方面，该装置 包括压敏粘合剂，溶剂接合，配合配件、或粘合剂、焊接、溶剂结合和配 套配件的组合；以及其他此类紧固件和联接器。在单一化组件的一些方面， 穿孔构件包括至少50,000个；100,000个；150,000个；200,000个、250,000 个或更多的穿孔，且在一些方面，SWIIN为复合SWIIN，并且复合SWIIN 的每个部分都包含具有至少50,000个；100,000个；150,000个；200,000 个、250,000个穿孔的穿孔构件。在一些方面，截留物构件和渗透物构件 由聚碳酸酯、环烯烃共聚物或聚甲基丙烯酸甲酯制成；在一些方面，截留 物构件和渗透物构件的长度为75mm至350mm，宽度为50mm至250mm， 且厚度为2mm至15mm。在单一化组件的一些方面，截留物构件和渗透物 构件的长度为150mm至250mm，宽度为100mm至150mm，且厚度为4mm 至8mm。在单一化组件的一些方面，存在两个渗透物分配通道和/或两个 截留物分配通道，并且在一些方面，截留物分配通道和/或渗透物分配通道 的长度约为150mm，宽度约为1mm。在一些方面，截留物脊和/或渗透物脊的高度约为0.5mm，长度约为80mm，并且在一些方面，截留物和/或渗 透物的流动导向器的跨度约为5mm。在一些方面，单一化组件的体积为 15mL至100mL。
本公开内容的一些实施例提供了一种SWIIN模块，该SWIIN模块包 括单一化组件，并且进一步包括：包括至少两个储器的储器组件，其中， 第一储器1)流体地联接至至少一个储器端口，流入该储器端口的流体和/ 或细胞从SWIIN模块外部流入第一储器中；2)流体地联接至储器/通道端 口，流体和/或细胞从该储器/通道端口流入一个或更多个截留物构件端口 中；以及3)气动地联接至压力源；第二储器1)流体地联接至至少一个 储器端口，流入该储器端口的流体从SWIIN模块外部流入第二储器中；2) 流体地联接至储器/通道端口，流体从该储器/通道端口流入一个或更多个 渗透物构件端口中；以及3)气动地联接至压力源；以及SWIIN盖。在SWIIN 模块实施例的一些方面，SWIIN模块进一步包括两个另外的储器，其中第 一和第三储器1)流体地联接至至少两个储器端口，从SWIIN模块外部流 入该至少两个储器端口的流体和/或细胞流入第一和第三储器中；2)流体 地联接至储器/通道端口，流体和/或细胞从该储器/通道端口流入至少两个 截留物构件端口；以及3)气动地联接至压力源；以及第二和第四储器1) 流体地联接至至少两个储器端口，流入该储器端口的流体从SWIIN模块外 部流入第二和第四储器；2)流体地联接至储器/通道端口，流体从该储器/ 通道端口流入至少两个渗透物构件端口；以及3)气动地联接至压力源。
在SWIIN模块实施例的一些方面，SWIIN盖包括SWIIN盖的储器盖 部分，并且其中，储器盖部分包括1)至少两个储器进入孔口，其中，储 器进入孔口提供通向储器端口的通路，2)至少两个气动进入孔口，其中， 气动进入孔口提供通向至少两个储器的通路，并且为至少两个储器提供负 压和正压。在一些方面，SWIIN模块被配置为在诱导编辑后监测细胞集落 的生长，并且进一步包括用于择优挑选缓慢生长的细胞集落的装置。在 SWIIN模块的一些方面，编辑由作为温度诱导型启动子的诱导型启动子诱 导，并且通过珀耳帖装置向SWIIN模块提供诱导核酸酶和/或引导核酸转 录的温度。
本公开内容的其他实施例提供了一种自动化多模块细胞编辑仪器，包 括：SWIIN模块；以及被配置为容纳所有一些模块的壳体；被配置为接收 细胞的接受器；被配置为接收核酸的一个或更多个接受器；生长模块；被 配置为将核酸引入细胞中的转化模块；处理器，该处理器被配置为基于用 户输入和/或对预编程脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器。
在自动化多模块细胞编辑仪器的一些方面，转化模块包括流通式电穿 孔装置；并且在一些方面，自动化多模块细胞编辑仪器进一步包括细胞浓 缩模块。在一些方面，细胞浓缩模块为切向流过滤模块(angential flow filtration module)。在一些方面，液体处理系统在模块之间转移液体。并且 在一些方面，自动化多模块细胞处理系统进行以下过程：使细胞生长，浓 缩细胞并使细胞变成电感受态(electrocompetent)；用核酸引导的核酸酶编 辑成分转化细胞；将转化的细胞单一化；在单一化的细胞中诱导编辑；以 及使细胞生长并富集细胞，而无需人工干预。
在其他实施例中，提供了一种自动化多模块细胞编辑仪器，包括： SWIIN模块；被配置为容纳所有一些模块的壳体；被配置为接收细胞的接 受器；被配置为接收核酸的一个或更多个接受器；被配置为将核酸引入细 胞中的转化模块；处理器，该处理器被配置为基于用户输入和/或对预编程 脚本的选择来操作自动化多模块细胞编辑仪器。在自动化多模块细胞处理 仪器的一些方面，以及一种将试剂转移到模块之间以及SWIIN模块的液体 处理系统。在一些方面，独立的、集成的、自动化的多模块细胞处理系统 包括生长模块(该生长模块包括旋转生长瓶)、核酸组装模块、或试剂盒。 并且在一些方面，自动化多模块细胞处理系统进行以下过程：使细胞生长； 浓缩细胞并使细胞变成电感受态；用核酸引导的核酸酶编辑成分转化细胞； 将转化的细胞单一化；在单一化的细胞中诱导编辑；以及使细胞生长并富 集细胞，而无需人工干预。与其他实施例一样，自动化多模块细胞编辑仪 器的该实施例包括在模块之间转移液体的液体处理系统。
在又一种实施方案中，提供了一种用于在核酸引导的核酸酶编辑过程 中富集经编辑的细胞的方法，该方法包括：用一种或更多种载体转化细胞， 所述载体包含驱动核酸酶表达的诱导型启动子、驱动引导核酸转录的诱导 型启动子、以及DNA供体序列；将转化的细胞稀释至使转化的细胞在基 底上基本上单一化的细胞浓度；使细胞在基底上生长2-200倍；通过诱导 一个或更多个驱动引导核酸和核酸酶的转录的诱导型启动子来启动编辑；使经诱导的细胞生长成集落；并且从基底的基本上单一化的集落中选择经 诱导的细胞，其中，对经诱导的基本上单一化的集落富集经编辑的细胞。
在该方法实施方案的一些方面，驱动引导核酸转录的诱导型启动子为 pL启动子，并且驱动核酸酶表达的诱导型启动子为pL启动子。在一些方 面，所有的核酸酶、引导核酸和DNA供体序列都在同一载体上。在又其 他的方面，核酸酶在第一载体上，而引导核酸和DNA供体序列在第二载 体上，并且需要两个转化步骤。在一些方面，DNA供体序列还包含PAM改变序列(PAM-alteringsequence)，并且在一些方面，一个或更多个载体各 自还包含选择性标志物的基因。在一些方面，该方法还包括将选择剂添加 至基底的培养基以选择一种或更多种载体上的一个或更多个选择性标志 物。在一些方面，所选择的经诱导的基本上单一化的集落是小的集落，而 在其他方面，细胞生长成最终尺寸的集落。
在一种方法实施方案中还提供了一种用于在核酸引导的核酸酶编辑 期间富集经编辑的细胞的方法，该方法包括：用一种或更多种载体转化细 胞，所述载体包含驱动核酸酶表达的启动子、驱动引导核酸转录的诱导型 启动子、以及DNA供体序列；将转化的细胞稀释至使转化的细胞在第一 基底上基本上单一化的细胞浓度；使细胞生长以在第一基底上形成集落； 从第一基底的基本上单一化的集落中选择细胞，并将选择的细胞布置在第 二基底上；制备第二基底的复制物，形成第三基底；使第二基底上的细胞 生长并进行诱导；使第三基底上的细胞在不允许基因组修复的条件下生长 并进行诱导；比较第二基底和第三基底上的细胞生长；并且选择在第二基 底上生长但在第三基底上不生长的细胞。
在该方法实施方案的一些方面，驱动引导核酸转录的启动子为pL启 动子，并且在一些方面，驱动核酸酶表达的启动子为诱导型启动子。在一 些方面，驱动引导核酸和核酸酶中的每一种的表达的诱导型启动子为相同 的诱导型启动子，并且为pL启动子。在一些方面，DNA供体序列还包含 PAM改变序列，并且该方法还包括将选择剂添加到第一基底的培养基中以 选择一个或更多个载体。在一些方面，引导核酸是引导RNA，并且在一些 方面，细胞是细菌细胞，并且引擎载体(engine vector)还包含重组工程化系 统。
方法的又另一种实施方案提供了一种用于在核酸引导的核酸酶编辑 过程中富集经编辑的细胞的方法，该方法包括：用一种或更多种载体转化 细胞，所述载体包含驱动核酸酶表达的启动子、驱动引导核酸转录的诱导 型启动子、以及DNA供体序列；将转化的细胞稀释至使转化的细胞在基 底上基本上单一化的细胞浓度；使细胞在基底上生长2倍和200倍之间； 通过诱导诱导型启动子来启动编辑并使细胞生长以形成集落；并且从基底 的基本上单一化的集落中选择小的集落，其中，对经诱导的基本上单一化 的集落富集经编辑的细胞。
以及又一种另外的实施方案提供了一种用于在核酸引导的核酸酶编 辑过程中富集经编辑的细胞的方法，该方法包括：用一种或更多种载体转 化细胞，所述载体包含驱动核酸酶表达的启动子、驱动引导核酸转录的诱 导型启动子、以及DNA供体序列；将转化的细胞稀释至使转化的细胞在 第一基底上基本上单一化的细胞浓度；使细胞在第一基底上生长2倍和200 倍之间；通过诱导诱导型启动子来启动编辑；以及使细胞生长以形成最终 尺寸的集落。该实施方案的一些方面还包括汇集最终尺寸的集落，并且该 实施方案的一些方面还包括挑选最终尺寸的集落。
下面更详细地描述本发明的这些方面以及其他特征和优点。
附图说明
图1A为用于富集和选择经编辑的细胞的示例性方法的简化流程图。 图1B为光密度与时间的曲线图，示出了经编辑的细胞(虚线)和未经编 辑的细胞(实线)的生长曲线。图1C描绘了用于调控gRNA和/或核酸酶 转录的示例性诱导型表达系统。
图2A描绘了用于进行核酸引导的核酸酶基因组编辑的现有技术标准 方案。图2B-2F描绘了改进的方案，改进的方案采用单一化或基本上单一 化、诱导以及归一化或择优挑选(例如选择)来鉴定已经历核酸引导的核 酸酶基因组编辑的细胞群体中的经编辑的细胞。图2B描绘了用于编辑过 程的功能性解析(deconvolution)的方案，该方案通过在包含不同培养基的 96孔板中布置细胞或通过在包含不同培养基的培养皿上布置细胞来进行。图2C描绘了用于从培养皿中挑选集落、将集落布置在96孔板上然后进行 功能性解析的方案。图2E描绘了用于择优挑选的方案，且图2F描绘了用 于确认择优挑选对于选择经编辑的细胞的极其有效的方案。
图3A描绘了用于在实体壁装置中单一化、编辑和归一化细胞的工作 流程的简化图。图3B描绘了用于在实体壁装置中基本上单一化、编辑和 归一化细胞的工作流程的变型的简化图形。图3C为实体壁装置的一种实 施方案的照片。图3D-3F为在低、中和高倍率下具有可渗透底部的实体壁 装置中的微孔中被很大程度上单一化(经由基本上泊松分布)并生长成集 落的照片。
图4A-4E为穿孔构件和其中的微孔的照片。图4F-4R描绘了单一化组 件的三种示例性实施方案的部件，这些部件包括截留物构件和渗透物构件 以及穿孔构件/过滤器/垫圈组件。图4S–4Z描绘了组装后的单一化、生长、 诱导编辑和归一化或择优挑选的模块(例如“实体壁分离/诱导/归一化模 块”或“SWIIN”)。图4AA和4BB描绘了包括两个单一化组件(图4AA) 或四个单一化组件(图4BB)的复合SWIIN模块。图4CC为关于图4A-4Z 描述的SWIIN模块的示例性气动架构图。图4DD为双层SWIIN的示例性 气动架构图。
图5A-5D描绘了独立的、集成的、自动化的多模块仪器及其部件，包 括单一化模块，利用该单一化模块可以生成和鉴定经编辑的细胞。
图6A描绘了与本文所述的细胞生长模块一起使用的旋转生长瓶的一 种实施方案。图6B示出了处于细胞生长模块壳体中的旋转生长装置的一 种实施方案的透视图。图6C描绘了图6B的细胞生长模块的剖视图。图 6D示出了联接至LED、检测器和温度调控部件的图6B的细胞生长模块。
图7A为在本文提出的TFF模块中使用的切向流过滤过程的模型(现 有技术)。图7B描绘了示例性TFF装置/模块的一种实施方案的下部构件 的俯视图。图7C描绘了示例性TFF模块的上部构件和下部构件以及膜的 自顶向下视图。图7D描绘了示例性TFF模块的上部构件和下部构件以及 膜的自底向上视图。图7E-7H描绘了TFF模块的实施方案的各种视图，该TFF模块具有用于截留物、滤液和更换缓冲剂的流体联接的储器。
图8A和图8B分别为流通式电穿孔装置的顶部透视图和底部透视图 (这里，有六个这样共连接装置)。图8C为示例性流通式电穿孔装置的一 种实施方案的俯视图。图8D描绘了图8C的电穿孔装置的横截面的俯视图。 图8E为图8C和8D的电穿孔装置的下部部分的侧视横截面图。
图9为示例性自动化多模块细胞处理仪器的一种实施方案的简化框图， 该仪器包括单一化或基本上单一化/生长/编辑和归一化或择优挑选模块 (“实体壁分离/诱导/归一化模块”或“SWIIN”)。
图10为示例性自动化多模块细胞处理仪器的一种替代实施方案的简 化框图，该仪器包括单一化或基本上单一化/生长/编辑和归一化或择优挑 选模块(“实体壁分离/诱导/归一化模块”或“SWIIN”)。
图11A为可以在本文所述的方法中使用的示例性引擎载体的图；并且 图11B为可以在本文所述的方法中使用的示例性编辑载体(具有编辑盒)的 图。
图12是示出观察到的多种启动子下的galK gRNA靶向盒的转化效率 的柱状图。
图13为细胞生长与时间的图，展示了编辑的热诱导不影响细胞生长 或存活力。
图14描绘了展示对于三种示例性核酸酶，受阻遏的gRNA盒产生了 高细胞存活力/转化效率的结果。
图15示出了显示未诱导和经诱导的细胞群体在6小时的OD的热图和 生长曲线。
图16示出了在各种条件下大肠杆菌(E.coli)细胞的细胞菌落归一化的 结果。
图17A为具有琼脂上的可渗透底部的实体壁装置的照片，在所述琼脂 上的可渗透底部上，酵母细胞已基本上单一化并生长成克隆菌落。图17B 呈现了在不同时间点的酵母菌落生长的照片。
图18示出了实验结果。
详细描述
除了在明确说明的情况下或者在特征或功能与附加实施例不兼容的 情况下以外，结合一个实施例描述的所有功能旨在适用于本文描述的附加 实施例。例如，在结合一种实施方案明确地描述了给定的特征或功能而结 合替代实施方案没有明确提及该给定的特征或功能的情况下，应当理解， 可以结合替代实施方案来部署、利用或实现该特征或功能，除非该特征或 功能与替代实施方案不兼容。
除非另有说明，否则本文所述的技术的实践可以采用常规技术和有机 化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化 学和测序技术的描述，这些技术应是从事本领域的技术人员所能掌握的技 术。这样的常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接以及使 用标记物检测杂交。参考本文的实施例可得到关于适合的技术的具体说明。 然而，当然也可以使用其他等效的常规程序。此类常规技术和描述可在标 准实验室手册中找到，诸如Green等人编辑，Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(I-IV卷)(1999)；Weiner、Gabriel、Stephens编辑，Genetic Variation:A LaboratoryManual(2007)；Dieffenbach、Dveksler编辑，PCR Primer:A Laboratory Manual(2003)；Bowtell和Sambrook，DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual(2003)；Mount，Bioinformatics:Sequence and Genome Analysis(2004)；Sambrook和Russell，CondensedProtocols from Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2006)；Stryer、Biochemistry(第 四版)W.H.Freeman,New York N.Y.(1995)；Gait，“OligonucleotideSynthesis: A Practical Approach”(1984)，IRL Press,London；Nelson和Cox,Lehninger， Principles of Biochemistry第三版,W.H.Freeman Pub.，New York,N.Y.(2000)；Berg等人，Biochemistry,第五版，W.H.Freeman Pub.,New York, N.Y.(2002)；Doyle&Griffiths编辑,Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures inBiotechnology,Doyle&Griffiths,eds.,John Wiley&Sons (1998)；G.Hadlaczky编辑，Mammalian Chromosome Engineering–Methods and Protocols,Humana Press(2011)；以及Lanza和Klimanskaya编辑， Essential Stem Cell Methods,Academic Press(2011)，出于所有目的，以上标 准实验室手册的全部内容通过引用并入本文。CRISPR特异性技术可以在 例如Appasani和Church，Genome Editing and Engineering From TALENs andCRISPRs to Molecular Surgery(2018)以及Lindgren和Charpentier，CRISPR: Methodsand Protocols(2015)中找到；出于所有目的，以上两个文献的全部 内容通过引用并入本文。
需指出，如本文和所附权利要求中所使用的，单一形式“一个(a)”、 “一(an)”和“该(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。 因此，例如，对“一细胞”的引用是指一个或更多个细胞，并且对“该系统” 的引用包括对本领域技术人员已知的等效的步骤、方法和装置的引用，等 等。另外，应理解，本文中可以使用的诸如“左”、“右”、“顶部”、“底部”、 “前”、“后”、“侧”、“高度”、“长度”、“宽度”、“上部”、“下部”、“内部”、 “外部”、“内”和/或“外”的术语仅描述参考点，而不必将本公开内容的 实施例限制为任何特定的定向或配置。此外，本文所公开的诸如“第一”、 “第二”、“第三”等术语仅表示多个部分、部件、步骤、操作、功能和/ 或参考点中的一个，并且同样地并非必须将本公开内容的实施例限制为任何特定的配置或定向。
另外，术语“约”、“接近”、“次于(minor)”和类似术语通常是指在 某些实施例中在20％、10％或优选5％的限度内的范围(包括所表示的值 在内)及其之间的任何值。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发 明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。为了描述和公开 可与当前描述的发明结合使用的装置、方法和细胞群体，本文提及的所有 出版物均通过引用并入本文。
在提供值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限值和下限值之间 的每个中间值以及该陈述范围内的任何其他陈述值或中间值都包括在本 发明内。这些较小范围的上限值和下限值可以独立地包括在较小的范围内， 并且也包含在本发明内，但要受所陈述范围内的任何明确排除的限制。在 所陈述的范围包括极限值中的一个或两个的情况下，这两个所包括的极限 值都不包括的范围也包括在本发明内。
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明的更透彻的理解。 然而，对于本领域普通技术人员明显的是，可以在没有这些具体细节中的 一者或更多者的情况下实施本发明。在其他情况下，没有对本领域技术人 员众所周知的特征和过程进行描述，以避免模糊本发明。
如本文所用，术语“互补”是指核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对， 并且具体地是指彼此氢键键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶残基或尿嘧啶残基 通过两个氢键与腺嘌呤残基连接，并且胞嘧啶残基和鸟嘌呤残基通过三个 氢键连接。通常，核酸包括被描述为与指定的第二核苷酸序列具有“互补 性百分比”或“同源性百分比”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与 指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％的互补性，表明序列的10 个核苷酸中的8个核苷酸、序列的10个核苷酸中的9个核苷酸、序列的 10个核苷酸中的10个核苷酸与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷 酸序列3′-TCGA-5′与核苷酸序列5′-AGCT-3′100％互补；核苷酸序列3′-TCGA-5′与核苷酸序列5′-TTAGCTGG-3′的一个区域100％互补。
术语DNA“控制序列”统称为启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终 止序列、上游调控域、复制起点、内部核糖体进入位点、核定位序列、增 强子等，它们共同为接受细胞中的编码序列提供复制、转录和翻译。这些 类型的控制序列不需要全都存在，条件是选择的编码序列能够在适当的宿 主细胞中复制、转录和(对于一些组分而言)能够翻译。
如本文所用，术语“供体DNA”或“供体核酸”是指这样的核酸，该 核酸被设计为使用核酸引导的核酸酶通过同源重组将DNA序列修饰(插入、 缺失、取代)引入基因座中。对于同源性引导的修复，供体DNA必须与基 因组靶序列中位于“切割位点”或待编辑位点的侧翼的区域具有足够的同 源性。同源臂的长度将取决于例如所进行的修饰的类型和尺寸。例如，供 体DNA将与基因组靶基因座具有至少一个序列同源性区域(例如，一个同 源臂)。在许多情况下并且优选地，供体DNA将与基因组靶基因座具有两 个序列同源性区域(例如，两个同源臂)。优选地，“插入”区域或“DNA 序列修饰”区域(人们期望引入细胞中基因组靶基因座的核酸修饰)将位于 两个同源性区域之间。DNA序列修饰可以在靶基因组DNA序列的一个特 定位点或多于一个特定位点处改变一个或更多个碱基。改变可以包括改变 靶序列的1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30 个、35个、40个、50个、75个、100个、150个、200个、300个、400 个或500个或更多个碱基对。缺失或插入可以是对靶序列的1个、2个、3 个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50 个、75个、100个、150个、200个、300个、400个或500个或更多个碱 基对的缺失或插入。供体DNA任选地还包含对靶序列的改变，例如PAM 突变，PAM突变防止发生编辑后核酸酶在靶序列中的PAM或间隔序列处 的结合。
如本文所用，“富集”是指通过细胞的单一化或基本上单一化、细胞 初始生长成细胞集落、诱导编辑以及使细胞集落生长成最终尺寸的集落(例 如，集落生长的饱和或归一化)来富集经编辑的细胞。如本文所用，“择优 挑选”或“选择经编辑的细胞”是指以下过程：使用单一化或基本上单一 化的组合，使细胞初始生长为集落，诱导编辑，然后基于编辑诱导的生长 延迟，使用细胞生长(通过集落尺寸、代谢物或废产物的浓度或与细胞生长 速率相关的其他特征来测量)来选择经编辑的细胞。
术语“引导核酸”或“引导RNA”或“gRNA”是指包含以下的多核 苷酸：1)能够与基因组靶基因座杂交的引导序列，和2)能够与核酸引导的 核酸酶相互作用或复合的支架序列。
“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间的序列相似性， 或更通常地，在本公开内容的上下文中，是指两个核酸分子之间的序列相 似性。术语“同源区域”或“同源臂”是指供体DNA上与靶基因组DNA 序列具有一定程度的同源性的区域。同源性可以通过比较每个序列中的位 置来确定，所述序列可以为了比较的目的而进行比对。当比较的序列中的 一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，则分子在该位置是同源的。序列 之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源的位置数目的函数。
“可操作地连接”是指元件的所描述的部件被配置为执行其通常的功 能的布置。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够实现编码序列 的转录，并且在一些情况下，实现翻译。控制序列不必与编码序列邻接， 条件是它们起作用以引导编码序列的表达。因此，例如，在启动子序列和 编码序列之间可以存在中间的非翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认 为该启动子序列与编码序列“可操作地连接”。实际上，这样的序列不必位于在同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍然可以具有相互作用，从而 导致调控改变。
“启动子”或“启动子序列”为DNA调控区，其能够结合RNA聚合 酶并启动由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的多核苷酸或多 肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、小核或核仁RNA、引导RNA 或任何种类RNA)的转录。启动子可以为组成型的或诱导型的。在本文描 述的方法中，驱动gRNA转录的启动子是诱导型的。
如本文所用，术语“选择性标志物”是指引入细胞中的这样的基因， 该基因赋予适于人工选择的性状。通常使用的选择性标志物是本领域普通 技术人员熟知的。可以使用药物选择性标志物，诸如氨苄青霉素/羧苄青霉 素，卡那霉素，氯霉素，红霉素，四环素，庆大霉素，博来霉素，链霉素， 嘌呤霉素，潮霉素，杀稻瘟素和G418。在其他实施方案中，选择性标志物 包括但不限于人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第 6,365,373号中描述的)、截短的人类生长因子受体(用MAb检测)、突变型 人类二氢叶酸还原酶(DHFR；可用的荧光MTX底物)、分泌型碱性磷酸酶 (SEAP；可用的荧光底物)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿 苷的抗性)、人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择 性烷基化剂白消安缀合；CD34+细胞中的化疗保护性选择性标志物)、造血 干细胞中的CD24细胞表面抗原、鼠李糖、赋予对N-膦酰基乙酰基 (phosphonacetyl)-L-天冬氨酸(PALA)的抗性的人类CAD基因、人类多药耐 药性蛋白1(human multi-drugresistance-1，MDR-1；可通过增加耐药性来 选择或通过FACS富集的P糖蛋白表面蛋白质)、人类CD25(IL-2α；可通 过MAb-FITC检测)、甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；可通过卡莫 司汀选择)以及胞苷脱氨酶(CD；可通过Ara-C选择)。如本文所用的“选择 性培养基”是指已经向其中添加了选择选择性标志物或针对选择性标志物 进行选择的化合物或生物部分的细胞生长培养基。
如本文所用，术语“单一化(singulation)”或“单一化(singulate)”意指 分离个体细胞，使得每个细胞(以及由每个细胞形成的集落)将与其他细胞 分开；例如，单个微孔中的单个细胞，或100个各自在其自己的微孔中的 单个细胞。在一种实施方案中，“单一化”或“单一化的细胞”是由阵列 细胞的泊松分布产生的。术语“基本上单一化的”、“很大程度上单一化的” 和“基本上单一化”意指细胞在很大程度上彼此分开成小组或批。也就是 说，其中2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、 12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、 22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或多达 50个(但优选是10个或更少的细胞)被递送至微孔中。在一种实施方案中， “基本上单一化”或“很大程度上单一化”是由阵列细胞的“基本上泊松 分布”产生的。对于更复杂的编辑文库，或可能包含致死编辑或具有极大 改变适应性效应的文库，优选经由泊松分布对细胞进行单一化。
术语“靶基因组DNA序列”、“靶序列”或“基因组靶基因座”是指 体外或体内或细胞或细胞群体的核酸(例如基因组)中的任何基因座，其中 期望使用核酸引导的核酸酶编辑系统改变至少一个核苷酸。靶序列可以是 基因组基因座或染色体外基因座。
“载体”是包含期望的待递送至细胞和/或在细胞中表达的一个或更多 个序列的多种核酸中的任一种。载体通常由DNA组成，尽管RNA载体也 是可用的。载体包括但不限于质粒、F黏粒(fosmid)、噬粒(phagemid)、病 毒基因组、YAC、BAC、哺乳动物合成染色体等。如本文所用，短语“引 擎载体”包含待用于本公开内容的核酸引导的核酸酶系统和方法的核酸酶 的编码序列(任选地在诱导型启动子的控制下)。在细菌系统中，引擎载体 还可以包含λ红色重组工程化系统或其等同物，以及选择性标志物。如本 文所用，短语“编辑载体”包含供体核酸和在诱导型启动子的控制下的 gRNA的编码序列，所述供体核酸包含对靶序列的改变，该改变防止发生 编辑后核酸酶在靶序列中的PAM或间隔序列处的结合。编辑载体还可以 包含选择性标志物和/或条形码。在一些实施方案中，引擎载体和编辑载体 可以被组合；也就是说，引擎载体的内含物可以存在于编辑载体上。
通常的核酸引导的核酸酶基因组系统的诱导型编辑
本公开内容提供了用于核酸引导的核酸酶基因组编辑的仪器、模块和 方法，其提供了1)增强的观察到的核酸引导的核酸酶编辑方法的编辑效率， 和2)对基因组已被正确编辑的细胞的筛选和检测(包括高通量筛选技术)的 改进。在当前使用核酸酶系统的方案中，组成型表达的核酸酶组分通常用 于驱动高效编辑。然而，在汇集或多重化形式中，编辑组分的组成型表达 可以导致由于缺少在编辑过程中发生的双链DNA断裂而未经编辑的细胞 的选择性富集。此外，组成型表达的核酸引导的核酸酶组分(例如，核酸酶 和引导核酸)使新鲜转化的生理上脆弱的细胞立即暴露于编辑，从而损害了 存活力。本文提供了这样的工具，该工具用于严格调控核酸引导的核酸酶 编辑系统组分的表达，包括严格调控引导核酸以及任选地和优选地核酸酶 (或核酸酶，以及任选地和优选地，引导核酸)的转录，从而允许将转化过 程和编辑过程分开。另外，本文所述的方法利用了单一化(分离细胞并使它们生长成克隆集落)和细胞集落归一化或缓慢生长集落的择优挑选的优势。 单一化或基本上单一化、初始生长、随后诱导编辑和归一化克服了未经编 辑细胞的生长偏倚，并且代替归一化的择优挑选允许直接选择经编辑的细 胞。所述仪器、模块和方法可以应用于所有细胞类型，包括古细菌细胞、 原核细胞和真核(例如酵母，真菌，植物和动物)细胞。
本文所述的仪器、模块和方法采用编辑盒，该编辑盒包含与供体DNA 序列共价连接的引导RNA(gRNA)序列，其中所述gRNA在诱导型启动子 的控制下(例如，编辑盒是CREATE盒；参见2019年5月29日发布的USPN 9/982,278和2019年3月26日发布的USPN 10/240,167；2019年4月23 日发布的USPN 10/266,849；和2018年4月9日提交的美国公布第 15/948,785号；2019年2月14日提交的美国公布第16/275,439号；以及 2019年2月14日提交的美国公布第16/275,465号，其全部内容通过引用 以其整体并入)。编辑盒提供提高的转化效率和对编辑过程的时机和持续时 间的控制。所公开的方法允许细胞被转化、基本上单一化、生长若干倍、 然后在细胞中诱导编辑。过程的组合有效地消除了未经编辑的细胞在细胞 群体中占优势的效应。基本上单一化的细胞、然后允许初始生长、随后诱 导gRNA(和/或核酸酶)转录、以及细胞集落的归一化或择优挑选细胞的组 合使得在鉴定经编辑的细胞方面比现有技术方法增加2-250x、10-225x、 25-200x、40-175x、50-150x、60-100x或50-100x，并且允许产生包含布置 或汇集的具有经编辑的基因组的经编辑的细胞的细胞文库。另外，可以利用这些方法来创建迭代编辑系统，以产生在每个细胞基因组中具有两个至 许多个编辑的组合细胞文库。用于使细胞“脉冲式”暴露于活性编辑组分 的诱导型gRNA构建体(和/或诱导型核酸酶构建体)和方法1)允许对细胞进 行布置(例如，很大程度上单一化)，然后启动编辑程序，2)降低脱靶活性， 3)允许鉴定稀有细胞编辑，并且4)富集经编辑的细胞，或允许高通量筛选 应用，以使用细胞生长(通过例如测量光学密度、集落尺寸或代谢副产物或 其他特征)作为编辑的指标来鉴定编辑活性，从而富集经编辑的细胞群体。
本文所述的仪器、组合物和方法改进了CRISPR编辑系统，CRISPR 编辑系统中核酸引导的核酸酶(例如RNA引导的核酸酶)用于编辑生物体 的基因组中的特定靶区域。在细胞中与合适的合成的引导核酸复合的核酸 引导的核酸酶可以在期望的位置处切割细胞的基因组。引导核酸帮助核酸 引导的核酸酶识别并切割特定靶序列处的DNA。通过操纵引导核酸的核苷 酸序列，可以对核酸引导的核酸酶进行编程以靶向任何DNA序列以进行 裂解，条件是附近有合适的前间区序列邻近基序(PAM)即可。在某些方面， 核酸引导的核酸酶编辑系统可以使用两个单独的引导核酸分子，这两个单 独的引导核酸分子组合来发挥引导核酸的功能，例如，CRISPRRNA(crRNA)和反式活化CRISPR RNA(tracrRNA)。在其他方面，引导核酸可以 是包含crRNA序列和tracrRNA序列两者的单个引导核酸，或者是不需要tracrRNA的单个引导核酸。在本文所述的组合物和方法中，如果将两个单 独的RNA分子组合来发挥引导核酸的功能，则至少一种引导核酸组分在 诱导型启动子的控制下。如果采用单个引导核酸，则单个引导核酸在诱导 型启动子的控制下。
通常，引导核酸(例如gRNA)与相容的核酸引导的核酸酶复合，并且 然后可以与靶序列杂交，从而将核酸酶引导至靶序列。引导核酸可以是 DNA或RNA；可选地，引导核酸可以包含DNA和RNA两者。在一些实 施方案中，引导核酸可以包含修饰的或非天然存在的核苷酸。在引导核酸 包含RNA的情况下，gRNA由多核苷酸分子(诸如质粒、线性构建体)上的 DNA序列或位于编辑盒中的DNA序列编码，并且优选地在诱导型启动子 的控制下。
引导核酸包含引导序列，其中引导序列是这样的多核苷酸序列，该多 核苷酸序列与靶序列具有足够互补性以与靶序列杂交，并且引导复合的核 酸引导的核酸酶与靶序列的序列特异性结合。当使用合适的比对算法进行 最佳比对时，引导序列与对应靶序列之间的互补性程度为约或大于约50％、 60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更大。可以使用任何 合适的用于比对序列的算法来确定最佳比对。在一些实施方案中，引导序 列(引导核酸与靶序列杂交的部分)的长度为约或大于约10个、11个、12 个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22 个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40 个、45个、50个、75个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列 的长度小于约75个、50个、45个、40个、35个、30个、25个、20个核 苷酸。优选地，引导序列的长度为10-30个或15-20个核苷酸，或长度为 15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
在本发明的方法和组合物中，引导核酸被提供为从质粒或载体表达的 序列，并且作为单个转录物包含在诱导型启动子的控制下的引导序列和支 架序列两者。可选地，引导核酸可以从两个单独的序列转录，其中至少一 个序列在诱导型启动子的控制下。可以通过改变引导序列将引导核酸工程 化以靶向期望的靶DNA序列，使得引导序列与靶DNA序列互补，从而允 许引导序列和靶DNA序列之间杂交。通常，为了在靶DNA序列中产生编 辑，gRNA/核酸酶复合物结合到由引导RNA确定的靶序列，并且核酸酶 识别与靶序列相邻的前间区序列邻近基序(PAM)序列。靶序列可以是原核 细胞或真核细胞内源或外源或在体外的任何多核苷酸(DNA或RNA)。例如， 靶序列可以是位于在真核细胞的核中的多核苷酸。靶序列可以是编码基因 产物(例如蛋白质)的序列和/或非编码序列(例如调控性多核苷酸，内含子，PAM或“无用(junk)”DNA)。
引导核酸可以是编码供体核酸的编辑盒的一部分；也就是说，编辑盒 可以是CREATE盒(参见，例如2019年5月29日发布的USPN 9/982,278 和2019年3月26日发布的USPN10/240,167；2019年4月23日发布的 USPN 10/266,849；以及2018年4月9日提交的美国公布第15/948,785号； 2019年2月14日提交的美国公布第16/275,439号；以及2019年2月14日提交的美国公布第16/275,465号，将其全部内容通过引用以其整体并入)。 引导核酸和供体核酸可以并且通常在单个(在这种情况下，优选为诱导型) 启动子的控制下。再次，须注意，引导核酸或核酸酶必须在诱导型启动子 的控制下，并且在一些实施方案中，并且优选地，引导核酸和核酸酶两者 都在诱导型启动子的控制下。实际上，重要的是控制引导核酸和/或(最优 选地，和)核酸酶的转录的诱导型启动子被严格控制。尤其重要的是，控制核酸酶活性，以在单一化和单一化的生长之前避免显著的偏倚和效率损失。 因此，不依赖于单一化或基本上单一化过程，编辑机制能够达到“关闭(OFF)”状态的程度很重要。可选地，引导核酸可以不是编辑盒的一部分， 而是可以被编码在引擎载体或编辑载体的骨架上。例如，可以首先将编码 引导核酸的序列组装或插入载体骨架中，随后插入供体核酸。在其他情况 下，可首先将供体核酸插入或组装到载体骨架中，随后插入编码引导核酸 的序列。在又其他的情况下，将编码引导核酸和供体核酸的序列(插入例如 编辑盒中)同时但分开地插入或组装到载体中。在又其他的实施方案中，并 且优选地，编辑盒中包含编码引导核酸的序列和编码供体核酸的序列两者。
靶序列与PAM相关联，PAM是被gRNA/核酸酶复合物识别的短核苷 酸序列。不同的核酸引导的核酸酶对PAM的精确序列和长度的要求有所 不同；然而，PAM通常是与靶序列相邻或邻近的2-7个碱基对序列，并且 取决于核酸酶，可以相对于靶序列在5′或3′。对核酸引导的核酸酶的PAM 相互作用域的工程化可以允许改变PAM特异性，提高靶位点识别准确性，降低靶位点识别准确性并增加核酸引导的核酸酶的多功能性。在某些实施 方案中，对靶序列的基因组编辑既将期望的DNA改变引入靶序列(例如细 胞的基因组DNA)，又将靶序列中的前间区序列(PAM)区域去除、将靶序 列中的前间区序列(PAM)区域突变或使靶序列中的前间区序列(PAM)区域 失活；也就是说，供体DNA通常包含靶序列的改变，以防止发生编辑后 核酸酶在靶序列中的PAM处结合。使靶序列处的PAM失活阻止了在该靶 序列处对细胞基因组的额外编辑，例如，在后面轮次的编辑中随后暴露于 与合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶时。因此，可以使用与和靶序 列互补的合成的引导核酸复合的核酸引导的核酸酶来选择具有期望的靶 序列编辑和改变的PAM的细胞。未经历第一次编辑事件的细胞将被切割， 致使双链DNA断裂，并且因此将无法继续存活。包含期望的靶序列编辑 和PAM改变的细胞将不会被切割，因为这些经编辑的细胞不再包含必需 的PAM位点，并且将继续生长和增殖。
核酸引导的核酸酶可以识别的靶序列的范围受到定位于期望的靶序 列附近的特定PAM的需要的限制。因此，常常难以以基因组编辑所必需 的精度来靶向编辑。已经发现，核酸酶可以很好地识别一些PAM(例如， 经典的PAM)，而对其他PAM的识别不是很好或较差(例如，非经典的PAM)。 因为本文公开的方法允许在未经编辑的细胞的大背景中鉴定经编辑的细 胞，所以该方法允许在PAM次于最佳值的情况下鉴定经编辑的细胞；也 就是说，即使编辑效率非常低，本文中用于鉴定经编辑的细胞的方法也允 许鉴定经编辑的细胞。另外，本发明的方法扩大了可以被编辑的靶序列的 范围，因为更容易鉴定编辑，包括基因组编辑与功能较弱的PAM相关联 的细胞。
对于核酸引导的核酸酶编辑系统的核酸酶组分，可以对编码核酸引导 的核酸酶的多核苷酸序列进行密码子优化，以在特定细胞诸如古细菌细胞、 原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母细胞、真菌细胞、藻类 细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。真核细胞可以是特定生物体的真 核细胞或源自特定生物体的真核细胞，所述特定生物体诸如哺乳动物，， 包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人类哺乳动物包括非人类灵 长类动物。待使用的核酸引导的核酸酶的选择取决于许多因素，诸如在靶 序列中将进行何种类型的编辑以及合适的PAM是否位于期望的靶序列附 近。在本文所述的方法中使用的核酸酶包括但不限于Cas9、Cas12/CpfI、 MAD2或MAD7或其他MAD酶。与引导核酸一样，核酸酶可以由载体(例 如，引擎载体)上的DNA序列编码，并且在组成型启动子或优选地诱导型 启动子的控制下。再次，核酸酶和引导核酸中的至少一种，并且优选地， 两者在诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，编码核酸酶的序列在 诱导型启动子的控制下，并且该诱导型启动子可以与控制引导核酸转录的 诱导型启动子独立但相同；也就是说，单独的诱导型启动子驱动核酸酶和 引导核酸序列的转录，但是两个诱导型启动子可以是相同类型的诱导型启 动子(例如，两者都是pL启动子)。可选地，控制核酸酶表达的诱导型启动 子可以与控制引导核酸转录的诱导型启动子不同；也就是说，例如，核酸 酶可以在pBAD诱导型启动子的控制下，而引导核酸可以在pL诱导型启 动子的控制下。再次须注意，重要的是控制引导核酸和核酸酶的转录的诱 导型启动子被严格控制。尤其重要的是，控制核酸酶的活性，以在单一化 和单一化的生长过程之前避免显著的偏倚和效率损失。因此，不依赖于单 一化或基本上单一化过程，编辑机制能够达到“关闭”状态的程度很重要。
