CN109715804A - 用于宿主细胞的指导rna表达系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域。更具体地，本发明涉及一种用于真核宿主细胞的指导RNA表达系统。

Description

用于宿主细胞的指导RNA表达系统

技术领域

本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域。更具体地，本发明涉及一种用于宿主细胞的指导RNA表达系统。

背景技术

RNA指导的核酸酶系统(RNA-guided nuclease system)中最著名的是CRISPR/Cas9系统，其是一种用于基因组编辑和基因调控的强大工具。该工具需要表达Cas9蛋白和指导RNA(gRNA或sgRNA)，所述指导RNA使Cas9能够靶向特定DNA序列。在例如真核宿主系统中，指导RNA往往从RNA聚合酶III(POLIII)启动子表达，所述RNA聚合酶III(POLIII)启动子募集用于转录的内源RNA聚合酶III，所述内源RNA聚合酶III是产生没有5'帽的指导RNA的RNA聚合酶。其他方法已经将RNA聚合酶II(POLII)启动子与核酶组合使用，以产生没有5'帽的指导RNA(未加帽的RNA)。然而，现有技术的指导RNA表达需要复杂且庞大的表达盒，并且缺乏对指导RNA的量的直接调谐。此外，可以在宿主细胞中引入体外转录的指导RNA。然而，这种引入的瞬时性限制了该方法用于基因组编辑和基因组调控的用途。因此，一直迫切需要开发用于细胞内指导RNA的改进和简化的表达系统。

发明内容

本发明提供了单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。

本发明还提供了一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，优选由病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，更优选由T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶执行。

本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含所述细胞、所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到根据本发明的启动子。

本发明还提供了一种可通过根据本发明的方法获得的细胞。

本发明还提供了一种细胞，所述细胞包含至少所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到根据本发明的启动子，所述细胞优选能够产生目的化合物。

本发明还提供了一种用于生产目的化合物的方法，所述方法包括在有助于生产所述目的化合物的条件下培养根据本发明的细胞，以及任选地纯化或分离所述目的化合物。

附图说明

图1示出了整合的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因、潮霉素B(HygB)选择标记和dCas9-Mxi1(dCas9-Mxi)表达单元的图形表示。dCas9-Mxi1由半乳糖诱导的(GAL)启动子表达。

图2示出了整合的绿色荧光蛋白(GFP)报告基因、潮霉素B(HygB)选择标记和dCas9-Mxi1(dCas9-Mxi)/T7-RNA聚合酶(T7-RNAP)表达单元的图谱。使用2A病毒肽(2A)来从半乳糖诱导的(GAL)启动子共表达dCas9-Mxi1和T7-RNA聚合酶。

图3示出了多拷贝(2微米)载体pRN1120-AG1的载体图谱。所述载体上存在诺尔丝菌素(NatMX)和氨苄青霉素(ampR)标记。所述载体含有驱动gRNA表达的SNR52启动子(SNR52p)。示出了20个核苷酸(nt)的指导序列(基因组靶序列)和gRNA结构部件。所述指导RNA序列之后是SUP4终止子(SUP4 3’侧翼区)。

图4示出了多拷贝(2微米)载体pAG701的载体图谱。所述载体上存在诺尔丝菌素(NatMX)和氨苄青霉素(ampR)标记。载体含有驱动gRNA表达的T7启动子。示出了20nt指导序列(基因组靶序列)和gRNA结构部件。gRNA序列之后是3’自切割(自加工)核酶(HDV)和T7终止子。

图5示出了与T7产生的gRNA(乱序的(T7-乱序的)和非乱序的(T7))相比，SNR52产生的gRNA(乱序的(SNR52-乱序的)和非乱序的(SNR52-靶3))的抑制效率。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。

图6示出了以下所有测试菌株在半乳糖诱导后的细胞密度(在600nm处测量的光密度)：SNR52产生的gRNA(乱序的(SNR52-乱序的)和非乱序的(SNR52))、T7产生的gRNA(乱序的(T7-乱序的)和非乱序的(T7))。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。

图7示出了具有SNR52产生的靶向和乱序gRNA的菌株的细胞群。

图8示出了具有T7产生的靶向和乱序gRNA的菌株的细胞群。

图9示出了由不同强度的T7启动子(T7-高、T7-中、T7-低和T7-乱序的)产生的gRNA的抑制效率。示出了三次单独实验的平均值和标准偏差。

图10示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN061的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN061表达经密码子对优化的CAS9以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。

图11示出了多拷贝(2微米)载体pRN1120的载体图谱。载体上存在NatMX标记。

图12示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN070的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN070表达经密码子对优化的CAS9和在SbTDH3启动子控制下的T7RNAP以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。

图13示出了单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN071的载体图谱，所述单拷贝(CEN/ARS)载体pCSN071表达经密码子对优化的CAS9和在enoI启动子控制下的T7RNAP以用于在S.cerevisiae中表达。载体上存在KanMX标记。

图14示出了TOPO供体DNA fwnA的质粒图谱

图15示出了BG-AMA17的质粒图谱

图16示出了BG-AMA18的质粒图谱

图17示出了BG-AMA19的质粒图谱

序列说明

SEQ ID NO:1列出了用于扩增5’区段以供整合到INT1基因座中的正向引物序列。

SEQ ID NO:2列出了用于扩增5’区段以供整合到INT1基因座中的反向引物序列。

SEQ ID NO:3列出了用于扩增3’区段以供整合到INT1基因座中的正向引物序列。

SEQ ID NO:4列出了用于扩增3’区段以供整合到INT1基因座中的反向引物序列。

SEQ ID NO:5列出了整合在基因组中的GFP-dCas9-Mxi1表达单元的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下元件(指示的核苷酸位置)：5’INT1整合位点(1-418)；接头序列(419-468)、GFP表达盒(473-1814)；接头序列(1819-1868)；接头序列(1869-1918)；潮霉素B抗性标记盒(1923-3735)；接头序列(3747-3796)；GAL1启动子(3797-4401)；dCas9-Mxi1(4402-8736)；终止子(8737-8977)；接头序列(8798-9028)；3’INT1整合位点(9029-9362)。

SEQ ID NO:6列出了整合在基因组中的GFP-dCas9-Mxi1-T7RNAp表达单元的核苷酸序列，所述核苷酸序列包含以下元件(指示的核苷酸位置)：5’INT1整合位点(1-418)；接头序列(419-468)、GFP表达盒(473-1814)；接头序列(1819-1868)；接头序列(1869-1918)；潮霉素B抗性标记盒(1923-3735)；接头序列(3747-3796)；GAL1启动子(3797-4401)；dCas9-Mxi1(4402-8733)；T2A肽序列(8734-8787)；T7RNA聚合酶(8788-10617)；T7-RNAp的SV40核定位信号N末端(8791–8811)；终止子(10618-10858)；接头序列(10859-10909)；3’INT1整合位点(10910-11243)。

SEQ ID NO:7列出了SNR52gRNA表达载体pRN1120-AG1的核苷酸序列。20nt指导序列(基因组靶序列)是加下划线的。

SEQ ID NO:8列出了T7gRNA表达载体pAG701的核苷酸序列。T7启动子序列以粗体示出(1-18)，并且20nt指导序列(基因组靶序列)是加下划线的(18-38)。T7启动子3'末端的‘G’被转录，并且是所得gRNA的组成部分。指导RNA结构部件存在于核苷酸序列39-118处。终止单元由自切割(自加工)核酶(HDVr，119-186)和T7终止子(187-233)组成，其以大写和小写下划线斜体示出。

SEQ ID NO:9列出了20nt指导序列的核苷酸序列，所述20nt指导序列靶向用于在测试菌株AG1和AG2中组成型表达GFP的Saccharomyces bayanus TDH3(SbTDH3)启动子。

SEQ ID NO:10列出了用于归一化的随机20nt指导序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11列出了用于gRNA表达的强T7启动子的核苷酸序列。该序列取代SEQID NO:8中以粗体指示的T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAG)。

SEQ ID NO:12列出了用于gRNA表达的中等强度T7启动子的核苷酸序列。该序列取代SEQ ID NO:8中以粗体指示的T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAG)。

SEQ ID NO:13列出了用于gRNA表达的弱强度T7启动子的核苷酸序列。该序列取代SEQ ID NO:8中以粗体指示的T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAG)。

SEQ ID NO:14列出了CAS9的核苷酸序列，所述CAS9包含经密码子对优化的C末端SV40核定位信号以用于在Saccharomyces cerevisiae中表达。所述序列包含来自Kluyveromyces lactis的Kl11启动子和来自Saccharomyces cerevisiae的GND2终止子序列。

SEQ ID NO:15列出了载体pCSN061的核苷酸序列。

SEQ ID NO:16列出了载体pRN1120的核苷酸序列

SEQ ID NO:17列出了T7-RNA聚合酶(T7RNAP)表达单元的核苷酸序列。所述序列包含在TDH3启动子和EnoI终止子序列控制下的经密码子对优化的T7RNAP基因以用于在S.cerevisiae中表达

SEQ ID NO:18列出了T7-RNA聚合酶(T7RNAP)表达单元的核苷酸序列。所述序列包含在enoI启动子和EnoI终止子序列控制下的经密码子对优化的T7RNAP基因以用于在S.cerevisiae中表达

SEQ ID NO:19列出了用于在酵母中表达的经密码子对优化的T7RNAP基因的序列

SEQ ID NO:20列出了S.cerevisiae的tdh3启动子(Ptdh3)的核苷酸序列

SEQ ID NO:21列出了S.cerevisiae的enoI启动子(PenoI)的核苷酸序列

SEQ ID NO:22列出了S.cerevisiae的enoI终止子(TenoI)的核苷酸序列

SEQ ID NO:23列出了pCSN061骨架到T7RNAP表达盒的5’转换的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:24列出了pCSN061骨架到T7RNAP表达盒的5’转换的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:25列出了pCSN061骨架到T7RNAP表达盒的3’转换的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:26列出了pCSN061骨架到T7RNAP表达盒的3’转换的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:27列出了载体pCSN070的核苷酸序列

SEQ ID NO:28列出了载体pCSN071的核苷酸序列

SEQ ID NO:29列出了INT1基因组靶的核苷酸序列

SEQ ID NO:30列出了丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的核苷酸序列

SEQ ID NO:31列出了T7终止子的核苷酸序列

SEQ ID NO:32列出了用于gRNA表达的弱强度T7启动子的核苷酸序列

SEQ ID NO:33列出了用于gRNA表达的中等强度T7启动子的核苷酸序列

SEQ ID NO:34列出了用于gRNA表达的强T7启动子的核苷酸序列

SEQ ID NO:35列出了用于gRNA表达的野生型强度T7启动子的核苷酸序列

SEQ ID NO:36列出了在强T7启动子控制下的指导RNA表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO:37列出了在中等强度T7启动子控制下的指导RNA表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO:38列出了在弱T7启动子控制下的指导RNA表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO:39列出了在野生型T7启动子控制下的指导RNA表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO:40列出了用于获得在转化中使用的T7控制的指导RNA片段的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:41列出了用于获得在转化中使用的T7控制的指导RNA片段的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:42列出了在转化中使用的由强T7启动子控制的指导RNA片段的核苷酸序列，所述指导RNA片段的侧翼为在5’侧上84bp的pRN1120序列和在3’侧上93bp的pRN1120序列，以用于体内组装到载体pRN1120中

SEQ ID NO:43列出了在转化中使用的由中等强度T7启动子控制的指导RNA片段的核苷酸序列，所述指导RNA片段的侧翼为在5’侧上84bp的pRN1120序列和在3’侧上93bp的pRN1120序列，以用于体内组装到载体pRN1120中

SEQ ID NO:44列出了在转化中使用的由弱T7启动子控制的指导RNA片段的核苷酸序列，所述指导RNA片段的侧翼为在5’侧上84bp的pRN1120序列和在3’侧上93bp的pRN1120序列，以用于体内组装到载体pRN1120中

SEQ ID NO:45列出了在转化中使用的由野生型T7启动子控制的指导RNA片段的核苷酸序列，所述指导RNA片段的侧翼为在5’侧上84bp的pRN1120序列和在3’侧上93bp的pRN1120序列，以用于体内组装到载体pRN1120中

SEQ ID NO:46列出了100bp左侧翼的上游链的核苷酸序列

SEQ ID NO:47列出了与SEQ ID NO:46反向互补的100bp左侧翼的核苷酸序列

SEQ ID NO:48列出了正向上的100bp右侧翼的核苷酸序列

SEQ ID NO:49列出了与SEQ ID NO:48反向互补的100bp右侧翼的核苷酸序列

SEQ ID NO:50列出了YFP供体DNA表达盒的核苷酸序列

SEQ ID NO:51列出了用以获得用于整合YFP供体DNA盒的577bp左侧翼的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:52列出了用以获得用于整合YFP供体DNA盒的577bp左侧翼的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:53列出了用于在S.cerevisiae的INT1基因座中整合YFP供体表达盒的左侧翼的核苷酸序列

SEQ ID NO:54列出了用以获得用于整合YFP供体DNA表达盒的581bp右侧翼的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:55列出了用以获得用于整合YFP供体DNA表达盒的581bp右侧翼的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:56列出了用于在S.cerevisiae的INT1基因座中整合YFP供体表达盒的右侧翼的核苷酸序列

SEQ ID NO:57列出了用于扩增YFP表达盒的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:58列出了用于扩增YFP表达盒的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:59列出了用于扩增在5’侧上包括接头5的YFP供体DNA表达盒的正向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:60列出了用于扩增在3’侧上包括接头3的YFP供体DNA表达盒的反向引物的核苷酸序列

SEQ ID NO:61列出了由DiCarlo描述的指导RNA结构元件的序列

SEQ ID NO:62列出了以fwnA为靶标的有序gBlock供体DNA的核苷酸序列

SEQ ID NO:63列出了TOPO载体的核苷酸序列，其中供体DNA(靶fwnA)为在TOPO载体中克隆gBlock供体DNA的结果

SEQ ID NO:64列出了用于扩增供体DNA(靶fwnA)的正向引物序列

SEQ ID NO:65列出了用于扩增供体DNA(靶fwnA)的反向引物序列

SEQ ID NO:66列出了用于扩增具有用于连接在AMA载体中的附加KpnI侧翼的Cas9盒的正向引物序列

SEQ ID NO:67列出了用于扩增具有用于连接在AMA载体中的附加KpnI侧翼的Cas9盒的反向引物序列

SEQ ID NO:68列出了BG-AMA17(Cas9/hygB)的核苷酸序列，所述BG-AMA17(Cas9/hygB)为连接PCR片段(具有KpnI侧翼的Cas9盒)与BG-AMA8的结果

SEQ ID NO:69列出了具有T7gRNA盒——T7.pro WT sgRNA fwnA——的有序gBlock的核苷酸序列

SEQ ID NO:70列出了具有T7 gRNA盒——T7.pro强sgRNA fwnA——的有序gBlock的核苷酸序列

SEQ ID NO:71列出了BG-AMA18(Cas9/hygB/T7 wt sgRNA fwnA)——具有gBlockT7.pro WT sgRNA fwnA的Golden Gate产物BG-AMA17——的核苷酸序列

SEQ ID NO:72列出了BG-AMA19(Cas9/hygB/T7强sgRNA fwnA)——具有gBlockT7.pro强sgRNA fwnA的Golden Gate产物BG-AMA17——的核苷酸序列