核酸引导的核酸酶系统的另一组分是供体核酸。在一些实施方案中， 供体核酸与引导核酸在同一多核苷酸(例如载体或编辑(CREATE)盒)上。供 体核酸被设计成用作与靶序列(被作为gRNA/核酸酶复合物的一部分的核 酸引导的核酸酶切口(nick)或裂解)同源重组的模板。供体核酸多核苷酸可 以是任何合适的长度，诸如长度为约或大于约30个、35个、40个、45个、 50个、75个、100个、150个、200个、500个、1000个、2500个、5000 个核苷酸或更长。在某些优选方面，供体核酸可以以40-300个核苷酸之间、 更优选50-250个核苷酸之间的寡核苷酸提供。供体核酸包含与靶序列的一 部分互补的区域(例如同源臂)。当进行最佳比对时，供体核酸的例如约10 个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、50个、60个、70个、80 个、90个或更多个核苷酸与靶序列重叠(互补)。在许多实施方案中，供体 核酸包含位于供体核酸与靶模板之间的突变或差异的侧翼的两个同源臂 (与靶序列互补的区域)。与靶序列相比，供体核酸包含至少一个突变或改 变，诸如与靶序列相比具有插入、缺失、修饰或其任何组合。
通常将供体核酸作为编辑盒提供，将编辑盒插入载体骨架中，其中载 体骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子和gRNA的编码序列，或者载体 骨架可以包含驱动gRNA转录的启动子，但包含gRNA本身。此外，可以 将多于一个，例如两个、三个、四个或更多个引导核酸盒/供体核酸盒插入 到引擎载体中，其中引导核酸在单独的不同的启动子的控制下，在单独的 相似启动子的控制下，或者其中所有引导核酸/供体核酸对均在单个启动子 的控制下。(参见，例如2019年2月14日提交的USSN 16/275,465，被引 入到多CREATE盒中。)驱动gRNA和供体核酸(或驱动多于一个gRNA/ 供体核酸对)的转录的启动子优选为诱导型启动子，并且驱动核酸酶转录的 启动子也任选地为诱导型启动子。也就是说，引导核酸(gRNA)和核酸酶中 的至少一种，并且优选地两者在诱导型启动子的控制下。
诱导型编辑的优势在于，在启动编辑之前，可以使基本上或很大程度 上单一化的细胞生长若干到许多次细胞倍增，这增加了带有编辑的细胞存 活的可能性，因为由活性编辑引起的双链切割对细胞有很大的毒性。这种 毒性不仅导致经编辑的集落的细胞死亡，而且导致确实存活但必须在编辑 后进行修复和恢复的经编辑的细胞的生长滞后。然而，在经编辑的细胞有 恢复的机会时，经编辑的细胞的集落的尺寸将最终赶上未经编辑的细胞的集落的尺寸(例如，“归一化”或将集落生长到“最终尺寸”的过程；参见， 例如下文描述的图1B)。
除供体核酸外，编辑盒可以包含一个或更多个引物位点。引物位点可 以用于通过使用寡核苷酸引物来扩增编辑盒；例如，如果引物位点位于编 辑盒的一个或更多个其他组件的侧翼。
同样，如上所述，供体核酸可以包含(除了至少一个相对于靶序列的突 变外)一个或更多个使靶序列中的PAM位点突变、缺失或使其失活的PAM 序列改变。如果使用相同的核酸酶，则靶序列中的PAM序列改变使得PAM 位点对核酸引导的核酸酶“免疫”，并且在随后轮次的编辑中保护靶序列 免于进一步的编辑。
编辑盒还可以包含条形码。条形码是独特的DNA序列，该独特的DNA 序列对应于供体DNA序列，使得条形码可以鉴定对相应靶序列进行的编 辑。条形码可以包含多于四个的核苷酸。在一些实施方案中，编辑盒包含 供体核酸的集合，该供体核酸的集合代表例如全基因范围或全基因组范围 的供体核酸文库。将编辑盒文库克隆到载体骨架中，其中，例如，每个不 同的供体核酸设计与不同的条形码缔合，或者，可选地，每个不同的盒分 子与不同的条形码缔合。
另外，在一些实施方案中，核酸引导的核酸酶系统的表达载体或盒编 码组件还编码包含一个或更多个核定位序列(NLS)(诸如约或多于约1个、 2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS)的 核酸引导的核酸酶。在一些实施方案中，工程化核酸酶包含氨基末端处的 NLS或氨基末端附近的NLS、羧基末端处的NLS或羧基末端附近的NLS、 或其组合。
用于编辑、富集和选择经编辑的细胞的示例性工作流程
本文所述的方法提供了核酸引导的核酸酶编辑方法的增强的观察到 的编辑效率，这是由于单一化或基本上单一化、初始细胞生长、诱导编辑 以及所得细胞集落的归一化或择优挑选缓慢生长的细胞集落的结果。单一 化或基本上单一化、初始细胞生长、诱导编辑和归一化过程的组合克服了 有利于未经编辑细胞的生长偏倚以及编辑的适应性效应(包括差异编辑率)， 从而允许所有细胞都可以彼此“平等计费”。单一化或基本上单一化、初 始细胞生长、诱导编辑和择优挑选的组合允许直接选择经编辑的细胞集落。 本文所述方法的结果是，即使在编辑并非最佳的核酸引导的核酸酶系统中 (诸如在靶向非经典PAM的系统中)，观察到的编辑效率也有所提高；也就 是说，即使在大的未经编辑的细胞的背景下也可以鉴定经编辑的细胞。观 察到的编辑效率可以提高高达80％或更高。细胞集落的单一化、初始生长、 诱导编辑和归一化或细胞集落的择优挑选可以使得在鉴定经编辑的细胞方面比现有技术方法增加2-250x、10-225x、25-200x、40-175x、50-150x、 60-100x或5-100x，并且允许产生包含基因组文库的布置或汇集的经编辑 的细胞。另外，可以利用仪器、模块和方法来创建迭代编辑系统，以产生 组合文库、鉴定稀有细胞编辑以及实现高通量富集应用以鉴定编辑活性。
图1A示出了用于单一化细胞以用于富集(100a)和用于择优挑选(100b) 的两种可选的示例性方法100a和方法100b的简化流程图。参见图1A，方 法100开始于用进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞110。 例如，可以用单独的引擎载体和编辑载体同时转化细胞；细胞可以已经用 表达核酸酶的引擎载体转化(例如，细胞可以已经用引擎载体转化，或者核 酸酶的编码序列可以已经稳定整合到细胞基因组中)，使得仅需要将编辑载 体转化到细胞中；或者可以用包含进行核酸引导的核酸酶基因组编辑所需 的所有组件的单个载体转化细胞。
各种递送系统可用于将核酸引导的核酸酶编辑系统组分引入(例如，转 化或转染)到宿主细胞110中。这些递送系统包括使用酵母系统，脂质转染 系统，显微注射系统，生物弹射系统，病毒体(virosome)，脂质体，免疫脂 质体，聚阳离子，脂质:核酸缀合物，病毒颗粒，人工病毒颗粒，病毒载体， 电穿孔，细胞可渗透肽，纳米颗粒，纳米线，外泌体。可选地，分子木马 (trojanhorse)脂质体可用于跨血脑屏障递送核酸引导的核酸酶组分。感兴趣 的是，特别是在自动化多模块细胞编辑仪器的情况下，使用电穿孔法，尤 其是流通式电穿孔法(作为独立仪器或作为自动化多模块系统中的模块)， 如描述于例如2018年9月28日提交的USSN 16/147,120；2018年9月28 日提交的16/147,353；2018年9月30日提交的16/147,865；以及2018年 9月30日提交的16/147,871中。如果实体壁单一化或基本上单一化/生长/ 诱导编辑和归一化模块为下文所述的自动化多模块细胞编辑仪器中的一 个模块，则细胞可能在自动化细胞转化模块中转化。
在用进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞后，将细胞基 本上或很大程度上单一化120；也就是说，将细胞在液体培养基中稀释(如 果需要的话)，使得当将细胞递送至用于单一化的基底时，细胞基本上彼此 分离并且可以形成基本上彼此分离的集落。例如，如果使用实体壁装置(下 文关于图3A–3E和4A–4CC描述的)，则将细胞稀释，使得当递送至实体 壁装置时，细胞以泊松分布或基本上泊松分布填充实体壁装置的微孔。在一个示例中(在图3A中示出)，当平均1/2的细胞被递送至每个微孔时，单 一化完成；也就是说，其中一些微孔包含一个细胞，而其他微孔不包含细 胞。可选地，当将两个到若干个(2个、3个、4个、5个、6个、7个、8 个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28 个、29个、30个或多达50个(但优选10个或更少，或优选5个或更少) 细胞递送至微孔中(如图3B所示)时，发生细胞的基本上泊松分布。
在细胞已被基本上或很大程度上单一化120后，使细胞生长至例如2 倍和130倍之间或5倍和120倍之间或10倍和100倍之间，建立克隆集 落140。建立集落之后，诱导编辑130，例如，其中一个或更多个诱导型 启动子驱动gRNA和核酸酶中的一种或两者(优选两者)的转录以及例如细 菌系统中的λ红色重组系统组分的转录。对于示例性诱导型系统，参见下 文详细描述的图1C。编辑完成后，在富集方法100a中，使细胞生长成最 终尺寸的集落150；也就是说，使由基本上或很大程度上单一化的细胞产 生的集落生长成达到这样的点的集落，在该点，对于经编辑的细胞和未经 编辑的细胞两者，细胞生长均达到峰值并且归一化或饱和。当生长中的细 胞集落周围的培养基中的营养物耗尽和/或细胞生长充满微孔和进一步生 长受物理限制时，发生归一化。通过例如从包含固体介质或其他基底的板 刮下集落或通过从实体壁装置或模块中的微孔冲洗克隆细胞集落以汇集 来自归一化的细胞集落的细胞来汇集最终尺寸的集落160。再次，因为单 一化或基本上单一化克服了未经编辑的细胞或表现出由于所进行的编辑 导致的适应性效应的细胞的生长偏倚，因此单独的单一化或基本上单一化、 初始生长、诱导编辑和归一化富集了具有经编辑的细胞的总细胞群体；也 就是说，将单一化或基本上单一化与初始细胞生长、编辑诱导和归一化(例 如，使集落生长至最终尺寸)组合，允许高通量富集经编辑的细胞。
图1A中示出的方法100b与方法100a类似，其中将感兴趣的细胞用 进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化110。如上所述，可以使用 引擎载体和编辑载体两者同时转化细胞，细胞可以已经表达核酸酶(例如， 细胞可以已经用引擎载体转化，或者核酸酶的编码序列可以稳定整合到细 胞基因组中)，使得仅需要编辑载体被转化到细胞中，或者可以用包含进行 核酸引导的核酸酶基因组编辑所需的所有组件的单个载体转化细胞。此外，如果细胞的单一化或基本上单一化、初始细胞生长、编辑诱导以及归一化 或择优挑选模块(“实体壁分离/诱导/归一化模块”或“SWIIN”)为自动化 多模块细胞编辑仪器中的一个模块，则细胞转化可以在下文关于图8A-8E 描述的自动化转化模块中进行。
在用进行核酸引导的核酸酶编辑所必需的组分转化细胞110后，将细 胞在液体培养基中稀释(如果需要的话)，使得当递送至单一化装置或模块 时，细胞彼此分离并且可以形成彼此分离的集落。例如，如果使用实体壁 装置(关于图3A–3E和4A–4CC描述的)，则将细胞稀释，使得当递送至实 体壁装置时，细胞以泊松分布或基本上泊松分布填充实体壁装置的微孔。
在细胞已被基本上或很大程度上单一化120后，使细胞生长至例如2 倍和150倍之间或5倍和120倍之间或10倍和100倍之间，建立克隆集 落130。建立集落后，通过例如活化控制gRNA和核酸酶中至少一种(如上 所述，优选两者)的转录的诱导型启动子以及在细菌的情况下活化控制重组 工程化系统的转录的诱导型启动子来诱导编辑140。在诱导编辑140后， 由于在编辑过程中发生的双链DNA断裂，克隆集落中的许多经编辑的细 胞死亡；然而，在一定百分比的经编辑的细胞中，基因组被编辑，并且双 链断裂被正确修复。当允许恢复时，这些经编辑的细胞开始生长，并在每 个分离的分区或集落内重新建立细胞群体；然而，经编辑的集落的生长往 往滞后于未发生编辑的克隆集落的生长(例如，细胞“逃避”)。如果监测 这些集落的生长170，则可以鉴定小的或缓慢生长的集落(经编辑的细胞)， 并且然后基于可观察到的集落尺寸差异来进行选择或择优挑选180。
图1B是未经编辑细胞(实线)相对于经编辑的细胞(虚线)的OD与时间 的图。图1B示出了经编辑的集落和未经编辑的集落的归一化如何发生。 须注意，经编辑的细胞的OD(例如，生长)最初滞后于未经编辑的细胞， 但由于例如未经编辑的细胞耗尽培养基中的营养物、在微孔或其他受限的 生长区域(诸如液滴)内变得物理上受限或以其他方式退出对数生长期而最 终赶上未经编辑的细胞。允许细胞集落生长足够长的时间，以使经编辑的集落的生长赶上未经编辑的集落(接近例如未经编辑的集落的尺寸，未经编 辑的集落的细胞数量)。
图1C描绘了用于调控gRNA活性的示例性诱导型表达系统，在该示 例中为pL诱导型系统。在图1C的顶部，示出了示例性引擎载体111的一 部分，示例性引擎载体111包含复制起点112，驱动c1857阻遏基因116 表达的启动子114和驱动核酸酶121表达的第一pL启动子118。在图1C 的顶部，还可见示例性编辑载体131的一部分，示例性编辑载体131包含 复制起点132和驱动编辑盒136(例如，CREATE盒)的转录的第二pL启动 子134，所述编辑盒136包含gRNA和供体DNA的编码序列。图1C的中 间图示描绘了引擎载体111上的c1857阻遏基因116的产物124主动阻遏 驱动核酸酶121转录的第一pL启动子118和驱动编辑载体131上的编辑 盒136转录的第二pL启动子134。最后，图1C的底部图示描绘了引擎载 体111上的c1857阻遏基因116的蛋白质产物126由于温度升高而解折叠/ 降解。解折叠或降解的蛋白质产物126不能结合第一pL启动子118或第 二pL启动子134；因此，pL启动子118有活化性，并且驱动引擎载体111 上的核酸酶121的转录，而且pL启动子134是有活性的，并且驱动编辑 载体131上的编辑盒136的转录。
在图1C中，核酸酶和gRNA两者的转录都在pL启动子的控制下；然 而，在其他实施方案中，可以使用不同的诱导型启动子来驱动核酸酶和 gRNA的转录，或者在一些实施方案中，核酸酶和gRNA中仅一种在诱导 型启动子的控制下。例如，示出了与图11A和图11B中的示例性引擎载体 和编辑载体相关的pL启动子和pBAD启动子，并且已经开发出许多基因 调节控制系统来控制植物细胞、微生物细胞和动物细胞包括哺乳动物细胞 中的基因表达。这些系统包括四环素控制的转录活化系统(Tet-On/Tet-Off， Clontech,Inc.(Palo Alto,CA)；Bujard和Gossen ,PNAS,89(12):5547-5551 (1992)),the Lac Switch Induciblesystem(Wyborski等人,Environ Mol Mutagen,28(4):447-58(1996)；DuCoeur等人,Strategies 5(3):70-72(1992)； 以及美国专利第4,833,080号)，蜕皮激素诱导型基因表达系统(No等人, PNAS,93(8)：3346-3351(1996))，cumate基因转换系统(Mullick等人,BMCBiotechnology,6:43(2006))以及他莫昔芬诱导型基因表达(Zhang等人, Nucleic AcidsResearch,24：543-548(1996))以及其他。然而，pL启动子是 特别有用的诱导型启动子，因为pL启动子通过温度升高至例如42℃而活 化，并且通过使温度回到例如30℃而失活。对于通过特定分子化合物的存 在或不存在而被活化的其他诱导系统，活化诱导型启动子需要向培养基中 添加分子化合物或从培养基中去除分子化合物，因此需要液体处理、培养 基交换、洗涤步骤等。
图2A描绘了用于进行核酸引导的核酸酶基因组编辑的标准、常规的 现有技术方案200，其中通常使用组成型表达的核酸酶组分来驱动高效编 辑。在图2A中，将编辑载体202的文库或集合引入203(例如，电穿孔) 到培养的细胞204中，该培养的细胞204包含在组成型或诱导型启动子的 控制下的核酸酶的编码序列。在一些实施方案中，核酸酶的编码序列包含 在“引擎载体”上，但是在其他实施方案中，核酸酶的编码序列可以整合 到细胞基因组中。在又一替代方案中，引擎载体和编辑载体的组件可以被 组合。编辑载体202包含编辑序列，该编辑序列包含用于细胞内源性核酸 序列中的期望的编辑的序列以及任选的PAM改变序列(最通常是使基因 组中靶序列处的PAM失活的序列)、在组成型启动子控制下的gRNA编码 序列和选择性标志物。在细胞用编辑载体转化后，将细胞铺205在选择培 养基206上，以选择具有引擎载体和编辑载体两者的细胞，并使细胞生长 直至形成集落。然后从集落中挑选207细胞，并使细胞在例如96孔板208 中生长，以准备用于基因组或质粒测序。在带有选择培养基的板208上生 长的细胞将包含引擎载体和编辑载体两者；然而，在某些细胞中，核酸引 导的编辑组分可能是无功能的。在汇集或多重化形式中，由于未经编辑的细胞未经受编辑过程中发生的双链DNA断裂，因此可能会存在具有无功 能性编辑系统的细胞的选择性富集。对具有无功能性核酸引导的核酸酶编 辑系统的细胞的强大选择导致最终细胞群体中未经编辑细胞的比例过高， 并损害了经由多重核酸酶编辑系统生成的文库的完整性。
图2B-2F描绘了用于进行核酸引导的核酸酶基因组编辑的改进方案。 图2B描绘了改进方案的第一实施例201，其使用诱导型启动子来驱动 gRNA的表达来进行核酸引导的核酸酶基因组编辑。在图2B中，将编辑 载体202的文库或集合引入203(例如电穿孔)到培养的细胞204中，该 细胞包含在组成型或诱导型启动子的控制下的核酸酶的编码序列；然而，通过使用诱导型启动子来驱动核酸酶的表达来实现对核酸引导的核酸酶 系统的最严格的调控，因此优选地，使用诱导型启动子来驱动核酸酶的转 录。在一些实施例中，核酸酶的编码序列包含在已经被转化到细胞中的“引 擎质粒”上(最常见的是与例如选择性标志物一起)，但是在其他实施例 中，核酸酶的编码序列可以被整合到细胞的基因组中。在其他实施例中， 核酸酶的编码序列可以位于编辑载体(也就是说，引擎载体和编辑载体的 组合)上。编辑载体202包含编辑序列，编辑序列可选地包含PAM改变 序列(最通常是使基因组中靶位点处的PAM失活的序列)、在诱导型启动 子控制下的gRNA的编码序列和选择性标志物。
在用编辑载体转化细胞204后，将细胞铺205在选择培养基上以选择 具有引擎载体和编辑载体两者的细胞，并使其生长直至形成集落206。然 后从集落中挑选207细胞，并使细胞例如在第一96孔板208中在针对引 擎载体和编辑载体两者所选择的培养基中过夜生长。在下一步骤209中， 将来自第一96孔板208的细胞复制到第二96孔板210中到达含有另外的 选择性组分(诸如例如，阿拉伯糖)的培养基中，以驱动对λ红色重组工 程化系统(同源修复机制)的强烈诱导。由阿拉伯糖在生长培养基中的存 在而诱导的诱导型pBAD启动子控制了λ红色重组工程化系统，并在下文 中关于图11A进行了描述。同样，尽管这里在细菌编辑系统中例示了重组 工程化系统，但是在真核编辑系统中通常不需要重组工程化系统。在30℃ 的初始细胞生长后，通过将第二96孔板210中的温度升高至42℃例如约 半小时至约两个小时(取决于细胞类型)来诱导细胞基因组的切割和编辑， 以活化pL诱导型启动子，该pL诱导型启动子驱动核酸酶和gRNA的转录。 在诱导切割和编辑后(例如，约2个小时)，使温度返回到30℃，以允许 细胞恢复。
另外，在步骤211中，将来自第一96孔板208的细胞复制到第三96 孔板214中到达培养基中，该培养基不包含诱导同源修复机制的选择性组 分(此处为阿拉伯糖，使得λ红色重组工程化系统不被活化)。然而，第三 96孔板214除了不向生长培养基中添加阿拉伯糖外处于与第二96孔板相 同的条件；也就是说，最初细胞在30℃下生长，将温度升高到42℃例如 2个小时，以活化pL诱导型启动子，pL诱导型启动子驱动核酸酶和gRNA 的表达，然后将温度降低到30℃以允许细胞恢复。作为96孔板210和214 的替代，示出了两个琼脂板212和216，其中布置有来自板208的细胞。 板212对应于第二96孔板210，该板212包含具有阿拉伯糖的生长培养基， 且板216对应于第三96孔板214，该板216包含不具有阿拉伯糖的生长培养基。需注意，作为用+/-阿拉伯糖进行图2B中描绘的方法的替代，可以 进行通过-/+温度诱导切割的方法。例如，在+/-温度诱导实验中，板210将 是未诱导的培养板(无温度)，而培养板214将是温度诱导的培养板。整 体情况是一样的；然而，切割活性是分离的，以避免必须将切割与粘贴修 复(paste)解析分开。
观察第二和第三96孔板(分别为210和214)以及板212和216，可 以看到细胞集落。首先看第二96孔板210，有两种类型的集落：226(白 色孔)和228(阴影孔)。观察第三96孔板214，有两种类型的集落：220 (黑色孔)和226(白色孔)。用鉴别培养基将细胞从第一96孔板复制铺 到第二和第三96孔板中允许对所得细胞群体进行功能性解析。在第三96 孔板214中，在无阿拉伯糖的培养基中培养细胞。如果没有阿拉伯糖，则 λ红色重组工程化系统将不起作用，并且具有活性gRNA和核酸酶表达(通 过将培养细胞的温度升高到42℃诱导)的细胞由于被活性gRNA和核酸 酶双链切割但未被λ红色重组工程化系统修复而无法存活。这些细胞集落 222用白色孔表示。黑色孔表示的细胞集落220表示具有失活的gRNA的 细胞，使得这些集落中的细胞基因组不被gRNA和核酸酶复合物切割。在 典型的细胞编辑实验中，失活gRNA的发生频率约为2-15％，通常是由于 gRNA的引导序列部分(同源性部分)出现错误导致的。
在第二96孔板210中，将细胞在带有阿拉伯糖的培养基中培养，从 而活化λ红色重组工程化系统。切割、编辑具有活性gRNA和核酸酶表达 (通过将培养细胞的温度升高到42℃诱导)的细胞，然后λ红色重组工 程化系统修复双链DNA断裂，因此这些细胞可存活。然而，具有失活gRNA (或更不常见的，失活核酸酶)的细胞也可存活。板210中的所有活集落用阴影孔228表示。最后，用白色孔226表示具有活性gRNA但未经适当 编辑(由于例如无活性的重组工程化系统)的细胞。通过比较第二96孔 板和第三-96孔板，可以确定每个集落中核酸引导的核酸酶系统的功能。 例如，如果细胞集落在没有阿拉伯糖的情况下(板214，黑色孔220)和 具有阿拉伯糖的情况下(板210，阴影孔228)生长，则细胞必定不具有 活性gRNA。如果细胞具有活性gRNA，则在没有阿拉伯糖(例如，没有 活性λ红色重组工程化系统)的培养基中它们将无法存活。如果细胞集落 无法在没有阿拉伯糖的培养基中生长(板214，白色孔226)，并且在向培 养基中添加阿拉伯糖(板210，阴影孔228)时确实生长，则这些孔中的 细胞包含活性核酸引导的核酸酶系统(具有活性gRNA)和很有可能已被 正确编辑的核酸酶组分。最后，如果细胞集落在没有阿拉伯糖的情况下(板 214，白色孔226)或在有阿拉伯糖的情况下(板210，白色孔226)均无 法生长，则gRNA是有活性的，但细胞由于某些原因无法修复切割。因此， 在一个实验中，图2B中描绘的方法允许经由编辑“机制”的各个组分的 功能化解析来鉴定经编辑的细胞集落。
在板212和216中，表型读数与在96孔板210和214中相同。培养 皿212像96孔板210一样，培养皿212中的培养基包含阿拉伯糖，而培 养皿216像96孔板214一样，培养皿216中的培养基不包含阿拉伯糖。 因此，在培养皿216中，具有失活gRNA的细胞会生长，因为没有编辑(双 链断裂)需要修复。然而，在具有活性gRNA的细胞中，会进行编辑，但 没有活性修复机制来修复编辑，并且细胞无法存活，也不会形成集落。在 含有阿拉伯糖的培养皿212中，具有失活gRNA的细胞形成集落，具有活 性gRNA但经过适当编辑的细胞也是如此。无论出于何种原因无法存活的 细胞都不会形成集落。与96孔板210和214一样，培养皿212和214的 比较可以使编辑机制的各个组分解析。如果细胞在培养皿212和214上均 生长，则gRNA可能无活性。如果细胞在培养皿212上生长而不在培养皿 214上生长，则gRNA可能有活性，并且已经进行了适当的编辑。如果细 胞无法在培养皿212或214上生长，则细胞可能具有活性gRNA，但编辑 无法正确修复。
因此，图2B中描绘的方法201允许鉴定具有非功能性gRNA的细胞， 所述非功能性gRNA由于没有双链DNA断裂而具有生长优势。最重要的 是，图2B中描绘的方法201允许鉴定已经被适当编辑的细胞。来自第二 96孔板210或琼脂板212的集落228(被证实具有活性gRNA的集落)的 等分试样可以被挑选并测序以确认编辑。可以保留96孔板210或琼脂板212，使得一旦通过例如测序确认适当的编辑，就可以返回到板210或212 并取出正确编辑的细胞。板210和212可以被称为，例如，“细胞库(cell hotel)”或“细胞贮库(cellrepositories)”。需注意，图2B中描绘的方法 201首先通过将细胞以适当的稀释度铺在选择培养基上来基本上或很大程 度上单一化细胞，使得单个细胞形成单个集落。再次，单一化或基本上单 一化克服了未经编辑的细胞所特有的生长偏倚。然后，该方法通过将96孔微量滴定板中的群体在不同选择培养基下复制铺板对不同集落进行功 能性解析，从而允许阳性鉴定经编辑的集落。在下文的实施例6中描述了 此示例性方法的特定方案。
图2C描绘了改进方案230的第二示例性实施方案，该方案用于使用 诱导型启动子来驱动gRNA的表达，并且优选地还驱动核酸酶的表达，以 进行核酸引导的核酸酶基因组编辑。在图2C中，如在图2B中一样，将编 辑载体202的文库或集合引入203(例如电穿孔)到培养的细胞204中， 该培养的细胞204包含在组成型或诱导型启动子的控制下的核酸酶的编码 序列；然而，通过使用诱导型启动子来驱动核酸酶的表达来实现对核酸引 导的核酸酶系统的最严格的调控，并因此是优选的。同样如图2B一样， 在一些实施例中，核酸酶的编码序列被包含在已经被转化到细胞中的“引 擎质粒”上(最常见的是与例如选择性标志物一起)，但是在其他实施例 中，核酸酶的编码序列可以被整合到细胞的基因组中。在还有的其他实施 例中，核酸酶的编码序列可以位于编辑载体(也就是说，引擎载体和编辑 载体的组合)上。编辑载体202包含相对于细胞中的内源核酸序列具有所 需编辑的编辑序列以及PAM改变序列(最常见的是在基因组中靶位点处 使PAM失活的序列)、在优选诱导型启动子控制下的gRNA的编码序列、 以及选择性标志物。
在已经用编辑载体转化细胞204后，将细胞铺235在基底或板236上 的选择培养基上，以选择具有引擎载体和编辑载体两者的细胞。在铺板之 前将细胞稀释，使得细胞基本上或很大程度上单一化(足够分离，以使它 们及他们形成的集落与其他细胞集落分离)，然后使细胞在板或基底236 上生长237，直到集落238开始形成。使细胞在例如30℃生长例如2倍至 150倍之间或5倍至120倍之间或10倍至50倍之间，以建立克隆集落。 细胞的最初生长是为了在集落中积累足够的克隆细胞，以在编辑诱导下存 活下来。一旦建立集落后，通过对驱动gRNA和核酸酶中的一者或两者的 启动子以及λ红色重组工程化系统(如果存在)诱导或活化来诱导细胞基 因组的切割和编辑。如果λ红色重组工程化系统存在并且在诱导型启动子 的控制下，则优选地，该诱导型启动子不同于驱动gRNA和核酸酶转录的 诱导型启动子，并在诱导gRNA和核酸酶之前被活化(诱导)。λ红色重组 工程化系统可作为细菌中双链断裂的“创可贴”或修复系统，并且在一些 细菌物种中，必须存在λ红色重组工程化系统以解决编辑过程中发生的双 链断裂。λ红色重组工程化系统可以在例如pBAD启动子的控制下。pBAD 启动子，与pL启动子一样，为诱导型启动子；然而，通过向生长培养基 中添加阿拉伯糖来调控(诱导)pBAD启动子。因此，如果在基底或板236 的选择培养基中包含阿拉伯糖，则当细胞生长237时，λ红色重组工程化 系统将被活化。至于编辑239的诱导，如果gRNA和核酸酶的转录均在pL 启动子的控制下，则通过将温度升高至42℃持续例如半小时至两小时(或 更长，取决于细胞类型)来诱导gRNA和核酸酶的转录，从而活化pL诱 导型启动子。诱导切割和编辑并在42℃培养两个小时后，将温度恢复到 30℃，以使细胞恢复并使pL启动子系统失活。
一旦细胞恢复并在30℃生长，细胞就在基底或板236上生长成最终尺 寸的集落244；也就是说，将由基本上或很大程度上单一化的细胞产生的 集落生长到细胞生长达到峰值并且对于经编辑的和未经编辑的细胞均归 一化的程度(例如饱和)的集落。如上所述，随着生长着的细胞集落周围 的培养基中的营养物耗尽和/或细胞生长充满微孔或受到其他限制时；也就 是说，在细胞处于衰老状态时，就会发生归一化。然后通过例如将集落从基底或板上刮下(或通过例如从实体壁装置中的微孔冲洗出克隆细胞集落) 来汇集241最终尺寸的集落，以汇集280来自归一化细胞集落中的细胞。 需注意，针对图2C示出和描述的方法230利用了单一化或基本上单一化、 初始生长、诱导、归一化和对所得细胞集落的汇集。同样，由于单一化或 基本上单一化克服了未经编辑的细胞或由于编辑而表现出适应性效应的 细胞的生长偏倚，因此单一化或基本上单一化、初始生长、诱导编辑和归 一化的组合富集了具有已经编辑的细胞的总细胞群体。但是需注意，与分 别在图2B和图2D中描绘的方法201、250不同，在图2C中的方法230 不采取解析编辑“机制”的步骤。
图2D描绘了改进方案250的第三示例性实施方案，该方案用于使用 诱导型启动子驱动gRNA的表达并且在一些实施例中且优选地还驱动核酸 酶的表达来进行核酸引导的核酸酶基因组编辑。图2D描绘了用于基于活 性的错误更正和重新布置的方案250。在图2D中，与图2B和图2C中一 样，将编辑载体202的文库或集合引入203(例如电穿孔)到培养的细胞204中，培养的细胞204包含在组成型或诱导型启动子(优选诱导型)控 制下的核酸酶的编码序列)，或者被包含在已经被转化到细胞中或者整合 到细胞的基因组中的“引擎质粒”(例如，连同例如选择性标志物)上。 可选地，核酸酶的编码序列可以位于编辑载体上。编辑载体202包含编辑 序列、PAM改变序列(最通常是使基因组中靶位点处的PAM失活的序列)、在优选诱导型启动子控制下的gRNA的编码序列、以及选择性标志物。
在已经用编辑载体转化细胞后，将细胞稀释并铺205在选择培养基206 上以选择具有引擎载体和编辑载体两者的细胞(例如，含有氯霉素和羧苄 青霉素的培养基)，并同样在基本上或很大程度上将细胞单一化的过程中 生长直至集落221形成。然后从集落221中挑选207细胞，并使其在例如 不包含选择培养基的培养基中在第一96孔板208中过夜生长。在下一步 骤中，将来自第一96孔板的细胞复制211到第二96孔板214中处于没有 阿拉伯糖的培养基中，得到具有集落的孔(黑色孔220)和没有细胞集落 的孔(白色孔222)。该过程可鉴定出具有活性gRNA的细胞，因为具有活 性gRNA的细胞将会因为在没有阿拉伯糖的情况下λ红色重组工程化系统 无法活化修复由gRNA产生的基因组中的切割而无法生存。因此，孔222 可能表示具有活性gRNA的孔。在此第二96孔板214中生长的集落可能 具有失活的gRNA，因此没有需要修复的切割，并且细胞保持活力(以黑 色孔220表示)。
一旦鉴定出具有活性gRNA的细胞(孔222)，然后将这些细胞从第一 96孔板中“择优挑选”213出来，并布置到第三96孔板252中，以被保 留作为细胞贮库或“细胞库”。第三96孔板252中的所有集落都是已被鉴 定为可能具有活性gRNA 222的细胞。利用该细胞贮库252，然后可以将 这些“择优挑选的”细胞(例如，此处为具有活性gRNA的细胞)的等分 试样布置255到第四96孔板254中处于具有阿拉伯糖的培养基中。在初 始生长期之后，使该第四96孔板254中的细胞经受切割和编辑条件，例 如，将温度升高至42℃持续例如两个小时，以诱导驱动核酸酶和gRNA的 表达的pL诱导型启动子。一旦进行了切割和编辑过程，就可以通过监测 集落的生长并选择生长缓慢的集落，或通过靶向或全基因组测序从板254 中挑选细胞来鉴定含有已正确编辑的细胞的集落。一旦鉴定出具有所需编 辑的细胞，就可以从96孔板252(例如，细胞贮库或“细胞库”)中取出 具有所需编辑的细胞。可选地，可以将板252上具有推定活性的gRNA的 细胞集落汇集253到混合细胞培养物256中，或者进行分析或者进行另一 轮编辑。
图2E描绘了改进方案270的另一个示例性实施方案，其用于使用诱 导型启动子来驱动gRNA和/或核酸酶中的一个或更多个的表达来进行核 酸引导的核酸酶基因组编辑。图2D中的方案270不要求细胞的编辑“机 制”功能性解析，而是描绘了用于使用集落形态学鉴定经编辑的细胞的高 通量筛选的方案。同样，在经编辑的细胞中，在诱导编辑后的时间段内细 胞活力受到损害。本方法利用经编辑的细胞集落中的生长滞后来鉴定经编 辑的细胞。在一些实施例中，经编辑的细胞的集落大小比未经编辑的细胞 的集落小20％。在一些方面，经编辑的细胞的集落大小比未经编辑的细胞 的集落小30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在许多实施例 中，经编辑的细胞的集落大小比未经编辑的细胞的集落小30-80％，并且 在一些实施例中，经编辑的细胞的集落大小比未经编辑的细胞的集落小 40-70％。
在图2E中，与图2B-2D中一样，将编辑载体202的文库或集合引入 203(例如电穿孔)到培养的细胞204中，培养的细胞204包含在组成型 或诱导型启动子(优选地，诱导型启动子)的控制下的核酸酶的编码序列， 核酸酶的编码序列：被包含1)在已经转化到细胞中的“引擎质粒”上(大 多数情况下通常与选择性标志物一起使用)；2)整合到被转化的细胞的基 因组中；或3)核酸酶的编码序列可以位于编辑载体上。编辑载体202包 含编辑序列，并且可选地包含PAM改变序列(例如，使基因组中的靶位 点处的PAM失活的序列)、在优选诱导型启动子控制下的gRNA的编码序 列、以及选择性标志物。在许多实施例中，将诱导型启动子包含在编辑载 体骨架中，并且将编辑盒插入诱导型启动子的3′，其中该编辑盒包含5′至 3′：gRNA的编码序列和包含靶序列和PAM改变序列(例如，CREATE盒) 的所需编辑的供体DNA。再次注意，gRNA和核酸酶中的一者或两者的转 录必须在诱导型启动子的控制下。然而，优选地，gRNA和核酸酶的转录 均在诱导型启动子的控制下。
在步骤271处，将转化的细胞稀释并铺(例如，基本上或很大程度上 单一化)到针对引擎载体和编辑载体两者所选择的选择培养基272(例如， 既包含氯霉素又包含羧苄青霉素的培养基)上，并且还包含阿拉伯糖以便 活化λ红色重组工程化系统。在铺板后，使细胞在30℃生长273 6-8小时， 使得细胞最初建立集落，然后将温度升至42℃持续例如半小时到两个小 时，以诱导核酸酶和gRNA表达进而用于切割和编辑。一旦进行了足够时 间的编辑，温度就会返回到30℃，以便细胞生长至在板272上重新建立集 落。一旦出现集落，就会有大集落278和小集落276。小尺寸集落276表 示有活性的gRNA并且很可能已经被编辑过，这是由于活性编辑诱导的双 链切割对细胞有很大的毒性，从而导致经编辑的集落中的细胞死亡以及导 致确实存活但必须在编辑后修复并恢复的经编辑的细胞的生长滞后。择优 挑选277小集落(经编辑的细胞)，并将其布置在96孔板282上。可以培 养96孔板282中的细胞，并且可以对来自96孔板282的等分试样进行测 序，并鉴定出具有所需编辑的集落。该96孔板可以被保留作为细胞库或 细胞贮库，一旦鉴定出已正确编辑的细胞，就可以从“细胞库”96孔板 282中取出具有所需编辑的细胞。
可选地，由于经编辑的细胞已经在第一轮编辑中选择出并且可能包括 来自第一轮的编辑，因此可以挑选并汇集275小集落276以用于另外轮次 的编辑。再次注意，该方法不提供编辑机制的功能性解析；然而，图2E 中描绘的方法同时采用了单一化或基本上单一化和择优挑选两种方式，因 此使高通量诊断方法能够基于集落尺寸形态来鉴定极有可能被编辑的细 胞，并且一旦被鉴定出，经编辑的细胞群体可以被富集。用非功能性gRNA 筛选出大部分细胞允许更容易地鉴定经编辑的细胞。经证明，经由单一化 或基本上单一化来消除生长速率偏差可将观察到的编辑效率相比于传统 方法提高多达2X、3X、4X或更多X，并且此外，使用本文所述方法挑选 樱桃集落使观察到的单一化编辑效率提高了1.5X、1.75X、2.0X或2.5X或 更多X。因此，基本上单一化和择优挑选的结合可将观察到的编辑效率相 比于传统方法提高8X。下面的实施例9提供了用于该实施例的材料和方法。
虽然本文已在测量琼脂板上细胞集落的集落尺寸的背景下描述了使 用细胞生长作为编辑代表物来筛选经编辑的细胞的方法，但可以改为测量 正在生长的细胞集落(诸如在微量滴定板或一系列管中)的光密度(OD)。 此外，除了或代替细胞集落尺寸或OD，可以测量其他细胞生长参数。例 如，使用可见光、紫外光或近红外(NIR)光的光谱法允许监测细胞培养 物中的营养物和/或废产物的浓度。另外，光谱测量可以用于同时量化多种 化学物质。非对称化学物质可以通过鉴定NIR中的特性吸收特征来量化。 相反，对称化学物质可以使用拉曼光谱法容易地量化。许多重要的代谢物， 诸如葡萄糖、谷氨酰胺、氨和乳酸盐在IR中具有独特的光谱特征，使得 可以容易地对其进行量化。由样品吸收的光的量和频率可以与样品中存在 的化学物质的类型和浓度相关。这些测量类型中的每一种测量类型都具有特定的优势。FT-NIR提供最大的光穿透深度，因此可以用于较厚的样品， 从而提供更高的光散射度。FT-mid-IR(MIR)在针对某些分析物时提供更 容易辨别的信息，因为这些分析物的波长更接近基本的IR吸收，因此更 容易辨别。当要最小化由水引起的干扰时，FT-Raman是有利的。可以经 由例如介电阻抗谱、可见荧光、荧光偏振或发光来测量其他光谱特性。另外，用于测量例如溶解氧、二氧化碳、pH和/或电导率的传感器可用于评 估细胞生长速率。
图2F使用基于所进行的实验(参见下文实施例1)的特定示例描绘了 图2E中所示的示例性实施方案的另外的细节。图2F示出了使用集落形态 来鉴定或择优挑选经编辑的细胞的高通量筛选290。如上所述，在经编辑 的细胞中，在诱导编辑后的时间段内细胞活力受到损害。本方法利用经编 辑的细胞集落中的生长滞后来鉴定经编辑的细胞。在图2F中，将转化的 细胞稀释并铺在含有阿拉伯糖274的培养基上，并在例如30℃生长一段时 间。通过例如将温度升高到42℃持续一段时间然后将温度降低到30℃来 开始编辑(例如，将转化的细胞基本上或很大程度上单一化)。允许集落 生长，并得到小集落276和大集落278。从该板挑选291集落，并将集落 布置在包含选择培养基(例如选择用于成功编辑galK的培养基)的第二板 292上，从而当铺在补充有作为唯一碳源的半乳糖的MacConkey琼脂上时， 会产生白色(与红色相比)集落。需注意，从第一板中挑选小集落293主 要会产生经编辑的细胞296(白色集落，在此示为空心圆)，以及在较低的 频率下，其中gRNA失活294的某些细胞(红色集落，在此处示为填实的 圆)。通过从第一个板中挑选295大集落278并将其铺在第二板中(集落 298)可以示出其中的gRNA为失活的集落，当这些细胞在补充有作为唯 一碳源的半乳糖的MacConkey琼脂上生长时会产生红色集落，从而确认失 活的gRNA或编辑机制的其他部分。因此，分别使用小集落和大集落形态 作为经编辑的和未经编辑的细胞的代表物，可为经编辑的细胞提供高通量 和简便的筛选方法。需注意，图2E和2F中描绘的方法采用既采用了单一 化或基本上单一化又采用了择优挑选策略。
本文所述的示例性工作流程采用了单一化的概念。单一化克服了偏向 于未经编辑的细胞的生长偏倚，从而允许经编辑的细胞与未经编辑的细胞 “平等计费”。此外，这些方法利用严格调控的诱导型系统从未经编辑细 胞中筛选经编辑的细胞(gRNA无法起作用的细胞和gRNA起作用但核酸 引导的核酸酶系统的某些组分无法起作用的细胞)。筛选可以使用复制板 进行，并鉴定出“逃避物”或其中gRNA无法起作用的细胞，筛选可以通 过利用经编辑的细胞相比于未经编辑的细胞的生长滞后来进行，或者可以 通过使用单一化或基本上单一化、初始生长、诱导编辑和归一化的组合来 进行富集。该方法的结果是，即使在编辑不是最佳的核酸引导的核酸酶系 统中(诸如在靶向非规范PAM的系统中)，观察到的编辑效率也有所提高； 也就是说，即使在未经编辑的细胞的大背景下也可以鉴定经编辑的细胞。
需注意，图2B-2F所描绘的方法示出了在细胞培养皿或96孔板中的 固体培养基上的细胞集落单一化、初始生长以及诱导编辑。本领域普通技 术人员应该认识到，鉴于本文的讨论，可以以其他形式来进行单一化、初 始生长和诱导编辑，诸如例如，在关于图3A-3F和4A–4CC所描述的实体 壁装置中，或在2018年9月24日提交的题为“Detection ofNuclease Edited Sequences in Automated Modules and Systems”的USSN 62/735,365和在 2018年12月18日提交的题为“Improved Detection of Nuclease Edited Sequencesin Automated Modules and Systems”的USSN 62/781,112中描述， 这两个专利包括对通过在功能化岛上分离细胞进行单一化或基本上单一 化、在疏水性载液或乳液中的凝胶珠(Gel Beads-in-Emulsion)(GEM，参 见例如10X Genomics,Pleasanton,CA)中携带的水滴中进行单一化或基本 上单一化或在聚合的藻酸盐支架内进行单一化或基本上单一化(对于该单 一化的实施例，另请参见2018年11月20日提交的题为“Improved Detection ofNuclease Edited Sequences in Automated Modules and Instruments via Bulk CellCulture”的USSN 62/769,805)的描述。
用于编辑、富集和选择经编辑的细胞的示例性模块
本文所述的仪器、方法和模块能够实现核酸引导的核酸酶编辑方法的 增强的观察到的编辑效率，这是由于单一化或基本上单一化、初始细胞生 长、诱导编辑和归一化的结果。单一化或基本上单一化、初始生长、诱导 编辑和归一化过程的组合克服了偏向于未经编辑的细胞的生长偏倚以及 编辑的适应性效应(包括差异编辑率)，从而使所有细胞都可以彼此“平 等计费”。本文描述的仪器、模块和方法的结果是，即使在编辑不是最佳 的核酸引导的核酸酶系统中(诸如在靶向非规范PAM的系统中)，观察到 的编辑效率也有所提高；也就是说，即使在未经编辑细胞的大背景下也可 以鉴定经编辑的细胞。观察到的编辑效率可以提高高达80％或更高。
图3A描绘了实体壁装置350和用于在实体壁装置中的微孔中单一化 细胞的工作流程，其中在该工作流程中，gRNA和核酸酶中的一者或两者 (优选两者)都在诱导型启动子的控制下。在图的左上角(i)处，描绘了 带有微孔352的实体壁装置350。基底350的一部分354在(ii)处示出， 其也描绘了微孔352。在(iii)处，示出了实体壁装置350的侧横截面，并且已经微孔352已经被装载，在该实施例中，已经进行了泊松或基本泊 松装载；也就是说，每个微孔具有一个或没有细胞，并且任何一个微孔具 有多于一个的细胞的可能性很低。在(iv)处，示出了工作流程340，其 中具有微孔352的基底350示出了每个微孔具有一个细胞的微孔356、在 微孔中没有细胞的微孔357以及在微孔中具有两个细胞的一个微孔360。 在步骤351中，使微孔中的细胞翻倍约2-150倍以形成克隆集落(v)，然 后通过加热基底(例如，对于温度诱导的编辑)或使化学物质在在基底下 方或上方流动(例如，糖，抗生素，对于化学诱导的编辑)或通过将实体 壁装置移至不同的培养基来诱导编辑353，如果将实体壁装置放置在膜上 (膜未示出)，膜形成微孔352的底部，则将实体壁装置移至不同的培养 基是特别容易的。
在诱导编辑353后，由于活性编辑造成的双链切割，已被编辑的细胞 集落中的许多细胞死亡，并且确实存活但在编辑之后必须修复并恢复的经 编辑的细胞存在生长滞后(微孔358)，其中未经历编辑的细胞茁壮成长(微 孔359)(vi)。所有细胞被允许继续生长以建立集落并归一化，其中微孔 358中的经编辑的细胞的集落的大小和/或细胞数量赶上微孔359中的未经 编辑的细胞(vii)。一旦细胞集落归一化，就可以汇集360微孔中的所有 细胞，在这种情况下，通过消除未经编辑的细胞的偏倚和编辑的适应性效 应，使细胞富集以用于经编辑的细胞；可选地，在编辑后监测微孔中的集 落生长，并且鉴定并选择361(例如，“择优挑选”)生长缓慢的集落(例 如，微孔358中的细胞)，从而使经编辑的细胞更加富集。
在培养细胞时，使用的培养基当然取决于被编辑的细胞的类型，例如 细菌、酵母或哺乳动物。例如，用于细菌生长的培养基包括LB、SOC、 M9最小培养基和Magic培养基；用于酵母细胞生长的培养基包括TPD、 YPG、YPAD和合成最小培养基；用于哺乳动物细胞生长的培养基包括 MEM、DMEM、IMDM、RPMI和Hanks。为了培养贴壁细胞，可将细胞 置于悬浮在培养基中的珠子或另一种类型的支架上。除从造血系统衍生的 细胞外，大多数正常的哺乳动物组织来源细胞均依赖锚定，并且需要表面 或细胞培养支持才能正常增殖。在本文所述的旋转生长瓶中，利用了微载 体技术。特定用途的微载体的直径通常为100-300μm，且密度略高于培养 基的密度(因此便于细胞和培养基的分离以进行，例如培养基更换)，但 密度还必须足够低以使载体以最小的搅拌速率完全悬浮，以避免对细胞的 流体动力破坏。可以使用许多不同类型的微载体，并且针对不同类型的细 胞优化了不同的微载体。有：带正电的载体，诸如Cytodex 1(基于葡聚糖， GE Healthcare)、DE-52(基于纤维素，Sigma-AldrichLabware)、DE-53(基 于纤维素，Sigma-Aldrich Labware)、HLX 11-170(基于聚苯乙烯)；胶原 蛋白或ECM(细胞外基质)涂层的载体，诸如Cytodex 3(基于葡聚糖， GE Healthcare)或HyQ-sphere Pro-F 102-4(基于聚苯乙烯，Thermo Scientific)；不带电的载体，例如HyQspheres P 102-4(Thermo Scientific)； 或基于明胶(Cultisphere，PercellBiolytica)或纤维素(Cytopore，GE Healthcare)的大孔载体。
图3B描绘了实体壁装置350和用于在实体壁装置中的微孔中基本上 单一化细胞的工作流程，其中在该工作流程中(如图3A中描绘的工作流 程)，gRNA和核酸酶中的一者或两者(优选两者)都在诱导型启动子的控 制下。在图的左上角(i)处，描绘了带有微孔352的实体壁装置350。基 底350的一部分354在(ii)处示出，其也描绘了微孔352。在(iii)处， 示出了实体壁装置350的侧横截面，并且微孔352已经被装载，其中，在 该实施例中，已经进行了基本上泊松装载；也就是说，一些微孔357没有 细胞，而一些微孔376、378有一些细胞。在图3B中，具有活性gRNA的 细胞被示为实体圆，而具有失活gRNA的细胞被示为空心圆。在(iv)处， 示出了工作流370，其中具有微孔352的基底350显示出所具有的几个细 胞全部都具有活性gRNA的三个微孔376、不具有细胞的微孔357、以及 所具有的细胞一些具有活性gRNA且一些具有非活性gRNA的两个微孔 378。在步骤371中，使微孔中的细胞翻倍约2倍-150倍以形成克隆集落 (v)，然后通过加热基底(例如，对于温度诱导的编辑)或在使化学物质 在基底的下方或上方流动(例如，糖、抗生素，对于化学诱导的编辑)或 通过将实体壁装置移至不同的培养基来诱导编辑373，如果将实体壁装置 放置在膜上，该膜形成微孔352的底部，则将实体壁装置移至不同的培养 基是特别容易的。
在诱导编辑373后，由于活性编辑造成的双链切割，已被编辑的细胞 集落中的许多细胞死亡，并且确实存活但在编辑之后必须修复并恢复的经 编辑的细胞存在生长滞后(微孔376)，其中未经历编辑的细胞茁壮成长(微 孔378)(vi)。因此，在微孔376中，只有具有活性gRNA的细胞存在(以 实体圆描绘的细胞)，大多数细胞死亡；然而，在含有具有非活性gRNA 的细胞的微孔378(以空心圆描绘的细胞)中，细胞继续生长并且不受活 性编辑的影响。每个微孔(376和378)中的细胞被允许生长以继续建立 集落并归一化，其中微孔376中经编辑的细胞的集落的大小和/或细胞数赶 上了微孔378中确实未进行编辑的未经编辑的细胞的大小和/或细胞数(vii)。需注意，在该工作流程370中，微孔中的细胞集落不是克隆的； 也就是说，并非孔中的所有细胞都来自单个细胞。替代地，孔中的细胞集 落可能是混合集落，在许多孔中出现从两种到几种不同的细胞。一旦细胞 集落归一化，就可以汇集390微孔中的所有细胞，在这种情况下，通过消 除未经编辑的细胞的偏倚和编辑的适应性效应，针对经编辑的细胞对细胞 进行富集；可选地，在编辑后监测微孔中的集落生长，并且鉴定并选择391 (例如，“择优挑选”)生长缓慢的集落(例如，微孔376中的细胞)，从 而使经编辑的细胞更加富集。
图3C为包括用于单一化细胞的微孔的实体壁基底的一种实施例的照 片。从照片中可以看出，实体壁基底为金属的穿孔盘，直径约为2英寸(～ 47mm)。在这张照片中看到的穿孔盘由316不锈钢制成，其中穿孔形成微 孔的壁，并使用过滤器或膜形成微孔的底部。使用过滤器或膜(诸如0.22μm 的PVDFDuroporeTM编织膜过滤器)允许培养基和/或营养物进入微孔，但 阻止细胞向下流动和流出微孔。可以用于实体壁单一化或基本上单一化/ 初始生长/诱导编辑和归一化或择优挑选装置和模块的过滤器或膜构件是： 耐溶剂的、在过滤过程中无污染的、并且能够保留感兴趣的细胞的类型和 大小。例如，为了保留小细胞类型(诸如细菌细胞)，孔径可以低至0.10μm， 然而对于其他细胞类型，孔径可以高至0.5μm。实际上，可用于细胞浓缩 装置/模块的孔径包括孔径为0.10μm、0.11μm、0.12μm、0.13μm、0.14μm、 0.15μm、0.16μm、0.17μm、0.18μm、0.19μm、0.20μm、0.21μm、0.22μm、 0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、 0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、 0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、 0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm和更大孔径的过滤器。过滤器可以由 任何合适的材料制成，包括纤维素混合酯(硝酸纤维素和醋酸纤维素) (CME)，聚碳酸酯(PC)，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚醚砜(PES)，聚 四氟乙烯(PTFE)，尼龙或玻璃纤维。
在图3C所示的照片中，穿孔的直径约为150μm至200μm，从而导致 微孔的体积约为2.5nl，总共约30,000个微孔。微孔的中心到中心之间的 距离约为279nm。尽管这里的微孔的体积约为2.5nl，但微孔的体积可以为 1至25nl，或优选为2至10nl，甚至更优选为2至4nl。微孔的优选大小/ 体积将取决于细胞的类型(例如细菌，酵母，哺乳动物)。此处显示的穿 孔盘由316不锈钢制成；然而，可以使用其他生物相容性金属和材料。实 体壁装置可以为一次性的，也可以为可重复使用的。图3C所示的实体壁 装置为圆形的，但是也可以为任何形状，例如正方形、矩形、椭圆形等(例 如，参见图4A)。如果使用培养皿经由例如petri培养皿或其他细胞培养皿 中的固体培养基向实体壁模块提供营养物，则圆形穿孔盘是有用的。用于 形成实体壁装置的微孔的底部的过滤器包括0.22μmPVDF DuroporeTM编织 膜过滤器。此外，尽管示出了直径为2英寸(～47mm)的穿孔盘，但穿孔 盘可以根据需要更小或更大，并且实体壁模块的配置将取决于如何将营养 物供应到实体壁模块以及如何进行培养基更换。例如，参见图4A的穿孔 构件和图4F-4BB中的实体壁模块的实施例。
图3D-3F分别为以低、中和高倍率放大的在具有膜底部的穿孔盘中的 微孔或穿孔中的经由泊松或基本上泊松分布基本上或很大程度上单一化 的大肠杆菌细胞的照片。图3D示出了在低倍率下的数字生长，其中较暗 的微孔为其中细胞正在生长的微孔。图3E为穿孔盘中的微孔的俯视图， 其中较暗的微孔为其中细胞正在生长的微孔。图3F为微孔的照片，其中 膜(例如，形成微孔的底部的可渗透膜)已被去除，其中无图案(光滑) 的微孔为细胞未生长的微孔，而具有不规则色素/图案化的微孔则是细胞正 在生长的微孔，并且在这张照片中，这些细胞已经填满了它们在其中生长 的微孔。在这些照片中，在高压下将0.2μm的过滤器(膜)锻压在穿孔盘 上，诸如图3C中所示的圆形穿孔盘。穿孔盘形成微孔的壁，且0.2μm的 过滤器形成微孔的底部。为了装载穿孔盘+过滤器，使用真空将大肠杆菌 细胞吸入微孔中(方法参见实施例6)。然后将穿孔盘+过滤器膜侧朝下放 置在LB琼脂板上，并使细胞在30℃过夜生长，然后在室温生长两天。除 去膜，并通过光学显微镜拍摄无底微孔。需注意，容易使用不同的选择培 养基选择某些细胞表型；也就是说，仅需要将穿孔盘+过滤器转移到包含 所需选择培养基的另一不同板或petri培养皿中。通常，装入单一化装置或 单一化组件中的细胞的数量约为穿孔或微孔数量的0.1倍至2.5倍之间， 或约为穿孔或微孔数量的0.3倍至2.0倍之间，或约为穿孔或微孔数量的 0.5倍至1.5倍之间。
图4A至图4BB描绘了不同实施例的各种部件以及实体壁单一化或基 本上单一化、生长、诱导编辑以及归一化或择优挑选模块(“实体壁分离/ 诱导/归一化模块”或“SWIIN”)的部件，该部件适合所有类型的细胞单 一化(或基本上单一化)、使细胞生长以进行例如初始的2-150轮细胞分裂、 诱导编辑以及归一化或择优挑选所得的细胞集落。所示的SWIIN模块可以 为独立装置，或者通常为自动化多模块细胞处理仪器中的一个模块。图4A 为形状大致为矩形的穿孔金属板或穿孔构件401的图示。穿孔未按比例呈 现。如同关于图3C-3F所述的穿孔盘一样，穿孔构件401由316不锈钢制 成，其中穿孔形成微孔的壁，并使用过滤器或膜(在此图4A中未看到) 形成微孔的底部。
在图4B所示的扫描电子显微照片中，穿孔(微孔)的直径约为 150μm-200μm，而穿孔构件的深度约为125μm，从而致使微孔的体积约为 2.5nl，总共约200,000个微孔。微孔的中心到中心之间的距离约为279μm。 尽管这里的微孔具有约为2.5nl的体积，但微孔的体积可以为1nl至25nl， 或优选为2 nl至10nl，或甚至更优选为2 nl至4nl。图4A中所示的穿孔构 件长约14cm，宽10cm(140mmx100mm)；然而，取决于穿孔构件中的微 孔的密度和所需的微孔或分区的数量，可以使用较小的穿孔构件(诸如图 3C所示)或较大的穿孔构件。例如，用于编辑细胞群体的文库的复杂性(例 如，复杂度)越大，则优选的微孔或分区的数量就越多。例如，如果使用 10,000个丛库来编辑细胞群体，那么具有200,000个微孔或分区的穿孔构 件将绰绰有余；然而，如果使用50,000个丛库来编辑细胞群体，则首选具 有总共400,000个或更多个微孔或分区的穿孔构件(或两个或更多个构件)。 通常，装入单一化装置或单一化组件中的细胞的数量的范围在穿孔或微的 孔数量的约0.1X至2.5X之间、或在穿孔或微孔的数量的约0.3X至2.0X 之间、或在穿孔或微孔的数量的约0.5X至1.5X之间；因此，装载到包含 约200,000个穿孔的穿孔构件上的细胞数量在约20,000个细胞至约500,000个细胞之间的范围内、或在约60,000个细胞至约400,000个细胞之间、或 在约100,000个细胞至约300,000个细胞之间的范围内。微孔的优选大小/ 体积将取决于细胞的类型(例如，古生菌，细菌，酵母，非哺乳动物真核 生物和/或被编辑的哺乳动物)。此处示出的穿孔构件由316不锈钢制成； 然而，可以使用其他生物相容性金属和材料，诸如钛、钴基合金和陶瓷。SWIIN可以为一次性的，也可以为可重复使用的。如果再次使用，可将 SWIIN加热到55℃或更高温度以对SWIIN进行灭菌，可选地，可通过 SWIIN冲洗抗生素。
图4B-4E为穿孔构件401的一部分的扫描电子显微照片(图4B)，不 带有形成微孔402的底部的过滤器膜的一个微孔402的特写照片(图4C) 以及带有形成微孔402的底部的过滤器膜的一个微孔402的特写照片(图 4D和4E)。图4B示出了穿孔构件401和30个左右的微孔402。图4C还 示出了穿孔构件401和单个微孔402，其中该微孔的直径约为172μm。图 4D示出了穿孔构件401和约8个微孔402，每个微孔具有形成微孔402的 底部的过滤器或膜403的一部分。图4E为来自图4D中所示的穿孔构件 401的微孔402中的一个的更高倍率的显微照片。如上文关于图3C-3F所 述，使用过滤器或膜(诸如0.22μm的PVDFDuroporeTM编织膜过滤器) 可以使培养基和/或营养物进入微孔，但阻止细胞向下流动并流出微孔。可 以用于在实体壁单一化或基本上单一化/初始生长/诱导编辑和归一化或择 优挑选模块中形成穿孔构件的微孔的底部的膜或膜构件是耐溶剂的、在过 滤过程中无污染的、在更换培养基和装载细胞所需的压力下不撕裂的、且 能够保留感兴趣的细胞的类型和大小的膜或膜构件。例如，为了保留小细 胞类型(诸如细菌细胞)，孔径可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型， 孔径可以高至0.5μm或更大。过滤器可以由任何合适的材料制成，包括纤 维素混合酯(硝酸纤维素和醋酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏 二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙或玻璃纤 维。穿孔构件401和过滤器403被模锻在一起；也就是说，在高压(例如 20kpsi)下将穿孔构件401和过滤器403压在一起。在一些实施例中，穿 孔构件中的孔眼或分区被蚀刻成稍微带有锥度，并且将过滤材料压入开口 中，然后松开以形成有效的型锻件，从而允许无粘合剂的联接。作为替代 方案，可以使用粘合剂。
图4F从顶部透视图描绘了单一化组件420a的一种实施例，其示出了 单一化组件420a的“截留物侧”。如本文所用，“单一化组件”包括作为顶 部构件的截留物构件404、作为底部构件的渗透物构件408、环绕穿孔构 件401的垫圈416以及过滤器403，其中垫圈416、穿孔构件401和过滤 器403被夹在截留物构件404和渗透物构件408之间。在图4F-4Q和图4Y所示的实施例中，截留物构件404和渗透物构件408分别是透明的，并且 约为200mm长、130mm宽和4mm厚，尽管在其他实施例中，截留物构件 和渗透物构件可以长75mm到350mm、或者长100mm到300mm、或者长 150mm到250mm；宽50mm到250mm、或者宽75mm到200mm、或者宽100mm到150mm；且厚2mm到15mm、或者厚4mm到10mm、或者厚 5mm到8mm。在图4F-4BB所示的实施例中，截留物构件由PMMA(聚 甲基丙烯酸甲酯)制成；然而，也可以使用其他材料，包括聚碳酸酯、环 烯烃共聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚砜、 聚氨酯以及这些和其他聚合物的共聚物。垫圈416是平坦的、周向环绕穿 孔构件401和过滤器403，并且由橡胶、硅树脂、丁腈橡胶、聚四氟乙烯， 诸如聚氯三氟乙烯的塑料聚合物或其他易于压缩的材料制成。
截留物构件404包括：大致光滑的上表面；单个分配通道405(这里 位于中心)，其从截留物构件404的顶表面到其底表面穿过截留物构件404 并且穿越截留物构件404的大部分长度(图4I对于其细节进行了描述)； 以及脊406a，脊406a在这里布置在截留物构件404的底表面上(例如， 邻近穿孔构件401)，其中，脊406a从一侧到另一侧(例如，从左到右)穿越截留物构件404的底部(在该实施例中，约有28个脊406a)。如本文 关于截留物构件或渗透物构件中的分配通道所使用的，“大部分长度”是 指截留物构件或渗透物构件的长度的约95％，或截留物构件或渗透物构件 的长度的约90％、85％、80％、75％或70％。流动导向器406形成在脊 406a之间。另外，截留物构件404具有单个端口407，端口407允许将细 胞引入到单一化组件420a中；还有分配通道盖413，分配通道盖413覆盖 了截留物构件404中的单个分配通道405。在该实施例中，分配通道405 的长约150mm且宽约1mm；截留物构件脊406a的高约0.5mm且长约80mm； 并且截留物构件流动导向器406的跨度约为5mm。单一化组件中的流体体 积的范围为5mL至100mL、或7.5mL至60mL、或10mL至40mL(需注 意，这是针对200K穿孔单一化组件)。
除了截留物构件404之外，还在图4F中看到的是紧固件412、包括垫 圈416的中心“夹心(sandwich)”层，垫圈416环绕布置在过滤器或膜 403上方的穿孔构件401(在该图4F中未示出各个部件)。在图4F中看到 的单一化组件420a的底层由渗透物构件408形成。像截留物构件404一样， 渗透物构件408包括一个或更多个渗透物构件分配通道、渗透物构件脊、 渗透物构件流动导向器和一个或更多个端口(在图4F中未示出，但图4G 可见)。单一化组件420和包括单一化组件420的SWIIN模块400由承受 4℃至60℃的温度的材料制成。SWIIN模块的加热和冷却由珀耳帖装置或 热电冷却器提供；或可以在例如多层SWIIN模块(参见例如图4BB和4CC) 中采用诸如逆向兰金(Rankine)蒸汽压缩制冷或吸收热泵之类的系统的组 合。
在图4A-4CC中所述的实体壁单一化或基本上单一化、生长、诱导编 辑和归一化和/或择优挑选模块(“实体壁分离/诱导/归一化模块”或 “SWIIN”)中，细胞和培养基(在适于穿孔构件的微孔中的细胞泊松分布 或基本上泊松分布的稀释度下)从截留物构件404中的一个或更多个端口 (在图4F中，有一个端口407)流入分配通道405，并且细胞再次以微孔中的细胞泊松分布或基本上泊松分布的方式沉淀在微孔中。由于细胞无法 通过过滤器403，因此它们被保留在微孔中。细胞装载后，可以经由截留 物构件将适当的培养基引入单一化组件中；也就是说，培养基是通过端口 411(图4G)引入的，并且培养基进入渗透物构件408中的分配通道409 (图4G)中，然后在渗透物构件408中的整个流动导向器410(图4G) 中进行分配。渗透物构件408中的培养基可以向上流过过滤器403，以滋 养装入微孔中的细胞。在操作中，一旦细胞沉积到微孔中，它们就会初始 生长例如2-100倍左右，例如通过将SWIIN的温度升高至42℃以诱导温 度诱导型启动子或通过从渗透物构件去除生长培养基(经端口411返回， 参见图4G)并用包含诱导诱导型启动子的化学组分的培养基替换生长培养 基来诱导编辑。一旦进行了编辑，可以降低温度或SWIIN，或者可以去除 诱导培养基并用缺乏化学组分的新鲜培养基代替，从而使诱导型启动子失 活。然后使细胞继续在SWIIN中生长，直到微孔中细胞集落的生长归一化。 一旦进行了归一化，就将集落从微孔中冲洗掉(例如，通过对渗透物构件 408施加压力，从而对过滤器403施加压力)，并汇集集落中的细胞；或者， 可选地，监测微孔中细胞集落的生长，并通过例如从微孔中吸移生长缓慢 的细胞到管或其他容器中来汇集生长缓慢的集落的细胞来直接选择慢生 长的集落，或可以选择来自各个微孔的集落，然后将其吸移到例如96孔 板或384-孔板的各个孔中。
可以通过自动化装置，诸如JoVE出售的那些自动化装置(ScanLagTM system,Cambridge,MA)来监测单一化组件中的集落生长(另见 Levin-Reisman等人，NatureMethods，7：737-39(2010))。例如哺乳动物 细胞的细胞生长可以通过例如IncuCyte(AnnArbor,MI)出售的生长监测 器进行监测(另见Choudhry，PLos One，11(2)：e0148469(2016))。此 外，可以使用自动化集落挑选器，诸如由例如TECAN(PickoloTM system,Mannedorf,Switzerland)；Hudson公司(RapidPickTM,Springfield,NJ)； MolecularDevices(QPix 400 TMsystem,San Jose,CA)；以及Singer Instruments(PIXLTMsystem,Somerset,UK)出售的自动化集落挑选器。
图4G从底部透视图描绘了图4F中的单一化组件420a的实施例，其 示出了单一化组件420a的渗透物构件408的底部。渗透物构件408包括： 大体上光滑的下表面(在图4G中，因为从底部观察单一化组件420a，所 以下表面朝向图4G的顶部)；两个分配通道(未示出)，其在此由分配通 道盖414覆盖、位于渗透物构件408的底部的两侧(左侧/右侧)。还可以 看到脊410a，其在此布置在渗透物构件408的顶表面上(其中图4G中的 渗透物构件408的顶表面朝下)并且从右到左横穿渗透物构件408的顶部 (在该实施例中，约有28个脊410a)，其中流动导向器410由脊410a形 成。另外，渗透物构件408具有两个端口411，端口411将流体递送至分 配通道(这里未示出，因为分配通道被分配通道盖414覆盖了)和从分配 通道去除流体。
除了渗透物构件404之外，还在图4F中看到的是紧固件412，包括垫 圈416的中心“夹心”层，垫圈416环绕与过滤器或膜403模锻在一起的 穿孔构件401(在该图4G中未示出各个部件)。在图4G中看到的单一化 组件420a的最底层为截留物构件404。应当注意，在图4F-4CC所示的实 施例中，紧固件412是举例说明的；然而，也可以使用其他手段来固定截留物构件404、垫圈416、穿孔构件401、过滤器403以及渗透物构件408， 诸如使用粘合剂(诸如压敏粘合剂)、超声波焊接或结合、溶剂结合、配 合配件、或者粘合剂、焊接、溶剂结合和配合配件的组合；以及其他此类 紧固件和联接器来固定。
图4H从侧视分解透视图描绘了图4F和图4G的单一化组件420a的实 施例。从图4H的顶部可以看到，截留物构件404包括：单个分配通道405， 其从截留物构件404的顶表面到其底表面穿过截留物构件404并且穿越截 留物构件404的大部分长度(图4I对其细节进行了描述)；脊406a，其布 置在截留物构件404的底表面上并从左到右穿越截留物构件404的底表面 (在该实施例中，约有26个脊406a)；以及在脊406a之间形成的流动导 向器406。另外，截留物构件404具有单个端口407，端口407允许将细 胞和其他流体引入到截留物构件404中并因此引入到单一化组件420a中或 从截留物构件404中并因此从单一化组件420a中去除。还存在分配通道盖 413，该分配通道盖413被配置为装配到单个分配通道405中并覆盖单个 分配通道405。
在单一化组件420a的此分解图中可以更清楚地看到垫圈416、穿孔构 件401和过滤器403，其中穿孔构件401和过滤器403具有非常相似的尺 寸(如果不是相同的尺寸)，并且垫圈416被配置为环绕穿孔构件401和 过滤器403，并在截留物构件404和渗透物构件408之间提供防漏密封。 在图4H中，从上向下看渗透物构件408，其中渗透物构件408包括：纵向定位在渗透物构件408的两侧(左右侧)上的两个分配通道409；脊410a， 其在此布置在渗透物构件408的顶表面上，并从一侧到另一侧(从左到右 穿越渗透物构件408的顶部(在此实施例中，约有28个脊410a)；以及形 成在渗透物构件408中的脊410a之间的流动导向器410。另外，渗透物构 件408具有两个端口411(在图4H中仅看到其中一个)，其中端口411递 送流体并从分配通道409去除流体。还可以看到还未就位覆盖分配通道409 的分配通道盖414。在图4H中还可见到紧固件412，尽管如此，同样也可 以使用用于固定单一化组件420a的部件的其他手段，并且优选地将这些手 段用于生产单一化组件。
图4I为截留物构件404的顶表面的特写侧视透视图，截留物构件404 包括：端口407(此处具有从流体源到截留物构件404中的端口407的鲁 尔连接件)；分配通道405，其从截留物构件404的顶表面到其底表面穿越 截留物构件404并且穿越截留物构件404的大部分长度，并且被配置为将 流体递送至截留物构件408的底表面上的流动导向器406(和从其除去流 体)。分配通道405包括流动导向器孔眼415，流动导向器孔眼415与流动 导向器406相对应，与流动导向器孔眼415一样位于截留物构件脊406a 之间的分配通道405中。分配通道盖413布置在截留物404的顶表面上， 覆盖分配通道405(并形成其顶表面)。
图4J为单一化组件420a的特写侧视横截面图。在图4J中，可以看到 截留物端口407(具有从流体源到端口407的鲁尔连接件)，也可以看到垫 圈416，穿孔构件401和过滤器403模锻在一起并布置在截留物构件404 和渗透物构件408之间。还看到的是布置在截留物构件404的底表面上的 脊406a以及形成在脊406a之间的流动导向器406。另外，可看到渗透物 构件408的脊410a以及形成在脊410a之间的流动导向器410。需注意， 截留物构件404上的脊406a和渗透物构件408上的脊410a通过穿孔构件 401和过滤器403连接并彼此重合，仅由穿孔构件401和过滤器403分开， 因此，流动导向器406和流动导向器410也彼此重合。还看到流动导向器 孔眼415，因为导向器孔眼415与流动导向器406都被定位在截留物构件脊406a之间，所以流动导向器孔眼415与流动导向器406相对应。截留物 构件404上的脊406a和渗透物构件408上的脊410a不仅分别在截留物构 件404和渗透物构件408中形成流动导向器406和410，而且通过在整个 单一化组件420上分配压力并防止过滤器或膜403撕裂而向单一化组件 420提供支撑。
图4K从顶部透视图描绘了单一化组件420b的另一实施例，其示出了 单一化组件420b的“截留物侧”。在图4K中看到的单一化组件420b的实 施例与在图4F-4H中看到的单一化组件420a的不同之处在于，图4K-4M 中的截留物构件404具有在截留物构件404的两侧(左右侧)纵向布置的 两个分配通道405，而不是沿截留物构件404的中部朝下纵向布置的单个 分配通道405。如在图4F-4H中一样，图4J-4M的截留物构件404包括： 大体上光滑的上表面；两个分配通道405，其从截留物构件404的顶表面 到其底表面穿越截留物构件404并且在穿越截留物构件404的大部分长度； 以及脊406a，该脊406a布置在截留物构件404的底表面上，并从左至右 从一侧到另一侧穿越截留物构件404的底部(在该实施例中，约有28个截留物构件脊406a)。流动导向器406形成在截留物构件404上的脊406a 之间。另外，截留物构件404具有两个端口407，端口407允许将细胞和 培养基引入单一化组件420b中(以及从单一化组件420b中去除)。还存 在分配通道盖413，其覆盖两个分配通道405并且实际上提供分配通道405 的顶表面。
除了截留物构件404之外，还可在图4K中看到紧固件412、包括垫圈 416的中心“夹心”层，垫圈416环绕与过滤器或膜403模锻在一起(并 定位在其上方)的穿孔构件401(在该图4K中未看到各个部件)。在图4K 中看到的单一化组件420b的底层由渗透物构件408形成。像截留物构件 404一样，渗透物构件408包括一个或更多个(如图4L所示，有两个)渗 透物构件分配通道、多个脊和流动导向器、以及一个或多个端口(其未在 图4K中示出，但图4L可见)。
如先前关于图4F-4H所述，在图4F-4CC中所述的实体壁单一化或基 本上单一化、生长、诱导编辑和归一化或择优挑选模块(“实体壁分离/诱 导/归一化模块”或“SWIIN”)中，细胞和培养基(在适于穿孔构件的微 孔中的细胞泊松分布或基本上泊松分布的稀释度的下)从截留物构件404 中的两个端口407流入分配通道405，并且细胞再次以微孔中的细胞泊松 分布或基本上泊松分布的方式沉淀在微孔中。由于细胞无法通过过滤器 403，因此细胞被保留在穿孔构件401的微孔中。适当的培养基通过渗透 物构件408引入单一化组件420b中。培养基向上流过过滤器403以滋养 细胞。因此，在操作中，将细胞沉积到微孔中，进行初始(例如，2-100 倍)生长，通过例如将SWIIN的温度升高至42℃以诱导温度诱导型启动子或通过从渗透物构件中去除生长培养基，并用包含诱导诱导型启动子的 化学组分的培养基代替生长培养基来诱导编辑。一旦允许进行编辑，就可 以降低SWIIN的温度，或者可以去除诱导培养基，并用缺少化学组分的新 鲜培养基代替，从而活化诱导型启动子。然后细胞被允许继续在SWIIN中 生长，直到微孔中细胞集落的生长归一化。一旦集落归一化，就将集落从 微孔中冲洗掉(通过向渗透物构件通道和流动导向器施加压力，从而向过 滤器施加压力)并汇集；可选地，监测微孔中细胞集落的生长，并通过例 如从缓慢生长的集落中汇集细胞来直接选择缓慢生长的集落。
图4L从底部透视图示出了图4K中的单一化组件420b的实施例，其 示出了单一化组件420b的渗透物构件408的底部。渗透物构件408包括： 大体上光滑的下表面(在图4L中，因为从底部观察单一化组件420b，所 以下表面朝向图4L的顶部)；由分配通道盖414(在此位于渗透物构件408 的两侧(左右侧)上)覆盖的两个分配通道(未示出)、脊410a，其布置在渗透物构件408的顶表面上(其中图4L中的渗透物构件408的顶表面 “朝下”)并且从一侧到另一侧穿越渗透物构件408的顶部(在该实施例 中，约有28个脊410a)，并且在脊410a之间形成流动导向器410。另外， 渗透物构件408具有两个端口411，其将流体递送至分配通道(这里未示 出分配通道，因为它们被分配通道盖414覆盖)(和从分配通道去除流体) 并且然后递送至流动导向器410。
除了渗透物构件404之外，还在图4L中看到的是紧固件412、包括垫 圈416的中心“夹心”层，垫圈416环绕穿孔构件401，该穿孔构件401 与过滤器或膜403模锻在一起并定位在过滤器或膜403上方(在该图4L 中未示出各个部件)，并且图4L中所示的单一化组件420b的最底层为截 留物构件404。再次应当注意，在图4F-4CC所示的实施例中，紧固件是举 例说明的；然而，也可以使用其他手段来固定截留物构件408、垫圈416、 穿孔构件401，过滤器403和渗透物构件408，诸如通过粘合剂、超声波 焊接或结合、溶剂结合，配合配件、或者粘合剂、焊接、溶剂结合和配合 配件的组合；以及其他此类紧固件和联接器来固定。
图4M从侧视分解透视图示出了图4K和4L的单一化组件420b的实 施例。从图4M的顶部可以看到，截留物构件404包括：位于截留物构件 404的两侧(左右侧)上的两个分配通道405，这两个分配通道均从截留 物构件404顶表面到其底表面穿越截留物构件404并且穿越截留物构件 404的大部分长度；脊406a，其布置在截留物构件404的底表面上并从一 侧到另一侧穿越截留物构件404的底表面(在该实施例中，约有28个脊 406a)；以及形成在脊406a之间的流动导向器406。另外，截留物构件404 具有两个端口407，端口407允许细胞和其他流体通过分配通道405被引 入单一化组件420a中(以及从中去除)。还存在两个分配通道盖413，其 被配置为装配到两个分配通道405中并覆盖两个分配通道405。
在单一化组件420b的此分解图中可以更清楚地看到垫圈416、穿孔构 件401和过滤器403，其中穿孔构件401和过滤器403具有非常相似的尺 寸，并且垫圈416被配置为环绕穿孔构件401和过滤器403以固定穿孔构 件401和过滤器403，并在截留物构件404和渗透物构件408之间提供防 漏密封。在图4M中，从上向下看渗透物构件408，其中渗透物构件408包括：在渗透物构件408的两侧(左右侧)上的纵向定位的两个分配通道 409，这两个分配通道均从渗透物构件408的底表面到其顶表面穿越渗透 物构件408并且穿越渗透物构件408的大部分长度；脊410a，其在此布置 在渗透物构件408的顶表面上并从一侧到另一侧穿越渗透物构件408的顶 表面；以及形成在脊410a之间的流动导向器410。另外，渗透物构件408具有两个端口411，在该图4M中看到的为截留物构件404上的端口，当 组装单一化组件420b时，该两个端口411流体地连接至渗透物构件408 上的分配通道409，分配通道409连接至流量分布器410，并因此连接至 布置在渗透物构件408上的过滤器403。还可以看到分配通道盖414，在 该分解图中，分配通道盖414与单一化组件420b分离，并且未插入渗透 物构件408中以覆盖分配通道409。在图4M中还可看到用于紧固件412 (紧固件未示出)的孔眼，尽管如此，同样，紧固件之外的其他手段也可 用于固定单一化组件420b的部件。
图4N从顶部透视图描绘了单一化组件420c的另一实施例，其呈现了 单一化组件420c的“截留物侧”。在图4N中看到的单一化组件420c的实 施例与在图4F-4H中看到的单一化组件420a的不同之处在于，图4N-4P 中的截留物构件404具有在截留物构件404的两侧(左右侧)纵向布置的 两个分配通道405，而不是沿截留物构件404的中部朝下纵向布置的单个 分配通道405。图4N中看到的单一化组件420c的实施例与在图4K-4M中 看到的单一化组件420b的不同之处在于，图4N-4P中的截留物构件404 中的分配通道405(以及渗透物构件408中的分配通道409)的构造不同 于图4K-4M中的构造。图4N-4P中的分配通道405(以及分配通道409) 是分支的；也就是说，在图4N-4P所示的单一化组件的实施例中，代替在 端口407直接与分配通道405相交的点处直接将流体递送至分配通道405 中的端口407，而是将流体先流入端口407，然后流入截留物构件407两 侧(左右侧)上的分支的分配通道405。分支的分配通道具有第一导管， 该第一导管终止于截留物构件404的长度的约一半，其中第一导管然后分 支成两个次级导管，两个次级导管分支成四个三级导管，并且这些三级导管将流体递送至沿截留物构件的长度上延伸的最终导管，从而将流体均匀 地分配递送到流动导向器406。
需注意，分配通道的任何构造(例如，截留物构件404上的分配通道 405和渗透物构件408上的分配通道409)都可以用在截留物构件404或 渗透物构件408上，只要分配通道将流体适当地分配给流动导向器406或 流动导向器410即可。如图4F至图4H所示，截留物构件404上的分配通 道405的构造与渗透物构件408上的分配通道409的构造可以不同，或者如图4K-4M和图4N-4P所示，截留物构件404上的分配通道405的构造 与渗透物构件408上的渗透物构件分配通道409的构造可以相同。如在图 4K-4M中一样，图4N-4P的截留物构件404包括：大体上光滑的上表面； 两个分配通道405，其中一个分配通道在截留物构件404的左侧，另一个 在截留物构件404的右侧，该两个分配通道405从截留物构件404的顶表 面到其底表面穿越截留物构件404并分支，从而在截留物构件404的长度 上分配流体。
截留物构件404还包括脊406a，脊406a布置在截留物构件404的底 表面上并且从一侧到另一侧穿越截留物构件404的底部。另外，并且如在 先前的实施例中一样，在截留物构件404上的脊406a之间形成有流动导向 器406；以及两个端口407，其将细胞和培养基引入并分配到单一化组件 420c的截留物构件404中(以及从中去除细胞和培养基)。还可以看到分 配通道盖413，它覆盖了截留物构件404上的两个分支的分配通道405， 并实际上提供了分支的分配通道405的顶表面。需注意，在该实施例中， 分配通道405的分支为截留物构件404的一部分；然而，截留物构件404 可以不包括分支，并且分支可以被表征在与截留物构件404配合的分配通 道盖413上。
除了截留物构件404之外，还在图4N中看到的是紧固件412、包括垫 圈416的中心“夹心”层，垫圈416环绕穿孔构件401，穿孔构件401与 过滤器或膜403模锻在一起并定位在过滤器或膜403上方。在图4N中所 示的单一化组件420c的底层由渗透物构件408形成。像截留物构件404 一样，渗透物构件408包括一个或更多个(如图4O所示，有两个)分配 通道(在这里，这些分配通道是分支的)、脊、流动导向器和一个或更多 个端口(在图4N中均未示出，但是图4O可见)。
图4O从底部透视图示出了图4N中的单一化组件420c的实施例，其 呈现了单一化组件420c的渗透物构件408的底部。渗透物构件408包括： 大体上光滑的下表面(在图4O中，因为从底部观察单一化组件420c，所 以下表朝向图4O的顶部)；被分配通道盖414覆盖的两个分支的分配通道 409；脊410a，其布置在渗透物构件408的顶表面上(其中，在图4O中， 渗透物构件408的顶表面面朝下)并且从一侧到另一侧穿越渗透物构件408 的顶表面；以及形成在脊410a之间的流动导向器410。另外，渗透物构件 408具有两个端口411，该两个端口411将流体递送至分支的分配通道409 并递送至流动导向器410。如同截留物构件404和分配通道盖413一样， 渗透物构件408中的分配通道409的分支为渗透物构件408的一部分；然而，渗透物构件408可不包括分支，并且该分支可以替代地被表征在与渗 透物构件408配合的分配通道盖414上。
除了渗透物构件404之外，还在图4O中看到的是紧固件412、包括垫 圈416的中心“夹心”层，垫圈416环绕穿孔构件401，该穿孔构件401 与过滤器或膜403布置在过滤器或膜403上方(在该图4M中未示出各个 部件)，并且图4O中所示的单一化组件420a的最底层为截留物构件404。
图4P从侧视分解透视图示出了图4N和4O的单一化组件420c的实施 例。从图4P的顶部可以看到，截留物构件404包括：位于截留物构件404 的两侧(左右侧)上的两个分支的分配通道405，这两个分支的分配通道 均从截留物构件404顶表面到其底表面穿越截留物构件404并且穿越截留 物构件404的大部分长度；脊406a，其布置在截留物构件404的底表面上 并从一侧到另一侧穿越截留物构件404的底表面；以及形成在脊406a之间 的流动导向器406。另外，截留物构件404具有两个端口407，该两个端 口407被流体地联接至分支的分配通道405和流动导向器406并且被配置 为将细胞及其他流体引入到单一化组件420a中(以及从单一化组件420a 中去除)。还存在分配通道盖413，其被配置为装配到两个分支的分配通道 405中并覆盖两个分支的分配通道405。
在单一化组件420c的此分解图中可以清楚地看到垫圈416、穿孔构件 401和过滤器403，其中穿孔构件401和过滤器403具有非常相似的尺寸， 并且垫圈416被配置为环绕穿孔构件401和过滤器403并在截留物构件404 和渗透物构件408之间提供防漏密封。在图4P中，从上向下看渗透物构 件408，其中渗透物构件408包括在渗透物构件408的两侧(左右侧)上 纵向地定位的两个分支的分配通道409，这两个分支的分配通道均从渗透 物构件408的底表面到其顶表面穿越渗透物构件408并为渗透物构件408 的大部分长度提供分支的导管。渗透物构件408进一步地包括脊410a，脊 410a在此被布置在渗透物构件408的顶表面上并且从一侧到另一侧穿越渗 透物构件408的顶部；以及形成在渗透物构件脊410a之间的流动导向器 410。另外，渗透物构件408具有两个端口411(在图4P中只能看到一个 端口411)。还可以看到分配通道盖414，在该分解图中与单一化组件420c 分开，并且没有插入以覆盖分支的分配通道409。在图4N中还可以看到紧 固件412，尽管如此，同样，可以使用紧固件以外的其他手段来固定单一 化组件420c的部件。
图4Q为如图4N和图4P所示的从截留物构件404的顶部观察的特写 俯视图。看到的是布置在截留物构件404的底表面上并且从一侧到另一侧 穿越截留物构件404的底表面的脊406a以及形成在脊406a之间的流动导 向器406。另外可以看到分配通道405，该分配通道405包括配置为向流 动导向器406中分配流体的流动导向器孔眼，其中分配通道405被分配通 道盖413覆盖。
图4R为截留物构件404的特写剖视图，截留物构件404具有脊406a 和形成在脊406a之间的流动导向器406。还可以看到渗透物构件408，其 具有脊410a和形成在渗透物构件脊410a之间的流动导向器410。垫圈416、 穿孔构件401和过滤器403介于截留物构件404和渗透物构件408之间。 需注意，截留物构件404上的脊406a与脊410a彼此重合，仅由穿孔构件 401和过滤器403分开。如前所述，脊406a和脊410a为穿孔构件401和 过滤器403提供支撑，并降低了过滤器403在例如细胞装载或培养基更换 期间撕裂的可能性。
图4S-4W描绘了实体壁单一化或基本上单一化、生长、诱导编辑以及 归一化和择优挑选(SWIIN)模块400的一种实施例的不同视图。图4S 呈现了SWIIN模块400的侧视透视图。SWIIN模块400包括例如图4F-4H、 4K-4M和4N-4P中所示的示例性单一化组件中的一种，单一化组件被容纳 在SWIIN盖440中并且为SWIIN模块的一部分。SWIIN盖440的各种部 件包括储器盖442、把手441、窗口444(示为六个窗口)、支脚443以及 条形码(或其他识别信息)445。需注意，在图4S-4Z所描绘的实施例中， 窗口为圆形的；然而，本领域普通技术人员应该认识到，窗户可以为任何 形状。通常，希望截留物构件的30％或更多可供观察，以获取有关细胞装 载的合理子样本统计数据。还可以看到储器组件盖430a，在该实施例中， 储器组件盖430a没有与SWIIN盖440模制在一起，而是位于SWIIN盖440 的储器盖部分442内。储器组件盖430a包括四个储器进入孔口(432a、432b、 432c和432d)和四个气动进入孔口(433a、433b、433c、433d)。在大多 数实施例中，气动进入孔口433a、433b、433c和433d包括过滤器以防止 污染。
窗口444可以用于经由相机(例如，摄像机)监测细胞装载和/或细胞 生长。例如，摄像机可以用于通过例如基于空孔的图像的密度变化测量用 相衬的方式来监测细胞的生长，或者如果可能的话，使用例如显色标志物 (诸如显色蛋白质)为细胞添加可区分的颜色来监测细胞的生长。显色标 志物，诸如blitzen蓝色(blitzen blue)、dreidel蓝绿色(dreidel teal)、virginia 紫色(virginia violet)、vixen紫色(vixen purple)、prancer紫色(prancerpurple)、 tinsel紫色(tinsel purple)、maccabee紫色(maccabeepurple)、donner洋红 色(donner magenta)、cupid粉色(cupid pink)、seraphina粉色(seraphinapink)、scrooge橙色(scrooge orange)和leor橙色(leor orange)((the ChromogenicProtein Paintbox，所有的都可从ATUM(Newark，CA)获得) 消除了使用荧光的需要，但是也可以使用荧光细胞标志物、荧光蛋白和化 学发光细胞标志物。