SEQ ID NO:73列出了用于通过GoldenGate检查AMA载体(BG-AMA18和BG-AMA19)中克隆的T7 gRNA盒的正向引物序列

SEQ ID NO:74列出了用于通过GoldenGate检查AMA载体(BG-AMA18和BG-AMA19)中克隆的T7 gRNA盒的反向引物序列

SEQ ID NO:75列出了用于扩增fwnA基因的部分以产生用于测序的DNA片段的正向引物序列，以及还用于测序反应以检查门DNA在基因组中的正确整合的引物

SEQ ID NO:76列出了用于扩增fwnA基因的部分以产生用于测序的DNA片段的反向引物序列

序列

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

具体实施方式

本发明涉及单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7 RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7 RNA聚合酶启动子。

所述用途，所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，所述病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，所述T3、SP6、K11和T7 RNA聚合酶，所述指导RNA，所述RNA指导的核酸酶系统，所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子和所述T3、SP6、K11或T7 RNA聚合酶启动子在本文中称为根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，T3、SP6、K11和T7RNA聚合酶，指导RNA，RNA指导的核酸酶系统，单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子和T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。根据本发明的指导RNA优选是未加帽的RNA；即它不具有5'帽((参见一般定义))。

为了完整起见，不使用定冠词时表示“至少一个(种)”；例如，单亚基DNA依赖性RNA聚合酶因此被解释为一种、两种、三种或更多种单亚基DNA依赖性RNA聚合酶。指导RNA优选是具有预定序列的指导RNA；因此，排除任何天然的过程，并且仅工程化(人造)过程和产物被认为是在本发明的范围内。

根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶是这样的RNA聚合酶，所述RNA聚合酶从DNA模板转录并且是单亚基RNA聚合酶的成员。这种RNA聚合酶是本领域的技术人员已知的。优选的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶是病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选来自噬菌体。更优选的病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶选自由以下项组成的组：T3、SP6、K11和T7RNA聚合酶，或它们的仍然具有单亚基DNA依赖性RNA聚合酶活性的变体。根据本发明的细胞可以是一般定义中所定义的任何细胞。在根据本发明的用途中，细胞可以是任何合适的细胞，并且优选是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞；所有这些都如在本文的一般定义中所定义的。

术语“表达”是本领域的技术人员已知的，并且在本发明的上下文中定义为多核苷酸从多核苷酸模板转录的过程(例如DNA模板多核苷酸被转录成mRNA多核苷酸转录物或其他RNA转录物)和/或随后将mRNA转录物翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸转录物来源于基因组模板DNA，则表达可包括在宿主细胞中剪接mRNA转录物。术语“调控表达”在本文中是指与亲本宿主细胞相比升高或降低的表达，所述亲本宿主细胞中当使用相同条件测定时表达不被调控。降低的表达可以是减少量的转录物，诸如mRNA，和/或减少量的翻译产物，诸如多肽。由此可见，增加的表达可以是增加量的转录物，诸如mRNA，和/或增加量的翻译产物，诸如多肽。为了清楚起见，指导RNA的表达意指通过根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶从DNA模板产生根据本发明的指导RNA。

指导RNA(也称为gRNA或sgRNA)是由核糖核苷酸组成的指导多核苷酸，并且包含至少这样的指导序列，所述指导序列能够与靶多核苷酸杂交并且能够指导RNA指导的核酸酶系统与靶多核苷酸的序列特异性结合。本领域的技术人员熟悉指导RNA，参见例如Qi等人，2013和Tycko等人，2016。在根据本发明的用途中，启动子和RNA聚合酶是相容的组。换句话说，根据本发明的指导RNA的表达由根据本发明的启动子驱动，所述启动子能够从其编码DNA模板启动指导RNA的转录，并且所述转录通过根据本发明的RNA聚合酶执行，所述RNA聚合酶识别所述启动子以从所述启动子启动表达。作为示例，根据本发明的指导RNA的表达可以由T7启动子驱动，并且转录由T7RNA聚合酶执行。

在根据本发明的用途中，根据本发明的RNA聚合酶可以作为多肽以其活性形式进入细胞，或者作为在递送入细胞后被激活的前肽而进入细胞。根据本发明的RNA聚合酶还可以在细胞内从多核苷酸(诸如表达构建体)表达。这种表达构建体可以是任何类型的表达构建体，诸如线性核酸构建体、基因组或载体，优选质粒。优选的核酸构建体，即质粒载体，包含选择性标记。选择性标记是目的多核苷酸的产物，该产物提供生物杀灭剂(biocide)抗性或病毒抗性、重金属抗性、使原养型变成营养缺陷型等。选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)以及它们的等同物。

在根据本发明的用途中，指导RNA由(DNA)多核苷酸编码，所述(DNA)多核苷酸可操作地连接到根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子。所述包含编码指导RNA的多核苷酸和根据本发明的启动子(所述指导RNA从其表达)的所述构建体可以是线性核酸构建体、基因组或载体，优选地所述载体是质粒，优选地是包含选择性标记的质粒。线性核酸也可以是已经线性化的质粒。

根据本发明的RNA指导的核酸酶系统可以是本领域的技术人员已知的任何RNA指导的核酸酶系统。RNA指导的核酸酶系统尤其在Hsu等人，2014；Sander和Joung，2014；以及Tycko等人，2016……中进行了综述。在根据本发明的用途中优选的众所周知的RNA指导的核酸酶系统基于成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。CRISPR/Cas变体是本领域的技术人员已知的(参见例如Nelson等人，2016)。本领域的技术人员应理解，根据本发明的RNA指导的核酸酶系统可方便地用于基因组编辑，例如插入、缺失和/或突变细胞基因组中的序列，优选使用外源多核苷酸(诸如供体DNA分子)来进行。因此，本发明还提供了一种外源多核苷酸，其在由RNA指导的核酸酶系统切割靶多核苷酸后与所述靶多核苷酸重组，从而产生经修饰的靶多核苷酸。这种外源多核苷酸可以是单链或双链的。在本文中，供体DNA分子也可称为外源核酸分子、修复模板或外源多核苷酸。术语“外源的”在本文中被解释为外源核酸分子本身不是天然存在于细胞中；所述外源核酸分子从外部进入细胞。外源核酸分子将大部分对细胞而言是外源的。然而，在某些实施方案中，外源核酸分子可以是对于细胞天然的，但已经在细胞外部工程化并进入细胞中；在这种情况下，外源核酸分子可被认为是对于细胞天然的。

在根据本发明的用途中，RNA聚合酶当在细胞中表达时从表达构建体表达，在所述表达构建体上编码RNA聚合酶的多核苷酸可操作地连接到启动子。这种启动子是本领域的技术人员已知的，并且可以是任何合适的启动子，诸如诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子使得能够瞬时表达根据本发明的RNA聚合酶和/或调控RNA聚合酶的表达水平。RNA聚合酶还可以与来自单个启动子的另一种蛋白质(诸如Cas蛋白质)一起表达。在这种情况下，所述两个编码序列可以由允许表达多种蛋白质的序列分开，所述序列为诸如病毒2A序列，例如病毒T2A序列。图2示出了这种构建体的一个示例。

根据本发明的RNA聚合酶的密码子使用可以经调适以与特定宿主细胞的密码子使用更相容。因此，在根据本发明的用途中，RNA聚合酶优选是密码子优化的RNA聚合酶，优选地密码子对优化的RNA聚合酶。在替代方案或与密码子优化的RNA聚合酶的组合中，RNA聚合酶可以是变体RNA聚合酶，诸如断裂RNA聚合酶。这种断裂RNA聚合酶是本领域的技术人员已知的，并且包含几个(诸如一个、两个、三个或甚至四个)结构域，所述结构域可以单独表达，并且仅当所有结构域均表达时才聚集形成功能性RNA聚合酶。变体单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，诸如变体T3和T7聚合酶是本领域的技术人员已知的，并且尤其描述于US2013224793、US2015024435、US5102802、US5869320，Shis等人、2014，Imburgio等人、2000，Temme等人、2012中；所有这些参考文献都以引用方式并入本文)。

在一个实施方案中，根据本发明的RNA聚合酶包含核定位信号(NLS，也称为核靶向信号，参见例如Benton等人，1989)，优选地在RNA聚合酶的C末端或N末端，优选地在RNA聚合酶的N末端。优选的NLS是SV40NLS，并且优选存在于RNA聚合酶的N末端处。

在细胞中表达不止一种指导RNA在本发明的范围内。如果表达多种不同的指导RNA，则它们可以从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。因此，两种或更多种指导RNA从由单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子驱动的操纵子样结构表达，或者两种或更多种指导RNA各自从单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达；所述多个启动子甚至是不同的启动子。

在一个实施方案中，指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。

在根据本发明的用途中，单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子可以是本领域的技术人员已知的任何合适的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子。这种启动子可以是变体启动子，诸如嵌合启动子。变体启动子是与天然存在的野生型启动子相比具有序列差异同时仍保留启动子活性的启动子。变体启动子由Jones等人，2015，Temme等人，2012，Imburgio等人，2000)描述。嵌合或杂合启动子是包含不同启动子的至少两个部分同时保留启动子活性的启动子。此类变体启动子尤其描述于Romanienko等人，2016和US5,017,488中，所述文献以引用方式并入本文。在本发明的所有实施方案中，优选的变体T7启动子是具有如SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中所述序列的启动子。

本领域的技术人员知道，正确表达编码序列需要几个控制序列。具体地，在根据本发明的用途中，指导RNA优选由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。这种自加工核酶和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子是本领域的技术人员已知的。在本文的示例中给出了优选的构建体，其中指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到根据本发明的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。

在本发明的范围内，如果指导RNA由可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子的多核苷酸编码并且所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，则通过将包含指导多核苷酸的靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到细胞内。这详细描述于EP16181781.2中并且极大地促进了指导RNA的表达，因为可以避免一个或多个克隆步骤。EP16181781.2以引用方式并入本文。除了前者之外或与前者组合，整个指导RNA编码序列还可以作为双链寡核苷酸或作为两条单链互补寡核苷酸提供，并且因此组装进细胞内的表达构建体中，所述表达构建体优选存在于质粒上。

在根据本发明的用途中，所述细胞优选缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。所述与NHEJ相关的部件优选是Ku70、Ku80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4和/或LIG4的同源物或直系同源物。或者，在根据本发明的细胞中，可以通过使用抑制RNA连接酶IV的化合物(诸如SCR7)来使NHEJ缺乏。本领域中的技术人员知道如何调控NHEJ及其对RNA指导的核酸酶系统的影响，参见例如WO2014130955A1；Chu等人，2015；Maruyama等人，2015；Song等人，2015和Yu等人，2015；所有这些以引用方式并入本文。缺乏在下文中定义。

在本发明的范围内，作为RNA指导的核酸酶系统的组成部分的异源基因组编辑酶作为蛋白质存在于细胞中并且因此可以被引入细胞内，或者所述异源基因组编辑酶在细胞内从编码序列表达。因此，在根据本发明的用途中，细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者在细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。

取决于具体的基本原理，本领域的技术人员可以自由使用各种Cas酶，诸如众所周知的野生型Cas9和Cpf1(Zetsche等人，2015)，以及Cas9切口酶或dCas9(由Sander和Young评论))。

Cpf1介导稳健的DNA干扰，具有与Cas9不同的特征。Cpf1是缺乏tracrRNA的单个RNA指导的内切核酸酶，并且其利用富含T的与原型间隔区相邻的基序(T-richprotospacer-adjacent motif)。Cpf1经由交错的DNA双链断裂切割DNA。已经鉴定出了两种来自Acidaminococcus和Lachnospiraceae的候选Cpf1酶，它们在人类细胞中具有有效的基因组编辑活性。

野生型Cas9核酸酶在与gRNA的5'末端互补的DNA靶位点处产生双链断裂。切割靶DNA位点的一条链而不是两条链的Cas9变体被称为切口酶。Cas9含有RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域。通过使用D10A突变使RuvC核酸酶结构域突变而产生的Cas9切口酶仅切割与gRNA互补并被gRNA识别的DNA链。通过HNH核酸酶结构域突变和H840A突变产生的Cas9切口酶仅切割不与gRNA相互作用的DNA链。为了改善Cas9特异性，两种D10A Cas9切口酶可以配对并由一对适当定向的gRNA指导。这导致对两个切口的诱导，所述两个切口如果同时被引入，则将预期产生5'悬突。催化失活或“死亡”的Cas9(dCas9)(例如，在RuvC结构域和HNH结构域两者中都具有突变)。这可以由gRNA募集，而无需切割靶DNA位点。催化失活的dCas9可以与异源效应结构域融合，例如以允许对基因表达的激活或抑制，如Didovyk等人，2016所评论的。

在本发明的实施方案中，根据本发明的细胞中将在某些阶段存在至少几种如本文所定义的部件，诸如根据本发明的编码指导RNA的多核苷酸、根据本发明的RNA聚合酶。这些部件可以同时或连续引入细胞中。这同样适用于其他部件，诸如RNA指导的核酸酶系统的部件。本领域的技术人员知道这一点并且了解如何设置这样的系统。

本发明可方便地用于在细胞内表达指导RNA。因此，在第二方面，本发明提供了一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，优选由病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，更优选由T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶执行。所述方法在本文中称为根据本发明的方法。本发明该方面的所有特征优选地是在本发明的第一方面中定义的相应特征。优选地，在根据本发明的方法中，RNA聚合酶在细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。优选的核酸构建体，即质粒载体，包含选择性标记。选择性标记是目的多核苷酸的产物，该产物提供生物杀灭剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、使原养型变成营养缺陷型等。选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)以及它们的等同物。

优选地，在根据本发明的方法中，指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒，所述质粒优选包含本文其他地方所定义的选择性标记。

优选地，在根据本发明的方法中，RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如本文其他地方所定义的CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。

根据本发明的细胞可以是一般定义中所定义的任何细胞。优选地，在根据本发明的方法中，细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。

优选地，在根据本发明的方法中，RNA聚合酶由本文其他地方所定义的诱导型启动子表达。

优选地，在根据本发明的方法中，RNA聚合酶是如本文其他地方所定义的密码子优化的RNA聚合酶和/或如本文其他地方所定义的断裂RNA聚合酶。

优选地，在根据本发明的方法中，RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，多个不同的指导RNA从单一的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变异的单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，诸如嵌合启动子；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含指导多核苷酸的靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到细胞内；全部如本文其他地方所定义。

优选地，在根据本发明的方法中，细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。所述与NHEJ相关的部件优选是酵母Ku70、Ku80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4和/或LIG4的同源物或直系同源物。或者，在根据本发明的细胞中，可以通过使用抑制RNA连接酶IV的化合物(诸如SCR7)来使NHEJ缺乏。缺乏在本文其他地方定义。

优选地，在根据本发明的方法中，细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9；全部如本文其他地方所定义。

在第三方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含所述细胞、所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到如本发明的第一方面中所定义的启动子。所述组合物在本文中称为根据本发明的组合物。

在第四方面，本发明提供了一种可通过根据本发明的第二方面的方法获得的细胞，或者通过根据本发明的第二方面的方法获得的细胞。此外，提供了一种细胞，所述细胞包含至少所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到启动子；所有这些都在本发明的第一方面中定义。优选地，所述细胞能够产生目的化合物。优选地，所述细胞还包含如本文先前所定义的RNA指导的核酸酶系统。