图4T为SWIIN模块400的俯视图，其示出了SWIIN盖440及其各种 部件，这些部件包括储器盖442、把手441、窗口444(示出为六个窗口)、 支脚443和条形码(或其他识别信息)445。还可以看到位于SWIIN盖440 的储器盖部分442内的储器组件盖430a，其中，储器组件盖430a包括四 个储器进入孔口(432a、432b、432c和432d)和四个气动进入孔口(433a、433b、433c和433d)。
图4U为SWIIN模块400的侧视图，描绘了SWIIN盖440、储器盖 442、把手441和支脚443。图4V为从SWIIN模块400的条形码“端”朝 向SWIIN模块400的储器“端”观察的视图。可以看到SWIIN盖400、 储器盖442、把手441和支脚443。图4W为SWIIN模块400的底部透视 图，示出了SWIIN盖440、储器盖442、支脚443以及布置在渗透物构件 408的底部上的分配通道盖414。
图4X-4Z描绘了储器组件430的视图。在图4X中，储器组件430布 置在单一化组件420上，单一化组件420包括：截留物构件404；分配通 道盖413；垫圈、穿孔构件和过滤器组件(未清楚示出)以及渗透物构件 (也未清楚示出)。储器组件430包括储器组件盖430a，其中，储器组件 盖430a包括四个储器进入孔口(432a、432b、432c和432d)以及四个气 动进入孔口(433a、433b、433c和433d)。
图4Y为通过SWIIN盖440的“储器”端截取的储器组件430的横截 面的顶部透视图。可以看到SWIIN盖440的支脚443。可以看到储器431a、 431b、431c和431d以及储器/通道端口434a、434b、434c和434d。储器 431b和431c流体地联接至导管，该导管流体地联接至截留物构件上的分 配通道或者流体地联接至渗透物构件上的分配通道，且储器431a和431d 流体地联接至导管，该导管流体地联接至截留物构件上的分配通道或者流 体地联接至渗透物构件上的分配通道；也就是说，如果储器431b和431c 流体地联接至与截留物构件上的分配通道联接的导管，则储器431a和431d 流体联接至与渗透物构件上的分配通道联接的导管。然而，任何储器可被 配置用于将流体递送至截留物构件404或渗透物构件408或将流体从截留 物构件404或渗透物构件408去除。储器431a、431b、431c和431d通常 具有5.0mL到100mL或7.5mL到60mL、或10mL到40mL的体积(这些 体积用于200K单一化组件)。需注意，储器431a、431b、431c和431d在 通向储器/通道端口434a、434b、434c和434d的储器的部分中呈漏斗形， 并且有助于从储器431a、431b、431c和431d递送流体。
图4Z示出了四个共连接的储器435的三个不同的视图。上面的图为 共连接的储器435的俯视图，中间的图为共连接的储器435的侧视图，且 下面的图为共连接的储器435的仰视图。在所有附图中都可看到储器431a、 431b、431c和431d，并且在俯视图和仰视图中可看到储器/通道端口434a、 434b、434c和434d。
图4AA为适用于图4S-4W所示的SWIIN模块并且例如利用关于图 4F-4R所述的单一化组件的示例性气动框图。需注意，每个储器(两个截 留物储器(RR1和RR2)和两个渗透物储器(PR1和PR2))各有两个电 磁阀(SV)，其中一个阀用于气动，另一个阀用于阻塞管线。需注意，每 对电磁阀都有一个流量计。同样，在该实施例中，存在为所有储器提供服 务的单个歧管；然而，其他实施例可以采用两个歧管，其中一个歧管服务 于PR1和RR1，另一个歧管服务于PR2和RR2，或者每个储器(PR1，RR1，PR2，RR2)由单独的歧管服务。
图4BB示出了双层SWIIN模块460，其具有包括两个单一化组件的壳 体(在图4BB中看不到单一化组件)。图4CC以图形方式描绘了包括四个 单一化组件420的四层SWIIN模块465。图4BB以图形方式描绘了珀耳帖 装置466和具有强制气流468的风扇467，风扇467可用于将四个单一化 组件420保持在所需温度；然而，需注意，在多层SWIIN中，可以使用系 统(诸如反向Rankine蒸气压缩制冷或吸收式热泵)的组合。
Figure BDA0003517636680000631
Figure BDA0003517636680000641
Figure BDA0003517636680000651
Figure BDA0003517636680000661
Figure BDA0003517636680000671
图4DD为双层SWIIN的示例性气动架构图，其与表1和表2一起示 出了用于对关于图4BB描述的SWIIN模块中的细胞进行单一化或基本上 单一化、生长、启动编辑并归一化的气动装置的一种实施例。参见图4DD， 看到了四个渗透物储器(PR1、PR2、PR3和PR4)和四个截留物储器(RR1、 RR2、RR3和RR4)。有四个流量计(FM1、FM2、FM3和FM4)、十个三 通电磁阀(“三通SV”)、压力传感器、用于调节压力的比例阀(prop valve)、 以及能够递送-5psi至5psi的压力的泵。代号NC表示“常闭(normally closed)”，NO表示“常开(normally open)”，C表示“关闭”。对于细胞浓 缩过程的每个步骤，表1提供了图4CC中所示的每个阀的状态以及由压力 传感器1和2检测到的压力。在表1中，对于泵，1＝打开，且0＝关闭。对 于电磁阀，1＝通电，且0＝断电。对于细胞浓缩过程的每个步骤，表2提供 了每个储器(即四个截留物储器和四个渗透物储器)中的流体的体积(单 位mL)。示出了穿孔构件401，以及温度区499。
除了关于图3A-3E和4A-4BB描述的实体壁细胞单一化装置(SWIIN) 之外，在多模块细胞处理仪器中可以采用其他细胞单一化(或基本上单一 化)装置，诸如在2018年9月24日提交的题为“Detection of Nuclease Edited Sequences in Automated ModulesandSystems”的USSN 62/735,365和在 2018年12月18日提交的题为“ImprovedDetectionof Nuclease Edited Sequences inAutomatedModules and Systems”的USSN62/781,112中所描 述的那些细胞单一化装置，包括通过在琼脂上铺板进行单一化或基本上单 一化、通过在功能化岛上分离细胞进行单一化或基本上单一化、在疏水性 载液或GelBeads-in-Emulsion(GEM，参见例如，10X Genomics,Pleasanton, CA)中携带的水滴中进行单一化或基本上单一化、或在聚合的藻酸盐支架 内进行单一化或基本上单一化(对于这种单一化的实施例，另请参见2018 年11月20日提交的题为“Improved DetectionofNucleaseEditedSequences in Automated Modules and Instruments via Bulk CellCulture”的USSN 62/769,805)。
自动化细胞编辑仪器和模块
自动化细胞编辑仪器
图5A描绘了示例性自动化多模块细胞处理仪器500，其例如用于进行 下文描述的一个示例性工作流程，示例性自动化多模块细胞处理仪器500 包括本文所述的一个或更多个试剂盒。仪器500例如可以并且优选地被设 计为在实验室环境中使用的独立台式仪器。仪器500可以包含可重复使用 的部件和一次性部件的混合，以在进行细胞自动化基因组裂解和/或编辑中 进行各种集成过程。示出了门架(gantry)502，其提供自动化机械运动系统(致动器)(未示出)，该自动化机械运动系统向例如包括空气置换移液 器(airdisplacement pipettor)532的自动化(即，机器人)液体处理系统 558提供XYZ轴运动控制，这允许在多个模块之间进行细胞处理，而无需 人工干预。在一些自动化多模块细胞处理仪器中，空气置换移液器532由 门架502移动，并且各种模块和试剂盒保持静止；然而，在其他实施例中， 当各种模块和试剂盒移动时，液体处理系统558可以保持静止。自动化多模块细胞处理仪器500中还包括试剂盒510，试剂盒510包括储器512和 转化模块530(例如，如关于图8A-8E详细描述的流通式电穿孔装置)以 及包括储器506的清洗盒504。清洗盒504可被配置为容纳大的管，例如 清洗溶液或在整个迭代过程中经常使用的溶液。在一个示例中，清洗盒504 可被配置为当两个或更多个试剂盒510被顺序地使用和更换时保持在原位。尽管试剂盒510和清洗盒504在图5A中被示为分离的盒，但是清洗盒504 的内容物可以并入到试剂盒510中。试剂盒510和清洗盒504可以是相同 的，除了插入其中的消耗品(试剂或其他的包含在各种插入物中的组分) 之外。需注意，在该实施例中，转化模块530被容纳在试剂盒510内；然 而，在替代实施例中，转化模块530被包含在其自己的模块内，或者可以 为另一个模块(诸如生长模块)的一部分。
在一些实施方式中，清洗盒504和试剂盒510包括被设置用于自动化 多模块细胞处理/编辑仪器500中的一次性套件(各种插入物和试剂中的一 种或更多种)。例如，在活化细胞处理之前，用户可以在自动化多模块细 胞编辑仪器500的机架内打开并放置试剂盒510和清洗盒504中的每一个， 试剂盒510和清洗盒504包括各种所需的插入物和试剂。
在图5A中还示出了包括门架502和空气置换移液器532的机器人液 体处理系统558。在一些示例中，机器人处理系统558可以包括自动化液 体处理系统，诸如由TecanGroup Ltd.of Mannedorf,Switzerland,Hamilton Company of Reno,NV制造的(例如，参见WO2018015544A1)或由Beckman Coulter,Inc.of Fort Collins,CO.制造的(例如，参见US20160018427A1)。 可将移液管吸头设置在移液管移送吸头供应器(未示出)中，以与空气置 换移液器532一起使用。
在一些实施方式中，清洗盒504和试剂盒510的插入物或部件被标有 诸如条形码之类的机器可读标记(未示出)，以被机器人处理系统558识 别。例如，机器人液体处理系统558可以扫描清洗盒504和试剂盒510中 的每者内的一个或更多个插入物，以确认内容物。在其他实施方式中，可 以在每个清洗盒504和试剂盒510上标记机器可读标记，并且自动化多模 块细胞编辑仪器500的处理系统(未示出，但是参见图5B的元件526)可 以基于机器可读标记识别出存储的材料图。图5A的示例性自动化多模块 细胞处理仪器500进一步包括细胞生长模块534。(需注意，下面将详细描 述此处简要叙述的所有模块。)在图5A所示的实施例中，细胞生长模块534 包括两个细胞生长瓶518、520(在下面关于图6A-6D更详细地描述)以 及细胞浓缩模块522(关于图7A-7H详细地描述)。在替代实施例中，细 胞浓缩模块522可以与细胞生长模块534分离，例如在单独的专用模块中。 还示出单一化模块540为图5A的自动化多模块细胞处理仪器500的一部 分，单一化模块540由例如机器人液体处理系统558和空气置换移液器532 服务。还可看到可选的核酸组装/脱盐模块514，其包括反应室或管接受器 (未示出)和磁体516，以允许使用例如磁性固相可逆固定化(SPRI)珠 (AppliedBiologicalMaterials Inc.,Richmond,BC)来纯化核酸。下文更详 细地描述了细胞生长模块、细胞浓缩模块、转化模块、试剂盒和核酸组装 模块、以及上文关于图3A-3E和4A-4BB详细描述的示例性单一化模块。
图5B为图5A中描绘的示例性多模块细胞处理仪器500的前部的平面 图。例如，基于盒的源材料(诸如在试剂盒510中)可以被放置在仪器500 的平台502上的指定区域中，以被机器人处理仪器(在该图中未示出)访 问。如图5B所示，平台可包括保护槽，使得从仪器500的任何模块溅出、 滴落或溢出的污染物被容纳在保护槽的唇缘内。除了试剂盒510之外，在 图5B中还可以看到清洗盒504、单一化模块540和生长模块534的一部分。 在此视图中还可以看到触摸屏显示器550、转化模块控制器538、电子装 置架536和处理系统526。
图5C至图5D分别示出了包括用于台式型式的自动化多模块细胞编辑 仪器500的机架590的多模块细胞处理仪器500的侧视图和正视图。例如， 机架590可具有约24-48英寸的宽度、约24-48英寸的高度和约24-48英 寸的深度。机架590可以并且优选地设计为保持所有模块和自动化细胞处 理中使用的一次性用品，并进行所有所需的过程而无需人工干预(也就是 说，机架590被配置为提供集成的独立的自动化多模块细胞处理仪器)。 机架590可以安装机器人液体处理系统558，以在模块之间移动材料。如 图5C所示，机架590包括具有手柄554和铰链556a(在图5D中可见铰 链556b和556c)的盖552，铰链556a用于掀起盖552和进入机架590的 内部。冷却格栅464(图5C)允许空气经由内部风扇(未示出)流动。此外，机架590由可调的支脚570a、570c抬高(图5D中示出了支脚570a、 570b)。可调支脚570a-570c例如可以在机架590下方提供额外的气流。在 一些实施例中，控制按钮566允许单按钮自动开始和/或停止自动化多模块 细胞处理仪器500内的细胞处理。
在一些实施方式中，在机架590内部，机器人液体处理系统558沿着 门架502布置在清洗盒504上方(在这些图中未示出试剂盒510)。在一些 实施例中，控制电路、液体处理管、空气泵控制器、阀、热单元(例如， 加热和冷却单元)以及其他控制机构布置在机架590的平台下方、在控制 箱区域568中。在图5C和图5D中还可看到单一化装置或模块540。在图5D中可看到包括磁体516的核酸组装模块514。
尽管未示出，但是在一些实施例中，显示屏可以定位在机架590的前 面上，例如覆盖盖的一部分(例如，参见图5B中的显示器550)。显示屏 可以向用户提供关于自动化多模块细胞编辑仪器500的处理状态的信息。 在另一示例中，显示屏可以接受来自用户的输入以进行细胞处理。
旋转生长模块
图6A示出了与本文所述的细胞生长装置一起使用的旋转生长瓶600 的一种实施例。旋转生长瓶600为光学透明容器，其具有：用于接收液体 培养基和细胞的开口端604；限定主容器的中央瓶区域606，主容器用于 生长的细胞；限定至少一个光路610的锥形至收缩区域618；封闭端616 以及驱动接合机构612。旋转生长瓶600具有瓶绕其旋转的中心纵轴620， 并且光路610通常垂直于瓶的纵轴。第一光路610位于锥形至收缩区域618 的下部收缩部分中。可选地，旋转生长瓶600的一些实施例在锥形至收缩 区域618的锥形区域中具有第二光路608。在该实施例中，两个光路都位 于旋转生长瓶的始终填充有细胞培养物(细胞+生长培养基)的区域中， 并且不受生长瓶的旋转速度的影响。第一光路610比第二光路608短，以 允许当瓶中的细胞培养物的OD值处于高水平时(例如，在细胞生长过程 的后期)对OD值进行灵敏测量，而当瓶中的细胞培养物的OD值处于较 低水平时(例如，在细胞生长过程的早期)，第二光路608允许进行OD值 的灵敏测量。
驱动接合机构612与马达(未示出)接合以使瓶旋转。在一些实施例 中，马达驱动驱动接合机构612，使得旋转生长瓶600仅沿一个方向旋转， 并且在其他实施例中，旋转生长瓶600在第一时间量或周期内沿第一方向 旋转，在第二时间量或周期内沿着第二方向(也就是说，相反方向)旋转， 并且可以重复该过程，使得旋转生长瓶600(和细胞培养内容物)经历振 荡运动。此外，用户可以选择是否对培养物进行振荡及其周期性振荡。第 一时间量和第二时间量可以相同或可以不同。时间量可以为1秒、2秒、3 秒、4秒、5秒或更多秒，或者可以为1分钟、2分钟、3分钟、4分钟或 更多分钟。在另一个实施例中，在细胞生长的早期，旋转生长瓶600可以 以第一周期(例如，每60秒)振荡，然后在细胞生长的后期，旋转生长 瓶600可以以与第一周期不同的第二周期(例如，每一秒)振荡。
旋转生长瓶600可以为可重复使用的，或者优选地，旋转生长瓶为可 消耗的。在一些实施例中，旋转生长瓶为可消耗的，并被提供给用户用生 长培养基预填充，其中瓶在开口端604处用箔密封件气密密封。以这种方 式包装的填充培养基的旋转生长瓶可以为用于与独立细胞生长装置或细 胞生长模块(细胞生长模块作为自动化多模块细胞处理系统的一部分)一 起使用的套件的一部分。为了将细胞引入瓶中，用户仅需吸移所需体积的 细胞，并使用移液管吸头刺穿瓶的箔密封。开口端604可以可选地包括延 伸的唇缘602，以与细胞生长装置重叠并接合。在自动化系统中，旋转生 长瓶600可以用条形码或可以由作为自动化系统的一部分的扫描仪或相机 (未示出)读取的其他识别装置标记。
旋转生长瓶600的体积和细胞培养物(包括生长培养基)的体积能有 很大差异，但是旋转生长瓶600的体积必须足够大以生成指定总数的细胞。 实际上，旋转生长瓶600的体积可以在1mL-250mL、2mL-100mL、5mL -80mL、10mL-50mL或12mL-35mL的范围内。同样，细胞培养物(细胞+ 生长培养基)的体积应适当，以允许在旋转生长瓶600中进行适当的通气 和混合。适当的通气促进生长培养基中均匀的细胞呼吸。因此，细胞培养 物的体积应为生长瓶体积的约5％-85％或生长瓶体积的20％-60％。例如， 对于30mL的生长瓶，细胞培养物的体积将为约1.5mL至约26mL，或6mL 至约18mL。
旋转生长瓶600优选地由生物相容的光学透明材料制成，或者至少瓶 的包括一个或更多个光路的部分是透明的。另外，制造旋转生长瓶的材料 应能够冷却至约4℃或更低并能够加热至约55℃或更高，以适应基于温 度的细胞测定和低温下的长期存储。此外，用于制造瓶的材料必须能够承 受高达55℃的温度，并且在旋转时不会变形。合适的材料包括环烯烃共 聚物(COC)、玻璃、聚氯乙烯、聚乙烯、聚酰胺、聚丙烯、聚碳酸酯、 聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚砜、聚氨酯以及这些和其他聚合物的共 聚物。优选的材料包括聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯。在一些实施例中， 旋转生长瓶通过例如注塑或挤压被廉价地制造。
图6B为细胞生长装置630的一个实施例的透视图。图6C描绘了图 6B的细胞生长装置630的剖视图。在两个图中，都看到旋转生长瓶600 位于主壳体636内，旋转生长瓶600的延伸唇缘602在主壳体636的上方 延伸。另外，在两个图中都示出了端部壳体652、下部壳体632和凸缘634。 凸缘634用于将细胞生长装置630附接到加热/冷却装置或其他结构(未示出)。图6C描绘了另外的细节。在图6C中，示出了位于主壳体636内的 上轴承642和下轴承640。上轴承642和下轴承640支撑旋转生长瓶600 的竖直负载。下部壳体632包含驱动马达638。图6C的细胞生长装置630 包括两个光路：主光路644和次级光路650。光路644对应于位于旋转生 长瓶600的锥形至收缩部分的收缩部分中的光路610，并且光路650对应 于旋转生长瓶600的锥形至收缩部分的锥形部分中的光路608。在图6C中 未示出光路610和608，但是在图6A中可以看到。除了光路644和640 外，还有发射板648，用于照亮光路，还有检测器板646，用于在光穿过 旋转生长瓶600中的细胞培养液后检测光。
马达638与驱动机构612接合，并且用于使旋转生长瓶600旋转。在 一些实施例中，马达638为具有内置驱动控制器的无刷DC型驱动马达， 该驱动控制可被设置为保持0至约3000RPM之间的恒定的每分钟转数 (RPM)。可替代地，可以使用其他马达类型，诸如步进马达，伺服马达， 有刷DC马达等。可选地，马达638还可以具有方向控制器以改变旋转方 向，以及具有转速表以感测并报告实际RPM。马达由处理器(未示出)根 据例如编程到处理器和/或用户输入中的标准方案来控制，并且马达可以被 配置为改变RPM以引起细胞培养物的轴向进动(axialprecession)，从而 增强混合，例如，以防止细胞聚集、增加通气并优化细胞呼吸。
细胞生长装置630的主壳体636、端部壳体652和下部壳体632可以 由任何合适的、坚固的材料制成，包括铝、不锈钢和其他导热材料，包括 塑料。这些结构或其部分可以通过各种技术，例如金属制造、注射成型、 融合的结构层的形成等来形成。尽管在某些实施例中旋转生长管形瓶600 被设想为可以重复使用，但优选为可消耗的，细胞生长装置630的其他部 件优选地是可重复使用的，并且用作独立台式装置或用作多模块细胞处理 系统中的模块。
细胞生长装置630的处理器(未示出)可以使用待用作生长细胞培养 物的“空白物(blank)”或对照物的信息编程。“空白物”或对照物为仅包 含细胞生长培养基的容器，其产生100％的透射率和0的OD，而细胞样品 将使光线偏转，并且将具有较低的透射率和较高的OD。随着细胞在培养 基中生长并变得更致密，透射率将降低，而OD将增加。可以对细胞生长装置630的处理器(未示出)进行编程以使用与通常用于细胞培养(例如， 哺乳动物细胞，细菌细胞，动物细胞，酵母细胞等)的生长培养基相对应 的空白物的波长值。可选地，第二分光光度计和容器可以被包括在细胞生 长装置630中，其中第二分光光度计用于以指定的间隔从空白物读取信息。
图6D示出了作为组件的一部分的细胞生长装置630，该组件包括联接 至光源690、检测器692和热部件694的图6B的细胞生长装置630。旋转 生长瓶600被插入到细胞生长装置中。光源690和检测器692的部件(例 如，诸如具有增益控制以覆盖5-log的光电二极管)联接至细胞生长装置 的主壳体。示出了容纳使旋转生长瓶600旋转的马达的下部壳体632，以 及将细胞生长装置630固定至组件的凸缘634中的一个。而且，所示的热 部件694为珀耳帖装置或热电冷却器。在该实施例中，通过将细胞生长装 置630经由下部壳体632的基部上的凸缘634附接并热集成至热部件694 来实现热控制。热电冷却器能够将热量“泵送”到接合处的任一侧，以根 据电流流动的方向冷却表面或加热表面。在一种实施例中，使用热敏电阻 来测量主壳体的温度，然后通过标准的电子比例-积分-微分(PID)控制器 回路，将旋转生长瓶600控制在约+/-0.5℃。
在使用中，通过刺穿箔密封件或膜，将细胞接种(例如，可以从自动 化液体处理系统或由用户吸取细胞)到旋转生长瓶600的预填充的生长培 养基中。细胞生长装置630的编程软件设置针对生长的控制温度，通常为 30℃，然后缓慢地使旋转生长瓶600开始旋转。细胞/生长培养基混合物由 于离心力而缓慢地沿壁竖直向上移动，从而允许旋转生长瓶600将混合物 的大部分表面积暴露于正常的氧气环境。生长监测系统以预设或预编程的 时间间隔连续读取OD或OD测量值。这些测量值存储在内部存储器中， 并且如果需要，软件可以绘制测量值与时间的曲线图以显示生长曲线。如 果需要增强混合，例如为了优化生长条件，则可以改变瓶旋转的速度以引 起液体的轴向进动，和/或可以以程控的间隔进行完全的方向改变。可以对 生长监测进行程控，使其以预定的OD自动终止生长期，然后将混合物快 速冷却至较低的温度以抑制进一步的生长。
细胞生长装置630的一种应用是不断地测量正在生长的细胞培养物的 光密度。细胞生长装置的一个优点在于可以连续测量光密度(动态监测) 或以特定的时间间隔测量光密度；例如，每5秒、10秒、15秒、20秒、 30秒、45秒或60秒，或每1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6 分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟。尽管已经在测量正在生长的细 胞培养物的光密度(OD)的背景下描述了细胞生长装置630，但是，鉴于 本说明书的教导，技术人员应该理解，除了或代替细胞培养物OD之外， 可以测量其他细胞生长参数。与上述相对于实体壁装置或模块的细胞生长 的可选度量一样，使用可见光、UV或近红外(NIR)光的光谱法允许监测 细胞培养物中营养物和/或废产物的浓度以及进行其他光谱测量；也就是说， 可以经由例如介电阻抗谱、可见荧光、荧光偏振或发光来测量其他光谱特 性。另外，细胞生长装置630可以包括用于测量例如溶氧量、二氧化碳、 pH值、电导率等的附加传感器。
细胞浓缩模块
图5A-5D所示的自动化多模块细胞处理仪器包括细胞浓缩模块522。 图7A-7H描绘了利用切向流过滤的细胞浓度/缓冲液更换模块的一种实施 例的变体。本文所述的细胞浓缩模块使用切向流过滤(TFF)(也称为交叉 流过滤)进行操作，其中大部分进料切向流过过滤器的表面，从而与进料 流入过滤器的死端过滤(dead-end filtration)相比减少了滤饼(cake)(截 留物)的形成。如下所述，还利用相对于主进料的次级流来生成剪切力， 该剪切力防止滤饼形成和膜结垢，从而使颗粒恢复率最大化。
设计本文所述的TFF装置考虑了两个主要的设计注意事项。首先，TFF 装置的几何形状导致在大的表面积上过滤细胞培养物，从而使处理时间最 小化。其次，TFF装置的设计被配置为最小化过滤器结垢。图7A为切向 流过滤的一般模型750。TFF装置使用切向流过滤(也称为交叉流过滤) 进行操作。图7A示出了在膜754上流动的细胞，其中在培养基或缓冲液 中的细胞752的进料流平行于膜754。TFF与死端过滤不同，死端过滤的 进料流和压降均垂直于膜或过滤器。
图7B描绘了提供切向流过滤的示例性TFF装置/模块的一个实施例的 下部构件720的俯视图。如在图7B中可以看到的，TFF装置模块的下部 构件720包括通道结构716，该通道结构716包括细胞培养物所流动经过 的流动通道。通道结构716包括单个流动通道702b。(需注意，流动通道 总体上表示为702，流动通道的位于TFF装置的上部构件722中的部分被 表示为702a，流动通道的位于TFF装置的下部构件720中的部分被表示为 702b。)该特定实施例包括通道构型714，例如，波状起伏的蛇形几何形状 (即，流动通道702中的小“扭动”)和蛇形的“之字形”图案，其中， 流动通道702b从装置左侧的一端到装置右侧的另一端在TFF装置的下部 构件720上来回交错。相对于装置尺寸和总通道体积，蛇形图案可在高表 面积上进行过滤，而波状起伏的作用可产生次级惯性流，以实现有效的膜 再生，从而防止膜结垢。尽管这里例示了波状起伏的几何形状和蛇形图案， 但是可以使用其他通道构型714，只要流动通道702可以被膜分为两部分 (如下文所述)，并且只要通道构型714提供在交替方向上通过TFF模块 的细胞流动即可。通道口(portal)704和706因对流过流动通道702的细 胞进行操作而成为通道结构716的一部分。通常，通道口704收集流过膜 (未示出)的一侧上的流动通道702的细胞(“截留物”)，而通道口706 收集流过膜的相反侧(未示出)上的流动通道702的培养基(“滤液”或 “渗透物”)。在该实施例中，凹口708容纳螺钉或其他紧固件(未示出)， 这些螺钉或其他紧固件允许TFF装置的部件彼此固定。
通道结构716的长度710和宽度712可以根据供生长的细胞培养物的 体积和要浓缩的细胞培养物的光密度而变化。通道结构716的长度710通 常为1mm至300mm，或50mm至250mm，或60mm至200mm，或70mm 至150mm，或80mm至100mm。通道结构716的宽度712通常为1mm至 120mm，或20mm至100mm，或30mm至80mm，或40mm至70mm，或 50mm至60mm。流动通道702的横截面构型可以为圆形、椭圆形、卵形、 正方形、矩形、梯形或不规则形状。如果是正方形、矩形或其他具有大体 直的边的形状，则横截面的宽度可以为约10μm至1000μm，或200μm至 800μm，或300μm至700μm，或400μm至600μm；并且高度为约10μm至 1000μm，或200μm至800μm，或300μm至700μm，或400μm至600μm。 如果流动通道702的横截面大体上为圆形、卵形或椭圆形，则通道的半径 的水力半径可以为约50μm至1000μm，或5μm至800μm，或200μm至 700μm，或300μm至600μm，或约200至500μm。
当参见图7B的TFF装置/模块的下部构件720的俯视图时，需注意， 有两个截留物通道口704和两个滤液通道口706，其中在TFF装置/模块 700的两端(例如，窄边缘)各有一种类型的通道口。在其他实施例中， 截留物通道口和滤液通道口可以在同一构件(例如，上部构件722或下部 构件720)的同一表面上，或者它们可以布置在组件的侧面上。与其他连续运行的切向流过滤装置不同，本文所述的TFF装置/模块使用交替流动 方法浓缩细胞。图7C描绘了示例性TFF模块700的上部构件722和下部 构件720的俯视图。在下部构件720的顶表面上看到流动通道的下部部分 702b。再者，看到通道口704和706。如上所述，凹口(诸如图7B所示的 凹口708)提供了一种在操作过程中经由例如螺钉或其他类似的紧固件将 TFF装置/膜700的部件(上部构件722、下部构件720和膜724)彼此固 定的装置。然而，在替代实施例中，可以使用粘合剂(诸如压敏粘合剂) 或超声焊接或溶剂结合将上部构件722、下部构件720和膜724联接在一 起。实际上，在本公开内容的引导下，本领域的普通技术人员可以找到用 于联接TFF装置700的部件的其他构造，诸如例如夹具；布置在上部构件 722和下部构件720上的配合配件；粘合剂、焊接、溶剂结合和配合配件 的组合；以及其他此类紧固件和联接器。
需注意，在图7C中，在TFF装置/模块700的每“端”(例如，窄边 缘)上各有一个截留物通道口704和一个滤液通道口706。当细胞和培养 基在TFF模块700中从右向左流动时，TFF装置/模块700左侧的截留物通 道口704和滤液通道口706将分别收集细胞(从上部构件722在760处的 流动路径)和培养基(从下部构件720在770处的流动路径)。同样，当 细胞和培养基在TFF装置中从左向右流动时，TFF装置/模块700右侧的截 留物通道口704和滤液通道口706将分别收集细胞(在760处的流动路径) 和培养基(在770处的流动路径)。在该实施例中，从TFF装置的顶表面 上的通道口704收集截留物，并从装置的底表面上的通道口706收集滤液。 细胞保持在膜724上方的TFF流动通道702a(图7D中所示)中，而滤液(培养基)流过膜724，然后流过滤液通道口706；因此，顶部/截留物通 道口704和底部/滤液通道口706的构造是实用的。然而，应当认识到，可 以实现截留物通道口704和滤液通道口706的其他构造，诸如将截留物通 道口704和滤液通道口706定位在TFF装置700的侧面(区别于顶表面和 底表面)上。在图7C中，可以看到流动通道702b在TFF装置700的下部 构件720上。然而，在其他实施例中，截留物通道口704和滤液通道口706 可以安置在TFF装置的相同表面上。
使用TFF装置/模块700进行细胞浓缩的总体工作流程涉及使细胞培 养物或细胞样品切向流过通道结构716。使流动通道702分成两部分的膜 724将细胞保持在膜的一面上，并允许不想要的培养基或缓冲液流过膜进 入TFF装置700的滤液侧(例如，下部构件720)。在此过程中，将固定体 积的培养基或缓冲液中的细胞驱动通过装置，直到将细胞样品收集到截留 物通道口704中的一个中，并且已经穿过膜的培养基/缓冲液通过滤液通道口706中的一个或两个来收集。所有类型的原核和真核细胞(贴壁细胞和 非贴壁细胞)都可在TFF装置中浓缩。贴壁细胞可以在悬浮在旋转生长瓶 中的培养基中的珠或其他细胞支架上生长，然后通过TFF装置。
在细胞浓缩过程中，使细胞样品通过TFF装置并在截留物通道口704 中的一个中收集细胞，同时在滤液通道口706中的一个中收集培养基，这 被认为是细胞样品的“一次通过(onepass)”。在截留物储器之间的转移将 培养物“抛出(flip)”。对于给定的通过，分别收集细胞和培养基的截留物 通道口和滤液通道口位于TFF装置/模块700的同一端，其流体连接布置 成使得截留物侧和滤液侧有两个不同的流动层(未示出)，但是，如果截 留物通道口704位于TFF装置/模块700的上部构件722上(也就是说， 细胞被驱动通过膜上方的流动通道702a(未示出)，并且滤液(培养基) 到达膜下方的流动通道702b的一部分)，滤液通道口706将位于TFF装置 /模块700的下部构件上，并且反之亦然(也就是说，如果细胞样品被驱动 通过膜下方的流动通道702b，则滤液(培养基)到达膜上方的流动通道 702a的一部分)。在图7C-7D中可以更清楚地看到此构造，其中截留物流 动路径760从截留物通道口704出来且滤液流动路径770从滤液通道口706 出来。
在“通过”结束时，细胞样品通过穿过截留物通道口704并进入截留 物储器(未示出)来被收集。为了开始另一次“通过”，细胞样品将被再 次通过TFF装置700，这一次的流动方向与第一次通过相反。细胞样品通 过穿过截留物通道口704并进入TFF装置/模块700的与用于第一次通过 过程中收集细胞截留物通道口704相对的端上的截留物储器(未示出)中 来被收集。同样地，第二次通过穿过膜的培养基/缓冲液通过TFF装置/模 块700的与用于第一次通过时收集滤液的滤液通道口706相对的端上的滤 液通道口706来被收集，或通过两个通道口来收集。重复这种使截留物(浓 缩的细胞样品)穿过TFF装置/模块700的交替过程，直到细胞已经浓缩 到所需的体积为止，并且在通过过程中可以将两个滤液通道口706都打开 以减少操作时间。另外，在开始另一次“通过”之前，可以通过向截留物 储器中的细胞样品添加所需的缓冲液(或新鲜培养基)来进行缓冲液更换， 并重复此过程，直到将旧的培养基或缓冲液稀释并滤出并且细胞驻留在新 鲜的培养基或缓冲液中为止。需注意，缓冲液更换和细胞浓缩可以同时发 生(并且通常发生)。
返回图7C，还可以看到膜或过滤器724。适用于TFF装置/模块700 的过滤器或膜是耐溶剂的、在过滤过程中无污染、并且能够保留感兴趣的 类型和大小的细胞。例如，为了保留小细胞类型(诸如细菌细胞)，孔径 可以低至0.2μm，然而对于其他细胞类型，孔径可以高至5μm。实际上， 在TFF装置/模块700中有利的孔径包括尺寸为0.20μm、0.21μm、0.22μm、0.23μm、0.24μm、0.25μm、0.26μm、0.27μm、0.28μm、0.29μm、0.30μm、 0.31μm、0.32μm、0.33μm、0.34μm、0.35μm、0.36μm、0.37μm、0.38μm、 0.39μm、0.40μm、0.41μm、0.42μm、0.43μm、0.44μm、0.45μm、0.46μm、 0.47μm、0.48μm、0.49μm、0.50μm及更大的过滤器724。过滤器724可以由任何合适的非反应性材料制成，该材料包括纤维素混合酯(硝酸纤维素 和醋酸纤维素)(CME)、聚碳酸酯(PC)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚 砜(PES)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、玻璃纤维或如在激光或电化学蚀 刻的情况下的金属基底。图7C和图7D中所示的TFF装置700未示出可 在其处安置或固定过滤器724的位于上部构件722和下部构件720中的座 (例如，在上部构件722和下部构件720中的每个中的为过滤器724的一 半厚度的座)；然而，在一些实施例中可以考虑这样的座。
图7D描绘了图7C所示的示例性TFF模块的上部构件722和下部构 件720的自底向上的视图。再次看到通道口704和706。再次注意，在TFF 装置/模块700的上部构件722和下部构件720的每一端各有一个截留物通 道口704和一个滤液通道口706(在该视图中未看到所有的通道口)。在 TFF装置700的左侧对于同一次通过，分别地，截留物通道口704将收集细胞(在760处的流动路径)，而滤液通道口706将收集培养基(在770 处的流动路径)。同样，在TFF装置700的右侧，对于同一次通过，分别 地，截留物通道口704将收集细胞(在760处的流动路径)，而滤液通道 口706将收集培养基(在770处的流动路径)。在图7D中，可以在TFF装置700的上部构件722的下表面上看到流动通道702a的上部部分。因此， 观察图7C和图7D，注意到在上部构件722(图7D中的流动通道702a) 和下部构件722(图7C中的流动通道702b)两者中均具有流动通道702， 膜724在上部构件722和下部构件720之间。再者，上部构件722的流动 通道702a和下部构件720的流动通道702b配合以形成流动通道702，其 中膜724水平地定位在TFF装置/模块的上部构件和下部构件之间，从而 使流动通道702分成两部分(未示出)。
在TFF装置/模块700上进行细胞浓缩和/或通过向浓缩至所需体积的 细胞中添加所需缓冲液使细胞具有能力的期间；例如，在细胞浓缩至少20 倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、 200倍或更多倍以后，缓冲液更换。通过添加到截留物储器(未示出)中， 将所需的更换培养基或更换缓冲液添加至细胞，并重复使细胞通过TFF装 置700的过程，直到细胞已在更换培养基或缓冲液中浓缩至所需的体积为 止。该过程可以重复任意数量的所需次数，以达到所需的缓冲液更换水平 和所需的细胞体积。更换缓冲液可包含例如甘油或山梨糖醇，从而除了降 低细胞样品的总体积外，还使细胞具有转化能力。
TFF装置700可以由任何坚固的材料制成，可以在其中铣削流动通道， 该材料包括：不锈钢；硅；玻璃；铝；或者塑料，包括环烯烃共聚物(COC)、 环烯烃聚合物(COP)、聚苯乙烯、聚乙烯基、氯化物、聚酰胺、聚乙烯、 聚丙烯、丙烯腈丁二烯、聚碳酸酯、聚醚乙酮(PEEK)、聚甲基丙烯酸甲 酯(PMMA)、聚砜和聚氨酯以及这些聚合物和其他聚合物的共聚物。如 果TFF装置/模块700是一次性的，则其优选地由塑料制成。在一些实施 例中，用于制造TFF装置/模块700的材料是导热的，使得可以将细胞培 养物加热或冷却至所需的温度。在某些实施例中，TFF装置700通过精密 机械加工、激光加工、电火花加工形成(针对金属装置)；通过湿法或干 法蚀刻形成(针对硅装置)；通过干法或湿法蚀刻、粉末或喷砂、光刻形成(针对玻璃装置)；或使用适合于这些批量生产技术的上述材料通过热 成型、注塑成型、热压成型或激光加工形成(针对塑料装置)。
图7E示出了TFF模块的一个示例性实施方案的分解透视图，该模块 具有流体联接的用于截留物、滤液和更换缓冲液的储器。在此构造中，790 为TFF装置的顶部或盖，具有三个端口766，其中在最左侧的端口766中 放置有移液管吸头768。TFF装置的顶部790在操作中与组合的储器和上 部构件结构764联接。组合的储器和上部构件结构764包括：顶表面，其 在操作中邻近TFF装置的顶部或盖790、底表面，其包括TFF装置的上部 构件722，其中，TFF装置的上部构件722限定了切向流动通道的上部部 分(未示出)。组合的储器和上部构件结构764包括两个截留物储器772 和缓冲液或培养基储器774。截留物储器772流体地联接至流动通道的上 部部分，而缓冲液或培养基储器774则流体地联接至截留物储器772。在TFF装置的此分解图中还可以看到下部构件720，如前所述，下部构件720 在其顶表面上包括切向流动通道的下部部分702b(在下部构件720的顶表 面上可见)，其中，上部构件722和下部构件720的流通道702的上部部 分和下部部分在被联接时分别形成单个流动通道702(在操作中插入在上 部构件722和下部构件720之间的膜未示出)。
在下部构件720下方的是垫圈792，该垫圈792在操作中插入在下部 构件720和滤液(或渗透物)储器762之间。在操作中，顶部790、组合 的储器和上部构件结构764、膜(未示出)、下部构件720、垫圈792以及 滤液储器762被联接并固定在一起以形成流体密封和气密密封。在图7E 中，示出了可用于将各种结构(顶部790、组合的储器和上部构件结构764、 膜(未示出)、下部构件720、垫圈792以及滤液储器762)联接在一起的 紧固件。然而，作为螺钉或其他类似紧固件的替代，可以使用粘合剂(诸 如压敏粘合剂)、超声波焊接；或溶剂结合来联接TFF装置的各种结构。 此外，可以采用紧固件、粘合剂和/或焊接类型的组合来联接TFF装置的 各种结构。在本公开内容的引导下，本领域的普通技术人员可以找到用于 联接TFF装置的部件的其他构造，诸如例如，夹具、配合配件以及其他这 样的紧固件。
图7F描绘了组合的储器和上部构件结构764，其包括两个截留物储器 772和缓冲液或培养基储器774以及布置在组合的储器和上部构件结构 764的底部上的上部构件722。TFF装置的上部构件722限定了切向流动通 道的上部部分(未示出)，该切向流动通道布置在组合的储器和上部构件 结构764的底表面上。图7G为组合的储器和上部构件结构764的上表面 778的俯视图，该图描绘了截留物储器772的顶部780和缓冲液或培养基 储器774的顶部782。截留物储器772流体地联接至流动通道的上部部分 (未示出)，而缓冲液或培养基储器774则流体地联接至截留物储器772。 图7H为组合的储器和上部构件结构764的下表面的仰视图，示出了上部 构件722，切向流动通道702a的上部部分布置在上部构件722的底表面上。 在操作中，布置在上部构件722的底表面上的流动通道702a与布置在下部 构件720的顶表面上的切向流动通道的底部部分702b(在该图中未示出， 但是图7E可见)配合，其中，流动通道的上部部分702a和下部部分702b 分别配合以形成单个流动通道702，其中在流动通道的上部部分702a和下 部部分702b之间插入有膜或过滤器(未示出)。
核酸组装模块
本公开内容的自动化多模块细胞编辑仪器的某些实施方案任选地包 括核酸组装模块。核酸组装模块被配置为接受和组装促进期望的基因组编 辑事件所必需的核酸。通常，术语“载体”是指能够将与其连接的期望的 核酸转运到细胞中的核酸分子。载体包括但不限于单链、双链或部分双链 的核酸分子；包含一个或更多个游离端、无游离端(例如，环状)的核酸分 子；包含DNA、RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多 核苷酸。载体的一种类型为“质粒”，质粒是指环状双链DNA环，另外的 DNA片段可以诸如通过标准分子克隆技术插入质粒中。载体的另一种类型 为病毒载体，其中载体中存在用于包装成病毒(例如，逆转录病毒，复制缺 陷型逆转录病毒，腺病毒，复制缺陷型腺病毒和腺相关病毒)的病毒来源的 DNA序列或RNA序列。病毒载体还包括病毒携带的用于转染到宿主细胞 中的多核苷酸。某些载体能够在它们被引入其中的宿主细胞中自主复制(例 如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体(episomal)哺乳动物载体)。其 他载体(例如，非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞 的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与 其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”或“编 辑载体”。在重组DNA技术中有用的常见表达载体通常呈质粒的形式。另 外的载体包括F黏粒、噬粒和合成染色体。
重组表达载体可以包含适于在宿主细胞中转录的形式的核酸，以及对 于一些核酸序列而言，包含适于在宿主细胞中翻译和表达的形式的核酸， 这意味着重组表达载体包含一个或更多个与待表达的核酸序列可操作地 连接的调控元件，调控元件可以基于用于表达的宿主细胞来选择。在重组 表达载体中，“可操作地连接”意图意指感兴趣的核苷酸序列以允许转录 的方式与调控元件连接，并且对于一些核酸序列而言，以允许核苷酸序列翻译和表达的方式与调控元件连接(例如，在体外转录/翻译系统中或当将 载体引入宿主细胞中时在宿主细胞中)。合适的重组方法和克隆方法公开于 美国公布第2004/0171156号中，为了所有目的将其内容通过引用以其整体 并入本文。
在一些实施方案中，调控元件可操作地连接至可靶向核酸酶系统的一 个或更多个元件，以便驱动转录，并且对于一些核酸序列而言，以便驱动 可靶向核酸酶系统的一个或多更个组分的翻译和表达。
另外，可以对编码核酸引导的核酸酶的多核苷酸序列进行密码子优化， 以在特定细胞诸如原核细胞或真核细胞中表达。真核细胞可以是酵母细胞、 真菌细胞、藻类细胞、植物细胞、动物细胞或人类细胞。真核细胞可以是 特定生物体的真核细胞或源自特定生物体的真核细胞，所述特定生物体诸 如哺乳动物，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔、犬或非人哺乳动物包 括非人灵长类动物。另外或可选地，载体可以包括与多核苷酸序列可操作 地连接的调控元件，该多核苷酸序列在转录时形成引导RNA。
核酸组装模块可以被配置为以自动化方式执行多种多样不同的核酸 组装技术。可以在本发明公开的自动化多模块细胞编辑仪器的核酸组装模 块中执行的核酸组装技术包括但不限于那些使用限制性内切核酸酶的组 装方法，包括PCR、BioBrick组装(USPN 9,361,427)，IIS型克隆(例如， GoldenGate组装，欧洲专利申请公布EP 2395 087 A1)和连接酶循环反应(de Kok,ACS Synth Biol.3(2):97-106(2014)；Engler等人,PLoS One, 3(11):e3647(2008)；以及USPN 6,143,527)。在其他实施方案中，由本发明 公开的自动化多模块细胞编辑仪器执行的核酸组装技术基于核酸的相邻 部分之间的重叠，诸如
Figure BDA0003517636680000851
CPEC，SLIC，连接酶循环等。 另外的组装方法包括酵母中的缺口(gap)修复(Bessa,Yeast,29(10):419-23 (2012))，gateway克隆( Ohtsuka,Curr PharmBiotechnol,10(2):244-51(2009))； USPN 5,888,732；以及USPN6,277,608)和拓扑异构酶介导的克隆( Udo, PLoSOne,10(9):e0139349(2015)；以及USPN 6,916,632)。这些和其他核酸 组装技术在例如Sands和Brent,Curr Protoc Mol Biol.,113:3.26.1–3.26.20(2016)中描述。
取决于自动化多模块细胞编辑仪器中使用的核酸组装的类型，对核酸 组装模块进行温度控制。例如，当在核酸组装模块中使用PCR时，模块包 括允许温度在变性步骤、退火步骤和延伸步骤之间循环的热循环能力。当 在核酸组装模块中使用单一温度组装方法(例如，等温组装方法)时，模块 提供达到并保持在使所进行的特定组装过程最优化的温度的能力。这些温 度和保持这些温度的持续时间可以通过由脚本执行的一组预编程参数来确定，或者由用户使用自动化多模块细胞编辑仪器的处理系统来手动控制。
在一种实施方案中，核酸组装模块为使用单个等温反应进行组装的模 块。某些等温组装方法可以基于序列同一性同时组合多达15个核酸片段。 在一些实施方案中，组装方法提供包含与相邻核酸片段具有约20-40个碱 基重叠的待组装核酸。这些片段与三种酶的混合物(一种外切核酸酶，一种 聚合酶和一种连接酶)以及缓冲组分混合在一起。因为过程是等温的，并且 可以使用单个反应容器以1步法或2步法来进行，所以等温组装反应用于自动化多模块细胞编辑仪器是理想的。1步法允许使用单一步骤等温过程 组装多达五种不同的片段。将片段和酶的主混合物混合，并在50℃孵育最 多长达一小时。为了创建具有多达15个片段的更复杂的构建体，或为了 掺入100bp至10kb的片段，通常使用2步法，其中2步反应需要两次分 别添加主混合液；一次于外切核酸酶和退火步骤，并且第二次用于聚合酶和连接步骤。
转化模块
图8A-8E描绘了细胞转化模块(在这种情况下为流通式电穿孔装置) 的一种实施例的变体，其可以被包括在细胞生长/浓缩/转化仪器中。图8A 和图8B分别为六个共连接的流通式电穿孔装置850的顶部透视图和底部 透视图。图8A描绘了布置在单个基底856上的六个流通式电穿孔单元850。 六个流通式电穿孔单元850中的每个均具有限定细胞样品入口的入口孔 852和限定细胞样品出口的出口孔854。图8B为图8A的六个共连接的流 通式电穿孔装置的底部透视图，还描绘了布置在单个基底856上的六个流 通式电穿孔单元850。可以看到六个入口孔852，每个流通式电穿孔单元 850各一个，并且可以看到一个出口孔854(最左边的流通式电穿孔单元 850的出口孔)。此外，在图8B中看到在每个流通式电穿孔单元850中的 入口802、出口804、流动通道806以及在流动通道806的收缩部分的两 侧的两个电极808。一旦制造了六个流通式电穿孔单元850，它们就可以 是彼此分离的(例如，“折断分开(snapped apart)”)并一次使用一个，或 者可选地，在实施例中，两个或更多个流通式电穿孔单元850可以并行使 用而无需分离。
流通式电穿孔装置850实现了具有低毒性的高效细胞电穿孔。本公开 内容的流通式电穿孔装置850允许与通常在自动化系统(诸如，空气置换 移液器)中使用的机器人液体处理仪器的特别容易地集成。此类自动化仪 器包括但不限于来自Tecan(瑞士Mannedorf)、Hamilton(Reno,NV)、 Beckman Coulter(Fort Collins,CO)等的现成的自动化液体处理系统。
一般而言，与台式电穿孔装置相比，微流体电穿孔(使用小于约10mL 且低至1μl的细胞悬液体积)允许更精确地控制转染或转化过程并且允许 与其他细胞处理工具灵活集成。因此，微流体电穿孔为例如单细胞转化、 处理和分析提供了独特的优势：多单元电穿孔装置配置；以及集成的、自 动的、多模块的细胞处理和分析。
在本公开内容的流通式电穿孔装置850的特定实施例中，转化的毒性 水平导致电穿孔后大于10％的活细胞，优选在转化后大于15％、20％、 25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、 85％、90％或甚至95％的活细胞，这取决于细胞类型和被引入细胞中的核 酸。
关于图8A-8E描述的流通式电穿孔装置850包括具有电穿孔室的壳体、 配置为与电脉冲发生器接合的第一电极和第二电极，通过该电脉冲发生器， 电触点与电穿孔装置850的电极接合。在某些实施例中，电穿孔装置为耐 高压加热的和/或一次性的，并且可以与试剂一起包装在试剂盒中。电穿孔 装置850可以被配置为电穿孔1μl至2mL、10μl至1mL、25μl至750μl、 或50μl至500μl之间的细胞样品体积。可以用所公开的电穿孔装置850电 穿孔的细胞包括哺乳动物细胞(包括人细胞)、植物细胞、酵母、其他真 核细胞、细菌，古生菌和其他细胞类型。
在一个示例性实施方案中，图8C描绘了流通式电穿孔装置850的俯 视图，该流通式电穿孔装置具有用于引入细胞及待电穿孔到细胞中的外源 试剂(“细胞样品”)的入口802和用于电穿孔后的细胞样品的出口804。 电极808通过装置中的电极通道(在该图8C中未示出)被引入。图8D示 出了从流通式电穿孔装置850的顶部截取的视图，流通式电穿孔装置具有 入口802、出口804和相对于流动通道806中的收缩部分定位的电极808。 图8E中的流通式电穿孔装置850的下部部分的侧视剖视图示出了该实施 例中的电极808被定位在电极通道810中并且垂直于流动通道806，使得 细胞样品从入口通道812经过流动通道806流动到出口通道814，并且在 此过程中，细胞样品流入电极通道810中以与电极808接触。在这个方面， 入口通道812、出口通道814和电极通道810都源自装置的顶部平面侧； 然而，图8C-8E中描绘的流通式电穿孔架构仅为对本文所述的试剂盒有用 的一种架构。例如在2018年9月24日提交的USSN16/147,120；在2018 年9月30日提交的16/147,865；以及在2018年9月30日提交的16/147,871 中描述了另外的电极架构。
示例性工作流程
图9为示例性自动化多模块细胞处理仪器的实施例的简化框图，该仪 器包括用于富集或选择经编辑的细胞的单一化或基本上单一化/生长/编辑 和归一化或择优挑选模块。细胞处理仪器900可包括壳体944、待转化或 转染的细胞储器902、以及生长模块(细胞生长装置)904。带转化的细胞 从储器转移到生长模块进行培养，直到细胞达到目标OD。一旦细胞达到 目标OD，生长模块就可以冷却或冷冻细胞以用于以后的处理，或者可以 将细胞转移到细胞浓缩模块930中，在该模块中使细胞变成电感受态并浓 缩至最适于细胞转化的体积。在浓缩后，细胞然后被转移到电穿孔装置908 (例如，转化/转染模块，具有上面关于图8A-8E描述的一个示例性模块)。 在自动化多模块细胞处理仪器中使用的示例性电穿孔装置包括流通式电 穿孔装置，诸如在2018年9月28日提交的USSN 16/147,120中；2018年9月28日提交的16/147,353；2018年9月30日提交的16/147,865；2018 年9月30日提交的16/147,871中描述的那些，其全部内容通过引用并入 本文。
除了用于存储细胞930的储器之外，自动化多模块细胞处理仪器900 还可以包括用于存储编辑寡核苷酸盒916的储器和用于存储表达载体骨架 918的储器。编辑寡核苷酸盒和表达载体骨架两者都从试剂盒转移到核酸 组装模块920，其中编辑寡核苷酸盒被插入表达载体骨架中。可以将组装 的核酸转移到可选的纯化模块922中，以进行脱盐和/或制备组装的核酸以 进行转化所需的其他纯化和/或浓缩程序。可选地，可以将预组装的核酸例如编辑载体存储在储器916或918中。一旦由纯化模块922进行的过程完 成，就将组装的核酸转移至例如电穿孔装置908，该电穿孔装置908已经 包含生长至目标OD并经由细胞浓缩模块930使其变成电感受态的细胞培 养物。在电穿孔装置908中，将组装的核酸引入细胞中。电穿孔后，将细 胞转移到组合的恢复/选择模块910中。有关多模块细胞编辑仪器的示例， 请参见2018年6月30日提交的USSN 16/024,816和16/024,831；2018年 9月30日提交的16/147,865；2018年9月30日提交的16/147,871，其全 部内容通过引用并入本文。
在恢复并且可选地进行选择之后，将细胞转移至单一化或基本上单一 化、编辑和生长模块940，在该模块中，将细胞稀释并分隔，使得每个隔 室平均有一个细胞。一旦基本上或很大程度上单一化，就允许细胞生长预 定数量的倍数。一旦建立了这些初始集落，就诱导编辑并且使经编辑的细 胞生长以建立集落，该集落生长至最终尺寸(例如，将集落归一化)。在 一些实施例中，通过在诱导型启动子的控制下的一个或更多个编辑组分来 诱导编辑。在一些实施例中，诱导型启动子通过温度升高而被活化，并且 通过降低温度而“失活”。类似地，在包括形成微孔底部的过滤器的实体 壁装置的实施例中，可以将实体壁装置转移至包含具有活化或诱导编辑的 培养基然后转移到使编辑失活的培养基上的板(例如琼脂板或甚至液体培 养基)。在带有实体底部的实体壁装置中，可以通过培养基更换来进行诱 导编辑或使编辑失活。一旦集落长到最终尺寸，就将它们汇集。再者，单 一化或基本上单一化克服了未经编辑细胞的生长偏倚和由不同编辑的适 应性效应导致的生长偏倚。
恢复、选择以及单一化/诱导/编辑和归一化模块都可以为单独的，可 以如图9所示进行布置和组合，或者可以按其他配置进行布置或组合。在 某些实施例中，所有恢复、选择、单一化或基本上单一化、生长、诱导和 归一化均在单个模块中进行，例如在具有营养琼脂的基底上或在关于图 3A-3E和4A–4AA所述的实体壁装置上进行。可选地，如果需要，在单独 的容器(模块)中的液体培养基中进行恢复、选择和稀释，然后转移到单 一化/生长/诱导/编辑和归一化模块中。
一旦汇集了归一化的细胞集落，就可以将细胞例如存储在存储单元或 模块912中，在该模块中，可以将细胞保持在例如4℃直至取出细胞以进 行进一步研究914。可选地，可以在另一轮编辑中使用这些细胞。多模块 细胞处理仪器900由处理器942控制，该处理器被配置为基于用户输入来 操作仪器，如由一个或更多个脚本所引导的那样，或者作为用户输入或脚 本的组合来操作仪器。处理器942可以控制仪器900的各个模块的时间、 持续时间、温度和操作以及试剂的分配。例如，处理器942可以在转化后 使细胞冷却，直到需要编辑为止，这时温度可以升高到有利于基因组编辑 和细胞生长的温度。可以用标准方案参数对处理器进行编程，用户可以从 中选择标准方案参数，用户可以手动指定一个或更多个参数，或者与试剂 盒关联的一个或多个脚本可以指定一个或更多个操作和/或反应参数。另外， 处理器可以(例如，经由到智能电话或其他装置的应用)通知用户细胞已 经达到目标OD，并且向用户更新多模块系统中的各个模块中的细胞的进 度。
自动化多模块细胞处理仪器900为核酸酶引导的基因组编辑系统，并 且可以用于单个编辑系统中(例如，在单个编辑过程中将一个或更多个编 辑引入细胞基因组中)。下文描述的图10的系统被配置为进行顺序编辑， 例如，使用不同的核酸酶引导的系统顺序地在细胞中提供两个或更多个基 因组编辑；和/或递归编辑，例如利用单个核酸酶引导的系统以在细胞中依 次引入两个或更多个基因组编辑。
图10示出了自动化多模块细胞处理仪器的另一实施例，该自动化多 模块细胞处理仪器被配置为进行细胞的单一化或基本上单一化、细胞集落 的生长、诱导编辑和归一化。该实施例描述了对细胞群体进行递归基因编 辑的示例性系统。如在图9中所示的实施例中，细胞处理仪器1000可以 包括壳体1044、用于存储待被转化或转染的细胞的储器1002、以及细胞 生长模块(包括例如旋转生长瓶)1004。将待转化的细胞从储器转移到细胞生长模块进行培养，直到细胞达到目标OD。一旦细胞达到目标OD，生 长模块可以冷却或冷冻细胞以用于以后的处理或将细胞转移至细胞浓缩 模块1060，在细胞浓缩模块1060中对细胞进行缓冲液更换并使细胞变成 电感受态，并且细胞的体积可以大大减小。一旦细胞已经浓缩至合适的体 积，就将细胞转移至电穿孔装置1008。除了用于存储细胞的储器之外，多 模块细胞处理仪器1000还包括用于存储预先与编辑寡核苷酸盒1052组装 在一起的载体的储器。将预组装的核酸载体转移至电穿孔装置1008，该电 穿孔装置1008已经包含生长至目标OD的细胞培养物。在电穿孔装置1008 中，核酸被电穿孔到细胞中。在电穿孔后，将细胞转移到可选的恢复模块 1056中，在该恢复模块中，允许细胞在转化后短暂地恢复。
在恢复后，可以将细胞转移到存储单元或模块1012，在此处可以将细 胞存储在例如4℃下以用于以后处理，或者可以将细胞稀释并转移到实体 壁选择、单一化或基本上单一化/生长/诱导/编辑和归一化模块1058。在多 处理模块1058中，细胞被布置成使得每微孔平均有一个细胞。布置的细 胞可以在选择培养基中，以选择已经用编辑载体转化或转染的细胞。一旦 基本上或很大程度上单一化，细胞将生长250至50倍，并建立集落。在 建立集落后，通过提供进行诱导编辑的条件(例如，温度，添加诱导或抑 制化学物质)来诱导编辑。在开始编辑并使其继续进行后，可以使细胞在 微孔中生长至最终尺寸(例如，集落的归一化)，然后可以将其从微孔中 冲洗出来并汇集，然后转移至细胞取出单元1014或可以将其转移回生长 模块1004以进行另一轮编辑。在汇集和转移至生长模块之间，可存在一 个或更多个附加步骤，诸如通过切向流过滤进行细胞恢复、培养基更换、 细胞浓缩等。需注意，选择/单一化或基本上单一化/生长/诱导/编辑和归一 化模块可以为同一模块，其中所有过程均在实体壁装置中进行，或者选择 和/或稀释可以在细胞被转移到实体壁单一化或基本上单一化/生长/诱导/ 编辑和归一化模块(实体壁装置)之前在单独的容器中进行。一旦汇集了 推定编辑的细胞，就可以对它们进行另一轮编辑，从生长、细胞浓缩和处 理开始，使其变成电感受态，然后经由电穿孔模块1008在另一个编辑盒 中通过另一个供体核酸进行转化。
在电穿孔装置1008中，从第一轮编辑中选择的细胞被第二组编辑寡 核苷酸(或其他类型的寡核苷酸)转化，并且重复该循环直到细胞已经被 转化并被所需数量的例如编辑盒编辑。图10中例示的多模块细胞处理仪 器1000由处理器1042控制，该处理器1042被配置为基于用户输入来操 作该仪器，或者由一个或更多个脚本控制，该脚本包括与试剂盒相关联的 至少一个脚本。处理器1042可以控制各种过程的时间、持续时间和温度， 试剂的分配以及自动化多模块细胞处理仪器1000的各种模块的其他操作。 例如，脚本或处理器可以控制：细胞、试剂、载体和编辑寡核苷酸的分配； 哪些编辑寡核苷酸用于细胞编辑以及顺序如何；恢复和表达模块中使用的 时间、温度和其他条件；在细胞生长模块中读取OD所处的波长、细胞生 长到的目标OD以及细胞到达目标OD的目标时间。另外，处理器可以被 编程为(例如，经由到智能电话或其他装置的应用)通知用户关于自动化 多模块细胞处理仪器中的细胞的进度。
在给出本公开内容的情况下，对于本领域的普通技术人员应该明显的 是，所描述的过程可以为递归的和多路复用的；也就是说，细胞可以经历 关于图10所描述的工作流程，然后所得到的经编辑的培养物可以经历具 有不同编辑载体的另一轮(或几轮或多轮)的附加编辑(例如，递归编辑)。 例如，可以稀释来自第一轮编辑的细胞，并且由编辑载体A编辑的经编辑 的细胞的等分试样可以与编辑载体B组合，由编辑载体A编辑的经编辑的 细胞的等分试样可以与编辑载体C组合，由编辑载体A编辑的经编辑的细 胞的等分试样可以与编辑载体D组合，以此类推以进行第二轮编辑。在第 二轮之后，可以对每个双重编辑的细胞的等分试样进行第三轮编辑，其中， 例如，将AB-、AC-、AD-经编辑的细胞中的每个细胞的等分试样与其他编 辑载体诸如编辑载体X、Y和Z组合在一起。也就是说，双重编辑细胞 AB可以与载体X、Y和Z组合并由其编辑以产生三重编辑的经编辑的细 胞ABX、ABY和ABZ；双重编辑的细胞AC可以与载体X、Y和Z组合 并由其编辑以产生三重编辑的细胞ACX、ACY和ACZ；以及双重编辑细 胞AD可以与载体X、Y和Z组合并由其编辑以产生三重编辑细胞ADX、 ADY和ADZ，等等。在此过程中，可以进行许多排列和组合的编辑，从 而导致非常多样化的细胞群体和细胞库。在任何递归过程中，“固化”先 前的引擎载体和编辑载体(或单个载体系统中的单个引擎载体+编辑载体) 是有利的。“固化”是这样的过程，其中从转化的细胞中消除在前一轮编 辑中使用的一个或更多个载体。可以通过例如使用固化质粒裂解载体从而 使编辑和/或引擎载体(或单个，组合的载体)无功能化；经由细胞生长来 稀释细胞群体中的载体(也就是说，细胞经历的生长周期越多，保留编辑 或引擎载体的子细胞就越少)，或者通过例如利用编辑或引擎载体(或组 合的引擎+编辑载体)上的加热敏感复制起点来完成固化。固化条件将取 决于固化机理；也就是说，在该示例中，固化质粒如何裂解编辑和/或引擎 质粒。
使用自动化编辑方法、模块、仪器和系统产生细胞文库
在一个方面，本公开内容提供了用于创建细胞文库的自动化编辑方法、 模块、仪器和自动化多模块细胞编辑仪器，该细胞文库使用各种编辑策略 改变各种细胞类型中的感兴趣的RNA和/或蛋白质的表达、水平和/或活性， 如本文中更详细描述的。相应地，本公开内容意图覆盖通过本公开内容的 自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的经编辑的细胞文库。 这些细胞文库可以在各种生物体的细胞中具有不同的靶向编辑，包括但不 限于基因敲除，基因敲入，插入，缺失，单核苷酸编辑，短串联重复序列 编辑，移码，三联体密码子扩展等。这些编辑可以针对基因组的编码区或 非编码区，并且优选被合理地设计。
在其他方面，本公开内容提供了用于创建改变DNA连接过程的细胞 文库的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器。例如，细胞文库可 以包含这样的个体细胞，所述个体细胞在DNA结合位点中具有编辑以干 扰调控所选基因表达的调控元件的DNA结合。另外，细胞文库可以包括 基因组DNA中的编辑，所述基因组DNA中的编辑影响细胞过程，诸如异染色质形成、类别转换重组和VDJ重组。
在特定方面，对细胞群体内的个体细胞使用多重编辑来创建细胞文库， 其中细胞群体内的多于一个细胞在单轮编辑中进行编辑，即，细胞文库的 细胞内的多于一个改变在单次自动化操作中进行。可以在单次多重自动化 操作中创建的文库可以包括多达500个经编辑的细胞，1000个经编辑的细 胞，2000个经编辑的细胞，5000个经编辑的细胞，10,000个经编辑的细 胞，50,000个经编辑的细胞，100,000个经编辑的细胞，200,000个经编辑 的细胞，300,000个经编辑的细胞，400,000个经编辑的细胞，500,000个 经编辑的细胞，600,000个经编辑的细胞，700,000个经编辑的细胞，800,000 个经编辑的细胞，900,000个经编辑的细胞，1,000,000个经编辑的细胞，2,000,000个经编辑的细胞，3,000,000个经编辑的细胞，4,000,000个经编 辑的细胞，5,000,000个经编辑的细胞，6,000,000个经编辑的细胞，7,000,000 个经编辑的细胞，8,000,000个经编辑的细胞，9,000,000个经编辑的细胞， 10,000,000个经编辑的细胞或更多。
在其他特定方面，对细胞群体内的个体细胞使用递归编辑来创建细胞 文库，其中在两轮或更多轮编辑中将编辑添加到个体细胞。递归编辑的使 用导致靶向文库中的个体细胞的基因组中的两个或更多个位点的两个或 更多个编辑的合并。可以在自动化递归操作中创建的文库可以包括多达 500个经编辑的细胞，1000个经编辑的细胞，2000个经编辑的细胞，5000 个经编辑的细胞，10,000个经编辑的细胞，50,000个经编辑的细胞，100,000个经编辑的细胞，200,000个经编辑的细胞，300,000个经编辑的细胞， 400,000个经编辑的细胞，500,000个经编辑的细胞，600,000个经编辑的 细胞，700,000个经编辑的细胞，800,000个经编辑的细胞，900,000个经 编辑的细胞，1,000,000个经编辑的细胞，2,000,000个经编辑的细胞， 3,000,000个经编辑的细胞，4,000,000个经编辑的细胞，5,000,000个经编辑的细胞，6,000,000个经编辑的细胞，7,000,000个经编辑的细胞，8,000,000 个经编辑的细胞，9,000,000个经编辑的细胞，10,000,000个经编辑的细胞 或更多。
可以基于本说明书进行修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略 的示例可见于例如美国专利第8,110,360号、第8,332,160号、第9,988,624 号、第20170316353号和第20120277120号中。
在特定方面，可以首先使用递归编辑来创建细胞表型，并且然后在随 后若干轮编辑中用于反转表型和/或加速其他细胞特性。
在一些方面，细胞文库包含用于在细胞中创建非天然氨基酸的编辑。
在特定方面，本公开内容提供了经编辑的细胞文库，该经编辑的细胞 文库具有在使用本公开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪 器创建的在一个或更多个调控元件中的编辑。术语“调控元件”是指可以 在特定环境和/或背景中影响可操作地连接的编码序列的转录和/或翻译的 核酸分子。该术语意图包括所有促进或调控转录以及RNA稳定性的元件， 包括启动子、RNA聚合酶和转录因子基本相互作用所需的核心元件、上游元件、增强子和响应元件(参见，例如Lewin,"Genes V"(Oxford University Press,Oxford)pages 847-873)。原核生物中的示例性调控元件包括但不限于 启动子、操纵子序列和核糖体结合位点。真核细胞中使用的调控元件可以 包括但不限于启动子，增强子，隔离子(insulator)，剪接信号和聚腺苷酸化 信号。
优选地，经编辑的细胞文库包括基于预测蛋白质结构、特定细胞类型 中的表达和/或活性而设计的合理设计的编辑。例如，合理的设计可以基于 具有特定核酸酶和基因调控的基因组编辑的全系统生物物理模型，以预测 包括核酸酶表达和/或结合、生长条件和其他实验条件在内的不同编辑参数 如何共同控制核酸酶编辑的动力学。参见例如Farasat和Salis,PLoS Comput Biol.,29:12(1):e1004724(2016)。
在一个方面，本公开内容提供了使用本发明的自动化编辑仪器、系统 和方法创建的具有各种合理设计的调控序列的经编辑的细胞文库的创建。 例如，经编辑的细胞文库可以包括使用一组组成型和/或诱导型启动子、增 强子序列、操纵子序列和/或核糖体结合位点创建的原核细胞群体。在另一 个示例中，经编辑的细胞文库可以包括使用一组的组成型和/或诱导型启动 子、增强子序列、操纵子序列和/或不同的Kozak序列创建的用于表达感兴 趣的蛋白质的真核序列。
在一些方面，本公开内容提供了包括具有合理设计的编辑的细胞的细 胞文库，所述合理设计的编辑包括遍及生物体的基因组的感兴趣序列中的 一类或更多类编辑。在特定方面，本公开内容提供了包括具有合理设计的 编辑的细胞的细胞文库，所述合理设计的编辑包括遍及基因组的子集的感 兴趣序列中的一类或更多类编辑。例如，细胞文库可以包括具有合理设计 的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及外显子组的感兴趣序列(例如， 基因组的每个或大多数开放读码框)中的一类或更多类编辑。例如，细胞文 库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及整 个激酶组的感兴趣序列中的一类或更多类编辑。在又一个示例中，细胞文 库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑包括遍及整 个分泌组的感兴趣序列中的一类或更多类编辑。在另外的其他的方面，细 胞文库可以包括具有合理设计的编辑的细胞，所述合理设计的编辑被创建 以分析外显子组内编码的蛋白质的各种亚型(isoform)，并且可以将细胞文 库设计为控制一种或更多种特定亚型的表达，例如用于转录组分析。
重要的是，在某些方面，细胞文库可包括使用随机化序列(例如随机化 启动子序列)的编辑，以减少文库内个体细胞中一种或更多种蛋白质表达之 间的相似性。另外，细胞文库中的启动子可以是组成型的、诱导型的或两 者，以实现强的和/或可滴定的表达。
在其他方面，本公开内容提供了用于创建细胞文库的自动化编辑方法、 自动化多模块细胞编辑仪器，所述细胞文库包含编辑以鉴定所选基因靶的 最佳表达。例如，通过代谢工程产生生物化学物质通常需要途径酶的表达， 并且细胞中最佳的生产产率并不总是通过最高的量的靶途径酶来实现，而 是通过微调个体酶的表达水平和相关调控蛋白质和/或途径来实现。类似地， 有时可以通过实验调节异源蛋白质的表达水平以获得最佳产率。
转录影响基因表达水平的最明显方式是通过Pol II起始速率，其可以 通过启动子或增强子强度和反式活化因子的组合进行调控(Kadonaga等人, Cell,116(2):247-57(2004))。在真核生物中，延伸速率还可以通过影响选择 性剪接来确定基因表达模式(Cramer等人,PNAS USA,94(21):11456-60 (1997))。基因上终止失败可以通过降低启动子对Pol II的可及性而减少下 游基因的表达(Greger等人,PNAS USA,97(15):8415-20(2000))。这个过程 称为转录干扰，在低等真核生物中特别重要，因为它们通常具有紧密间隔 的基因。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于优化细胞基因转录的方法。 基因转录是若干种不同生物学现象(包括转录起始(RNAp募集和转录复合 物形成)、延伸(链合成/延伸)和转录终止(RNAp脱离和终止))的结果。
定点诱变
细胞文库可以使用采用定点诱变的自动化编辑方法、模块、仪器和系 统来创建，即，其中蛋白质的氨基酸序列或其他基因组特征可以通过对蛋 白质或基因组特征进行突变而有意且准确地改变。这些细胞系可用于各种 目的，例如，用于确定细胞内的蛋白质功能，鉴定细胞内的酶活性位点以 及设计新的蛋白质。例如，可以以多重化方式使用定点诱变，以将蛋白质 序列中的单个氨基酸交换为具有不同化学特性的另一个氨基酸。这使人们能够确定合理设计或随机产生的突变对细胞群体内的个体细胞的影响。参 见，例如，Berg等人Biochemistry,第六版(New York:W.H.Freeman and Company)(2007)。
在另一个示例中，可以对细胞文库内的个体细胞进行编辑，以取代蛋 白质复合物中用于相互作用的结合位点中的氨基酸，诸如取代蛋白质结合 位点中的一个或更多个氨基酸，或者取代可以容纳辅因子或配体的酶口袋 中的一个或更多个氨基酸。此类编辑允许对蛋白质进行特定操作，以测量 一种或更多种蛋白质的某些特性，包括与蛋白质复合物中的其他辅因子、 配体等的相互作用。
在又一个示例中，可以使用位点特异性诱变对细胞文库内的个体细胞 进行各种编辑类型，以研究表达量化性状基因座(expression quantitative trait loci，eQTL)。eQTL是解释基因表达表型的遗传变异的一部分的基因座。 本发明的文库对于评估eQTL并将eQTL联系到实际患病状态将是有用的。
在特定方面，引入本公开内容的细胞文库中的编辑可以使用基于已知 或预测的蛋白质结构的合理设计来创建。参见例如Chronopoulou和Labrou, Curr Protoc ProteinSci.；第26章：单元26.6(2011)。这样的定点诱变可以 为文库内的个体细胞提供细胞群体内的一个或更多个定点编辑，并且优选 两个或更多个定点编辑(例如，组合编辑)。
在其他方面，本公开内容的细胞文库是使用定点密码子突变“扫描” 基因的编码区中的所有或基本上所有密码子来创建的。以这种方式，可以 基于基因的一个或更多个密码子中的特定多态性来检查特定密码子的单 个编辑的功能丧失或功能获得。这些文库可以是强大工具，用于确定细胞 或细胞群体中哪些遗传改变是沉默的，或者哪些遗传改变是特定表型的原 因。密码子的编辑可以是随机产生的，或者可以基于已在待分析基因中鉴定出的已知多态性和/或突变进行合理设计。此外，对细胞中单个途径中的 两个或更多个基因使用这些技术可以确定细胞功能或途径中潜在的蛋白 质：蛋白质相互作用或冗余。
例如，丙氨酸扫描可用于确定特定残基对给定蛋白质的稳定性或功能 的贡献。参见，例如，Lefèvre等人,Nucleic Acids Research,卷25(2)：447– 448(1997)。丙氨酸经常用于这种密码子扫描技术中，因为丙氨酸具有非大 体积的(non-bulky)、化学上惰性的甲基官能团，该甲基官能团可以模拟许 多其他氨基酸具有的二级结构偏好。密码子扫描还可用于确定特定残基的 侧链是否在细胞功能和/或活性中起重要作用。如果需要突变残基的尺寸的 保守性，有时其他氨基酸(诸如缬氨酸或亮氨酸)可用于创建密码子扫描细 胞文库。
在其他特定方面，可以使用本发明的自动化编辑方法、自动化多模块 细胞编辑仪器来创建细胞文库，以确定细胞文库中的蛋白质诸如酶或激素 的活性位点，并阐明这些蛋白质中的一种或更多种的作用机理。与分子建 模研究相关的定点诱变可用于发现酶的活性位点结构，并从而发现酶的作 用机理。对这些细胞文库的分析可以提供对蛋白质复合物亚基之间的接触 中蛋白质活性位点处的特定氨基酸残基发挥的作用的理解，对各种遗传背 景下特定氨基酸残基对细胞内运输和蛋白质稳定性/半衰期发挥的作用的 理解。
饱和诱变
在一些方面，使用本公开内容的自动化编辑方法和自动化多模块细胞 编辑仪器创建的细胞文库可以是饱和诱变文库，其中单个密码子或密码子 组被随机化以在感兴趣的一个或更多个特定基因的位置处产生所有可能 的氨基酸。这些细胞文库对于产生变体例如对于定向演化可以特别有用。 参见例如，Chica等人,Current Opinion inBiotechnology 16(4):378–384 (2005)；以及Shivange,Current Opinion in ChemicalBiology,13(1):19–25 (2009)。
在一些方面，包含不同简并密码子的编辑可用于编码文库中个体细胞 中的氨基酸组。因为一些氨基酸比其他氨基酸由更多的密码子编码，所以 氨基酸的确切比例不能相等。在某些方面，使用了更严格的简并密码子。 ‘NNK’和‘NNS’具有编码全部20个氨基酸的优点，但仍然有3％的时 间编码终止密码子。替代密码子诸如‘NDT’、‘DBK’完全避免了终止密 码子，并且编码最少的氨基酸组，但该氨基酸组仍包含所有主要的生物物 理类型(阴离子类型、阳离子类型、脂肪族疏水性类型、芳香族疏水性类型、 亲水性类型、小的类型)。
在特定方面，在饱和诱变编辑过程中使用非冗余饱和诱变，其中使用 特定生物体最常用的密码子。
启动子互换和启动子阶梯
一种用于分析和/或优化一种或更多种感兴趣的基因的表达的机制是 通过创建“启动子互换”细胞文库，其中细胞包含具有与一种或更多种感 兴趣的基因连接的特定启动子的遗传编辑。相应地，使用本公开内容的方 法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的细胞文库可以是启动子互换细胞文 库，启动子互换细胞文库可以用于例如增加或减少感兴趣的基因的表达以 优化代谢途径或遗传途径。在一些方面，启动子互换细胞文库可用于鉴定 影响细胞活力(vitality)或存活力(viability)的基因(例如编码影响细胞生长速 率或总体健康的蛋白质的基因)的表达的增加或减少。在一些方面，启动子 互换细胞文库可用于创建在启动子之间具有依赖性和逻辑性的细胞以创 建合成的基因网络。在一些方面，启动子互换可用于控制自然界中均质性 和异质性(复合组织)群体的细胞之间的细胞间通信。
细胞文库可以利用任何给定数量的启动子和任何给定数量的靶基因， 所述启动子基于一系列表达强度的展示而分组在一起。启动子序列的阶梯 在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后使用本公开内容的自 动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器将该阶梯系统地应用于生物体 的一组基因。
在特定方面，使用本公开内容的自动化编辑方法、模块和系统形成的 细胞文库包括呈现给定启动子的个体细胞，所述给定启动子可操作地连接 至在其他方面相同的遗传背景中的一个或更多个感兴趣的靶基因。可以被 修改以利用自动化系统的非自动化编辑策略的示例可见于例如美国专利 第9,988,624号中。
在特定方面，通过编辑一组靶基因以可操作地连接至一组预选的启动 子来产生启动子互换细胞文库，该组预选的启动子充当用于表达感兴趣的 基因的“启动子阶梯”。例如，对细胞进行编辑，以便对一个或更多个感 兴趣的个体基因进行编辑以与启动子阶梯中的不同启动子可操作地连接。 当不存在内源启动子，内源启动子的序列未知，或者内源启动子先前已经 以某种方式进行了改变时，可以将启动子阶梯的个体启动子插入在感兴趣的基因的前面。这些产生的细胞文库具有这样的个体细胞，所述个体细胞 在其他方面相同的遗传背景下带有与一个或更多个靶基因可操作地连接 的阶梯的个体启动子。
通常选择启动子以产生遍及不同基因座的可变表达，并且所述启动子 可以包括诱导型启动子、组成型启动子或两者。
使用启动子阶梯编辑的该组靶基因可以包括基因组或基因组的选定 子集中的所有或大部分开放读码框(ORF)(例如，激酶组或分泌组的ORF)。 在一些方面，靶基因可以包括基因的各种亚型的编码区，并且细胞文库可 以被设计成表达一种或更多种特定亚型，例如，用于使用各种启动子进行 转录组分析。
该组靶基因也可以是已知参与或怀疑参与特定细胞途径(例如调控途 径或信号传导途径)的基因。该组靶基因可以是涉及功能的ORF，通过基 于先前产生的编辑之间的上位相互作用的算法选择、基于关于对靶有益的 ORF的假设的其他选择标准、或通过随机选择，所述功能涉及先前证明的 有益编辑(先前的启动子互换或先前的SNP互换)。在特定的实施方案中， 靶基因可以包含非蛋白质编码基因，包括非编码RNA。
其他功能遗传元件(包括隔离子元件和其他基因组组织元件)的编辑也 可以用于系统地改变一组靶基因的表达水平，并且可以使用本公开内容的 方法、自动化多模块细胞编辑仪器来引入。在一个方面，使用单独的增强 子序列的阶梯或者增强子序列的阶梯与选定的启动子或启动子阶梯的组 合来编辑细胞群体，以创建在这些增强子元件中具有各种编辑的细胞文库。 在另一个方面，使用单独的核糖体结合序列的阶梯或者核糖体结合序列的 阶梯与选定的启动子或启动子阶梯的组合来编辑细胞群体，以产生在这些 核糖体结合序列中具有各种编辑的细胞文库。
在另一个方面，对细胞群体进行编辑以允许各种mRNA和/或蛋白质 稳定化或去稳定化序列附接至转录物或蛋白质的5′端或3′端或任何其他位 置。
在某些方面，可以使用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器和 系统来编辑先前建立的细胞系的细胞群体，以创建细胞文库以改善细胞的 功能、健康和/或存活力。例如，目前许多用于大规模生产的工业株是在许 多年(有时是数十年)的时间段里，迭代使用随机诱变方法开发的。不需要 的中性突变和有害突变随着有益的改变一起引入菌株中，并且随着时间的 流逝，这导致株在总体稳健性和关键性状(诸如生长速率)方面具有缺陷。在另一个示例中，哺乳动物细胞系在一些时间段内通过细胞的传代继续突 变，并且同样地，这些细胞系可以变得不稳定并获得不期望的性状。本公 开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器可以使用编辑策略 (诸如SNP互换和/或STR互换、插入/缺失创建或其他技术)来去除或改变 不期望的基因组序列和/或引入新的基因组序列以解决这些缺陷，同时保留 细胞的期望特性。
当使用递归编辑时，在经编辑的细胞文库中的个体细胞中的编辑可以 在基因组的异位位点(ectopic site)(例如，CarT基因座)中掺入内含物“着陆 垫(landing pad)”，以优化表达、稳定性和/或控制。
在一些实施方案中，所产生的具有包含一个或更多个编辑(引入或去除) 的个体细胞的每个文库在一个或更多个标准(例如，产生感兴趣的化学物质 或产物)下进行培养和分析。然后将具有特定标准的细胞与细胞中的一个或 更多个特定编辑进行关联或相关。以这种方式，可以确定给定编辑对任何 数量的感兴趣的遗传性状或表型性状的影响。鉴定与特定标准或增强的功 能/稳健性相关的多于一个编辑可以致使细胞具有高度期望的特征。
敲除文库或敲入文库
在某些方面，本公开内容提供了用于创建具有对各种感兴趣的基因的 “敲除”(KO)编辑或“敲入”(KI)编辑的细胞文库的自动化编辑方法、模 块、仪器和系统。因此，本公开内容意图涵盖通过本公开内容的自动化编 辑方法、自动化多模块细胞编辑仪器创建的经编辑的细胞文库，所述经编 辑的细胞文库具有一个或更多个去除或减少所选感兴趣的基因的表达的 突变，以研究这些编辑对细胞文库内个体细胞的基因功能的作用。
可以使用靶向基因KO(例如，经由插入/缺失)或KO(例如，经由同源 引导修复)来创建细胞文库。例如，双链断裂常常经由非同源末端连接DNA 修复途径来修复。已知这种修复容易出错，并因此可以引入插入和缺失， 从而可以破坏基因功能。优选地，合理地设计编辑以特异性地影响感兴趣 的基因，并且可以创建具有一个或更多个感兴趣的基因座的KI或KI的个 体细胞。可以使用本公开内容的自动化递归编辑来创建具有两个或更多个 感兴趣的基因座的KO或KI的细胞。
在特定方面，使用对细胞群体内的细胞的同时多重编辑来创建KO或 KI细胞文库，并且细胞群体内的多于一个细胞在单轮编辑中进行编辑，即， 细胞文库的细胞内的多于一个改变在单次自动化操作中进行。在其他特定 方面，对细胞群体内的个体细胞使用递归编辑来创建细胞文库，并致使将 基因组中两个或更多个位点的多于一个编辑合并到单个细胞中。
SNP或短串联重复序列互换
在一方面，使用本公开内容的自动化编辑方法、自动化多模块细胞编 辑仪器来创建细胞文库，通过将单核苷酸多态性(“SNP”)系统性地引入 个体细胞的基因组中或取代个体细胞的基因组中的SNP来创建“SNP互换” 细胞文库。在一些实施方案中，本公开内容的SNP互换方法包括添加有益 的SNP和去除有害的和/或中性的SNP。SNP互换可以靶向编码序列、非 编码序列或两者。
在另一个方面，使用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器、仪 器和系统来创建细胞文库，通过将短串联重复序列(“STR”)系统性地引 入个体细胞的基因组中或取代个体细胞的基因组中的STR来创建“STR互 换”细胞文库。在一些实施方案中，本公开内容的STR互换方法包括添加 有益的STR和去除有害的和/或中性的STR。STR互换可以靶向编码序列、 非编码序列或两者。
在一些实施方案中，用于创建细胞文库的SNP和/或STR互换被多路 复用，并且细胞群体内的多于一个细胞在单轮编辑中被编辑，即，细胞文 库中的细胞内的多于一个改变在单次自动化操作中进行。在其他实施方案 中，用于创建细胞文库的SNP互换和/或STR互换是递归性的，并且致使 多于一个有益序列和/或有害序列去除合并到单个细胞中。多于一个改变可 以是一组特定的限定改变或部分随机的组合突变文库。有害突变的去除和 有益突变的合并可以为各种细胞过程提供直接改善。去除遗传负担或将有 益改变合并到无遗传负担的株中，也为另外的能够实现进一步改善的随机 诱变提供了新的稳健的起点。
SNP互换克服了随机诱变方法的根本局限性，因为SNP互换不是随机 方法，而是系统性引入或去除跨细胞的个体突变。
剪接位点编辑
RNA剪接是这样的加工，在该加工过程中，切除内含子并将外显子剪 接在一起以创建可以翻译成蛋白质的mRNA。细胞机制对剪接信号的准确 识别对于此过程至关重要。相应地，在一些方面，使用对各种基因座中的 已知和/或预测的剪接供体和/或受体位点的系统性编辑来编辑细胞群体， 以创建各种基因的剪接位点变体文库。这种编辑可以帮助阐明细胞环境中 基因的各种亚型的生物学重要性。用于合理设计各种编码区的剪接位点(包括与各种哺乳动物疾病相关的实际突变或预测突变)的序列可以使用分析 技术(诸如可见于Nalla和Rogan,Hum Mutat,25:334-342(2005)；Divina等 人,Eur J Hum Genet,17:759-765(2009)；Desmet等人,Nucleic Acids Res, 37:e67(2009)；Faber等人,BMCBioinformatics,12(增刊4):S2(2011)中的那 些分析技术)来预测。
起始/终止密码子交换和核酸类似物的掺入
在一些方面，本公开内容提供了使用本公开内容的自动化编辑方法、 模块、仪器和系统的细胞文库创建，其中通过交换生物体的整个基因组或 基因组中编码区的选定子集(例如激酶组或分泌组)中的起始密码子变体和 终止密码子变体来创建文库。在细胞文库中，个体细胞将具有替换一个或 更多个感兴趣的基因的天然起始密码子或终止密码子的一个或更多个起 始密码子或终止密码子。