还提供了一种生产目的化合物的方法，所述方法包括在有助于产生所述目的化合物的条件下培养所述能够产生目的化合物的细胞，以及任选地分离或纯化所述目的化合物。

在本发明的所有实施方案的上下文中，目的化合物可以是任何生物化合物。所述生物化合物可以是生物质或生物聚合物或代谢物。生物化合物可以由构成生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码，或者可以是单个多核苷酸的产物或一系列多核苷酸的产物的直接结果，所述多核苷酸可以是基因，所述一系列多核苷酸可以是基因簇。在本发明的所有实施方案中，编码目的生物化合物的单个多核苷酸或一系列多核苷酸或与目的生物化合物相关的生物合成或代谢途径是根据本发明的组合物和方法的优选靶标。生物化合物可以是对于宿主细胞天然的或对于宿主细胞异源的。

术语“异源生物化合物”在本文中定义为对细胞不是天然的生物化合物；或这样的天然生物化合物，所述天然生物化合物中已经进行结构修饰以改变所述天然生物化合物。

术语“生物聚合物”在本文中定义为具有相同、相似或不相似的亚基(单体)的链(或聚合物)。所述生物聚合物可以是任何生物聚合物。生物聚合物可以是例如但不限于核酸、聚胺、多元醇，多肽(或聚酰胺)，或多糖。

生物聚合物可以是多肽。多肽可以是具有目的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中并不是指特定长度的编码产物，因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语多肽是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖已被修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵，诸如与标记部件缀合。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体两者，以及氨基酸类似物和肽模拟物。多肽还包括上述多肽和杂合多肽的天然存在的等位基因和工程化变体。所述多肽可以是对于宿主细胞天然的或可以是对于宿主细胞异源的。多肽可以是胶原蛋白或明胶，或它们的变体或杂合体。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报告分子或转运蛋白、参与分泌过程的蛋白质、参与折叠过程的蛋白质、伴侣蛋白、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白质。细胞内蛋白质可以是酶，诸如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶。多肽也可以是细胞外分泌的酶。此类酶可以属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶的组。所述酶可以是糖酶，例如纤维素酶(诸如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)、半纤维素酶或果胶酶(诸如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、内多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯糖呋喃糖苷酶、阿拉伯糖基木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶)、裂解酶，或淀粉分解酶；水解酶、异构酶或连接酶、磷酸酶(诸如植酸酶)、酯酶(诸如脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(诸如氧化酶)、转移酶或异构酶。所述酶可以是植酸酶。所述酶可以是氨肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤过氧化物酶、蛋白质脱氨酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变构酶(mutanase)、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、叶绿素酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶，或葡糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

根据本发明，目的化合物可以是具有改进的分泌特征的多肽或酶，如WO2010/102982中所述。根据本发明，目的化合物可以是融合或杂合多肽，另一种多肽在所述多肽或其片段的N末端或C末端处融合到所述多肽。融合多肽是通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合而产生的。

用于产生融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包括连接编码所述多肽的编码序列，使得它们符合读框并且融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的控制下。杂合多肽可包含从至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种多肽对于宿主细胞可为异源的。融合多肽和信号序列融合物的示例为例如如WO2010/121933中所述。

生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不限于粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如，几丁质)。在一个优选的选项中，所述多糖是透明质酸。

编码目的化合物或编码参与根据本发明的目的化合物的生产的化合物的多核苷酸可以编码参与初级代谢物或次级代谢物(诸如有机酸类、类胡萝卜素类、(β-内酰胺)抗生素类和维生素类)合成的酶。这种代谢物可以被认为是根据本发明的生物化合物。

术语“代谢物”涵盖初级代谢物和次级代谢物；所述代谢物可以是任何代谢物。优选的代谢物是柠檬酸、葡糖酸、己二酸、富马酸、衣康酸和琥珀酸。

代谢物可以由一种或多种基因编码，诸如在生物合成途径或代谢途径中由一种或多种基因编码。初级代谢物是细胞的初级代谢或全身代谢的产物，所述产物涉及能量代谢、生长和结构。次级代谢物是次级代谢的产物(参见例如R.B.Herbert,The Biosynthesis ofSecondary Metabolites,Chapman and Hall,New York,1981)。

初级代谢物可以是但不限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯，或维生素。

次级代谢物可以是但不限于生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮化合物、奎宁、类固醇、肽或萜烯。次级代谢物可以是抗生素、拒食剂、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或灭鼠剂。优选的抗生素是头孢菌素和β-内酰胺。其他优选的代谢物是外代谢物。外代谢物的示例是Aurasperone B、Funalenone、克他命(Kotanin)、Nigragillin、Orlandin、其他萘并-γ-吡喃酮、Pyranonigrin A、Tensidol B、伏马菌素B2和赭曲霉素A。

生物化合物也可以是选择性标记的产物。选择性标记是目的多核苷酸的产物，该产物提供杀生体抗性或病毒抗性、重金属抗性、使原养型变成营养缺陷型等。选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)以及它们的等同物。

根据本发明，目的化合物优选是目的化合物列表中描述的多肽。

根据本发明的另一实施方案，目的化合物优选是代谢物。

根据本发明的细胞可能已经能够产生目的化合物。根据本发明的细胞还可以具有编码多肽的同源或异源核酸构建体，其中所述多肽可以是目的化合物或参与目的化合物生产的多肽。本领域的技术人员知道如何修饰微生物宿主细胞，使其能够产生目的化合物。

实施方案

提供了本发明的以下实施方案；这些实施方案中的特征优选为本文先前所定义的那些。

1.单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。

2.根据实施方案1所述的用途，其中所述RNA聚合酶在所述细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

3.根据实施方案1或2所述的用途，其中所述指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

4.根据实施方案1–3中任一项所述的用途，其中所述RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。

5.根据实施方案1–4中任一项所述的用途，其中所述细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或者其中所述细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。

6.根据实施方案1–5中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶从诱导型启动子表达。

7.根据实施方案1–6中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶是密码子优化的RNA聚合酶和/或断裂RNA聚合酶。

8.根据实施方案1–7中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在所述RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS。

9.根据实施方案1–8中任一项所述的用途，其中从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达多种不同的指导RNA。

10.根据实施方案1–9中任一项所述的用途，其中所述指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。

11.根据实施方案1–10中任一项所述的用途，其中所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变体启动子，诸如嵌合启动子。

12.根据实施方案1–11中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。

13.根据实施方案1–12中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含所述指导多核苷酸的所述靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到所述细胞内。

14.根据实施方案1–13中任一项所述的用途，其中所述细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。

15.根据实施方案1–14中任一项所述的用途，其中所述细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在所述细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。

16.一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，优选由病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，更优选由T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶执行。

17.根据实施方案16所述的方法，其中所述RNA聚合酶在所述细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒，优选为包含选择性标记的质粒。

18.根据实施方案16或17所述的方法，其中所述指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

19.根据实施方案16–18中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。

20.根据实施方案16–19中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或者其中所述细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。

21.根据实施方案16–20中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶从诱导型启动子表达。

22.根据实施方案16–21中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶是密码子优化的RNA聚合酶和/或断裂RNA聚合酶。

23.根据实施方案16–22中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在所述RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS。

24.根据实施方案16–23中任一项所述的方法，其中从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达多种不同的指导RNA。

25.根据实施方案16–24中任一项所述的方法，其中所述指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。

26.根据实施方案16–25中任一项所述的方法，其中所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变体单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，诸如嵌合启动子。

27.根据实施方案16–26中任一项所述的方法，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。

28.根据实施方案16-27中任一项所述的方法，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含所述指导多核苷酸的所述靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到所述细胞内。

29.根据实施方案16-28中任一项所述的方法，其中所述细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。

30.根据实施方案16–29中任一项所述的方法，其中所述细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在所述细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。

31.一种组合物，包含所述细胞、所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到如在实施方案1–30中任一项所定义的启动子。

32.一种可通过根据实施方案16-30中任一项所述的方法获得的细胞。

33.一种细胞，包含至少所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到如在实施方案1-30中任一项所定义的启动子，所述细胞优选能够产生目的化合物。

34.一种用于生产目的化合物的方法，包括在有助于生产所述目的化合物的条件下培养根据实施方案32或33所述的细胞，以及任选地纯化或分离所述目的化合物。

一般定义

在整个本说明书和所附权利要求书中，词语“包括”和“具有”以及诸如“包含”的变型将被包含性地解释。也就是说，这些词语旨在传达在上下文允许的情况下可能包括未具体叙述的其他要素或整数。

在本文中不使用定冠词时表示语法对象为一个或多于一个(即一个或至少一个)。举例而言，“要素”可以指一个要素或多于一个要素。

当与数值(例如，约10)结合使用时，词语“约”或“近似”优选地意味着该值可以是给定值(10)加减该值的1％。

CRISPR干扰(CRISPRi)是一种遗传扰动技术，该遗传扰动技术允许对原核和真核细胞中的基因表达进行序列特异性抑制或激活。

多核苷酸在本文中是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的混合物或类似物的任何长度或确定的特定长度范围或长度的核苷酸聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码或非编码区，根据连锁分析定义的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、具有任何序列的分离DNA、具有任何序列的分离RNA、核酸探针，寡核苷酸和引物。多核苷酸可包含天然和非天然核苷酸，并且可包含一个或多个修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物或核苷酸等同物，其中核苷酸类似物或等同物被定义为具有经修饰的碱基、和/或经修饰的骨架、和/或非天然的核苷间键、或这些修饰的组合的残基。根据需要，可以在组装多核苷酸之前或之后引入对核苷酸结构的修饰。聚合后可以进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记化合物缀合来修饰。

通常，密码子优化是指通过以下方式来修饰核酸序列以增强目的宿主细胞中的表达的过程：用在所述宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如，多于1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个密码子)，同时保持天然氨基酸序列。不同物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏倚。密码子偏倚(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率据信又尤其取决于被翻译的密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选择的tRNA在细胞中主导通常反映了肽合成中最常使用的密码子。因此，可以基于密码子优化来定制基因以实现给定生物中的最佳基因表达。密码子使用表是容易例如在“密码子使用数据库(Codon Usage Database)”中获得的，并且这些表可以以多种方式进行调整。参见例如Nakamura,Y.等人，2000。用于对特定序列进行密码子优化以在特定宿主细胞中表达的计算机算法，诸如Gene Forge(Aptagen；Jacobus,PA)，也是可得的。优选地，编码Cas蛋白的序列中的一个或多个密码子(例如，1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最频繁使用的密码子。用于密码子优化的优选方法描述于WO2006/077258和WO2008/000632中)。WO2008/000632涉及密码子对优化。密码子对优化是这样的一种方法，在所述方法中编码多肽的核苷酸序列已经在其密码子使用方面被修饰，特别是在所使用的密码子对方面被修饰，以获得编码多肽的核苷酸序列的改善表达和/或所编码多肽的改善产生。密码子对被定义为编码序列中的一组两个紧接的三联体(密码子)。根据本发明的组合物中的来源中Cas蛋白的量可以变化，并且可以进行优化以实现最佳性能。

在具有5'-帽的RNA分子中，7-甲基鸟苷酸残基位于RNA的5'末端上(诸如通常在真核细胞中的mRNA中)。RNA聚合酶II(Pol II)在真核细胞中转录mRNA。信使RNA加帽通常发生如下：由RNA末端磷酸酶去除mRNA转录物的最末端5'磷酸基团，留下两个末端磷酸酯。由鸟苷酰转移酶将单磷酸鸟苷(GMP)加入到转录物的末端磷酸酯中，在转录物末端处留下5'-5'三磷酸酯连接的鸟嘌呤。最后，用甲基转移酶甲基化该末端鸟嘌呤的7-氮。本文中术语“不具有5'-帽”用于指具有例如5'-羟基而不是5'-帽的RNA。例如，这种RNA可称为“未加帽的RNA”。未加帽的RNA可以在转录后在细胞核中更好地积累，因为5'-加帽的RNA经受核输出。

核酶是指这样的一种或多种RNA序列，所述一种或多种RNA序列形成能够在特定位点处切割RNA的二级、三级和/或四级结构。核酶包括“自切割核酶或自加工核酶”，其能够在相对于核酶序列的c/s位点处切割RNA(即，自动催化或自切割的)。核酶溶核活性的一般性质是本领域的技术人员已知的。用于RNA指导的核酸酶系统(诸如CRISPR/Cas)的指导RNA的生产中的自加工核酶尤其由Gao等人，2014描述。

核苷酸类似物或等同物通常包含经修饰的骨架。此类骨架的示例由吗啉代骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫化物骨架、亚砜骨架和砜骨架、甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架、亚甲基甲酰乙酰基骨架、核乙酰基(riboacetyl)骨架、含烯烃的骨架、氨基磺酸酯骨架、磺酸酯骨架和磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架，以及酰胺骨架提供。进一步优选的是，骨架中残基之间的键不包含磷原子，诸如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。

优选的核苷酸类似物或等同物包含具有经修饰的聚酰胺骨架的肽核酸(PNA)(Nielsen等人，(1991)Science 254,1497-1500)。基于PNA的分子是DNA分子在碱基对识别方面的真实模拟物。PNA的骨架由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键与骨架连接。替代的骨架包括一个碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar(2005)Chem.Commun,495–497)。因为PNA分子的骨架不含带电荷的磷酸基团，所以PNA-RNA杂合体通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂合体更稳定(Egholm等人(1993)Nature 365,566-568)。

进一步优选的骨架包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖被6元吗啉代环取代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括磷酰二胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖被6元吗啉代环取代，并且相邻吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键被非离子磷酰二胺键取代。

进一步优选的核苷酸类似物或等同物包括对磷酸二酯键中的至少一个非桥连氧的取代。这种修饰稍微破坏了碱基配对稳定性，但增加了对核酸酶降解的显著抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸酯、H-膦酸酯、甲基膦酸酯和其他烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸酯、硒代磷酸酯或硼代磷酸酯。

进一步优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个在2'、3'和/或5'位置处被单取代或二取代的糖部分，诸如-OH；-F；取代或未取代的、直链或支链的低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，所述基团可被一个或多个杂原子中断；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；O-烯丙基、S-烯丙基或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基，O-烷基-O-甲氧基，O-烷基-O-氨基丙氧基；氨氧基、甲氧基乙氧基；-二甲氨基氧基乙氧基；以及-二甲氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物，或脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物，或脱氧核糖或其衍生物。这种优选的衍生糖部分包括锁核酸(Locked Nucleic Acid,LNA)，其中2'-碳原子与糖环的3'或4'碳原子连接，从而形成双环糖部分。优选的LNA包含2'-O,4'-C-亚乙基桥连核酸(Morita等人，2001.Nucleic Acid Res增刊No.1:241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同物具有对RNA酶H和核酸酶的抗性并增加了对靶标的亲和力。

本发明上下文中氨基酸序列或核酸序列的“序列同一性”或“同一性”在本文中被定义为两个或更多个氨基酸(肽、多肽或蛋白质)序列或两个或更多个核酸(核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸)序列之间的关系，如通过比较所述序列确定的。在本领域中，“同一性”还表示视情况而定的氨基酸或核苷酸序列之间的序列相关程度，如通过这些序列的串之间的匹配所确定的。在本发明中，与特定序列的序列同一性优选是指在所述特定多肽或多核苷酸序列的整个长度上的序列同一性。