例如，真核生物使用的典型起始密码子为ATG(AUG)，而原核生物最 常使用ATG(AUG)，其次是GTG(GUG)和TTG(UUG)。细胞文库可以包 括这样的个体细胞，所述个体细胞具有对一个或更多个感兴趣的基因的天 然起始密码子的取代。
在一些方面，本公开内容提供了通过在所选择的感兴趣基因的前面用 TTG替换ATG起始密码子来自动化创建细胞文库。在其他方面，本公开 内容提供了通过用GTG替换ATG起始密码子来自动化创建细胞文库。在 其他方面，本公开内容提供了通过用ATG替换GTG起始密码子来自动化 创建细胞文库。在其他方面，本公开内容提供了通过用TTG替换GTG起 始密码子来自动化创建细胞文库。在其他方面，本公开内容提供了通过用 ATG替换TTG起始密码子来自动化创建细胞文库。在其他方面，本公开 内容提供了通过用GTG替换TTG起始密码子来自动化创建细胞文库。
在其他实例中，酿酒酵母(S.cerevisiae)和哺乳动物的典型终止密码子 分别为TAA(UAA)和TGA(UGA)。单子叶植物的典型终止密码子为TGA(UGA)，而昆虫和大肠杆菌通常使用TAA(UAA)作为终止密码子(Dalphin. 等人,Nucl.Acids Res.,24:216-218(1996))。细胞文库可以包括这样的个体 细胞，所述个体细胞具有对一个或更多个感兴趣的基因的天然终止密码子 的取代。
在一些方面，本公开内容提供了通过用TAG替换TAA终止密码子来 自动化创建细胞文库。在其他方面，本公开内容提供了通过用TGA替换 TAA终止密码子来自动创化建细胞文库。在其他方面，本公开内容提供了 通过用TAA替换TGA终止密码子来自动化创建细胞文库。在其他方面， 本公开内容提供了通过用TAG替换TGA终止密码子来自动化创建细胞文库。在其他方面，本公开内容提供了通过用TAA替换TAG终止密码子来 自动化创建细胞文库。在其他方面，本发明教导了通过用TGA替换TAG 终止密码子来自动化创建细胞文库。
终止子互换和终止子阶梯
用于鉴定一个或更多个感兴趣的基因的剪接前mRNA的最佳终止的 一种机制是通过创建“终止子互换”细胞文库，其中细胞包含具有与一个 或更多个感兴趣的基因连接的特定终止子序列的遗传编辑。相应地，使用 本公开内容的方法、模块、仪器和系统创建的细胞文库可以是终止子互换 细胞文库，所述终止子互换细胞文库可以用于例如通过从合成位点释放转 录物来影响mRNA的稳定性。在其他实施方案中，终止子互换细胞文库可 用于鉴定转录终止效率的增加或降低以及由此引起的未剪接的前mRNA 的累积(例如，West和Proudfoot,Mol Cell.；33(3-9)；354-364(2009))和/或3′ 端加工(例如，West等人,MolCell.29(5):600-10(2008))。在基因与多于一个 终止位点连接的情况下，该编辑可以将编辑的组合编辑成与基因缔合的多 于一个终止子。也可以在蛋白质的末端添加另外的氨基酸，以确定蛋白质 长度对终止子的影响。
细胞文库可以利用任何给定数量的终止子编辑和任何给定数量的靶 基因，所述终止子编辑是基于一系列活性的展示而为终止子阶梯选择的。 终止子序列的阶梯在至少一种条件下改变至少一个基因座的表达。然后使 用本公开内容的自动化编辑方法、模块、仪器和系统将该阶梯系统性地应 用于生物体中的一组基因。
在一些方面，本公开内容提供了使用本公开内容的自动化编辑方法、 模块、仪器和系统的细胞文库创建，其中创建文库以编辑文库的个体细胞 中基因组的一个或更多个区域中的终止子信号。真核生物中的转录终止通 过终止子信号来操作，终止子信号被与RNA聚合酶II缔合的蛋白质因子 识别。例如，细胞文库可以包含这样的个体真核细胞，所述个体真核细胞 在编码多聚腺苷酸特异性因子(CPSF)和裂解刺激因子(CstF)的基因和/或编 码由CPSF和CstF因子募集到终止位点的蛋白质的基因中具有编辑。在原 核生物中，两种主要机制(称为Rho非依赖性终止和Rho依赖性终止)介导 转录终止。例如，细胞文库可以包含在编码影响这些终止途径的结合、效 率和/或活性的蛋白质的基因中具有编辑的个体原核细胞。
在某些方面，本公开内容提供选择具有最佳特性的终止序列(“终止子”) 的方法。例如，在一些实施方案中，本公开内容教导提供用于在宿主细胞 内引入和/或编辑一个或更多个终止子和/或产生一个或更多个终止子的变 体的方法，所述终止子和/或终止子变体表现出一系列活性。终止子的特定 组合可以作为终止子阶梯组合在一起，并且本公开内容的细胞文库包括代 呈现这样的终止子的个体细胞，所述终止子可操作地连接至在其他方面相 同的遗传背景中的一个或更多个感兴趣的靶基因。可以被修改以利用自动 化仪器的非自动化编辑策略的示例可见于例如Serber等人的题为 “Microbial strainimprovement by a HTP genomic engineering platform.”的 美国专利第9,988,624号中。
在特定方面，通过编辑一组靶基因来产生终止子互换细胞文库，所述 靶基因可操作地连接至预选的一组终止子，所述终止子充当感兴趣的基因 的表达的“终止子阶梯”。例如，对细胞进行编辑，以便用启动子阶梯中 的不同启动子编辑可操作地连接至感兴趣的个体基因的内源启动子。当不 存在内源启动子、内源启动子序列未知、或者内源启动子先前已经以某种 方式进行了改变时，可以将启动子阶梯的个体启动子插入在感兴趣的基因 的前面。这些产生的细胞文库具有这样的个体细胞，所述个体细胞在其他 方面相同的遗传背景下带有与一个或更多个靶基因可操作地连接的阶梯 的个体启动子。然后将所讨论的终止子阶梯与感兴趣的给定基因缔合。
终止子阶梯可用于更普遍地影响基因组或基因组的选定子集中所有 或大多数ORF(例如，激酶组或分泌组的ORF)的终止。该组靶基因也可以 是已知参与或怀疑参与特定细胞途径(例如调控途径或信号传导途径)的基 因。该组靶基因可以是涉及功能的ORF，通过基于先前产生的编辑之间的 上位相互作用的算法选择、基于关于对靶有益的ORF的假设的其他选择标 准、或通过随机选择，所述功能涉及先前证明的有益编辑(先前的启动子互换或先前的SNP互换)。在特定的实施方案中，靶基因可以包含非蛋白质 编码基因，包括非编码RNA。
实施例
提出以下实施例以便向本领域普通技术人员提供如何进行和使用本 发明的完整公开内容和描述，并且不意图限制本发明人认为的其发明的范 围，也不意图表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。其他等同的方 法、步骤和组合物被意图包括在本发明的范围内。已经尽力确保关于所使 用的数字(例如量，温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。 除非另有说明，否则部份是按重量计的部份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1:评估模型诱导型系统的适用性
评估了模型系统的基本组分。模型系统包括用引擎载体转化的大肠杆 菌细胞，其中引擎载体包含在pL温度诱导型启动子的控制下的MAD核酸 酶(即MAD 4或MAD 7核酸酶)的编码序列、氯霉素抗性标志物、以及在 pBAD启动子控制下的λ红色重组工程化系统(通过向生长培养基中添加阿 拉伯糖进行诱导)。还用包含编辑寡核苷酸的编辑载体转化了大肠杆菌细胞， 所述编辑寡核苷酸在模型系统中为编辑寡核苷酸的文库，每个编辑寡核苷 酸均被配置为灭活galK，其中，当铺在补充有作为唯一碳源的半乳糖的 MacConkey琼脂上时，在成功编辑的情况下产生白色(相对于红色)菌落。 另外，编辑载体包含在pL温度诱导型启动子的控制下的gRNA编码序列， 羧苄青霉素抗性标志物，以及用于去除、突变或以其他方式使靶序列中的 PAM区失活的序列。图11A和图11B描绘了可以在本文描述的示例性编 辑工作流程中采用的示例性的引擎载体(图11A)和编辑载体(图11B)。在图 11A中，示例性引擎载体1110(p197)包含复制起点1112，和驱动编码调控 pL启动子的c1857阻遏物1116的基因的表达的启动子1114。在该示例性 实施方案中，第一pL启动子驱动编辑载体上的gRNA的转录，如以下关 于图11B所述，并且引擎载体上的第二pL启动子1118驱动核酸酶1120 的表达。驱动核酸酶1120的启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子； 然而，对核酸引导的核酸酶系统最严格的调控通过使用诱导型启动子来驱 动核酸酶以及引导核酸的表达来实现。同样，可以使用相似的诱导型启动 子和不同的诱导型启动子来驱动引导核酸和核酸酶的转录。pL启动子可以 受不耐热的c1857阻遏物1116调控(例如阻遏或诱导)，c1857阻遏物1116 在容许温度(例如30℃)是有活性的，而在较高温度(例如42℃)失活。参考 上文图1C更详细地示出了pL启动子的调控。
图11A中的引擎载体还包含pBAD启动子1140，pBAD启动子1140 驱动λ红色重组工程化系统1142的组分表达。pBAD启动子与pL启动子 一样是诱导型启动子，其中通过向生长培养基中添加阿拉伯糖来调控(诱 导)pBAD启动子。须注意，在该示例性细菌编辑系统中，提供重组工程化 系统诸如λ红色重组工程化系统作为核酸引导的核酸酶编辑系统的组分，以修复编辑过程中发生的DNA断裂。然而，在一些实施例中，待编辑的 细胞可以已经包含重组工程化系统(例如，以附加体形式包含重组工程化系 统，重组工程化系统整合到细胞基因组中或天然包含重组工程化系统)。另 外，尽管此处以λ红色重组工程化系统为例，但是应当理解，可以采用其 他重组工程化系统。此外，细胞(诸如酵母细胞，植物细胞和动物细胞)不 需要与λ红色重组工程化系统等效的重组工程化系统来修复由编辑产生的 DNA断裂。因此，用于例如酵母细胞、植物细胞和动物细胞的核酸引导的 核酸酶编辑组分不需要包括异源重组工程化系统。最后，示例性引擎载体 1110包含驱动氯霉素选择性标志物1152的表达的启动子1150。另外，本 发明公开的方法中使用的引擎载体和所有其他载体或构建体包含可操作 地连接至核酸引导的核酸酶编辑系统组件的合适的控制元件(例如，聚腺苷酸化信号、增强子)。
图11B描绘了示例性编辑载体1130(pLFORGE)。编辑载体1130包含 复制起点1132和驱动编辑盒1136表达的pL启动子1134。编辑盒包含 gRNA 1144、间隔区1146和供体DNA1158(包含位于待对靶序列进行期望 的编辑的侧翼的同源臂)的编码序列。编辑载体1130还包含驱动羧苄青霉 素选择性标志物1156的表达的启动子1154。须注意，pL诱导型启动子1134 被编码在载体骨架上，而不是编辑盒1136的一部分；然而，在其他实施方 案中，驱动gRNA转录的诱导型启动子可以是编辑盒的一部分。图11A和 图11B分别描绘了示例性引擎载体和编辑载体，但是鉴于本说明书的引导， 本领域的普通技术人员应该认识到，核酸引导的核酸酶编辑系统的所有元 件可以包含在单个质粒上，或者图11A和图11B的引擎载体和编辑载体上 示出的元件可以位于与所示不同的载体上。例如，pBAD启动子和λ红色 重组工程化系统可以包含在编辑载体上而不是引擎载体上；同样，c1857 阻遏物的基因可以包含在编辑载体上，而不是引擎载体上。
图12是示出观察到的在各种启动子下的galK gRNA靶向盒的转化效 率的柱状图。未经诱导的启动子的转化效率为启动子泄漏(leakiness)提供了 指标。如果存在高的gRNA的基础表达(例如“泄漏”)，则将存在低的CFU。 如果存在低的gRNA的基础表达(例如严格调控)，则将存在高的CFU。非 靶向gRNA实验是用设计成靶向无法促进gRNA和核酸酶结合及裂解的失 活的PAM序列的盒的汇集进行的。对于所描绘的每个启动子(pL、pBAD 和σ32)，将具有TTTC PAM的靶向galK的盒和被配置成在氨基酸D70处 进行终止密码子插入的间隔区克隆到启动子的下游。将质粒浓度归一化至 50ng/μL，并以相等的细胞体积转化。使用来自系列稀释铺板的CFU得出 转化效率，表示为CFU/μg。J23119启动子是组成型启动子，pL启动子是 高温诱导型，pBAD启动子受生长培养基中阿拉伯糖的存在诱导，并且σ32 启动子在稳定期细胞中诱导。对于MAD7核酸酶，σ32启动子显示出泄漏 表达，而pL启动子和pBAD启动子两者均受严格阻遏。
图13是示出热诱导对细胞存活力的影响的图。在该实验中，盒的汇 集被设计成靶向失活的PAM序列。将细胞以1/50v:v稀释至含有200μL LB +氯霉素(chlor)/羧苄青霉素(carb.)的微量滴定板中。在Infinite M Nano+板 读取器中持续振荡，在指示的温度将稀释的培养物诱导1小时，然后变回 到30℃。T0对应于诱导步骤的时间，并且通过以10分钟的间隔测量OD600 来监测生长。注意到高温(42℃)诱导对细胞存活力或生长速率没有影响。
图14示出了使用靶向galK基因座并在氨基酸D70处引入终止密码子 的单序列验证的编辑盒的汇集的诱导实验的结果。在生长三个小时后，将 细胞在42℃诱导15分钟或保持在30℃，然后进行系列稀释铺板。基于铺 板体积计算CFU/mL。作为参考，图14中的虚线示出了在等效实验中使用 组成型J23119启动子获得的典型CFU(数据未示出)。如可以观察到的，， 不存在诱导(即，不存在编辑)因缺少毒性dsDNA断裂而能够实现高效转化 (10倍-100倍)。
图15示出了从沉默PAM突变(SPM)文库中随机挑选的变体的生长概 况。这个拥有500个成员的文库靶向位于遍及整个大肠杆菌生物体的区域， 并整合了没有预期适应性影响的同义突变。从未经诱导的转化细胞的琼脂 板上挑选菌落。从琼脂板上挑选细胞，并以96孔微量滴定板形式在200μL LB+氯霉素/羧苄青霉素中过夜生长。然后将10μL亲本微量滴定板的孔 内容物转移至两个复制子代微量滴定板中，不接受诱导(顶部)或者接受在 42℃(底部)gRNA和核酸酶的诱导(经由pL诱导型启动子)1小时。孔图示 出了在6小时时的相对OD。插图示出了所示孔的完整生长曲线的实施例， 以作为参考。复制孔代表在具有gRNA诱导下或没有gRNA诱导的情况下， 从相同盒设计观察到的生长。尽管未经诱导的板的大多数孔均显示出正常 的生长概况，但经诱导的板显示，当被诱导时，大部分gRNA设计仍然是 有活性的，这通过细胞达到指数生长之前较大的滞后期而表明。也就是说， 活性编辑的细胞由于DNA损伤而降低了存活力，使得菌落中的许多细胞 死亡，并且确实存活的那些经编辑的细胞由于细胞机制工作以修复编辑， 因此起初生长缓慢。可以利用经编辑的细胞的这种特性以高通量方式筛选 活性编辑。
实施例2:编辑盒和骨架扩增和组装
编辑盒制备：使用Q5聚合酶以50μL体积扩增在芯片上合成的5nM 寡核苷酸。PCR条件为在95℃持续1分钟；在95℃持续30秒/在60℃持 续30秒/在72℃持续2.5分钟进行8轮；最后在72℃持续5分钟。扩增后， 对PCR产物进行SPRI清理，其中将30μLSPRI混合物添加到50μL PCR 反应物中，并孵育2分钟。使管经受磁场2分钟，去除液体，并且然后用 80％乙醇将珠洗涤2x，使洗涤之间间隔1分钟。最后一次洗涤后，将珠干 燥2分钟，将50μL 0.5x TEpH 8.0添加到管中，并将珠涡旋来混合。将浆 液在室温孵育2分钟，然后经受磁场2分钟。取出洗脱液并量化DNA。
量化后，使用来自SPRI清理的洗脱液的稀释液进行第二扩增程序。 PCR在以下条件下进行：在95℃持续1分钟；在95℃持续30秒/在72℃ 持续2.5分钟进行18轮；最后在72℃持续5分钟。在2％的琼脂糖凝胶上 检查扩增子，并鉴定出具有最干净的产物的汇集。未使用看起来具有异二 聚体或嵌合体的扩增产物。
骨架制备：对纯化的骨架进行10倍的系列稀释系列，并在以下条件 下扩增了每个稀释骨架系列：在95℃持续1分钟；然后在95℃持续30秒/在60℃持续1.5分钟/在72℃持续2.5分钟进行30轮；最后在72℃持续5 分钟。扩增后，如上文关于盒描述的，使扩增的骨架经受SPRI清理。将 骨架洗脱到100μL ddH2O中并量化，然后进行Gibson
Figure BDA0003517636680001111
吉布森组装(Gibson Assembly)：将150ng骨架DNA与100ng盒DNA 组合。添加等体积的2x吉布森主混合液(Gibson Master Mix)，并且将反 应物在50℃孵育45分钟。组装后，如上所述，对组装后的骨架和盒进行 SPRI清理。
实施例3:将编辑载体文库转化到E
Figure BDA0003517636680001114
中
转化：将20μL制备的编辑载体吉布森组装反应物与10μLE
Figure BDA0003517636680001112
(Lucigen,Middleton,WI)最高感受态细胞一起添加到30μL冷水中。将转化 细胞的等分试样点板接种(spot plate)以检查转化效率，其中需要>100x的覆 盖率才能继续。使转化的E
Figure BDA0003517636680001113
细胞在25mL SOB+100μg/mL羧苄青霉 素(carb)中生长。通过将500μL 50％甘油添加到1000μL饱和的过夜培养物 中，从饱和培养物产生甘油储备液。将储备液冷冻在-80℃。此步骤是任选 的，提供已克隆的编辑文库的现成储备液。可选地，可以在每次编辑实验 之前进行编辑盒与载体骨架的吉布森或另外的组装。
实施例4:感受态细胞的制备
将用引擎载体转化的EC1细胞的新鲜的过夜生长的培养物的1mL等 分试样添加到含有100mL LB/SOB+25μg/mL氯霉素培养基的250mL瓶中。 使细胞生长至0.4-0.7 OD，并通过将培养物转移至冰上10分钟来停止细胞 生长。将细胞在JA-18转子中以8000x g离心5分钟，用50mL冰冷的ddH2O 或10％甘油洗涤3x，并在JA-18转子中以8000x g离心5分钟。将洗涤的 细胞重悬于5mL冰冷的10％甘油中，并且等分成200μL的部分。任选地， 此时可以将甘油储备液储存在-80℃以备后续使用。
实施例5:创建用引擎载体转化的新细胞系
转化：将1μL引擎载体DNA(包含在pL诱导型启动子控制下的MAD7 核酸酶的编码序列、氯霉素抗性基因和λ红色重组工程化系统)添加到50μL EC1菌株大肠杆菌细胞中。将转化的细胞铺在含25μg/mL氯霉素(chlor)的LB板上，并过夜培养，以积累克隆(或基本上克隆)的分离株。第二天，挑 选菌落，使菌落在LB+25μg/mL氯霉素中过夜生长，并通过将500μL50％ 甘油添加到1000μL培养物中，从饱和的过夜培养物制备甘油储备液。将 包含引擎载体的EC1储备液冷冻在-80℃。
实施例6:高通量克隆编辑
以下方案解决由于dsDNA断裂而导致的细胞生长/存活偏倚：
转化：通过电穿孔将100ng的编辑载体克隆文库或编辑载体Gibson
Figure BDA0003517636680001121
反应物转化到100μL含有引擎载体的感受态EC1细胞中。将电 穿孔仪设置为2mm杯中2400V。转化后，使细胞在SOB培养基中恢复3 小时。将恢复细胞的10倍稀释系列(在H2O中)进行点板接种，并将所得 CFU计数/稀释比用于计算转化效率。
铺板和菌落布置：将100μL适当的稀释液铺在LB培养基+25μg/mL 氯霉素上，并在30℃过夜生长。挑选菌落并在96孔微量滴定板中于30℃ 过夜生长至饱和。
诱导切割、编辑和编辑验证：使用复制器(replicator)将孔中来自过夜 生长物的群体转移到复制的96孔微量滴定板中的200μL新鲜SOB+ 1％阿 拉伯糖中。复制器转移约1-2μL/孔，导致生长物稀释100倍。将微量滴定 板以250rpm振荡培养3-4小时，以使细胞达到对数中期。然后将板转移 至42℃的静态培养箱中并培养2小时，然后放置在30℃的培养箱中1小 时以恢复。此时，复制细胞被准备好进行基因组制备以及经由测序分析进 行验证。如关于图2B所描述的，可以使用新鲜的没有阿拉伯糖的SOB的 另外的复制板以能够对群体中的非活性切割设计进行功能解析。
实施例7:错误校正:重新布置并使用诱导型gRNA进行汇集编辑
转化：通过电穿孔将100ng的编辑载体克隆文库或
Figure BDA0003517636680001122
反应物转化到100μL含有引擎载体的感受态EC1细胞中。将电穿孔仪设置 为2mm杯中2400V。转化后，使细胞在SOB培养基中恢复3小时。将恢 复细胞的10倍稀释系列(在H2O中)进行点板接种，并将所得CFU计数/ 稀释比用于计算转化效率。
铺板和菌落布置：将100μL适当的稀释液铺在LB培养基+25μg/mL 氯霉素上，并在30℃过夜生长。挑选菌落，在96孔微量滴定板中于30℃ 在1mL SOB+25μg/mL氯霉素/100μg/mL羧苄青霉素中过夜生长至饱和。
鉴定活性盒并重新布置：使用复制器将孔中来自过夜生长物的群体转 移到复制的96孔微量滴定板中的200μL新鲜的没有阿拉伯糖的SOB中。 复制器转移约1-2μL/孔，导致生长物稀释100倍。将复制的微量滴定板以 250rpm振荡培养3-4小时，以使细胞达到对数生长中期。然后将板转移至 42℃的静态培养箱中并培养2小时，然后放置在30℃的培养箱中1小时以 恢复。然后，使用复制器将细胞从复制的微量滴定板转移到含LB培养基+ 25μg/mL氯霉素/100μg/mL羧苄青霉素的琼脂板上，并使细胞过夜生长。 鉴定出具有活性gRNA的孔，并将来自原始96孔微量滴定板的这些群体 的50μL细胞重新布置到“功能校正”的板中(例如，将鉴定为具有功能性 gRNA的细胞转移(择优挑选)到96孔板中)。
使用鉴定为有活性的汇集的盒进行汇集编辑：将鉴定为具有功能性 gRNA的100μL细胞转移到5mL SOB培养基中，并使细胞生长直至培养 物饱和。将1％阿拉伯糖添加至管中，并将管在30℃孵育2小时。通过将 管移至42℃振荡水浴2小时来诱导切割/编辑。然后将该管从水浴中取移， 并允许在250rpm的振荡培养箱中在30℃恢复2小时。将稀释的培养物(约 10-4至10-5)铺在LB培养基+25μg/mL氯霉素/100μg/mL羧苄青霉素上，产 生分离的克隆集落。通过靶向测序或全基因组测序来评估/验证编辑。
Figure BDA0003517636680001131
转化：通过电穿孔将100 ng的编辑载体克隆文库或Gibson
Figure BDA0003517636680001132
反应物转化到100μL含有引擎载体的感受态EC1细胞中。将电穿孔仪设置 为2mm杯中2400V。转化后，使细胞在SOB培养基中恢复3小时。将恢 复细胞的10倍稀释系列(在H2O中)进行点板接种，并将所得CFU计数/ 稀释比用于计算转化效率。
铺板和菌落布置：将100μL适当的稀释液铺在LB培养基+25μg/mL 氯霉素上，并在30℃过夜生长。挑选菌落，在96孔微量滴定板中于30℃ 在1mL SOB+25μg/mL氯霉素和100μg/mL羧苄青霉素中过夜生长至饱和。
鉴定活性盒并重新布置：使用复制器将孔中来自过夜生长物的群体转 移到复制的96孔微量滴定板中的200μL新鲜的没有阿拉伯糖的SOB中。 复制器转移约1-2μL/孔，导致生长物稀释100倍。将复制的微量滴定板以 250 rpm振荡培养3-4小时，以使细胞达到对数生长中期。然后将板转移至 42℃的静态培养箱中并培养2小时，然后放置在30℃的培养箱中1小时以 恢复。然后，使用复制器将细胞从复制的微量滴定板转移到含LB培养基+ 25μg/mL氯霉素/100μg/mL羧苄青霉素的板上，并使细胞过夜生长。鉴定 出具有活性gRNA的孔，并将来自原始96孔微量滴定板的这些群体的50μL 细胞重新布置到“功能校正”的板中(例如，将鉴定为具有功能性gRNA的 细胞转移到96孔板中)。
文库重新扩增、克隆和验证：汇集鉴定为具有功能性gRNA的细胞， 并提取和分离DNA。对分离的DNA进行系列稀释，并且用设计成扩增编 辑盒的引物进行扩增。PCR在以下条件下进行：在95℃持续1分钟；在 95℃持续30秒/在60℃持续30秒/在72℃持续2.5分钟进行18轮；最后在 72℃持续5分钟。在1％的琼脂糖凝胶上检查扩增子，鉴定出具有最干净 的产物的汇集。将扩增的盒进行微量制备，并洗脱到50μL ddH2O中。接 下来，进行包含150ng骨架DNA和100ng盒插入片段的Gibson
Figure BDA0003517636680001141
反应。将等体积的2x主混合液添加到骨架和插入片段中，并将反应物在 50℃孵育45min，然后用0.25μm滤片以静滴(sittingdroplet)透析30min。通 过电穿孔将100ng的Gibson
Figure BDA0003517636680001142
反应物转化到含有如上所述的引擎 载体的感受态EC1细胞中。转化后，使细胞在SOB培养基中恢复3小时。 将恢复细胞的10倍稀释系列(在H2O中)进行点板接种，并将所得CFU计 数/稀释比用于计算转化效率。将100μL适当的细胞稀释液铺在LB培养基 +25μg/mL氯霉素上，并在30℃过夜生长。通过例如测序来评估/验证编辑。
实施例9:通过生长滞后鉴定来富集编辑细胞
转化：通过电穿孔将100ng的编辑载体克隆文库或Gibson
Figure BDA0003517636680001143
反应物转化到100μL含有引擎载体的感受态EC1细胞中。将电穿孔仪设置 为2mm杯中2400V。转化后，使细胞在SOB培养基中恢复3小时。将恢 复细胞的10倍稀释系列(在H2O中)进行点板接种，并将所得CFU计数/ 稀释比用于计算转化效率。
铺板和菌落布置：将100μL适当的稀释液铺在LB琼脂培养基+ 25μg/mL氯霉素和+阿拉伯糖上，并在30℃生长6-8小时。可选地，可以 使细胞在30℃在LB培养基+25μg/mL氯霉素的液体培养物中生长至饱和， 并稀释至合适的浓度，然后铺在LB琼脂培养基+25μg/mL氯霉素+阿拉伯 糖上并在30℃生长6-8小时。在生长6-8小时后，将板的温度调节至42℃， 并将板孵育2小时。然后将温度调节回至30℃，并使细胞过夜恢复。
经编辑的细胞的鉴定：鉴定小尺寸的菌落。小的菌落尺寸的表型表明 在诱导编辑程序的过程中细胞存活力受到损害。通过鉴定并挑选小的菌落 并将来自这些小的菌落的细胞布置到96孔板上，来完成从初始汇集中有 效地回收经编辑的细胞，以创建经编辑的细胞的文库，或者汇集来自菌落 的细胞，产生高度编辑的细胞群体以用于递归编辑。通过测序来评估/验证 编辑。发现85％的小的菌落为经编辑的细胞。
实施例10:标准铺板方案控制
该方案描述了一种标准的铺板方案，用于通过单一化或基本上单一化、 生长、编辑和归一化来富集对细菌细胞的核酸引导的核酸酶编辑。该方案 用于利用核酸酶和gRNA两者的诱导型系统，以允许集落具有表型差异。 从所得的琼脂板，可以以高度(～80％)置信选择经编辑的细胞。尽管该方案 明显可以用于富集经编辑的细胞，但在本文所述的实验中，该“标准铺板 方案”或“SPP”用于比较实体壁装置的单一化或基本上单一化、编辑和 归一化的效率。材料：除标准分子生物学工具外，将需要以下材料：
表3
Figure BDA0003517636680001151
方案：该方案的输入为冷冻的电感受态细胞和纯化的核酸组装产物。 电穿孔后，立即将细胞/DNA混合物转移至含有2.7mL SOB培养基的培养 管中。在电穿孔之前在14mL培养管中制备2.7mL等分试样，允许更快地 从电穿孔杯中回收细胞；回收的最终体积为3mL。将所有培养管放置在设 置为250rpm和30℃的振荡培养箱中3小时。在培养物恢复的同时，从冰 箱中取出需要数量的含氯霉素和羧苄青霉素+1％阿拉伯糖的LB琼脂板， 并温热至室温。对每种铺板均使用多于一种稀释液，以便使板上具有可计 数且分离的菌落。铺板建议：
表4
测序类型 建议的稀释 至板的体积
单重(SinglePlex) 10<sup>-1</sup>至10<sup>-3</sup> 300μL
扩增子 无 300μL(＝1/10恢复率)
3小时后，将培养管从振荡培养箱中取出。首先，按照上表进行用于 扩增子测序的铺板。使用铺板珠(plating bead)将培养物均匀分配在琼脂上。 将珠从板上取出，并使板在层流柜中非覆盖地干燥。在板干燥时，使用剩 余的培养物进行系列稀释，其中标准稀释为将50μL培养物加入450μL无 菌的0.8％NaCl中。将用于这些稀释液(以及原始培养物)的板/管保持在4℃， 以备基于菌落计数需要进行另外的稀释。根据表4进行用于单重测序的铺 板。基于文库/感受态细胞知识，可以使用额外或更少的稀释。使用无菌铺 板珠将培养物均匀涂布遍及琼脂。然后将珠从板上取出，并使板在层流柜 中非覆盖地干燥。在板干燥的同时，根据以下设置对培养箱进行编程：在 30℃持续9小时→在42℃持续2小时→在30℃持续9小时。将琼脂板放置 在预设的培养箱中，并在完成温度循环(～21小时)后，将琼脂板从培养箱中 取出。如产生的细胞集落的尺寸差异所表明的，编辑的诱导是成功的。
实施例11:在实体壁装置中单一化和培养大肠杆菌
如上文实施例2-5中所述，用克隆文库、等温组装文库或处理对照 sgRNA质粒(逃避替代物)转化电感受态大肠杆菌细胞。大肠杆菌菌株携带 合适的内切核酸酶和λ红色组分以及编辑诱导系统(例如，在引擎质粒上或 整合到细菌基因组中或组合)。转化常规地使用150ng质粒DNA(或吉布 森组装反应物)和150ng pL sgRNA骨架DNA。电穿孔后，使细胞在3mL SOB中恢复，并在30℃振荡培养3小时。在通过实体壁装置处理样品的同 时，还使用固体铺板方案对样品进行处理(参见上文实施例10)，以便将实 体壁装置中的“归一化”与标准台式过程进行比较。在即将将细胞引入可 渗透底部实体壁装置之前，用0.1％TWEEN溶液处理形成微孔底部的 0.2μm过滤器，以实现细胞在实体壁装置的微孔中的适当分布/分配。将过 滤器放置在Swinnex过滤器支架(47mm，
Figure BDA0003517636680001171
SX0004700)中，并 且通过使用真空将3mL含0.85％NaCl和0.1％TWEEN的溶液吸过实体壁 装置和过滤器。评估了不同的TWEEN浓度，并确定对于直径为47mm的 具有形成微孔底部的0.2μM过滤器的实体壁装置，优选用0.1％TWEEN 预处理实体壁装置+过滤器(数据未示出)。
在SOB中恢复3小时后，将转化的细胞稀释，并再次使用真空通过 TWEEN处理的实体壁装置和过滤器处理3mL体积的稀释细胞。成功转化 的细胞数量预计为约1.0E+06至1.0E+08，目标是将约10,000个转化细胞 装载到当前的47mm可渗透底部实体壁装置(具有～30,000个孔)中。制备 10-1、10-2和10-3的系列稀释液，然后将这些稀释液中的每一种的100μL体 积与3mL 0.85％NaCl组合，并将样品装载到实体壁装置上。然后从Swinnex 过滤器支架中取出每个可渗透的底部实体壁装置，并转移到LB琼脂板上， 该琼脂板含有羧苄青霉素(100μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)和阿拉伯糖(最终 浓度1％)。实体壁装置的金属面朝上放置，以使可渗透的底部膜接触琼脂 的表面，使得来自板的营养物可以上移通过孔的过滤器“底部”。将LB琼 脂板上的实体壁装置在30℃孵育9小时，在42℃孵育2小时，然后返回 到30℃孵育12-16小时，而在另一个实验中孵育36-40小时。
孵育结束时，将穿孔盘和过滤器(仍组装好的)从支持营养源(在这种情 况下为琼脂板)上取下，并用聚焦“透射”光源拍照，以便可以评估实体壁 装置上已装载的微孔的数量和分布(数据未示出)。为了从可渗透的底部的 实体壁装置中取出细胞，将过滤器转移到标记的无菌100mm培养皿中， 该培养皿中含有15mL无菌0.85％NaCl，然后将培养皿放置在设置为30℃ /80RPM的振荡培养箱中，以温和地从过滤器中取出细胞，并将细胞重悬 在0.85％ NaCl中。使细胞振荡15分钟，然后转移至无菌管例如50mL锥 形离心管中。测量细胞悬浮液的OD600，并且此时，可以根据研究目的以 不同方式处理细胞。例如，如果将质粒或文库设计为靶向糖代谢途径基因 诸如galK，则可以将重悬的细胞涂布在含有半乳糖(最终浓度为1％)和适当 抗生素的MacConkey琼脂板上。在这种鉴别培养基上，成功编辑的细胞产 生的菌落预期在表型上颜色为白色，而未经编辑的菌落颜色为红色。然后 可以使用这种红色/白色表型来评估经编辑的细胞的百分比以及经编辑的 细胞和未经编辑的细胞的归一化程度。一个实验的结果示于下表5中。在 所有复制物中，使转化的细胞在实体壁装置中在30℃生长9小时，在42 下℃生长2小时，以及在30℃过夜生长。
表5
Figure BDA0003517636680001181
图16是示出在转化的细胞的不同稀释和以下条件下细胞的归一化程 度(经编辑的细胞的％)的图：在将细胞装载到实体壁装置的微孔中时，，未 用TWEEN处理与用TWEEN预处理与用TWEEN预处理+缓冲液中的TWEEN。与实体壁单一化实验平行进行标准铺板方案(SPP)作为基准(图中 的左侧的第一条柱)。注意到标准铺板方案的编辑百分比为约27.5％，而具 有TWEEN预处理的10-3稀释细胞的两个复制物的编辑百分比分别为约20％ 和26％。
实施例12:实体壁装置中酵母集落的单一化
如上文实施例2-5中所述，用克隆文库、等温组装文库或处理对照 sgRNA质粒(逃避替代物)转化电感受态酵母细胞。电感受态酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)细胞的制备如下：在转化发生前一天下午，用选 定的酿酒酵母菌株接种10mL YPAD。将培养物在250 RPM和30℃过夜振 荡。第二天，将100mL YPAD加入250mL带挡板的瓶中，并且用过夜培养物(约2mL过夜培养物)接种，直到OD600读数达到0.3+/-0.05。将培养 物放置在以250RPM振荡的30℃培养箱中并使其生长4-5小时，每小时检 查OD。当培养物的OD600达到约1.5时，将50mL体积倾倒入两个50mL 锥形瓶中，然后在室温以4300 RPM离心2分钟。从所有50ml锥形管中去 除上清液，同时避免扰动细胞沉淀物。将50mL的乙酸锂/二硫苏糖醇溶液 添加到每个锥形管中，并将沉淀物温和重悬。将两管悬浮液转移至250mL 瓶中，并放置在振荡器中；然后在30℃和200RPM振荡30分钟。培养结 束后，将悬浮液转移至两个50mL锥形瓶中。然后将悬浮液以4300RPM 离心3分钟，然后弃去上清液。
在乙酸锂/二硫苏糖醇处理步骤之后，使用冷液体，并将细胞保持在冰 上直至电穿孔。添加50mL的1M山梨糖醇，并将沉淀物重悬，然后在4℃ 以4300RPM离心3分钟，然后弃去上清液。重复1M山梨糖醇洗涤两次， 共洗涤三次。将50μL的1M山梨糖醇添加到一份沉淀物中，将细胞重悬， 然后转移到另一个管中以悬浮第二份沉淀物。测量细胞悬浮液的体积，并 用冷的1M山梨糖醇补至1mL。此时，将细胞是电感受态的，并且可以用 克隆文库、等温组装文库或处理对照sgRNA质粒转化。简而言之，通过 标记杯并且然后在冰上冷却来准备所需数量的2mm间隙电穿孔杯。将适 当的质粒(或DNA混合物)添加到每个对应的杯中并放置回冰上。将100μL 电感受态细胞转移到每个标记的杯中，并使用适当的电穿孔仪条件对每个 样品进行电穿孔。然后将900μL室温YPAD山梨糖醇培养基添加到每个杯 中。将细胞悬浮液转移至14mL培养管中，并且然后在30℃以250 RPM振 荡3小时。恢复3hr后，添加9mL含有适当抗生素(例如遗传霉素或潮霉 素B)的YPAD。
此时，将转化的细胞以实体壁装置和标准铺板方案进行并行处理(参见 上文实施例10)，以便将实体壁装置中的“归一化”与标准台式过程进行 比较。在即将将细胞引入可渗透底部实体壁装置之前，用0.1％TWEEN溶 液处理形成微孔底部的0.45μm过滤器，以实现细胞在实体壁装置的微孔 中的适当分布/分配。将过滤器放置在Swinnex过滤器支架(47mm，
Figure BDA0003517636680001201
SX0004700)中，并通过使用真空将3mL含0.85％NaCl和0.1％ TWEEN的溶液吸过实体壁装置和过滤器。评估了不同的TWEEN浓度， 并确定对于直径为47mm的具有形成微孔底部的0.45μm过滤器的实体壁 装置，优选用0.1％TWEEN预处理实体壁装置+过滤器(数据未示出)。
在SOB中恢复3小时后，将转化的细胞稀释，并再次使用真空通过 TWEEN处理的实体壁装置和过滤器处理3mL体积的稀释细胞。成功转化 的细胞数量预计为约1.0E+06至1.0E+08，目标是将约10,000个转化细胞 装载到当前的47mm可渗透底部实体壁装置(具有～30,000个孔)中。制备了 10-1、10-2和10-3的系列稀释液，然后将这些稀释液中的每一种的100μL 体积与3mL 0.85％NaCl组合，并将样品装载到实体壁装置上。然后从 Swinnex过滤器支架中取出每个可渗透的底部实体壁装置，并转移到LB 琼脂板上，该琼脂板含有羧苄青霉素(100μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)和阿拉 伯糖(最终浓度1％)。实体壁装置的金属面朝上放置，以使可渗透的底部膜 接触琼脂的表面，使得来自板的营养物可以上移通过孔的过滤器“底部”。 将YPD琼脂板上的实体壁装置在30℃孵育2-3天。
孵育结束时，将穿孔盘和过滤器(仍组装好的)从支持营养源(在这种情 况下为琼脂板)上取下，并用聚焦“透射”光源拍照，以便可以评估实体壁 装置上已装载的微孔的数量和分布(参见图17A和图17B)。为了从可渗透 的底部的实体壁装置中取出细胞，将过滤器转移到标记的无菌100mm培 养皿中，该培养皿中含有15mL无菌0.85％NaCl，然后将培养皿放置在设 置为30℃/80RPM的振荡培养箱中，以温和地从过滤器中取出细胞，并将 细胞重悬在0.85％NaCl中。使细胞振荡15分钟，然后转移至无菌管例如 50mL锥形离心管中。测量细胞悬浮液的OD600；此时，可以根据研究目 的以不同方式处理细胞。例如，如果使用了ADE2终止密码子诱变文库， 则在将重悬的细胞涂布到YPD琼脂板上并使细胞生长4-7天后，成功编辑 的细胞应会产生具有红色颜色表型的菌落。这种表型差异允许量化经编辑 的细胞的百分比以及经编辑的细胞和未经编辑的细胞的归一化程度。
实施例13:200K SWIIN中大肠杆菌的单一化、生长和编辑
使用MAD7核酸酶，在单个基因(yagP)中具有94个不同编辑的文库， 并采用诸如图4F-4R中所示的200K单一化装置成功进行了单重自动化基 因组编辑。所使用的引擎载体与图11A中描绘的引擎载体基本上相似(具 有在pL诱导型启动子的控制下的MAD7)，并且所使用的编辑载体与图11B 中描绘的引擎载体基本上相似，包括编辑盒在pL诱导型启动子的控制下， 以及λ红色重组工程化系统在pBAD诱导型启动子pBAD的控制下，除了 编辑盒包含94个yagP基因编辑(供体DNA)和适当的相应gRNA外。比较 了两个SWIIN工作流程，并且还以标准铺板方案(参见实施例7)作为基准。 两个SWIIN方案彼此不同之处在于：在一组复制物中使用含有阿拉伯糖的 LB培养基以在SWIIN中分配细胞(阿拉伯糖用于诱导λ红色重组工程化系 统(这允许修复在编辑过程中在大肠杆菌中产生的双链断裂)；而在另一组 复制物中使用不含阿拉伯糖的SOB培养基以在SWIIN中分配细胞，并且 对于初始生长，其中进行培养基交换以将不含阿拉伯糖的SOB培养基替换 为含阿拉伯糖的SOB培养基。将约70K个细胞加载到200K SWIIN中。
在所有方案(标准铺板，LB-SWIIN和SOB-SWIIN)中，使细胞在30℃ 生长9小时，并且通过将温度升至42℃持续2.5小时来诱导编辑，然后使 温度回到30℃，并使细胞过夜生长。该实验的结果在图18和下表6中示 出。注意，在两个SWIIN工作流程的四个复制物中观察到了相似的编辑性 能，表明在初始培养基中含阿拉伯糖和不含阿拉伯糖的SWIIN铺板的性能 相似。标准铺板方案的编辑百分比为约77％，在批量液体(bulk liquid)中 的编辑百分比为约67％，而SWIIN复制物的编辑百分比的范围为约63％ 至71％。注意，对于每种方案，独特的编辑盒除以编辑盒的总数的百分比 是相似的。
表6
Figure BDA0003517636680001221
实施例14:全自动化的单重RGN引导的编辑运行
使用MAD7核酸酶的单重自动化基因组编辑用诸如图5A-5D所示的 自动化多模块仪器成功进行。参见2018年5月29日发布的USPN 9,982,279 和2019年4月9日发布的USPN10/240,167。
在自动化仪器中包含的等温核酸组装模块中经由Gibson
Figure BDA0003517636680001222
将 ampR质粒骨架和lacZ_F172*编辑盒组装到“编辑载体”中。lacZ_F172在 功能上敲除lacZ基因。“lacZ_F172*”表示编辑发生在lacZ氨基酸序列的 第172位残基处。组装后，使用AMPure珠在等温核酸组装模块中将产物 脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中洗脱。将组装好的编辑载体和可重 组工程化的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中进行电穿孔。将细胞与核酸组合并使其混合1分钟，并进行电穿孔30秒。穿孔脉冲的参数为： 电压，2400V；时间长度，5ms；间隔，50ms；脉冲数，1；极性，+。转 移脉冲的参数为：电压，150V；时间长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数， 20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一个生长模块)，并 使细胞在含有氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将羧苄青霉素添加到 培养基中，并使细胞再恢复2小时。恢复后，将细胞保持在4℃直至由用 户回收。
在自动化处理和恢复后，将细胞的等分试样铺在补充有乳糖(作为糖底 物)、氯霉素和羧苄青霉素的MacConkey琼脂基底上，并生长直至出现菌 落。白色菌落代表经功能编辑的细胞，紫色菌落代表未经编辑的细胞。所 有液体转移均由自动化多模块细胞处理仪器的自动化液体处理装置执行。
自动化处理的结果为约1.0E-03的总细胞被转化(与常规台式结果相比)， 并且编辑效率为83.5％。通过对细胞基因组的经编辑的区域进行测序，证 实了白色菌落中的lacZ_172编辑。此外，通过网络摄像头远程观察了自动 化细胞处理的步骤，并发送了文本消息以更新自动化处理程序的状态。
实施例15:全自动化递归编辑运行
使用自动化的多模块细胞处理系统成功实现了递归编辑。在自动化系 统中包含的等温核酸组装模块中经由Gibson
Figure BDA0003517636680001231
将ampR质粒骨架 和lacZ_V10*编辑盒组装到“编辑载体”中。与lacZ_F172编辑类似， lacZ_V10编辑在功能上敲除lacZ基因。“lacZ_V10”表示编辑发生在lacZ 氨基酸序列的氨基酸位置10处。组装后，使用AMPure珠在等温核酸组装 模块中将产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中洗脱。将组装好的第 一编辑载体和可重组工程化的电感受态大肠杆菌细胞转移到转化模块中 进行电穿孔。将细胞与核酸组合并使其混合1分钟，并进行电穿孔30秒。 穿孔脉冲的参数为：电压，2400V；时间长度，5ms；间隔，50ms；脉冲 数，1；极性，+。转移脉冲的参数为：电压，150V；时间长度，50ms；间隔，50ms；脉冲数，20；极性，+/-。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另 一个生长模块)，使细胞在含有氯霉素的SOC培养基中恢复。1小时后将 羧苄青霉素添加到培养基中，并使细胞再生长2小时。然后将细胞转移至 离心机模块，并且然后进行培养基交换。将细胞重悬于含有氯霉素和羧苄 青霉素的TB中，在该TB中使细胞生长至2.7的OD600，然后浓缩细胞 并使其成为电感受态。