两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过比较一种肽或多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二种肽或多肽的序列来确定的。在一个优选的实施方案中，计算整个序列(SEQ ID NO:)的同一性或相似性，如在本文中所鉴定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算，所述已知方法包括但不限于在Computational MolecularBiology,Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编辑，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分，Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeine,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑，M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些方法。

用于确定同一性的优选方法被设计成给出所测试的序列之间的最大匹配。用于确定同一性和相似性的方法被编入了公开可用的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux,J.,等人，NucleicAcids Research 12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。BLAST X程序可从NCBI和其他来源(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD20894；Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)公开获得。还可以使用众所周知的史密斯-沃特曼算法(Smith Watermanalgorithm)来确定同一性。

多肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：BLOSSUM62，来自Hentikoff和Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)；空位罚分：12；以及空位长度罚分：4。使用这些参数的可用程序可作为来自位于Madison,WI的Genetics Computer Group的“Ogap”程序公开获得。上述参数是用于氨基酸比较的默认参数(并且没有针对末端空位的罚分)。

用于核酸比较的优选参数包括以下：算法：Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，不匹配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3。可从位于Madison,Wis的Genetics Computer Group获得Gap程序。以上给出了用于核酸比较的默认参数。

任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，如本领域的技术人员应当清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是已去除了所公开序列中的至少一个残基并在所述至少一个残基的位置中插入不同残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：Ala至ser；Arg至lys；Asn至gln或his；Asp至glu；Cys至ser或ala；Gln至asn；Glu至asp；Gly至pro；His至asn或gln；Ile至leu或val；Leu至ile或val；Lys至arg；gln或glu；Met至leu或ile；Phe至met、leu或tyr；Ser至thr；Thr至ser；Trp至tyr；Tyr至trp或phe；以及Val至ile或leu。

根据本发明的多核苷酸由核苷酸序列表示。根据本发明的多肽由氨基酸序列表示。根据本发明的核酸构建体被定义为从天然存在的基因中分离的多核苷酸，或者经过修饰以含有多个多核苷酸分段(segment)的多核苷酸，所述多核苷酸分段以天然不存在的方式组合或并置。

本文提供的序列信息不应如此狭窄地解释为需要包含错误鉴定的碱基。技术人员能够辨别出这种错误鉴定的碱基并且知道如何校正这种错误。

本发明的所有实施方案，优选地指细胞，而不是指无细胞的体外系统；换句话说，根据本发明的系统优选是细胞系统，而不是无细胞的体外系统。

在本发明的所有实施方案中，例如，根据本发明的细胞可以是单倍体细胞、二倍体细胞或多倍体细胞。

根据本发明的细胞在本文中可互换地称为“细胞”、“根据本发明的细胞”、“宿主细胞”和“根据本发明的宿主细胞”；所述细胞可以是任何细胞，优选真菌，即酵母细胞或丝状真菌细胞。优选地，细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。所述与NHEJ相关的部件优选是酵母Ku70、Ku80、MRE11、RAD50、RAD51、RAD52、XRS2、SIR4和/或LIG4的同源物或直系同源物。或者，在根据本发明的细胞中，可以通过使用抑制RNA连接酶IV的化合物(诸如SCR7)来使NHEJ缺乏。缺乏在本文其他地方定义。

当根据本发明的细胞是酵母细胞时，优选的酵母细胞来自选自由以下项组成的组的属：Candida、Hansenula、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces、Yarrowia或Zygosaccharomyces；更优选地酵母宿主细胞选自由以下项组成的组：Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140、Kluyveromyces marxianus、Kluyveromyces、thermotolerans、Candida krusei、Candidasonorensis、Candida glabrata、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK113-7D、Schizosaccharomyces pombe、Hansenula polymorpha、Issatchenkiaorientalis、Yarrowia lipolytica、Yarrowia lipolytica CLIB122、Pichia stipidis和Pichia pastoris。

根据本发明的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞。如本文所定义的丝状真菌包括Eumycota亚门和Oomycota亚门的所有丝状形式(如由Hawksworth等人在Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995,CAB International,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义的)。

丝状真菌宿主细胞可以是分类单位Trichocomaceae的任何丝状形式的细胞(如由Houbraken和Samson在Studies in Mycology 70:1–51.2011中所定义的)。在另一个优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞可以是三个科Aspergillaceae、Thermoascaceae和Trichocomaceae中的任一科的任何丝状形式的细胞，所述三个科容纳在分类单位Trichocomaceae中。

丝状真菌的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、脱乙酰几丁质、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝伸长而实现的，并且碳分解代谢是专性好氧的。丝状真菌菌株包括但不限于以下菌株：Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mortierella、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium，以及Trichoderma。根据本发明的优选丝状真菌宿主细胞来自选自由以下项组成的组的属：Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium和Trichoderma；更优选地来自选自由以下项组成的组的物种：Aspergillus niger、Acremonium alabamense、Aspergillus awamori、Aspergillusfoetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Rasamsonia emersonii、Rasamsonia emersonii CBS393.64、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Fusarium oxysporum、Mortierella alpina、Mortierellaalpina ATCC 32222、Myceliophthora thermophila、Trichoderma reesei、Thielaviaterrestris、Penicillium chrysogenum和P.chrysogenum Wisconsin 54-1255(ATCC28089)；甚至更优选地，根据本发明的丝状真菌宿主细胞是Aspergillus niger。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时，宿主细胞优选是CBS 513.88、CBS124.903，或它们的衍生物。

丝状真菌的几种菌株对公众来说是易于在一些菌种保藏中心得到的，所述菌种保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、农业研究机构保藏中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection)、北方地区研究中心(Northern Regional Research Center)(NRRL)，以及全俄微生物保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences)(俄文缩写-VKM，英文缩写-RCM)莫斯科，俄罗斯。作为根据本发明的宿主细胞的优选菌株是Aspergillus niger CBS 513.88、CBS124.903，Aspergillus oryzae ATCC 20423、IFO4177、ATCC 1011、CBS205.89、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P.chrysogenum CBS 455.95、P.chrysogenum Wisconsin54-1255(ATCC28089)、Penicillium citrinum ATCC 38065、Penicillium chrysogenum P2、Thielaviaterrestris NRRL8126、Rasamsonia emersonii CBS393.64、Talaromyces emersonii CBS124.902、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC26921或ATCC 56765或ATCC 26921、Aspergillus sojae ATCC11906、Myceliophthorathermophila C1、Garg 27K、VKM-F 3500D、Chrysosporium lucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500 D、ATCC44006，以及它们的衍生物。

在本发明的实施方案中，宿主细胞可以是藻类、微藻类或海洋真核生物。宿主细胞可以是Labyrinthulomycetes宿主细胞，优选为Thraustochytriales目的宿主细胞，更优选地为Thraustochytriaceae科的宿主细胞，更优选地为选自由以下项组成的组的属的成员：Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Schizochytrium、Thraustochytrium和Ulkenia，甚至更优选地为Schizochytrium sp.ATCC#20888。

优选地，根据本发明的宿主细胞具有修饰，优选在其基因组中具有修饰，所述修饰导致如果与未修饰的亲本宿主细胞相比，当在相同的条件下进行分析时，如本文所定义的不需要的化合物的产生减少或不产生。

可以通过本领域的技术人员已知的任何方法引入修饰，所述方法诸如但不限于传统菌株改良、随机诱变，之后进行选择。也可以通过定点诱变来引入修饰。

修饰可以通过在多核苷酸序列中一个或多个核苷酸的引入(插入)、取代(置换)或去除(缺失)来完成。可以实现编码不需要的化合物(诸如多肽)的多核苷酸的完全或部分缺失。不需要的化合物可以是本文其他地方列出的任何不需要的化合物；它也可以是合成不需要的化合物(诸如代谢物)的生物学途径中的蛋白质和/或酶。或者，编码所述不需要的化合物的多核苷酸可以部分或完全地用不编码所述不需要的化合物的多核苷酸序列替换，或用编码所述不需要的化合物的部分或完全失活形式的多核苷酸序列替换。在另一个替代方案中，可以将一个或多个核苷酸插入编码所述不需要的化合物的多核苷酸中，以导致对所述多核苷酸的破坏，由此使由所述被破坏的多核苷酸编码的所述不需要的化合物部分或完全失活。

在一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞在其基因组中包含选自以下项的修饰：

a)完全或部分缺失编码不需要的化合物的多核苷酸，

b)用不编码不需要的化合物或编码所述不需要的化合物的部分或完全失活形式的多核苷酸序列完全或部分替代编码所述不需要的化合物的多核苷酸。

c)通过在多核苷酸序列中插入一个或多个核苷酸来破坏编码不需要的化合物的多核苷酸，由此通过所述被破坏的多核苷酸使所述不需要的化合物部分或完全失活。

该修饰可以例如在编码序列中或者在所述不需要的化合物的转录或翻译所需的调节元件中。例如，可以插入或去除核苷酸，以便导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或编码序列的开放阅读框的改变或移码。编码序列或其调节元件的修饰可以通过定点或随机诱变、DNA改组方法、DNA重组方法、基因合成(参见例如Young和Dong,(2004),NucleicAcids Research 32(7)或Gupta等人.(1968),Proc.Natl.Acad.Sci USA,60:1338-1344；Scarpulla等人.(1982),Anal.Biochem.121:356-365；Stemmer等人.(1995),Gene 164:49-53)，或根据本领域中已知的方法的PCR产生的诱变来实现。随机诱变程序的示例是本领域中熟知的，诸如化学(例如NTG)诱变或物理(例如UV)诱变。定点诱变程序的示例是QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems,La Jolla,CA)，‘TheAltered II体外诱变系统(The Altered II in vitro MutagenesisSystems)’(Promega Corporation)，或者通过使用如在Gene.1989年4月15日；77(1):51-9(Ho SN,Hunt HD,Horton RM,Pullen JK,Pease LR“Site-directed mutagenesis byoverlap extension using the polymerase chain reaction”)中描述的PCR或使用如在Molecular Biology:Current Innovations and Future Trends.(A.M.Griffin和H.G.Griffin编辑，ISBN 1-898486-01-8；1995Horizon Scientific Press,PO Box 1,Wymondham,Norfolk,U.K.)中描述的PCR进行重叠延伸。

优选的修饰方法基于重组遗传操纵技术，诸如部分或完全基因置换或部分或完全基因缺失。

例如，在置换多核苷酸、核酸构建体或表达盒的情况下，可以在待替换的靶基因座处引入合适的DNA序列。合适的DNA序列优选存在于克隆载体上。优选的整合克隆载体包含这样的DNA片段，所述DNA片段与待替换基因座侧翼的多核苷酸同源和/或具有与待替换基因座侧翼的多核苷酸的同源性，以靶向克隆载体到该预定基因座的整合。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前将克隆载体线性化。优选地，执行线性化，使得克隆载体的至少一个末端但优选任一末端侧接与待替换的DNA序列(或其侧翼序列)同源的序列。该过程被称为同源重组，并且该技术也可用于实现(部分)基因缺失。

例如，对应于内源多核苷酸的多核苷酸可以被缺陷多核苷酸取代，缺陷多核苷酸是不能产生(全功能)多肽的多核苷酸。通过同源重组，缺陷多核苷酸取代内源多核苷酸。可能需要缺陷多核苷酸也编码标记，所述标记可用于选择其中核酸序列经修饰的转化体。

替代地或与其他提及的技术组合，可以使用基于E.coli细胞中粘粒重组的技术，如A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungusAspergillus nidulans(2000)Chaveroche,M-K.,Ghico,J-M.和d’Enfert C；Nucleicacids Research，第28卷，no 22中所述。

或者，可以使用与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列，通过已建立的反义技术来执行修饰，在所述修饰中所述宿主细胞产生较少蛋白质或不产生蛋白质，所述蛋白质为诸如具有淀粉酶活性，优选如本文所述的α-淀粉酶活性并且由如本文所述的多核苷酸编码的多肽。更具体地，可以通过引入与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列来减少或消除宿主细胞对多核苷酸的表达，所述核苷酸序列可以在细胞中转录并且能够与细胞中产生的mRNA杂合。在允许互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译的蛋白质的量由此被减少或消除。表达反义RNA的示例显示于Appl.Environ.Microbiol.2000年2月；66(2):775-82中。(Characterization of a foldase,protein disulfide isomerase A,in theprotein secretory pathway of Aspergillus niger.Ngiam C,Jeenes DJ,Punt PJ,VanDen Hondel CA,Archer DB)或(Zrenner R,Willmitzer L,Sonnewald U.Analysis of theexpression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and itsinhibition by antisense RNA.Planta.(1993)；190(2):247-52.)

导致减少或不产生不需要的化合物的修饰优选是由于如果与未经修饰的亲本微生物宿主细胞相比并且在相同条件下测量时，编码所述不需要的化合物的mRNA的产生减少。

可以通过RNA干扰(RNAi)技术(Mouyna等人，2004)获得导致从编码不需要的化合物的多核苷酸转录的mRNA量减少的修饰。在该方法中，将表达受影响的核苷酸序列的相同有义和反义部分克隆到彼此后面，中间具有核苷酸间隔区，并插入表达载体中。在转录此类分子后，小核苷酸片段的形成将导致有待被影响的mRNA的靶向降解。特定mRNA的消除可以是不同程度的。RNA干扰技术描述于例如WO2008/053019、WO2005/05672A1和WO2005/026356A1中。

可以通过不同的方法获得导致不需要的化合物的产生减少或不产生的修饰，例如通过针对这种不需要的化合物的抗体或化学抑制剂或蛋白质抑制剂或物理抑制剂(TourO.等人，(2003)Nat.Biotech:Genetically targeted chromophore-assisted lightinactivation.第21卷.no.12:1505-1508)或肽抑制剂或反义分子或RNAi分子(R.S.Kamath_等人，(2003)Nature:Systematic functional analysis of theCaenorhabditis elegans genome using RNAi.第421卷，231-237)。

除了上述技术之外或作为替代方案，还可以抑制不需要的化合物的活性，或者借助于替代信号序列(Ramon de Lucas,J.,Martinez O,Perez P.,Isabel Lopez,M.,Valenciano,S.和Laborda,F.The Aspergillus nidulans carnitine carrier encodedby the acuH gene is exclusively located in the mitochondria.FEMS MicrobiolLett.2001年7月24日；201(2):193-8.)或驻留信号(Derkx,P.M.和Madrid,S.M.Thefoldase CYPB is a component of the secretory pathway of Aspergillus niger andcontains the endoplasmic reticulum retention signalHEEL.Mol.Genet.Genomics.2001年12月；266(4):537-545)来重新定位不需要的化合物(诸如蛋白质)，或者通过将不需要的化合物如多肽靶向过氧化物酶体，所述过氧化物酶体能够与细胞分泌途径中涉及的细胞膜结构融合，从而导致多肽在细胞外分泌(例如，如在WO2006/040340中所述)。

可替代地或与上述技术组合，也可以获得不需要的化合物减少产生或不产生，例如通过UV诱变或化学诱变(Mattern,I.E.,van Noort J.M.,van den Berg,P.,Archer,D.B.,Roberts,I.N.和van den Hondel,C.A.,Isolation and characterization ofmutants of Aspergillus niger deficient in extracellular proteases.Mol GenGenet.1992年8月；234(2):332-6.)或者通过使用如本文所述的抑制不需要的多肽的酶活性的抑制剂(例如，野尻霉素，其用作β-葡糖苷酶的抑制剂(Carrel F.L.Y.和CanevasciniG.Canadian Journal of Microbiology(1991)37(6):459-464；Reese E.T.,Parrish F.W.和Ettlinger M.Carbohydrate Research(1971)381-388))。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞的基因组中的修饰是编码不需要的化合物的多核苷酸的至少一个位置中的修饰。