在细胞生长期间，在等温核酸组装模块中制备了第二编辑载体。第二 编辑载体包含卡那霉素抗性基因，并且编辑盒包含galK Y145*编辑。如果 成功，则galK Y145*编辑赋予细胞摄取和代谢半乳糖的能力。通过galK Y154*盒产生的编辑在第154位氨基酸残基处引入终止密码子，从而将酪 氨酸氨基酸改变为终止密码子。此编辑使galK基因产物无功能，并抑制细 胞使细胞不能够代谢半乳糖。组装后，使用AMPure珠在等温核酸组装模 块中将第二编辑载体产物脱盐，用80％乙醇洗涤，并在缓冲液中洗脱。将 组装好的第二编辑载体和电感受态大肠杆菌细胞(已用第一编辑载体转化 并针对第一编辑载体进行了选择)转移到转化模块中，使用与上述相同的参 数进行电穿孔。电穿孔后，将细胞转移至恢复模块(另一个生长模块)，使 细胞在含有羧苄青霉素的SOC培养基中恢复。恢复后，将细胞保持在4℃ 直至取出，然后将细胞的等分试样铺在补充有氯霉素和卡那霉素的LB琼 脂上。为了量化lacZ和galK编辑，在两种培养基类型上生成了复制贴片 (replica patch)板：1)补充有乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉素的 MacConkey琼脂基底，和2)补充有半乳糖(作为糖底物)、氯霉素和卡那霉 素的MacConkey琼脂基底。所有液体转移均由自动化多模块细胞处理系统 的自动化液体处理装置执行。
在该递归编辑实验中，所筛选的菌落中41％具有lacZ编辑和galK编 辑两者，其结果与使用“台式”或手动方法获得的双重编辑效率相当。
尽管本发明由许多不同形式的实施方案来满足，如结合本发明的优选 实施方案所详细描述的，但是应当理解，本公开内容应被认为是本发明原 理的实施例，而无意于将本发明限制在本文图示和描述的具体实施方案。 在不脱离本发明的精神的情况下，本领域技术人员可以做出许多变化。本 发明的范围将由所附权利要求及其等同物来确定。摘要和标题不应被解释 为限制本发明的范围，因为它们的目的是使适当的主管部门以及公众能够 快速确定本发明的一般性质。在所附的权利要求中，除非使用术语“装置”， 否则根据35U.S.C.§112，
Figure BDA0003517636680001241
其中所列举的特征或元件均不应被解释为装 置加功能的限制。
本申请还提供了以下方面：
(1)一种用于实体壁单一化或基本上单一化、生长、诱导编辑以及 归一化或择优挑选(SWIIN)模块的单一化组件，包括：
包括上表面和下表面的截留物构件，其中，所述截留物构件包括至少 一个截留物分配通道，所述截留物分配通道从所述截留物构件的上表面到 所述截留物构件的下表面穿越所述截留物构件并穿越截留物构件的长度 的70％至95％；其中，所述截留物构件的所述下表面包括截留物脊，截 留物流动导向器位于所述截留物脊之间；其中，所述截留物构件进一步包 括一个或更多个截留物构件端口，所述截留物构件端口被配置为向所述截 留物构件供应细胞和流体以及从所述截留物构件去除细胞和流体；并且其 中，所述截留物构件端口流体地连接至所述截留物分配通道和所述截留物 流动导向器；
具有上表面和下表面的穿孔构件，其中，所述穿孔构件的所述上表面 位于所述截留物构件的所述下表面的下方并邻近所述截留物构件的所述 下表面，并且其中，所述穿孔构件包括至少25,000个穿孔；
具有上表面和下表面的过滤器，其中，所述过滤器的所述上表面位于 所述穿孔构件的下表面的下方并邻近所述穿孔构件的下表面，并且其中， 所述过滤器的所述下表面位于渗透物构件的上表面上方并邻近渗透物构 件的上表面；
环绕所述穿孔构件和所述过滤器的垫圈；以及
所述渗透物构件，所述渗透物构件包括所述渗透物构件的所述上表面 和下表面，其中，所述渗透物构件包括至少一个渗透物分配通道，所述渗 透物分配通道从所述渗透物构件的下表面到所述渗透物构件的上表面穿 越所述渗透物构件并穿越渗透物构件的长度的70％至95％；其中，所述 渗透物构件的所述上表面包括渗透物脊，渗透物流动导向器位于所述渗透 物脊之间；其中，所述渗透物构件进一步包括一个或更多个渗透物构件端 口，所述渗透物构件端口被配置为向所述渗透物构件供应流体以及从所述 渗透物构件去除流体；并且其中，所述渗透物构件端口流体地连接至所述 渗透物分配通道和所述渗透物流动导向器；以及
联接所述截留物构件、所述穿孔构件、所述过滤器、所述垫圈和所述 渗透物构件的装置。
(2)一种包括根据(1)所述的单一化组件的SWIIN模块，进一步包 括：
储器组件，其包括至少两个储器，其中：
第一储器1)流体地联接到至少一个储器端口，从所述SWIIN 模块外部进入所述储器端口中的流体和/或细胞流入所述第一储器中； 2)流体地联接到储器/通道端口，流体和/或细胞从所述储器/通道端 口流入所述一个或更多个截留物构件端口中；以及3)气动地联接至 压力源；
第二储器1)流体地联接到至少一个储器端口，从所述SWIIN 模块外部进入所述储器端口中的流体流入所述第二储器中；2)流体 地联接到储器/通道端口，流体从所述储器/通道端口流入所述一个或 更多个渗透物构件端口中；以及3)气动地联接至压力源；以及SWIIN盖。
(3)根据(2)所述的SWIIN模块，进一步包括：
两个另外的储器，其中：
第一储器和第三储器1)流体地联接到至少两个储器端口，从所 述SWIIN模块外部进入所述至少两个储器端口中的流体和/或细胞流 入所述第一储器和所述第三储器中；2)流体地联接至储器/通道端口， 流体和/或细胞从所述储器/通道端口流入所述至少两个截留物构件 端口中；以及3)气动地联接至压力源；以及
第二储器和第四储器1)流体地联接到至少两个储器端口，从所 述SWIIN模块外部进入所述至少两个储器端口中的流体流入所述第 二储器和所述第四储器中；2)流体地联接至储器/通道端口，流体从 所述储器/通道端口流入所述至少两个渗透物构件端口中；以及3) 气动地联接至压力源。
(4)根据(2)所述的SWIIN，其中，所述SWIIN盖包括所述SWIIN 盖的储器盖部分，并且其中，所述储器盖部分包括：1)至少两个储器进 入孔口，其中，所述储器进入孔口提供通向所述储器端口的通路；以及2) 至少两个气动进入孔口，其中，所述气动进入孔口提供通向所述至少两个 储器的通路，并且为所述至少两个储器提供负压和正压。
(5)根据(1)所述的单一化组件，其中，联接所述截留物构件、所 述穿孔构件、所述过滤器、所述垫圈和所述渗透物构件的所述装置包括超 声焊接。
(6)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述穿孔构件包括至少100,000 个穿孔。
(7)根据(6)所述的单一化组件，其中，所述穿孔构件包括至少200,000 个穿孔。
(8)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述截留物构件和所述渗 透物构件由聚碳酸酯、环烯烃共聚物或聚甲基丙烯酸甲酯制成。
(9)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述截留物构件和所述渗 透物构件的长度为75mm至350mm，宽度为50mm至250mm，且厚度为 2mm至15mm。
(10)根据(9)所述的单一化组件，其中，所述截留物构件和所述 渗透物构件的长度为150mm至250mm，宽度为100mm至150mm，且厚 度为4mm至8mm。
(11)根据(1)所述的单一化组件，其中，存在两个截留物分配通道。
(12)根据(11)所述的单一化组件，其中，所述截留物分配通道的 长度约为150mm，宽度约为1mm。
(13)根据(1)所述的单一化组件，其中，存在两个渗透物分配通 道。
(14)根据(13)所述的单一化组件，其中，所述渗透物分配通道的 长度约为150mm，宽度约为1mm。
(15)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述截留物脊的高度约 为0.5mm，长度约为80mm。
(16)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述截留物流动导向器 的跨度约为5mm。
(17)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述渗透物脊的高度约 为0.5mm，长度约为80mm。
(18)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述渗透物流动导向器 的跨度约为5mm。
(19)根据(1)所述的单一化组件，其中，所述单一化组件的体积 为15mL至40mL。
(20)一种SWIIN模块，包括：
单一化组件，所述单一化组件包括：
包括上表面和下表面的截留物构件，其中，所述截留物构件包 括至少一个截留物分配通道，所述截留物分配通道从所述截留物构 件的上表面到所述截留物构件的下表面穿越所述截留物构件并穿越 截留物构件的长度的70％至95％；其中，所述截留物构件的所述下 表面包括截留物脊，截留物流动导向器位于所述截留物脊之间；其 中，所述截留物构件进一步包括一个或更多个截留物构件端口，所 述截留物构件端口被配置为向所述截留物构件供应细胞和流体以及 从所述截留物构件去除细胞和流体；并且其中，所述截留物构件端 口流体地连接至所述渗透物分配通道和所述截留物流动导向器；
具有上表面和下表面的穿孔构件，其中，所述穿孔构件的所述 上表面位于所述截留物构件的所述下表面的下方并邻近所述截留物 构件的所述下表面；
具有上表面和下表面的过滤器，其中，所述过滤器的所述上表 面位于所述穿孔构件的所述下表面的下方并邻近所述穿孔构件的所 述下表面，并且其中，所述过滤器的所述下表面位于渗透物构件的 上表面上方并邻近所述渗透物构件的所述上表面；
环绕所述穿孔构件和所述过滤器的垫圈；以及
所述渗透物构件，所述渗透物构件包括所述渗透物构件的所述 上表面和下表面，其中，所述渗透物构件包括至少一个渗透物分配 通道，所述渗透物分配通道从所述渗透物构件的所述下表面到所述 渗透物构件的所述上表面穿越所述渗透物构件并穿越渗透物构件的 长度的70％至95％；其中，所述渗透物构件的所述上表面包括渗透 物脊，渗透物流动导向器位于所述渗透物脊之间；其中，所述渗透 物构件进一步包括一个或更多个渗透物构件端口，所述渗透物构件 端口被配置为向所述渗透物构件供应流体以及从所述渗透物构件去 除流体；并且其中，所述渗透物构件端口流体地连接至所述渗透物 分配通道和所述渗透物流动导向器；以及
联接所述截留物构件、所述穿孔构件、所述过滤器、所述垫圈 和所述渗透物构件的装置；
储器组件，其包括至少两个储器，其中：
第一储器1)流体地联接到至少一个储器端口，从所述SWIIN 模块外部进入所述储器端口中的流体和/或细胞流入所述第一储器中； 2)流体地联接到至少一个储器/通道端口，流体和/或细胞从所述至 少一个储器/通道端口流入所述一个或更多个截留物构件端口中；以 及3)气动地联接至压力源；
第二储器1)流体地联接到至少一个储器端口，从所述SWIIN 模块外部进入所述储器端口中的流体流入所述第二储器中；2)流体 地联接至储器/通道端口，流体从所述储器/通道端口流入所述一个或 更多个渗透物构件端口中；以及3)气动地联接至压力源；以及SWIIN盖。

Claims (20)

1.一种用于在CRISPR编辑过程中富集经编辑的细胞的方法，包括：
用一种或更多种载体转化细胞，所述载体包含驱动CRISPR核酸酶的编码序列的转录的诱导型启动子和驱动引导核酸序列的转录的诱导型启动子以及DNA供体序列；
将转化的细胞稀释至使转化的细胞在基底上基本上单一化的细胞浓度；
使细胞在所述基底上生长2-200倍；
通过诱导驱动引导核酸和CRISPR核酸酶的转录的所述诱导型启动子来启动编辑；
使经诱导的细胞生长成集落；以及
选择或汇集在所述基底上生长缓慢的集落，其中针对经编辑的细胞对来自所述生长缓慢的集落的细胞进行富集。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，驱动引导核酸和CRISPR核酸酶中的每一种的表达的所述诱导型启动子为相同的诱导型启动子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述诱导型启动子为pL启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，CRISPR核酸酶的编码序列、引导核酸序列和DNA供体序列都在同一载体上。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，CRISPR核酸酶的编码序列在第一载体上并且引导核酸序列和DNA供体序列在第二载体上。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，DNA供体序列还包含PAM-改变序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或更多种载体各自还包含选择性标志物的基因。
8.根据权利要求7所述的方法，还包括将选择剂添加至所述基底以选择所述一种或更多种载体上的一个或多个所述选择性标志物。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，存在两种载体并且每种载体具有不同的选择性标志物的基因。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，引擎载体还包含重组工程化系统。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基底选自琼脂板和具有实体壁的装置。
12.一种用于在CRISPR核酸酶编辑过程中富集经编辑的细胞的方法，包括：
用一种或更多种载体转化细胞，所述载体包含驱动CRISPR核酸酶的编码序列的转录的启动子和驱动引导核酸序列的转录的诱导型启动子以及DNA供体序列；
将转化的细胞稀释至使转化的细胞在基底上基本上单一化的细胞浓度；
使细胞在所述基底上生长2倍至200倍；
通过诱导所述诱导型启动子来启动编辑；以及
使细胞生长以形成最终尺寸的集落。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，驱动引导核酸的转录的所述启动子为pL启动子。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，驱动CRISPR核酸酶的表达的所述启动子为诱导型启动子。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，驱动引导核酸和CRISPR核酸酶的编码序列中的每一种的转录的所述诱导型启动子为相同的诱导型启动子。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，驱动CRISPR核酸酶的编码序列的转录和驱动引导核酸的转录的所述诱导型启动子为pL启动子。
17.根据权利要求12所述的方法，其中，DNA供体序列还包含PAM-改变序列。
18.根据权利要求12所述的方法，还包括将选择剂添加至所述第一基底以选择所述一种或更多种载体。
19.根据权利要求12所述的方法，其中，CRISPR核酸酶是MAD酶核酸酶。
20.根据权利要求12所述的方法，还包括汇集所述最终尺寸的集落。
CN202210174158.5A 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法 Pending CN114854720A (zh)

Applications Claiming Priority (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/024,816 2018-06-30
US16/024,816 US10253316B2 (en) 2017-06-30 2018-06-30 Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US201862718449P 2018-08-14 2018-08-14
US62/718,449 2018-08-14
US201862735365P 2018-09-24 2018-09-24
US62/735,365 2018-09-24
US201862779119P 2018-12-13 2018-12-13
US62/779,119 2018-12-13
US201862781112P 2018-12-18 2018-12-18
US62/781,112 2018-12-18
PCT/US2019/030085 WO2020005383A1 (en) 2018-06-30 2019-04-30 Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
CN201980057181.2A CN112638494B (zh) 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980057181.2A Division CN112638494B (zh) 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114854720A true CN114854720A (zh) 2022-08-05

Family

ID=68985134

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980057181.2A Active CN112638494B (zh) 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法
CN202210174158.5A Pending CN114854720A (zh) 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980057181.2A Active CN112638494B (zh) 2018-06-30 2019-04-30 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法

Country Status (7)

Country Link
US (16) US10533152B1 (zh)
EP (2) EP3813974A4 (zh)
CN (2) CN112638494B (zh)
AU (2) AU2019292919A1 (zh)
CA (1) CA3108767A1 (zh)
IL (4) IL292273B2 (zh)
WO (1) WO2020005383A1 (zh)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10466160B2 (en) 2011-08-01 2019-11-05 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for retrieving and analyzing particles
US9103754B2 (en) 2011-08-01 2015-08-11 Denovo Sciences, Inc. Cell capture system and method of use
US9404864B2 (en) 2013-03-13 2016-08-02 Denovo Sciences, Inc. System for imaging captured cells
US10391490B2 (en) 2013-05-31 2019-08-27 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for isolating and analyzing cells
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11293021B1 (en) 2016-06-23 2022-04-05 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR20220104847A (ko) 2017-06-30 2022-07-26 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
EP3652312A1 (en) 2017-07-14 2020-05-20 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
JP6980904B2 (ja) 2017-08-29 2021-12-15 バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレイテッド 細胞を単離し分析するためのシステムおよび方法
US10526598B2 (en) 2018-04-24 2020-01-07 Inscripta, Inc. Methods for identifying T-cell receptor antigens
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
AU2019292919A1 (en) * 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US11142740B2 (en) 2018-08-14 2021-10-12 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11965154B2 (en) 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
US11214781B2 (en) 2018-10-22 2022-01-04 Inscripta, Inc. Engineered enzyme
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US10815467B2 (en) 2019-03-25 2020-10-27 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
US10633693B1 (en) 2019-04-16 2020-04-28 Celsee Diagnostics, Inc. System and method for leakage control in a particle capture system
US11273439B2 (en) 2019-05-07 2022-03-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for target material retrieval from microwells
US11578322B2 (en) * 2019-05-07 2023-02-14 Bio-Rad Laboratories, Inc. System and method for automated single cell processing
CN113939593A (zh) 2019-06-06 2022-01-14 因思科瑞普特公司 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
KR20220033484A (ko) 2019-06-14 2022-03-16 바이오 래드 래버러토리스 인코오포레이티드 자동화된 단일 세포 처리 및 분석을 위한 시스템 및 방법
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
AU2020407048A1 (en) 2019-12-18 2022-06-09 Inscripta, Inc. Cascade/dCas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
AU2021213705A1 (en) 2020-01-27 2022-06-16 Inscripta, Inc. Electroporation modules and instrumentation
US11281638B2 (en) * 2020-04-22 2022-03-22 Capital One Services, Llc Consolidating multiple databases into a single or a smaller number of databases
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
US20220002725A1 (en) * 2020-07-01 2022-01-06 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nuclease of nickase fusion editing of methylated nucleotides
WO2022025974A2 (en) * 2020-07-27 2022-02-03 Inscripta, Inc. Cure all for nucleic acid-guided cell editing in e. coli
US20220033855A1 (en) * 2020-07-30 2022-02-03 Inscripta, Inc. Arrayed nucleic acid-guided nuclease or nickase fusion editing
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
US11512297B2 (en) 2020-11-09 2022-11-29 Inscripta, Inc. Affinity tag for recombination protein recruitment
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11332742B1 (en) 2021-01-07 2022-05-17 Inscripta, Inc. Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing
WO2022251179A1 (en) * 2021-05-26 2022-12-01 Inscripta, Inc. Crispr editing in diploid genomes
WO2023028521A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Inscripta, Inc. Genome-wide rationally-designed mutations leading to enhanced cellobiohydrolase i production in s. cerevisiae
USD970036S1 (en) 2022-05-05 2022-11-15 Singular Genomics Systems, Inc. Reagent cartridge
USD979093S1 (en) 2022-05-05 2023-02-21 Singular Genomics Systems, Inc. Reagent cartridge

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
US20160184362A1 (en) * 2013-05-29 2016-06-30 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
CN106133138A (zh) * 2013-08-22 2016-11-16 先锋国际良种公司 使用引导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的基因组修饰及其使用方法
CN107250363A (zh) * 2014-12-17 2017-10-13 纳幕尔杜邦公司 使用与环状多核苷酸修饰模板组合的引导RNA/Cas内切核酸酶系统在大肠杆菌中进行有效基因编辑的组合物和方法

Family Cites Families (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4493815A (en) * 1983-07-28 1985-01-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Supporting and filtering biochemical test plate assembly
CA1293460C (en) 1985-10-07 1991-12-24 Brian Lee Sauer Site-specific recombination of dna in yeast
US4833080A (en) 1985-12-12 1989-05-23 President And Fellows Of Harvard College Regulation of eucaryotic gene expression
US6022742A (en) 1986-11-26 2000-02-08 Kopf; Henry B. Culture device and method
US6689610B1 (en) 1989-08-22 2004-02-10 University Of Utah Research Foundation Cells and non-human organisms containing predetermined genomic modifications and positive-negative selection methods and vectors for making same
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
KR100236506B1 (ko) 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
WO1992015694A1 (en) 1991-03-08 1992-09-17 The Salk Institute For Biological Studies Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
US6074605A (en) 1995-03-10 2000-06-13 Entremed, Inc. Flow electroporation chamber and method
JP4020429B2 (ja) 1995-06-07 2007-12-12 インヴィトロジェン コーポレーション 操作された組換え部位を使用する組換えクローニング
US5851804A (en) 1996-05-06 1998-12-22 Apollon, Inc. Chimeric kanamycin resistance gene
US6365373B2 (en) 1997-04-25 2002-04-02 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding NGF variants
US5792943A (en) 1997-04-30 1998-08-11 Hewlett-Packard Company Planar separation column for use in sample analysis system
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
WO1999021977A1 (en) 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
DE69815384T2 (de) 1997-12-05 2003-12-04 Europ Lab Molekularbiolog Neue methode zur klonierung dns unter anwendung des e. coli rece/rect rekombinationssystems
US6027488A (en) 1998-06-03 2000-02-22 Genetronics, Inc. Flow-through electroporation system for ex vivo gene therapy
EP2428249B1 (en) 1998-07-13 2015-10-07 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Skin and muscle-targeted gene therapy by pulsed electrical field
US6391582B2 (en) 1998-08-14 2002-05-21 Rigel Pharmaceuticlas, Inc. Shuttle vectors
US6150148A (en) 1998-10-21 2000-11-21 Genetronics, Inc. Electroporation apparatus for control of temperature during the process
WO2000046386A2 (en) 1999-02-03 2000-08-10 The Children's Medical Center Corporation Gene repair involving the induction of double-stranded dna cleavage at a chromosomal target site
SE9900530D0 (sv) * 1999-02-15 1999-02-15 Vincenzo Vassarotti A device for concentrating and/or purifying macromolecules in a solution and a method for manufacturing such a device
US6678558B1 (en) 1999-03-25 2004-01-13 Genetronics, Inc. Method and apparatus for reducing electroporation-mediated muscle reaction and pain response
US6818185B1 (en) 1999-05-28 2004-11-16 Cepheid Cartridge for conducting a chemical reaction
US6300108B1 (en) 1999-07-21 2001-10-09 The Regents Of The University Of California Controlled electroporation and mass transfer across cell membranes
US6986993B1 (en) 1999-08-05 2006-01-17 Cellomics, Inc. System for cell-based screening
CN2397122Y (zh) 1999-09-20 2000-09-20 中国科学院力学研究所 旋转管式细胞/组织培养器
AU2001280968A1 (en) 2000-07-31 2002-02-13 Menzel, Rolf Compositions and methods for directed gene assembly
AU8835601A (en) 2000-08-21 2002-03-04 Invitrogen Corp Methods and reagents for molecular cloning
FR2814642B1 (fr) 2000-10-03 2005-07-01 Ass Pour Le Dev De La Rech En Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee
US7029916B2 (en) 2001-02-21 2006-04-18 Maxcyte, Inc. Apparatus and method for flow electroporation of biological samples
US20020139741A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-03 Henry Kopf Integral gasketed filtration cassette article and method of making the same
DK2574662T3 (da) 2001-08-22 2021-09-20 Maxcyte Inc Fremgangsmåde til elektroporation af biologiske prøver
US7166443B2 (en) 2001-10-11 2007-01-23 Aviva Biosciences Corporation Methods, compositions, and automated systems for separating rare cells from fluid samples
US7018819B2 (en) 2001-11-30 2006-03-28 Cellectricon Ab Method and apparatus for manipulation of cells and cell-like structures focused electric fields in microfludic systems and use thereof
AU2003206415A1 (en) 2002-01-07 2003-07-24 Uab Research Foundation Electroporation cuvette-pipette tips, multi-well cuvette arrays, and electrode template apparatus adapted for automation and uses thereof
US8106255B2 (en) 2002-01-23 2012-01-31 Dana Carroll Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases
CA2391641A1 (fr) 2002-06-28 2003-12-28 Robert Longin Plateforme robotisee de cultures cellulaires en batteries de reacteurs miniaturises, equipee d'un systeme de mesure en temps reel de la turbidite cellulaire ou toutes autres proprietes optiques
US20040110253A1 (en) 2002-08-13 2004-06-10 Kappler John W. Method for identifying MHC-presented peptide epitopes for T cells
EP1565555A4 (en) 2002-09-30 2008-07-09 Maxcyte Inc DEVICE AND METHOD FOR STRETCH ELECTROPORATION
US20040138154A1 (en) 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
EP1516920A1 (en) 2003-09-19 2005-03-23 The Automation Partnership Cell culture vessel for the automated processing of cell cultures
US20050118705A1 (en) 2003-11-07 2005-06-02 Rabbitt Richard D. Electrical detectors for microanalysis
US7078227B2 (en) 2004-03-26 2006-07-18 Molecular Transfer Ready-to-use electroporation cuvette including frozen electrocompetent cells
JP4937904B2 (ja) 2004-05-12 2012-05-23 マックスサイト インコーポレーティッド 制御されたフローエレクトロポレーションチャンバーに関連した方法および装置
CN103060191B (zh) 2004-06-12 2015-03-11 英杰生命新加坡私人有限公司 一种电穿孔系统
US7422889B2 (en) 2004-10-29 2008-09-09 Stowers Institute For Medical Research Dre recombinase and recombinase systems employing Dre recombinase
US20070042427A1 (en) 2005-05-03 2007-02-22 Micronics, Inc. Microfluidic laminar flow detection strip
PL2325332T3 (pl) 2005-08-26 2013-03-29 Dupont Nutrition Biosci Aps Zastosowanie genów związanych z CRISPR (genów CAS)
US20070105206A1 (en) 2005-10-19 2007-05-10 Chang Lu Fluidic device
US7799555B2 (en) 2006-02-10 2010-09-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Apparatus for high-throughput electroporation
US7923238B2 (en) 2006-02-10 2011-04-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-channel electroporation system
WO2008052101A2 (en) 2006-10-25 2008-05-02 President And Fellows Of Harvard College Multiplex automated genome engineering