缺乏化合物(例如不需要的化合物，诸如不需要的多肽和/或酶)产生的细胞在本文中定义为突变的微生物宿主细胞，其已被修饰，优选地在其基因组中已被修饰，以导致表型特征，其中所述细胞：a)产生较少的不需要的化合物或基本上不产生任何不需要的化合物，和/或b)产生当在相同条件下分析时，与未修饰的亲本宿主细胞相比，具有降低的活性或降低的比活性的不需要的化合物或不具有活性或没有特定活性的不需要的化合物，以及这些可能性中的一种或多种的组合。

优选地，如果与未修饰的亲本宿主细胞相比并且当在相同条件下进行测量时，根据本发明的经修饰的宿主细胞产生少1％的不需要的化合物，至少少5％的不需要的化合物，至少少10％的不需要的化合物，至少少20％的不需要的化合物，至少少30％的不需要的化合物，至少少40％的不需要的化合物，至少少50％的不需要的化合物，至少少60％的不需要的化合物，至少少70％的不需要的化合物，至少少80％的不需要的化合物，至少少90％的不需要的化合物，至少少91％的不需要的化合物，至少少92％的不需要的化合物，至少少93％的不需要的化合物，至少少94％的不需要的化合物，至少少95％的不需要的化合物，至少少96％的不需要的化合物，至少少97％的不需要的化合物，至少少98％的不需要的化合物，至少少99％的不需要的化合物，至少少99.9％的不需要的化合物，或最优选少100％的不需要的化合物。

本文对作为现有技术给出的专利文件或其他事项的引用不应被视为承认该文件或事项是已知的，或者该文件或事项所包含的信息在任何权利要求的优先权日时是普通常识的一部分。

本文提供的序列信息不应如此狭窄地解释为需要包含错误鉴定的碱基。技术人员能够辨别出这种错误鉴定的碱基并且知道如何校正这种错误。

本文阐述的每个参考文献的公开内容全文以引用方式并入本文。

通过以下实施例来进一步说明本发明：

实施例

在以下实施例中，说明了本发明的各种实施方案。从以上描述和这些实施例，本领域的技术人员可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。

为了使用RNA指导的CRISPR/Cas9系统在细胞中实现基因组精密工程化，应当在细胞内同时表达主要部件Cas9蛋白和crRNA-tracrRNA融合转录物(称为指导RNA或gRNA)。类似地，为了实现表达调节，诸如通过CRISPR干扰(CRISPRi)实现表达调节，dCas9蛋白必须与gRNA同时表达(Qi等人，2013)。CRISPR/Cas系统的其他用途还需要同时表达Cas9(或Cas9的变体)和gRNA。以类似的方式，对于其他RNA指导的内切核酸酶，指导Cpf1和对应的crRNA或crRNA阵列(Zetsche等人，2015)。

实施例1：构建dCas9/SNR52启动子/T7启动子–T7RNA聚合酶测试菌株和gRNA表达载体

用于所有实验的亲本测试菌株是CEN.PK113-7D(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1MAL2-8 SUC2)。菌株CEN.PK113-7D可从EUROSCARF保藏中心(www.euroscarf.de，德国法兰克福)或从Centraal Bureau voor Schimmelcultures(荷兰乌得勒支，保藏号CBS 8340)获得。CEN.PK科菌株的起源由van Dijken等人，2000描述。通过转化下述表达构建体来构建测试菌株AG1和AG2，所述表达构建体通过PCR扩增并体内装配在Saccharomyces cerevisiae中(在下面详细描述)。在INT1基因座(位于染色体XV上的NTR1(YOR071c)和GYP1(YOR070c)之间的非编码区处)处执行DNA到基因组中的整合。通过在AG1和AF2测试菌株中转化PCR片段来体内装配所有gRNA表达载体，从而产生指导RNA表达载体pRN1120-AG1和pAG701。

通过体内装配到基因组DNA中来整合表达元件

使用PCR产生三个线性片段，将所述三个线性片段在体内组装并整合到菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA中，从而产生测试菌株AG1和AG2。设计引物以产生与相邻区段和5'和3'接头序列的约50bp重叠，所述重叠与INT1基因座具有同源性。5’片段的正向PCR引物和反向PCR引物显示在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中，而3’片段的正向PCR引物和反向PCR引物显示在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4中。高度同源(约50bp重叠)区段和DNA侧翼序列的存在允许通过体内同源重组(空位修复，Orr-Weaver等人，1983)在所需的位置处和以所需的顺序进入基因组DNA中而装配成一段DNA。

根据制造商的说明书使用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)产生供体DNA表达盒序列的PCR片段。根据制造商的说明，使用DNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒(由荷兰莱顿Baseclear Lab Products分销)纯化所有PCR片段。使用基因组DNA(使用醋酸锂SDS方法(等人，2011)从酵母菌株CEN.PK113-7D分离)作为模板，通过PCR产生5'片段和3'片段。

菌株说明

存在于菌株AG1中的DNA序列在图1中图示，并且在体内装配到菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA中后获得的最终DNA序列在SEQ ID NO:5中提供。菌株AG1组成型地表达GFP。驱动GFP表达的启动子是来自Saccharomyces bayanus的TDH3启动子(SbTDH3)。菌株AG1从半乳糖诱导型启动子(GAL1p)表达dCas9-Mxi1。dCas9-Mxi1的核苷酸序列获取自Gilbert等人，2013。菌株AG1含有潮霉素选择性标记，所述潮霉素选择性标记最初用于选择正确装配的菌株；然而，在实施例2中描述的抑制测定中未使用潮霉素进行选择。

存在于菌株AG2中的DNA序列在图2中图示，并且在体内装配到菌株CEN.PK113-7D的基因组DNA中后获得的最终DNA序列在SEQ ID NO:6中提供。菌株AG2组成型地表达GFP。驱动GFP表达的启动子是来自Saccharomyces bayanus的TDH3启动子(SbTDH3)。菌株AG2从半乳糖诱导型启动子(GAL1p)表达dCas9-Mxi1和T7-RNAp。两种编码序列dCas9-Mxi1和T7RNA聚合酶(T7-RNAp)由病毒T2A序列分开，所述病毒T2A序列使得能够从单个启动子共表达多种蛋白质。T2A序列来源于Thosea asigna病毒。据说提高切割效率的氨基酸SGS(Kim等人，2011)不是由本实施例中使用的T2A核苷酸序列编码的。dCas9-Mxi1的核苷酸序列获取自Gilbert等人，2013。从来自New England Biolabs的Escherichia coli BL21-DE3菌株(产品ID：C2527I)中直接PCR扩增T7-RNAp核苷酸序列。菌株AG2含有潮霉素选择性标记，所述潮霉素选择性标记最初用于选择正确装配的菌株；然而，在实施例2和实施例3中描述的抑制测定中未使用潮霉素进行选择。

载体说明

用于AG1菌株中的实验的亲本载体是pRN1120-AG1(SEQ ID NO:7，图3)，其含有2微米酵母复制起点和NatMX抗生素选择性标记。载体还含有指导RNA表达盒，所述指导RNA表达盒由以下项组成：SNR52启动子；靶向用于在AG1菌株中进行组成型GFP表达的所述SbTDH3启动子的指导序列；指导RNA结构部件；以及SUP4终止子，如在DiCarlo等人，2013中所述。

用于AG2菌株中的实验的亲本载体是pAG701(SEQ ID NO:8，图4)，其含有2微米酵母复制起点和NatMX抗生素选择性标记。通过用T7启动子替代来自pRN1120-AG1的SNR52启动子，来构建T7启动子gRNA表达载体。用丁型肝炎病毒核酶(HDVr)和T7终止子替代SUP4终止子，产生载体pAG701。HDVr是一种自切割的RNA元件，其可校正由弱终止引起的连缀(run-on)转录形式T7(Szafraniec等人，2012)。指导序列和指导RNA结构部件保持完整。gRNA靶向用于在菌株AG2中进行组成型GFP表达的SbTDH3启动子。

使用PCR构建所有gRNA表达载体以产生线性DNA片段并在Saccharomycescerevisiae中体内组装(如下所述)。

为了测试抑制效率，使用因特网上的gRNA设计工具(benchling.com)来设计靶向(SbTDH3)启动子的gRNA(SEQ ID NO:9)。将所有抑制结果归一化为靶向在酵母基因组中未发现的随机20nt DNA序列的乱序gRNA(SEQ ID NO：10)。

体内载体装配

使用PCR来产生载体区段的线性片段。使用引发与相邻区段的50bp重叠的引物来执行PCR。当被转化时，所述区段通过体内同源重组(空位修复，Orr-Weaver等人，1983)而装配到环状载体中，这允许对转化体进行诺尔丝菌素选择。

T7gRNA转录单位(SEQ ID NO：8的一部分)是作为合成DNA盒(gBlock)在比利时鲁汶的Integrated DNA Technologies订购的。该盒含有与亲本载体的50bp的同源性，其在没有SNR52启动子的情况下进行PCR扩增，并通过体内重组而装配在酵母中。将载体pRN1120-AG1装配所需的线性DNA片段转化到测试菌株AG1中。将载体pAG701装配所需的线性DNA片段转化到测试菌株AG2中。

转化条件

使用LiAc/鲑鱼精子(SS)载体DNA/PEG方法(Gietz和Woods，2002)将载体骨架和线性DNA区段(用于整合到基因组DNA中或装配到载体中)转化到S.cerevisiae菌株CEN-PK1137D中。在转化混合物中，使用等摩尔浓度的每个DNA区段(归一化为1微克反应中使用的最短DNA区段)。将转化混合物接种在YPD-琼脂(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、20克/升琼脂)上。为了构建菌株AG1和AG2，将200微克/ml的潮霉素(SigmaAldrich，荷兰Zwijndrecht)加入到所述YPD-琼脂中。为了进行酵母体内载体装配，将100微克/ml诺尔丝菌素(Sigma Aldrich，荷兰Zwijndrecht)加入所述琼脂中。在30℃下生长三到四天后，在转化平板上出现菌落。

实施例2：T7产生的gRNA的效能

抑制测定

用线性DNA片段转化菌株AG1和AG2，以允许体内装配以产生载体pRN1120-AG1(图3)和pAG701(图4)。挑取来自转化平板的三个菌落，并在补充有诺尔丝菌素选择(100微克/ml)的5ml YPD培养基(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖)中培养16小时。随后将培养物以1/200稀释到含有2％半乳糖(Sigma Aldrich，荷兰Zwijndrecht)、补充有诺尔丝菌素选择(100微克/ml)的YEP培养基(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨)中，以诱导AG1转化体中dCas9-Mxi1的表达和AG2转化体中dCas9-Mxi1和T7-RNA聚合酶(T7-RNAp)的表达。

在半乳糖培养基上生长20小时后，将细胞以1/20稀释到无菌水中。将稀释的培养物在Tecan F200平板读数器(Tecan Trading AG，瑞士)上运行以定量GFP荧光(激发480nm，发射515nm)和OD600。还将稀释的培养物在MACSQuant VYB流式细胞仪(德国MiltenyiBiotec)上运行以基于每个细胞定量GFP荧光并观察细胞群分布。

为了显示与SNR52产生的gRNA相比T7产生的gRNA的功能性，我们直接比较GFP荧光，作为dCas9-Mxi1活性的量度。如实施例1中所述，将载体pRN1120-AG1体内装配在菌株AG1中，在所述载体pRN1120-AG1中靶向SbTDH3启动子的gRNA从SNR52启动子表达。如实施例1中所述，将载体pAG701体内装配在菌株AG2中，在所述载体pAG701中靶向SbTDH3启动子上的相同位点的gRNA(在SEQ ID NO:9中指示的指导序列)从T7启动子表达。将用于SNR52系统和T7系统的乱序gRNA载体体内装配在适当的菌株中以进行抑制归一化。乱序的gRNA载体是菌株上的载体维持负荷和启动子负荷的对照，因为乱序的gRNA(SEQ ID NO：10中所示的指导序列)将在细胞中产生，但将不会靶向驱动GFP表达的SbTDH3启动子。

对所测试的每种载体的抑制倍数(使用流式细胞术数据计算)示出于图5中。两种测试菌株AG1和AG2的乱序对照以相同水平表达GFP。通过使用不同的gRNA生产方法靶向驱动GFP表达的启动子上的相同位置而实现的抑制倍数是几乎相同的。抑制倍数是通过将靶向菌株的几何平均值除以相应的乱序菌株的几何平均值来计算的。

结果表明，在该系统中可以使用用于表达指导RNA的SNR52启动子来抑制GFP表达。此外，结果表明使用T7启动子诱导指导RNA的表达也导致使用上述系统抑制GFP信号，表明用于表达指导RNA的T7RNA聚合酶和T7启动子在S.cerevisiae中起作用。

图6示出了所有菌株之间的生长差异。T7-RNAp的表达对细胞生长没有影响。与乱序gRNA(其靶向随机序列)相比，靶向gRNA的表达也对生长没有影响。

图7示出了通过流式细胞术测定的与SNR52乱序菌株相比，靶向SbTDH3启动子的SNR52产生的gRNA的菌株的细胞群。两种细胞群都是单峰的(关于每个细胞群观察到单个峰)，表明了菌株和载体稳定性。

图8示出了与T7产生的乱序菌株相比，靶向SbTDH3启动子的T7产生的gRNA的菌株的细胞群(流式细胞术)。两种细胞群都是单峰的，表明了菌株和载体稳定性。

实施例3：调节T7产生的gRNA的表达

如在E.coli中所表征的(Jones等人，2015)，使用不同强度的T7启动子来表达gRNA，并且定量化所得到的GFP基因敲低水平。使用具有高、中和低转录率的三种不同T7启动子(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13)，替代在SEQ ID NO:8中以粗体表示的T7启动子序列。所述T7启动子相差3-5bp。

如实施例1中所述，将允许体内装配到功能性载体中的不同PCR片段转化到菌株AG2中，得到载体pAG701的变体(图4，SEQ ID NO:8)，其中T7启动子被在SEQ ID NO:11、SEQID NO:12和SEQ ID NO:13中指示的序列替代。使三个单独的转化体生长，并如实施例2中的抑制测定所述分析GFP表达。

图9中示出的结果表明，当用于在S.cerevisiae中表达gRNA时，如在E.coli中所表征的(Jones等人，2015)的T7启动子强度与靶基因抑制相关。将所有抑制结果归一化为从靶向随机20nt DNA序列的强T7启动子表达的乱序gRNA(在SEQ ID NO:10中指示的指导序列)。结果表明，不同强度的T7启动子可用于在S.cerevisiae中进行指导RNA的功能性表达以及T7RNA聚合酶的表达。

通过构建简并碱基文库(Temme等人，2012)或选择预先表征的T7启动子来调谐T7启动子强度的简易性和多功能性允许通过调控gRNA表达水平进行精确的基因表达调谐/调节。如果与Cas9核酸酶一起使用，本发明可以在代谢途径优化和基因组编辑中具有应用。

实施例4：在S.cerevisiae中在T7启动子控制下的指导RNA的功能性

该实施例描述了当使用T7表达系统进行指导RNA表达时，S.cerevisiae中CRISPRCas系统的功能性。通过转化包含在T7启动子控制下的指导RNA盒的PCR片段，而在体内装配所有gRNA表达载体。将其中预表达Cas9以及T7RNAP的S.cerevisiae菌株CSN007和CSN008用于转化，从而用于评估T7表达系统的用于指导RNA表达的功能性。

构建表达Cas9和T7 RNAP的Saccharomyces cerevisiae菌株CSN007和CSN008

酵母载体pCSN061是单拷贝载体(CEN/ARS)，其含有CAS9表达盒和赋予G418抗性的功能性KanMX标记盒，所述CAS9表达盒由从Kl11启动子(KLLA0F20031g的Kluyveromyceslactis启动子)和S.cerevisiae GND2终止子表达的CAS9密码子优化变体组成。将CAS9表达盒通过KpnI/NotI连接到pRS414(Sikorski和Hieter，1989)，得到中间载体pCSN004。随后，将赋予G418抗性的功能性表达盒(参见http://www.euroscarf.de)从载体pUG7-KanMX进行NotI限制性切割，并且通过NotI连接到pCSN004，产生在图10中示出并且序列在SEQ ID NO:15中列出的载体pCSN061。

将含有Cas9表达盒的载体pCSN061进行SpeI/SacII限制性切割，并将100ng线性化的pCSN061载体与105ng的T7RNAP表达盒(SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18)转化到S.cerevisiae菌株CEN.PK113-7D(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8 SUC2)中。T7 RNAP表达盒作为合成DNA订购(在DNA2.0,Menlo Park,CA,USA订购)，并且包含密码子对优化的T7RNAP ORF(SEQ ID NO:19)以在Ptdh3(SEQ ID NO:20)或PenoI(SEQ ID NO:21)的控制下在S.cerevisiae中表达，以实现T7RNAP基因的高或中等表达水平。为了结束基因的转录，将TenoI终止子(SEQ ID NO:22)置于终止密码子之后。T7RNAP表达盒以在5'侧上与线性pCSN061的64bp同源性侧接于5'侧上，并且以与线性pCSN061的59bp同源性侧接在3'侧上，以通过体内同源重组(空位修复，Orr-Weaver等人，1983)装配成环状载体pCSN070或pCSN071。使用的转化方法是LiAc/鲑鱼精子(SS)载体DNA/PEG方法(Gietz和Woods，2002)，并在每毫升含200微克(μg)G418(Sigma Aldrich，荷兰Zwijndrecht)的YPD琼脂(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、20克/升琼脂)上选择转化体。在30℃下生长二到四天后，在转化平板上出现了转化体。在得到的转化体中，通过PCR测试8个菌落，以便在pCSN061质粒骨架中正确装配T7RNAP表达盒。如等人，2011所述地分离出转化体的总DNA，并在PCR反应中用作模板。用于确认pCSN061质粒骨架向T7RNAP转换的引物是用于T7RNAP表达盒到pCSN061骨架中的5’转换的SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24以及用于T7RNAP表达盒到pCSN061骨架中的3’转换的SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。根据制造商的说明和本领域的技术人员已知的PCR程序，使用MyTaqTM Red Mix(Catno BIO-25044,Bioline德国)执行PCR反应。5'转换934bp和3'转换467bp的片段证明了装配正确。使用1x TAE缓冲液(50x TAE(Tris/乙酸/EDTA)，1升，产品目录号1610743,BioRad，荷兰)和520-Nancy(产品目录号01494，Sigma Aldrich，德国)在0.8％琼脂糖凝胶上分析所得的PCR片段，以对dsDNA进行染色。

在测试T7RNAP表达盒在pCSN061骨架中正确装配的8个转化体中，在PenoI-T7RNAP-TenoI装配的情况下100％是正确的，并且在Ptdh3-T7RNAP-TenoI装配的情况下87.5％是正确的。

确认存在T7RNAP的转化体在Ptdh3控制的T7RNAP表达(质粒pCSN070，SEQ ID NO：27)的情况下被指定为CSN007，并且在PenoI控制的T7RNAP表达(质粒pCSN071，SEQ ID NO：28)的情况下被指定为CSN008。

菌株CSN007和CSN008用于转化以评估T7系统用于在CRISPR Cas系统中表达指导RNA的功能性。

T7控制的指导RNA表达盒

T7启动子指导RNA表达盒是作为合成DNA(gBlocks)在Integrated DNATechnologies(IDT,Leuven,Belgium)订购的，包括与pRN1120在5'侧和3'侧上的同源性以用于体内装配。表1中提供了序列的概述。T7启动子指导RNA由T7启动子、指导序列(也称为基因组靶序列；SEQ ID NO:29)、gRNA结构部件DiCarlo等人，2013(SEQ ID NO:61)和丁型肝炎病毒核酶(HDVr)(SEQ ID NO:30)以及T7终止子(SEQ ID NO:31)组成。HDVr是一种自切割的RNA元件，其可校正由弱终止引起的连缀转录形式T7(Szafraniec等人，2012)。对于指导RNA表达，测试具有可变强度的一组T7启动子，弱T7启动子具有SEQ ID NO:32，中和强T7启动子分别呈现在SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34中。野生型T7启动子也包括在所述一组测试的T7启动子中，并具有SEQ ID NO:35。

INT1基因座被所有4个指导RNA盒靶向，以用于整合供体YFP表达盒/ds断裂。INT1整合位点位于染色体XV上的NTR1(YOR071c)和GYP1(YOR070c)之间的非编码区中。

为获得用于转化的T7控制的指导RNA表达盒而进行的PCR反应的概述示于表1中。根据供应商的说明书和本领域的技术人员已知的PCR程序，使用PrimeStar GXL DNA聚合酶(Takara/产品目录号R050A)进行PCR反应。根据制造商的说明，使用NucleoSpin Gel和PCRClean-up试剂盒(Machery-Nagel，由荷兰莱顿Bioké分销)纯化产生的T7控制的指导RNA表达盒PCR片段。随后，使用NanoDrop(ND-1000分光光度计，Thermo Scientific，荷兰Bleiswijk)测量纯化的T7控制的指导RNA片段的DNA浓度。

表1.用于转化的T7控制的指导RNA序列的序列概述。使用在表1中指示的引物，将在IDT(比利时鲁汶)订购的gBlock用作PCR的模板，以获得用于转化实验的T7控制的指导RNA片段。

pRN1120载体构建(多拷贝表达载体，NatMX标记)

酵母载体pRN1120是多拷贝载体(2微米)，其含有赋予诺尔丝菌素抗性的功能性NatMX标记盒。该载体的骨架基于pRS305(Sikorski和Hieter，1989)，并包括功能性2微米ORI序列和功能性NatMX标记盒(参见http://www.euroscarf.de)。载体pRN1120如图11所示，并且序列如SEQ ID NO:16所示。

整合位点

INT1整合位点位于染色体XV上的NTR1(YOR071c)和GYP1(YOR070c)之间的非编码区中。

100bp ssODN侧翼序列

为了靶向供体YFP表达盒(SEQ ID NO:46)的整合，在转化中提供所谓的100bp的侧翼。这些左侧翼(LF)和右侧翼(RF)序列与YFP供体盒的5'-末端和3'-末端具有50bp的同源性，并且与基因组具有50bp的同源性。100bp侧翼中的每一者由2个互补的单链DNA(ssODN)片段组成。LF由SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:47组成并且RF由SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49组成。通过整合YFP盒的整合，在INT1基因座处敲除一段1kbp的基因组DNA。

500bp双链侧翼序列

为了靶向供体YFP表达盒(SEQ ID NO:50)的整合，在转化中提供所谓的577或581bp的侧翼。这些左侧翼(LF)和右侧翼(RF)序列与YFP供体盒的5'-末端和3'-末端具有50bp的同源性，并且与基因组具有527bp(LF)和531bp(RF)的同源性。使用CEN.PK113-7D的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增这些侧翼，所述CEN.PK113-7D的基因组DNA是如等人，2011所述地分离的。使用引物组SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52扩增LF，从而产生577bp片段(SEQ ID NO:53)。使用引物组SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55扩增RF，从而产生581bp片段(SEQ ID NO:56)。

根据供应商的说明书和本领域的技术人员已知的PCR程序，使用PrimeStar GXLDNA聚合酶(Takara/产品目录号R050A)进行PCR反应。根据制造商的说明，使用NucleoSpinGel和PCR Clean-up试剂盒(Machery-Nagel，由荷兰莱顿Bioké分销)纯化LF PCR片段和RFPCR片段。通过整合YFP盒，在INT1基因座处敲除一段1kbp的基因组DNA。

具有50bp接头侧翼的双链DNA(ds-DNA)供体YFP表达盒

经由适当E.coli载体中的单独启动子(P)、orf(O)和终止子(T)序列的Golden-Gate装配反应，来制备编码黄色荧光蛋白(YFP)变体Venus(Nagai等人，2002)的双链供体DNA盒。经由PCR反应用SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58中所示的引物扩增装配的POT盒。在第二PCR中，使用SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60中所示的引物组加入50bp接头序列。这产生了这样的YFP表达盒，所述YFP表达盒在所述表达盒(SEQ ID NO:50)的5'末端和3'末端包含50bp接头序列。在PCR反应中使用Q5DNA聚合酶(High-Fidelity 2X Master Mix的一部分,New England Biolabs，由荷兰莱顿Bioké供应，产品目录号M0492S)，所述PCR反应是根据制造商的说明书执行的。根据制造商的说明，使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up试剂盒(Machery-Nagel，由荷兰莱顿Bioké分销)纯化PCR片段。

DNA浓度

使用NanoDrop装置(ThermoFisher,Life Technologies，荷兰Bleiswijk)测定所有DNA浓度、侧翼(LF和RF)，包括指导RNA表达盒PCR片段和pRN1120，以提供以纳克/微升计的浓度。基于这些测量，在转化实验中使用1μg T7控制的指导RNA片段、100ng EcoRI/XhoI限制性pRN1120、100ng YFP供体表达盒和2x 100ng侧翼(长)或4x50ng侧翼(100bp侧翼)的量。

酵母转化

将预先表达CAS9和T7RNAP的菌株CSN007和CSN008接种在YPD-G418培养基(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、200微克(μg)/毫升G418(Sigma Aldrich，荷兰Zwijndrecht))中。随后，用如表2所示的1μg T7指导RNA盒、100ng XhoI/EcoRI限制性pRN1120、100ng各个侧翼(LF和RF)和100ng YFP表达盒供体，使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法(Gietz和Woods，2002)来转化菌株CSN007和CSN008。除了作为单次测量进行的对照之外，所有转化一式三份执行。将转化混合物接种在在每毫升含有200μg诺尔丝菌素(NTC,JenaBioscience,德国)和200μg G418(Sigma Aldrich,Zwijndrecht,荷兰)的YPD-琼脂(10克/升酵母提取物、20克/升蛋白胨、20克/升葡萄糖、20克/升琼脂)上。将平板在30摄氏度温育，直至菌落出现在平板上。

表2.用于转化的T7控制的指导RNA的概述

结果

进行上表2中概述的转化实验，并且在转化后，将细胞置于YPD选择性平板上。为了证实YFP表达盒供体在INT1处的整合，在Qpix450上分析每次转化的转化体的YFP荧光。

表3.通过Qpix450进行的转化体分析的概述

转化结果表明，当指导RNA在T7启动子的控制下表达时，CRISPR Cas系统增强了YFP表达供体盒的整合。野生型T7启动子在所测试的T7启动子组中是最有效的，在此对于YFP盒的整合具有45％的最大编辑频率。当T7RNAP以更高水平表达(在Ptdh3的控制下，菌株CSN007)时，获得了更高水平的YFP盒整合。以上结果证明了T7系统在S.cerevisiae中进行指导RNA表达的功能性。

实施例5：使用具有T7启动子部分A的sgRNA表达盒在Aspergillus niger中表达sgRNA

该实施例描述了使用CAS9与单指导RNA(sgRNA)表达盒前面的T7启动子与供体DNA的组合，来破坏A.niger基因组DNA中的fnwA基因座。具有fwnA基因突变的菌株将在孢子中具有从黑色到浅黄褐色的颜色变化(等人，2011)。

供体DNA

在IDT(基因片段，Integrated DNA Technologies,Inc)合成gBlock片段，其含有用于所需突变的供体DNA(SEQ ID NO:62)。用Invitrogen的Zero Blunt TOPOPCR克隆试剂盒将该DNA克隆到TOPO Zero Blunt载体中，并命名为TOPO供体DNA fwnA(SEQID NO:63)。TOPO供体DNA fwnA的质粒图谱如图14所示。根据标准PCR方案，用Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)，使用如SEQ ID NO:64中所示的正向引物和如SEQ ID NO:65中所示的反向引物，对来自TOPO载体的供体DNA进行PCR扩增。根据制造商的说明书，用来自Macherey Nagel的PCR纯化试剂盒纯化PCR片段。使用NanoDrop(ND-1000分光光度计，Thermo Scientific)来测量DNA浓度。

构建BG-AMA17质粒

使用如SEQ ID NO:66中所示的正向引物和如SEQ ID NO:67中所示的反向引物，执行Cas9表达盒的PCR扩增(在WO2016110453A1中描述了BG-C20Cas9表达盒的构建)。两种引物均含有具有KpnI限制性位点的侧翼。根据制造商的说明书，用来自Macherey Nagel的PCR纯化试剂盒(由荷兰莱顿Bioké分销)纯化PCR产物。使用NanoDrop(ND-1000分光光度计，Thermo Fisher Scientific)测量DNA浓度。

将骨架载体BG-AMA8(在WO2016110453A1中描述)和所获得的带有侧接KpnI的Cas9表达盒的PCR片段用KpnI(NEB酶)消化，并用来自Macherey Nagel的PCR纯化试剂盒(由荷兰莱顿Bioké分销)纯化。根据制造商的说明书，用T4连接(Invitrogen)将消化的BG-AMA8骨架载体和Cas9盒PCR产物进行连接。根据制造商的说明书，将连接混合物转化到ccdB抗性E.coli细胞(Invitrogen)中。用限制酶分析检查几个克隆，并将具有正确限制性模式的克隆命名为BG-AMA17(SEQ ID NO:68)。图15中提供了BG-AMA17的质粒图谱。质粒BG-AMA17含有从启动子和终止子表达的Cas9表达盒、dsRED盒，以及用于在A.niger中进行选择的HygB标记。

构建质粒BG-AMA18和BG-AMA19

在IDT(基因片段，Integrated DNA Technologies,Inc)合成gBlock片段，其含有靶向具有T7wt启动子(SEQ ID NO:69)和T7强启动子(SEQ ID NO:70)的fwnA的T7sgRNA表达盒。用Invitrogen的Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒将这些DNA片段克隆到TOPO Zero Blunt载体中。使用Golden Gate反应(根据专利申请WO2013/144257中的实施例1)将构建的TOPO DNA载体克隆到接收骨架载体BG-AMA17中。这产生了具有T7wt启动子的命名为BG-AMA18的载体→(SEQ ID NO:71)和具有T7强启动子的命名为BG-AMA19的载体→(SEQ ID NO:72)。通过E.coli菌落PCR检查BG-AMA18和BG-AMA19载体，以检查克隆的sgRNAfwnA盒的大小。根据标准PCR方案，使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)，使用如SEQID NO:73中所示的正向引物和如SEQ ID NO:74中所示的反向引物来进行PCR。BG-AMA18和BG-AMA19的质粒图谱示出于图16和图17中。