US8486692B2 (en) 2006-11-14 2013-07-16 Acme Biosystems Llc Cell culture apparatus and associated methods
EP2155868A2 (en) 2007-04-19 2010-02-24 Codon Devices, Inc Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly
US20110213288A1 (en) 2007-04-23 2011-09-01 The Board Of Regents, The University Of Texas System Device And Method For Transfecting Cells For Therapeutic Uses
WO2009025690A2 (en) 2007-05-23 2009-02-26 Nature Technology Corporation Improved e. coli plasmid dna production
WO2008151093A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Alburtylab, Inc. Liquid to liquid biological particle concentrator
WO2009035062A1 (ja) 2007-09-10 2009-03-19 Nec Corporation 試料充填装置
GB0724860D0 (en) 2007-12-20 2008-01-30 Heptares Therapeutics Ltd Screening
WO2009091578A1 (en) 2008-01-17 2009-07-23 Genetronics, Inc. Variable current density single needle electroporation system and method
EP2279253B1 (en) 2008-04-09 2016-11-16 Maxcyte, Inc. Engineering and delivery of therapeutic compositions of freshly isolated cells
US9845455B2 (en) 2008-05-15 2017-12-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell expansion
EP2135626B1 (en) 2008-06-19 2011-01-26 Eppendorf Array Technologies SA Strip for multiparametrics assays
JP5459903B2 (ja) 2008-09-02 2014-04-02 株式会社半導体エネルギー研究所 アントラセン誘導体、発光素子、発光装置、電子機器、及び照明装置
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
CN105624193B (zh) 2008-09-26 2021-07-13 索元生物医药(美国)有限公司 重组载体
KR101156886B1 (ko) 2008-11-04 2012-06-21 웅진코웨이주식회사 수위감지장치
WO2010059763A1 (en) 2008-11-19 2010-05-27 Amyris Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for the assembly of polynucleotides
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
WO2010093966A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Fred Hutchinson Cancer Research Center Generation of a dna nicking enzyme that stimulates site-specific gene conversion from a homing endonuclease
DK2440941T3 (en) 2009-06-10 2017-08-28 Cynvenio Biosystems Inc Sheath flow devices and methods
US8677839B2 (en) 2009-06-12 2014-03-25 Innovaprep Llc Surface sampler for biological particles
CA2769320C (en) 2009-08-02 2021-01-26 Qvella Corporation Cell concentration, capture and lysis devices and methods of use thereof
US8584535B2 (en) 2009-09-17 2013-11-19 Innova Prep LLC Liquid to liquid biological particle concentrator with disposable fluid path
US8584536B2 (en) 2009-09-21 2013-11-19 Innovaprep Llc Devices, systems and methods for elution of particles from flat filters
WO2011040889A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Agency For Science, Technology And Research Improved bioartificial kidneys
GB0922434D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucb Pharma Sa antibodies and fragments thereof
WO2011066498A2 (en) * 2009-11-28 2011-06-03 Smartflow Technologies, Inc. Portable filtration unit
PL2510096T5 (pl) 2009-12-10 2018-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Modyfikacja DNA zależna od efektora TAL
DE102010001779A1 (de) 2010-02-10 2011-08-11 Hamilton Bonaduz Ag Kalibrierbare Sensoreinheit für Reaktionsbehälter
US8726744B2 (en) 2010-02-16 2014-05-20 Innovaprep Llc Portable concentrator
SG185481A1 (en) 2010-05-10 2012-12-28 Univ California Endoribonuclease compositions and methods of use thereof
CA2801028A1 (en) 2010-06-03 2011-12-08 The Regents Of The University Of California Electroporation electrode configuration and methods
EP2395087A1 (en) 2010-06-11 2011-12-14 Icon Genetics GmbH System and method of modular cloning
CN103540518B (zh) 2010-07-23 2015-07-08 贝克曼考尔特公司 化验盒
US9361427B2 (en) 2011-02-01 2016-06-07 The Regents Of The University Of California Scar-less multi-part DNA assembly design automation
JP5874117B2 (ja) 2011-02-18 2016-03-02 学校法人東北学院 流体の温度と種類の影響を校正した熱伝導型センサと、これを用いた熱型フローセンサおよび熱型気圧センサ
US9382510B2 (en) 2011-08-25 2016-07-05 Jian Chen Methods and devices for electroporation
US8332160B1 (en) 2011-11-17 2012-12-11 Amyris Biotechnologies, Inc. Systems and methods for engineering nucleic acid constructs using scoring techniques
ITCO20120004A1 (it) 2012-02-07 2013-08-08 Giuseppe Caccia Apparecchio per elettroporazzione dinamica vaginale e anale
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
EP2831221A1 (en) 2012-03-29 2015-02-04 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University of Arizona Cell culture apparatus and culture methods using same
EA038924B1 (ru) 2012-05-25 2021-11-10 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции рнк-специфической модификации днк-мишени и рнк-специфической модуляции транскрипции
LT2864531T (lt) 2012-06-25 2019-03-12 Gen9, Inc. Nukleorūgšties konstravimo ir aukšto produktyvumo sekvenavimo būdai
EP2877490B1 (en) 2012-06-27 2018-09-05 The Trustees of Princeton University Split inteins, conjugates and uses thereof
CN116622704A (zh) 2012-07-25 2023-08-22 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
WO2014066655A2 (en) 2012-10-25 2014-05-01 Oncosec Medical Incorporation Electroporation device
KR102531576B1 (ko) 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
USD731634S1 (en) 2012-12-31 2015-06-09 Innovaprep Llc Aerosol filter and extraction cap
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
US9499855B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Elwha Llc Compositions, methods, and computer systems related to making and administering modified T cells
GB2584364A (en) 2013-03-15 2020-12-02 Abvitro Llc Single cell bar-coding for antibody discovery
US9234213B2 (en) 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
WO2014207016A1 (en) * 2013-06-25 2014-12-31 Tetra Laval Holdings & Finance S.A. Membrane filtration device having a hygienic suspension arrangement
CN116042726A (zh) 2013-07-09 2023-05-02 哈佛大学校长及研究员协会 多重rna向导的基因组工程
US9029109B2 (en) 2013-08-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic vortex-assisted electroporation system and method
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
US10822606B2 (en) 2013-09-27 2020-11-03 The Regents Of The University Of California Optimized small guide RNAs and methods of use
US20150098954A1 (en) 2013-10-08 2015-04-09 Elwha Llc Compositions and Methods Related to CRISPR Targeting
US10767156B2 (en) 2013-10-24 2020-09-08 Yeda Research And Development Co., Ltd. Polynucleotides encoding BREX system polypeptides and methods of using same
CN103555574A (zh) 2013-11-11 2014-02-05 苏州文曲生物微系统有限公司 一种流式电穿孔装置
WO2015088643A1 (en) 2013-12-11 2015-06-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a genome
JP6712948B2 (ja) 2013-12-12 2020-06-24 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
JP2017504320A (ja) 2013-12-20 2017-02-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 低剪断マイクロ流体デバイスならびにその使用および製造の方法
DE102013114732A1 (de) 2013-12-20 2015-06-25 Hamilton Bonaduz Ag Abdeckvorrichtung, insbesondere Deckel für die Abdeckung von Reaktionsgefäßen
US10787654B2 (en) 2014-01-24 2020-09-29 North Carolina State University Methods and compositions for sequence guiding Cas9 targeting
DK178140B1 (en) * 2014-02-03 2015-06-22 Sani Membranes Aps Filter plate assembly
EP3690044B1 (en) 2014-02-11 2024-01-10 The Regents of the University of Colorado, a body corporate Crispr enabled multiplexed genome engineering
WO2015143558A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 British Columbia Cancer Agency Branch T-cell epitope identification
US20170022499A1 (en) 2014-04-03 2017-01-26 Massachusetts Institute Of Techology Methods and compositions for the production of guide rna
JP2017513477A (ja) 2014-04-14 2017-06-01 マックスサイト インコーポレーティッド ゲノムｄｎａを改変するための方法および組成物
CN106459967A (zh) 2014-04-29 2017-02-22 Illumina公司 使用模板转换和标签化的多重单细胞基因表达分析
WO2015183025A1 (ko) 2014-05-28 2015-12-03 주식회사 툴젠 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 표적 dna의 민감한 검출 방법
EP3164482A1 (en) 2014-07-03 2017-05-10 Massachusetts Institute of Technology Microfluidic assay for rapid optimization of cell electroporation
US20160053304A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Depleting Target Sequences Using CRISPR
US20160053272A1 (en) 2014-07-18 2016-02-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods Of Modifying A Sequence Using CRISPR
EP3149492B1 (en) 2014-07-21 2020-06-24 Beckman Coulter Inc. Methods and systems for tube inspection and liquid level detection
CN107075452A (zh) 2014-07-25 2017-08-18 诺沃吉股份有限公司 来源于解脂耶氏酵母和解腺嘌呤阿氏酵母的启动子及其使用方法
US20160076093A1 (en) 2014-08-04 2016-03-17 University Of Washington Multiplex homology-directed repair
CN113930455A (zh) 2014-10-09 2022-01-14 生命技术公司 Crispr寡核苷酸和基因剪辑
CN104263646A (zh) 2014-10-10 2015-01-07 国家开发投资公司 一种微藻光生物反应器用管子
WO2016061481A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 The Penn State Research Foundation Methods and compositions for multiplex rna guided genome editing and other rna technologies
KR20160079661A (ko) 2014-12-28 2016-07-06 주식회사 펨토펩 운반체의 사용 없이 세포에 물질을 주입하여 변환시킨 세포
DK3242950T3 (da) 2015-01-06 2021-12-20 Dsm Ip Assets Bv Crispr-cas-system til en trådformet svampeværtscelle
EP3247808B1 (en) 2015-01-21 2021-05-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Point-of-care and/or portable platform for gene therapy
US20180284125A1 (en) 2015-03-11 2018-10-04 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
CA3017108A1 (en) 2015-03-12 2016-09-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania System, method, and device for high-throughput, automated culturing of genetically modified organisms
KR20170126500A (ko) 2015-03-16 2017-11-17 막스-델부뤽-센트럼 퓌어 몰레쿨라레 메디친 인 데어 헬름홀츠-게마인샤프트 Mhc 세포 라이브러리를 이용하여 신규한 면역원성 t 세포 에피토프를 검출하고 신규한 항원-특이적 t 세포 수용체를 단리하는 방법
CA2982759A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Maxcyte, Inc. Methods and compositions for modifying genomic dna
EP4070887A1 (en) 2015-04-21 2022-10-12 Isolation Bio Inc. Methods for high throughput microbiology applications
US20180023045A1 (en) 2015-04-21 2018-01-25 General Automation Lab Technologies, Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using combinatorial media strategies for high throughput microbiology applications
US10677793B2 (en) 2015-04-21 2020-06-09 General Automation Lab Technologies Inc. High resolution systems, kits, apparatus, and methods using lateral flow for high throughput microbiology applications
LU92752B1 (en) 2015-06-24 2016-08-07 Université Du Luxembourg Cell culture apparatus and culture methods using same
US9790490B2 (en) 2015-06-18 2017-10-17 The Broad Institute Inc. CRISPR enzymes and systems
SG10201913682QA (en) 2015-06-25 2020-03-30 Icell Gene Therapeutics Llc CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2017009399A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Institut Pasteur Improving sequence-specific antimicrobials by blocking dna repair
WO2017053729A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Nuclease-mediated genome editing of primary cells and enrichment thereof
CN108369230B (zh) 2015-09-25 2021-09-17 阿布维特罗有限责任公司 用于对天然配对t细胞受体序列进行t细胞受体靶向鉴别的高通量方法
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075294A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Board Institute Inc. Assays for massively combinatorial perturbation profiling and cellular circuit reconstruction
US11261435B2 (en) 2015-11-05 2022-03-01 Agency For Science, Technology And Research Chemical-inducible genome engineering technology
EP3374494A4 (en) 2015-11-11 2019-05-01 Coda Biotherapeutics, Inc. CRISPR COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR GENE THERAPY
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
MX2018007290A (es) 2015-12-18 2019-01-10 Danisco Us Inc Metodos y composiciones para expresion de acido ribonucleico (arn) guia basada en polimerasa ii (pol-ii).
EP3402890A1 (en) 2016-01-12 2018-11-21 SQZ Biotechnologies Company Intracellular delivery of complexes
EP3199632A1 (en) 2016-01-26 2017-08-02 ACIB GmbH Temperature-inducible crispr/cas system
US9896696B2 (en) 2016-02-15 2018-02-20 Benson Hill Biosystems, Inc. Compositions and methods for modifying genomes
US11565237B2 (en) 2016-03-18 2023-01-31 Qt Holdings Corp Compositions, devices, and methods for cell separation
CA3019814A1 (en) 2016-04-04 2017-10-12 CyteQuest, Inc. System, device and method for electroporation of cells
CN109072191B (zh) 2016-04-04 2024-03-22 苏黎世联邦理工学院 用于蛋白生产和文库产生的哺乳动物细胞系
US11499168B2 (en) 2016-04-25 2022-11-15 Universitat Basel Allele editing and applications thereof
WO2017193107A2 (en) 2016-05-06 2017-11-09 Juno Therapeutics, Inc. Genetically engineered cells and methods of making the same
US20190136224A1 (en) 2016-05-31 2019-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Hydrodynamically Controlled Electric Fields for High Throughput Transformation & High Throughput Parallel Transformation Platform
EP3272867B1 (en) 2016-06-02 2019-09-25 Sigma Aldrich Co. LLC Using programmable dna binding proteins to enhance targeted genome modification
CA3026170A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Lonza Limited Single use bioreactor
WO2017212400A2 (en) 2016-06-06 2017-12-14 The University Of Chicago Proximity-dependent split rna polymerases as a versatile biosensor platform
EP3475416A4 (en) 2016-06-22 2020-04-29 Icahn School of Medicine at Mount Sinai VIRAL DELIVERY OF RNA USING SELF-CLeavING RIBOZYMES AND CRISPR-BASED APPLICATIONS
CN109688820B (zh) 2016-06-24 2023-01-10 科罗拉多州立大学董事会（法人团体） 用于生成条形码化组合文库的方法
WO2018015419A1 (de) 2016-07-22 2018-01-25 Tecan Trading Ag Pipettenspitze für eine automatisierte pipettiervorrichtung sowie verfahren zu deren herstellung
US20190264193A1 (en) 2016-08-12 2019-08-29 Caribou Biosciences, Inc. Protein engineering methods
CN109715804A (zh) 2016-09-23 2019-05-03 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于宿主细胞的指导rna表达系统
EP3526326A4 (en) 2016-10-12 2020-07-29 The Regents of The University of Colorado, A Body Corporate NEW MODIFIED AND CHEMERICAL NUCLEASES
KR102606929B1 (ko) 2016-11-07 2023-11-27 제노비에 에이비 동족 항원과 t-세포 수용체 상호작용의 발견 및 특징규명을 위한 조작된 2-부분 세포 디바이스
US11001796B2 (en) 2016-11-23 2021-05-11 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Bi-layer multi-well cell culture platform
WO2018119296A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. System and method of using a microfluidic electroporation device for cell treatment
EP4317447A3 (en) 2017-02-15 2024-05-01 2seventy bio, Inc. Donor repair templates multiplex genome editing
JP2020513824A (ja) 2017-03-24 2020-05-21 キュアバック アーゲー Ｃｒｉｓｐｒ関連タンパク質をコードする核酸、及びその使用
US20180362590A1 (en) 2017-04-14 2018-12-20 Synthetic Genomics, Inc. Polypeptides with type v crispr activity and uses thereof
US10011849B1 (en) 2017-06-23 2018-07-03 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
KR20220104847A (ko) 2017-06-30 2022-07-26 인스크립타 인코포레이티드 자동 세포 처리 방법, 모듈, 기기 및 시스템
EP3682004A4 (en) 2017-09-15 2021-05-26 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University MULTIPLEX PRODUCTION AND GENETICALLY MODIFIED CELL BAR CODING
JP7394752B2 (ja) 2017-10-12 2023-12-08 ザ ジャクソン ラボラトリー トランスジェニック選択方法および組成物
US20190225928A1 (en) 2018-01-22 2019-07-25 Inscripta, Inc. Automated cell processing methods, modules, instruments, and systems comprising filtration devices
US10376889B1 (en) 2018-04-13 2019-08-13 Inscripta, Inc. Automated cell processing instruments comprising reagent cartridges
WO2019209926A1 (en) 2018-04-24 2019-10-31 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of peptide libraries
US10227576B1 (en) 2018-06-13 2019-03-12 Caribou Biosciences, Inc. Engineered cascade components and cascade complexes
AU2019292919A1 (en) * 2018-06-30 2021-03-11 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
EP3827074A2 (en) 2018-07-26 2021-06-02 Ospedale Pediatrico Bambino Gesù Therapeutic preparations of gamma-delta t cells and natural killer cells and methods for manufacture and use
US10752874B2 (en) * 2018-08-14 2020-08-25 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US10532324B1 (en) * 2018-08-14 2020-01-14 Inscripta, Inc. Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US20200056192A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments via bulk cell culture
US11965154B2 (en) * 2018-08-30 2024-04-23 Inscripta, Inc. Detection of nuclease edited sequences in automated modules and instruments
GB201816522D0 (en) 2018-10-10 2018-11-28 Autolus Ltd Methods and reagents for analysing nucleic acids from single cells
CN113939593A (zh) 2019-06-06 2022-01-14 因思科瑞普特公司 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
US10927385B2 (en) 2019-06-25 2021-02-23 Inscripta, Inc. Increased nucleic-acid guided cell editing in yeast
US10704033B1 (en) 2019-12-13 2020-07-07 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
US20160184362A1 (en) * 2013-05-29 2016-06-30 Cellectis Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
CN106133138A (zh) * 2013-08-22 2016-11-16 先锋国际良种公司 使用引导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的基因组修饰及其使用方法
CN107250363A (zh) * 2014-12-17 2017-10-13 纳幕尔杜邦公司 使用与环状多核苷酸修饰模板组合的引导RNA/Cas内切核酸酶系统在大肠杆菌中进行有效基因编辑的组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL290801B1 (en) 2023-01-01
US10633626B2 (en) 2020-04-28
US10844344B2 (en) 2020-11-24
CA3108767A1 (en) 2020-01-02
US20200399584A1 (en) 2020-12-24
IL282843B (en) 2022-06-01
EP4070802A1 (en) 2022-10-12
US10533152B1 (en) 2020-01-14
IL280683B (en) 2022-04-01
IL290801A (en) 2022-04-01
US10760043B2 (en) 2020-09-01
US20200056143A1 (en) 2020-02-20
US20210108171A1 (en) 2021-04-15
US20200087613A1 (en) 2020-03-19
US11072774B2 (en) 2021-07-27
US20200248131A1 (en) 2020-08-06
IL290801B2 (en) 2023-05-01
IL292273B1 (en) 2023-06-01
AU2022203425A1 (en) 2022-06-09
AU2019292919A1 (en) 2021-03-11
IL292273B2 (en) 2023-10-01
CN112638494A (zh) 2021-04-09
US20220112452A1 (en) 2022-04-14
US10647958B2 (en) 2020-05-12
IL282843A (en) 2021-06-30
US20200216794A1 (en) 2020-07-09
EP3813974A1 (en) 2021-05-05
US10633627B2 (en) 2020-04-28
US20210095241A1 (en) 2021-04-01
US10954485B1 (en) 2021-03-23
EP3813974A4 (en) 2022-08-03
US11046928B2 (en) 2021-06-29
US10801008B1 (en) 2020-10-13
US20200063088A1 (en) 2020-02-27
US20200216795A1 (en) 2020-07-09
US10851339B1 (en) 2020-12-01
US10550363B1 (en) 2020-02-04
US11739290B2 (en) 2023-08-29
IL280683A (en) 2021-03-25
US20220112508A1 (en) 2022-04-14
US20200095533A1 (en) 2020-03-26
US20200347342A1 (en) 2020-11-05
WO2020005383A1 (en) 2020-01-02
CN112638494B (zh) 2022-01-21
IL292273A (en) 2022-06-01
US10723995B1 (en) 2020-07-28
US20210317400A1 (en) 2021-10-14
US20210163877A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112638494B (zh) 用于改进活细胞中编辑序列的检测的仪器、模块和方法
US10835869B1 (en) Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
US20200071657A1 (en) Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
RU2773331C1 (ru) Инструменты, модули и способы для улучшенного обнаружения отредактированных последовательностей в живых клетках
WO2020037051A1 (en) Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells
NZ787629A (en) Instruments, modules, and methods for improved detection of edited sequences in live cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20220805