菌株

在该实施例中，在转化实验中使用Aspergillus niger菌株GBA 302(ΔglaA、ΔpepA、ΔhdfA)。GBA 302的构建描述于专利申请WO2011/009700中。

转化

除了在转化混合物中使用ATA(金精三羧酸＝核酸酶抑制剂)之外，如专利申请WO1999/32617和WO1998/46772中所述进行原生质体转化。

转化中使用的AMA载体(1.5μg/转化)：

1.AMA载体BG-AMA17(SEQ ID NO:68；图15)→AMA hygB/Cas9

2.AMA载体BG-AMA18(SEQ ID NO:71；图16)→AMA hygB/Cas9/T7WT sgRNA盒

3.AMA载体BG-AMA19(SEQ ID NO:72；图17)→AMA hygB/Cas9/T7强sgRNA盒

表4示出了在每次单独转化中转化到菌株GBA 302的DNA的具体量。

表4：所执行的转化的概述。执行到菌株GBA 302的转化。使用不同的AMA质粒作为环状质粒。作为供体DNA，含有所需突变的PCR片段包括在一些转化中，如下表所示。总共进行6次转化。

转化后，将原生质体接种在含有60μg/ml潮霉素B(Invitrogen)的再生培养基平板上。将所有平板在30℃下孵育4-6天。

转化结果可见于表5。

表5：6次转化实验的结果，其中含有fwnA表型的转化体的数目/获得的转化体的总数，以及在转化体的总数中鉴定的含有fwnA表型的浅黄色菌落的百分比。

对来自所有转化平板的转化体进行计数，并对fwnA突变的浅黄褐色孢子表型特征进行评分。

在没有供体DNA的所有转化中(转化编号1、3和4)，没有获得浅黄褐色的转化体。在没有sgRNA盒的转化2中，也没有获得浅黄褐色的转化体。

在转化5和6中(GBA 302、Cas9、sgRNA→WT或强T7启动子在sgRNA前面，并且具有供体DNA)，13％-10％的转化体具有fwnA表型。

当比较转化2与5和6时，唯一的区别是AMA质粒中存在T7sgRNA盒。似乎A.niger能够在sgRNA前面诱导T7启动子，所述T7启动子与Cas9和供体DNA一起引起一些转化体(13％-10％的转化体)的浅黄褐色着色。

当将转化5(T7wt sgRNA)与6(T7强sgRNA)进行比较时，获得相等百分比的浅黄褐色着色。

用于产生用于测序的DNA片段的菌落PCR

将转化体5和6的孢子接种在PDA平板(Difco)上，并在30℃下在培养箱中孵育2-3天。对于每个测试的菌落，用接种环取菌落样品并置于Eppendorf杯中的25μl Glucanex^TM溶液(50mg/ml Glucanex^TM溶解于KC缓冲液(60g/l KCl、2g/l柠檬酸，用KOH/HCl调节至pH6.2))中。在37℃孵育1小时后，向每个杯中加入75μl DNA稀释缓冲液，然后在具有加热盖的PCR设备中煮沸5分钟。煮沸后，加入100μl millQ水，并通过上下吹打三次非常温和地进行混合。随后，从溶液顶部小心移取5μl染色体DNA模板，并加入每次反应的PCR混合物中(不从底部移取以免吸取到细胞碎片)。根据标准PCR方案，使用Phusion聚合酶(New EnglandBiolabs)，通过使用如SEQ ID NO:75中所示的正向引物和如SEQ ID NO:76中所示的反向引物来执行PCR反应，从而扩增基因组fwnA6位置。根据手册，用来自Macherey Nagel的PCR纯化试剂盒纯化PCR片段。

通过测序确认fwnA中的基因组突变

根据手册，通过使用如SEQ ID NO:75中所示的正向引物并使用纯化的菌落PCR片段作为模板，使用Applied Biosystems的BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒进行PCR测序。根据供应商手册，通过乙醇/EDTA沉淀来清洁测序PCR产物。将fwnA6序列PCR片段沉淀溶解于10μl Applied Biosystems的HiDi甲酰胺中，并将悬浮液用于使用AppliedBiosystems的3500遗传分析仪(Sanger测序仪)进行序列分析。对于每次转化，对最多10个显示fwnA表型的转化体进行测序。

表6：测序结果表示为fwnA表型转化体总数中含有设计的5bp缺失的转化体的百分比，以及转化体总数中所设计的5bp缺失的百分比。

所有测序的浅黄褐色的转化体在fwnA基因中具有设计的5bp缺失。

实施例编号6：使用具有T7启动子的sgRNA表达盒与T7RNAP蛋白的组合在Aspergillus niger中表达sgRNA

该实施例描述了使用CAS9、在单指导RNA(sgRNA)表达盒前面的T7启动子、T7RNAP蛋白与供体DNA的组合来破坏A.niger基因组DNA中的fnwA基因座。具有fwnA基因突变的菌株将在孢子具有中从黑色到浅黄褐色的颜色变化(等人，2011)。

供体DNA

与实施例5相同

构建BG-AMA17

与实施例5相同

构建质粒BG-AMA18和BG-AMA19

与实施例5相同

菌株

与实施例5相同

转化

除了在转化混合物中使用ATA(金精三羧酸＝核酸酶抑制剂)之外，如专利申请WO1999/32617和WO1998/46772中所述进行原生质体转化。在一些转化中，使用T7RNAP蛋白(New England BioLabs)。

转化中使用的AMA载体(1.5μg/转化)：

4.AMA载体BG-AMA17(SEQ ID NO:68；图15)→AMA hygB/Cas9

5.AMA载体BG-AMA18(SEQ ID NO:71；图16)→AMA hygB/Cas9/T7WT sgRNA盒

6.AMA载体BG-AMA19(SEQ ID NO:72；图17)→AMA hygB/Cas9/T7强sgRNA盒

表7示出了在每次单独转化中转化到菌株GBA 302的DNA/蛋白质的具体量。

表7：所执行的转化的概述。执行到菌株GBA 302的转化。使用不同的AMA质粒作为环状质粒，并且在一些情况下使用T7RNAP蛋白。作为供体DNA，含有所需突变的PCR片段包括在一些转化中，如下表所示。总共进行8次转化。

转化后，将原生质体接种在含有60μg/ml潮霉素B(Invitrogen)的再生培养基平板上。将所有平板在30℃下孵育4-6天。

转化结果可见于表8。

表8：8次转化实验的结果，其中含有fwnA表型的转化体的数目/获得的转化体的总数，以及在转化体的总数中鉴定的含有fwnA表型的浅黄色菌落的百分比。

对来自所有转化平板的转化体进行计数，并对fwnA突变的浅黄褐色孢子表型特征进行评分。

在没有供体DNA的所有转化中(转化编号1、5和6)，没有获得浅黄褐色的转化体。在没有指导RNA的转化2中，也没有获得浅黄褐色的转化体。

在转化3和4中(GBA 302、Cas9、sgRNA→WT或强T7启动子在sgRNA前面，并且具有供体DNA)，4％的转化体具有fwnA表型。在转化7和8中(GBA 302、Cas9、sgRNAWT或强T7启动子在sgRNA前面，T7RNAP蛋白质，并且具有供体DNA)，8％–6％的转化体具有fwnA表型。

当比较转化2与3(都是没有sgRNA的对照)和4时，唯一的区别是AMA质粒中存在T7sgRNA盒。似乎A.niger能够在sgRNA前面使用T7启动子并表达功能性指导RNA。与Cas9和供体DNA一起，所述系统引起一些转化体(4％的转化体)的浅黄褐色着色。

这表明在sgRNA前面的T7启动子可以成功地用于在A.niger中进行基因组编辑。当比较转化3+4与7+8时，结果表明在转化中加入T7RNAP蛋白增加了浅黄褐色转化体的百分比。因此，通过加入T7RNAP蛋白，CRISPR/Cas介导的fwn突变效率增大。

用于产生用于测序的DNA片段的菌落PCR SDS/LiAC

将转化体3、4、7和8的孢子接种在PDA平板(Difco)上，并在30℃下在培养箱中孵育2-3天。对于每个测试的菌落，用接种环取菌落样品并置于Eppendorf杯中的25μlGlucanex^TM溶液(50mg/ml Glucanex^TM溶解于KC缓冲液(60g/l KCl、2g/l柠檬酸，用KOH/HCl调节至pH6.2))中。在37℃孵育1小时后，向每个杯中加入75μl DNA稀释缓冲液，然后在具有加热盖的PCR设备中煮沸5分钟。煮沸后，加入100μl millQ水，并通过上下吹打三次非常温和地进行混合。随后，从溶液顶部小心移取5μl染色体DNA模板，并加入每次反应的PCR混合物中(不从底部移取以免吸取到细胞碎片)。根据标准PCR方案，使用Phusion聚合酶(NewEngland Biolabs)，通过使用如SEQ ID NO:75中所示的正向引物和如SEQ ID NO:76中所示的反向引物来执行PCR反应，从而扩增基因组fwnA6位置。根据手册，用来自Macherey Nagel的PCR纯化试剂盒纯化PCR片段。

通过测序确认fwnA中的基因组突变

根据手册，通过使用如SEQ ID NO:71中所示的正向引物并使用纯化的菌落PCR片段作为模板，使用Applied Biosystems的BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒进行PCR测序。根据供应商手册，通过乙醇/EDTA沉淀来清洁测序PCR产物。将fwnA6序列PCR片段沉淀溶解于10μl Applied Biosystems的HiDi甲酰胺中，并将悬浮液用于使用AppliedBiosystems的3500遗传分析仪(Sanger测序仪)进行序列分析。

对于每次转化，对最多16个显示fwnA表型的转化体进行测序。

表9：测序结果表示为fwnA表型转化体总数中含有设计的5bp缺失的转化体的百分比，以及转化体总数中所设计的5bp缺失的百分比。

所有测序的浅黄褐色的转化体在fwnA基因中具有设计的5bp缺失。

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序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司，麻省理工学院

<120> 用于宿主细胞的指导RNA表达系统

<130> 32246-WO-PCT

<150> US62/399127

<151> 2016-09-23

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer used to amplify the 5'

piece for integration into the INT1 locus

<400> 1

ttaccaatcc tttcataagc taattatg 28

<210> 2

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer used to amplify the 5'

piece for integration into the INT1 locus

<400> 2

ggcacaaacg cctgtgggtg tggtactgga tatgcaaagc gattggaagt cgcttagggt 60

ttcaaagatc catacttctc 80

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer used to amplify the 3'

piece for integration into the INT1 locus

<400> 3

tgtttcttgt atatagtaat atgtaatatt tgcttcgtac gcttagtcct cattttactt 60

tttttagaat gacctgttcc 80

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer used to amplify the 3'

piece for integration into the INT1 locus

<400> 4

ttgtgaccgc cctgctgcaa aac 23

<210> 5

<211> 9360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the GFP-dCas9-Mxi1 expression unit

integrated in the genome

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(418)

<223> 5' INT1 integration site

<220>

<221> misc_feature

<222> (419)..(1814)

<223> GFP表达盒

<220>

<221> misc_feature

<222> (1819)..(1864)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1869)..(1918)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1923)..(3735)

<223> hygromycin B resistance marker cassette

<220>

<221> misc_feature

<222> (3747)..(3796)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3797)..(4401)

<223> GAL1 promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (4402)..(8736)

<223> dCAS9-Mxi1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8737)..(8977)

<223> terminator

<220>

<221> misc_feature

<222> (8798)..(9028)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (9029)..(9360)

<223> 3' INT1 integration site

<400> 5

ttaccaatcc tttcataagc taattatgcc atccatatag caagagaatc cggtgggggc 60

gccatgccta tccggcggca acattattac tctggtatac gggcgtaact ccataatatg 120

ccaccactta cctttaacat gttcatggta ggtaccccac ccagccataa ggaaattttc 180

aaaggcgttg gatcaaaaaa taggccttta tttcatcgcg tgattgagga gcataacatg 240

tttagtgaag gtttcttttg gaaaacttca gtcgctcatt attagaacca gggaggtcca 300

ggctttgctg gtgggagaga aagcttatga agctggggtt gcagatttgt cgattggtcg 360

ccagtacaca gttttaaaaa gtcagagaat gtagagaagt atggatcttt gaaaccctaa 420

gcgacttcca atcgctttgc atatccagta ccacacccac aggcgtttgt gccattcatc 480

tttcacctgc cattagtaac ccgacttctc attgagcggg ttacggcagc cacaggccac 540

attccgaatg tctgggtgag cggtcccttt tccagcatcc actaaatatc tcggatcccg 600

ctttttaatc tggcttcctg aaaaaaatca atggagtgat gcaaactgac tggagcaaaa 660

agctgacaca aggcaatcga cctacgtgtc tgtctatttt ctcacacctt ctattacctt 720

ctaactctct gggttggaaa aaactgaaaa aaaggttgtc tccagtttcc acaaatcatc 780

cccctgtttg attaataaat atataaagac gacaactatc gatcataaac tcataaaact 840

ataactcctt tacacttctt attttatagt tattctattt taattcttat tgattttaaa 900

accccaagaa cttagtttcg aaaacacaca cacacaaaca attaaaaatg tctaaaggtg 960

aagaattatt cactggtgtt gtcccaattt tggttgaatt agatggtgat gttaatggtc 1020

acaaattttc tgtctccggt gaaggtgaag gtgatgctac ttacggtaaa ttgaccttaa 1080

aattgatttg tactactggt aaattgccag ttccatggcc aaccttagtc actactttag 1140

gttatggttt gcaatgtttt gctagatacc cagatcatat gaaacaacat gactttttca 1200

agtctgccat gccagaaggt tatgttcaag aaagaactat ttttttcaaa gatgacggta 1260

actacaagac cagagctgaa gtcaagtttg aaggtgatac cttagttaat agaatcgaat 1320

taaaaggtat tgattttaaa gaagatggta acattttagg tcacaaattg gaatacaact 1380

ataactctca caatgtttac atcactgctg acaaacaaaa gaatggtatc aaagctaact 1440

tcaaaattag acacaacatt gaagatggtg gtgttcaatt agctgaccat tatcaacaaa 1500

atactccaat tggtgatggt ccagtcttgt taccagacaa ccattactta tcctatcaat 1560

ctgccttatc caaagatcca aacgaaaaga gagatcacat ggtcttgtta gaatttgtta 1620

ctgctgctgg tattacccat ggtatggatg aattgtacaa ataaactggt tgatggaaaa 1680

tataatttta ttgggcaaac ttttgtttat ctgatgtgtt ttatactatt atctttttaa 1740

ttaatgattc tatatacaaa cctgtatatt ttttctttaa ccaatttttt tttttataga 1800

cctagagctg tactcctcaa cgttgtccag gtttgtatcc acgtgtgtcc gttccgccaa 1860

tattccgccg gatcgatgta cacaaccgac tgcacccaaa cgaacacaaa tcttagcagt 1920

gctatttaaa aacctgtgtt atgctcaaat aacggttact gatccaaaac cttatatatg 1980

acggcaagtg tctcactgtt gcattacgcg ttgtttcttt tctttgttct tgtaagcgcg 2040

attttaccag aactagatgg cgctcgtgat cctgaaacgg ggagaaattt tgagaacacc 2100

gctttattag gcgaagcggt gggcacagct cacgcgtaag gtgttcccat tatttctcaa 2160

agtgatgcga atttcagaga acacattaac ctgggggcca taaacgcgac gtgctaccat 2220

tttcgttacg tatacttagg ccagagatta caacatgact actaatatca aacataactc 2280

tatatataag ggatgaagat gtatgctttc ttagaatttc aaacatgttc cgttaaagtt 2340

ttacttttcg atttcaattt cgactgcatg atgcttttct tagagagtgt tttgttatta 2400

aatagtatca taaattcttg tctttttaca taagaattag gaaagtacag aacaagagca 2460

aatttaatat ataatgggta aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 2520

gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 2580

tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 2640

tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 2700

ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 2760

acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 2820

cgcggaggca atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 2880

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 2940

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 3000

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 3060

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 3120

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 3180

gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 3240

gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 3300

tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 3360

aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 3420

cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 3480

tcgtccgagg gcaaaggaat aaacagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac 3540

ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg 3600

atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa 3660

gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac 3720

taacgccgcc atccagtgtc gacctcacgc tttccggcat cttccagacc acagtatatc 3780

catccgcctc ctgttggtgc acatggcatt accaccatat acatatccat atctaatctt 3840

acttatatgt tgtggaaatg taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt 3900

tggaactttc agtaatacgc ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc 3960

gccgagcggg cgacagccct ccgacggaag tctctcctcc gtgcgtcctc gtgttcaccg 4020

gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct 4080

acaatactag cttttatggt tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac 4140

cttcaaatca acgaatcaaa ttaacaacca taggataata atgcgattag ttttttagcc 4200

ttatttctgg ggtaattaat cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa 4260

atgcaaaagc tgcataacca ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt 4320

cttattcaaa tgtcataaaa gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac 4380

gtcaaggaga aaaaactata aatgtctaga gccccaaaga agaagagaaa agttagaccc 4440

ggggataaga aatactctat tggtttggct atcggtacaa actctgttgg ttgggctgtt 4500

attactgatg aatacaaggt tccatccaag aagttcaagg ttttgggtaa cactgataga 4560

cactccatca aaaagaactt gattggtgcc ttgttgttcg attctggtga aactgctgaa 4620

gctactagat tgaaaagaac cgctagaaga agatacacca gaagaaagaa cagaatctgc 4680

tacttgcaag aaatcttctc caacgaaatg gccaaggttg atgattcatt cttccacaga 4740

ttggaagaat ccttcttggt cgaagaagat aagaagcacg aaagacatcc aatcttcggt 4800

aacatcgttg atgaagttgc ttaccacgaa aagtacccaa ctatctacca tttgagaaag 4860

aagttggttg actctaccga taaggctgat ttgagattga tctatttggc tttggcccac 4920

atgattaagt tcagaggtca tttcttgatc gaaggtgatt tgaacccaga taactccgat 4980

gttgataagt tgttcatcca attagtccaa acctacaatc aattattcga agaaaaccca 5040

atcaacgcct ctggtgttga tgctaaagct attttgtctg ccagattgtc caagtccaga 5100

agattagaaa atttgatcgc ccaattacca ggtgaaaaga agaatggttt gttcggtaat 5160

ttgattgcct tgtctttggg tttgactcca aacttcaagt ccaatttcga tttggctgaa 5220

gatgccaagt tgcaattatc taaggatacc tacgatgacg atttggataa cttgttggct 5280

caaatcggtg atcaatacgc tgatttgttt ttggctgcta agaacttgtc cgatgccatt 5340

ttgttgtccg atattttgag agtcaacacc gaaattacta aggctccatt gtctgcctct 5400

atgatcaaaa gatacgatga acaccaccaa gacttgactt tgttgaaggc tttggtcaga 5460

caacaattac ctgaaaagta caaagaaatt ttcttcgatc aatccaagaa cggttacgcc 5520

ggttatattg atggtggtgc ttctcaagaa gaattttaca agttcatcaa gccaatcttg 5580

gaaaagatgg acggtactga agaattattg gtcaagttga acagagaaga tttgttgaga 5640

aagcaaagaa ccttcgacaa cggttctatt ccacatcaaa ttcacttggg tgaattgcac 5700

gcaattttga gaagacaaga agatttttat ccattcttga aggacaacag agaaaagatc 5760

gaaaagattc tgaccttcag aatcccttac tacgttggtc cattggctag aggtaattca 5820

agatttgcct ggatgactag aaagtccgaa gaaactatta ctccttggaa cttcgaagaa 5880

gttgtagata agggtgcttc tgcccaatcc tttattgaaa gaatgaccaa cttcgacaag 5940

aacttgccaa acgaaaaggt tttgccaaag cactctttgt tgtacgaata cttcaccgtc 6000

tacaacgaat tgactaaggt taagtacgtc accgaaggta tgagaaaacc agctttttta 6060

tccggtgaac aaaagaaggc tatcgtcgat ttgttgttca agaccaacag aaaggttact 6120

gtcaagcaat taaaagaaga ttacttcaag aaaatcgaat gcttcgactc cgttgaaatt 6180

tctggtgtcg aagatagatt caatgcctct ttaggtactt accatgactt gttgaaaatc 6240

atcaaggaca aggatttctt ggacaacgaa gaaaacgaag atattttgga agatattgtc 6300

ttgacattga ccttgtttga agatagagaa atgattgaag aaagattgaa aacctacgcc 6360

cacttgttcg atgataaggt tatgaagcaa ttaaagagaa gaagatacac tggttggggt 6420

agattgtcca gaaaattgat taacggtatc agagacaagc aatccggtaa gaccattttg 6480

gactttttga agtctgatgg tttcgctaac agaaacttca tgcaattaat ccacgacgat 6540

tccttgactt tcaaagaaga tatacaaaag gcccaagtct ctggtcaagg tgattcttta 6600

catgaacata tcgctaactt ggctggttct ccagctatta agaagggtat tttacaaacc 6660

gttaaggtcg ttgacgaatt ggtcaaagtt atgggtagac ataagccaga aaacatcgtt 6720

atcgaaatgg ctagagaaaa tcaaaccacc caaaagggtc aaaagaactc cagagaaaga 6780

atgaagagaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttgggttccc aaattttgaa agaacaccca 6840

gttgaaaaca cccaattaca aaacgaaaag ttgtacttgt actacttgca aaacggtaga 6900

gatatgtacg ttgaccaaga attggacatc aacagattgt ctgattacga tgttgacgct 6960

atcgttccac aatctttttt gaaggatgac tccattgaca acaaggtctt gactagatcc 7020

gataagaata gaggtaagtc cgataacgtt ccatctgaag aagtcgttaa gaaaatgaag 7080

aactattgga gacaattatt gaacgccaag ttgatcaccc aaagaaagtt tgacaatttg 7140

accaaggctg aaagaggtgg tttgtctgaa ttggataagg caggtttcat caaaagacaa 7200

ttagtagaaa ccagacaaat caccaagcac gttgctcaaa ttttggatag tagaatgaac 7260

actaagtacg acgaaaacga caaattgatc agagaagtta aggtcattac cttgaagtcc 7320

aagttggttt ccgatttcag aaaggacttc caattctaca aggtcagaga aatcaacaac 7380

taccatcatg cacatgatgc ttacttgaat gctgttgttg gtactgcctt gattaagaag 7440

tatccaaagt tggaatccga atttgtctac ggtgattaca aggtttacga cgttagaaag 7500

atgatcgcca agtccgaaca agaaattggt aaagctactg ccaaatactt cttctactcc 7560

aatattatga atttctttaa gaccgaaatc actttggcca acggtgaaat tagaaaaaga 7620

ccattgattg aaactaatgg tgaaacaggt gaaatcgttt gggataaggg tagagatttt 7680

gccactgtta gaaaggtatt gtccatgcca caagtaaaca tcgtcaaaaa gaccgaagtt 7740

caaactggtg gtttctccaa agaatccatt ttgcctaaga gaaactccga taagttgatc 7800

gctagaaaaa aagactggga cccaaaaaag tacggtggtt ttgattctcc aactgttgct 7860

tactctgttt tggttgttgc taaggtcgaa aagggtaaga gtaagaagtt gaagtccgtc 7920

aaagaattat taggtatcac tatcatggaa agatcctcat tcgaaaagaa tcctatcgac 7980

tttttggaag ccaagggtta caaagaagtc aagaaggact tgatcattaa gttgccaaag 8040

tacagtttgt tcgaattgga aaatggtaga aagagaatgt tggcttctgc cggtgaatta 8100

caaaagggta atgaattggc tttgccatcc aagtacgtta atttcttata cttggcctcc 8160

cactacgaaa aattgaaagg ttctcctgaa gataacgaac aaaagcaatt atttgtcgaa 8220

caacacaagc actacttgga cgaaatcatt gaacaaattt ccgaattttc caaaagagtc 8280

attttggctg acgccaattt ggacaaagtt ttgtcagctt acaacaagca cagagataag 8340

ccaattagag aacaagctga aaacatcatt cacttgttca ctttgactaa cttgggtgct 8400

ccagctgctt ttaagtattt cgataccact atcgacagaa agagatacac ctctaccaaa 8460

gaagttttgg acgctacttt gatccaccaa tctattactg gtttgtacga aactagaatc 8520

gacttgtctc aattaggtgg tgatgaggga gctcccaaga aaaagcgcaa ggtaggtagt 8580

tccaagcttg gcggcagcgg cggcagcatg gaacgtgtga gaatgattaa tgtgcaaagg 8640

ctgttagaag ccgcagagtt tttagaaaga agagaaagag aatgcgaaca cgggtatgcc 8700

agttctttcc ctagcatgcc ctctcccaga ggctaaatag gctaatatga atgtatttga 8760

tctctatttt attaatacga aaccccttaa taattgatat tttcgataca tatttggcag 8820

tagttagcta cgtaacagag tattattttc atttcaagtt atgcatgaac tctctaattt 8880

cacataccat gctaccacta cccttggagg ttttgttcat atcttttata ataaagctaa 8940

aaccgaaaag gtgaagggaa aaaaaactat tagagcctgt ttcttgtata tagtaatatg 9000

taatatttgc ttcgtacgct tagtcctcat tttacttttt ttagaatgac ctgttcccga 9060

cactatgtaa gatctagctt ttaacatatt atggaaacct gaaatgtaaa atctgaattt 9120

ttgtatatgt gtttatattt gggtagttct tttgaggaaa gcatgcatag acttgctgta 9180

cgaactttat gtgacttgta gtgacgctgt ttcatgagac tttagccctt tgaacatatt 9240

atcatatctc agcttgaaat actatagatt tacttttgca gccatttctt ggtgctccaa 9300

ggttgtgcgt atctattact taatttctgt ccttgccaag ttttgcagca gggcggtcac 9360

<210> 6

<211> 11243

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the GFP-dCas9-Mxi1-T7RNAp expression unit

integrated in the genome

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(418)

<223> 5' INT1 integration site

<220>

<221> misc_feature

<222> (419)..(468)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (473)..(1814)

<223> GFP表达盒

<220>

<221> misc_feature

<222> (1819)..(1868)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1869)..(1918)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (1923)..(3735)

<223> hygromycin B resistance marker cassette

<220>

<221> misc_feature

<222> (3747)..(3796)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (3797)..(4401)

<223> GAL1 promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (4402)..(8733)

<223> dCAS9-Mxi1

<220>

<221> misc_feature

<222> (8734)..(8787)

<223> 2A peptide sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (8788)..(10617)

<223> T7 RNA polymerase

<220>

<221> misc_feature

<222> (10618)..(10858)

<223> terminator

<220>

<221> misc_feature

<222> (10859)..(10909)

<223> connector sequence

<220>

<221> misc_feature

<222> (10910)..(11243)

<223> 3' INT1 integration site

<400> 6

ttaccaatcc tttcataagc taattatgcc atccatatag caagagaatc cggtgggggc 60

gccatgccta tccggcggca acattattac tctggtatac gggcgtaact ccataatatg 120

ccaccactta cctttaacat gttcatggta ggtaccccac ccagccataa ggaaattttc 180

aaaggcgttg gatcaaaaaa taggccttta tttcatcgcg tgattgagga gcataacatg 240

tttagtgaag gtttcttttg gaaaacttca gtcgctcatt attagaacca gggaggtcca 300

ggctttgctg gtgggagaga aagcttatga agctggggtt gcagatttgt cgattggtcg 360

ccagtacaca gttttaaaaa gtcagagaat gtagagaagt atggatcttt gaaaccctaa 420

gcgacttcca atcgctttgc atatccagta ccacacccac aggcgtttgt gccattcatc 480

tttcacctgc cattagtaac ccgacttctc attgagcggg ttacggcagc cacaggccac 540

attccgaatg tctgggtgag cggtcccttt tccagcatcc actaaatatc tcggatcccg 600

ctttttaatc tggcttcctg aaaaaaatca atggagtgat gcaaactgac tggagcaaaa 660

agctgacaca aggcaatcga cctacgtgtc tgtctatttt ctcacacctt ctattacctt 720

ctaactctct gggttggaaa aaactgaaaa aaaggttgtc tccagtttcc acaaatcatc 780

cccctgtttg attaataaat atataaagac gacaactatc gatcataaac tcataaaact 840

ataactcctt tacacttctt attttatagt tattctattt taattcttat tgattttaaa 900

accccaagaa cttagtttcg aaaacacaca cacacaaaca attaaaaatg tctaaaggtg 960

aagaattatt cactggtgtt gtcccaattt tggttgaatt agatggtgat gttaatggtc 1020

acaaattttc tgtctccggt gaaggtgaag gtgatgctac ttacggtaaa ttgaccttaa 1080

aattgatttg tactactggt aaattgccag ttccatggcc aaccttagtc actactttag 1140

gttatggttt gcaatgtttt gctagatacc cagatcatat gaaacaacat gactttttca 1200

agtctgccat gccagaaggt tatgttcaag aaagaactat ttttttcaaa gatgacggta 1260

actacaagac cagagctgaa gtcaagtttg aaggtgatac cttagttaat agaatcgaat 1320

taaaaggtat tgattttaaa gaagatggta acattttagg tcacaaattg gaatacaact 1380

ataactctca caatgtttac atcactgctg acaaacaaaa gaatggtatc aaagctaact 1440

tcaaaattag acacaacatt gaagatggtg gtgttcaatt agctgaccat tatcaacaaa 1500

atactccaat tggtgatggt ccagtcttgt taccagacaa ccattactta tcctatcaat 1560

ctgccttatc caaagatcca aacgaaaaga gagatcacat ggtcttgtta gaatttgtta 1620

ctgctgctgg tattacccat ggtatggatg aattgtacaa ataaactggt tgatggaaaa 1680

tataatttta ttgggcaaac ttttgtttat ctgatgtgtt ttatactatt atctttttaa 1740

ttaatgattc tatatacaaa cctgtatatt ttttctttaa ccaatttttt tttttataga 1800

cctagagctg tactcctcaa cgttgtccag gtttgtatcc acgtgtgtcc gttccgccaa 1860

tattccgccg gatcgatgta cacaaccgac tgcacccaaa cgaacacaaa tcttagcagt 1920

gctatttaaa aacctgtgtt atgctcaaat aacggttact gatccaaaac cttatatatg 1980

acggcaagtg tctcactgtt gcattacgcg ttgtttcttt tctttgttct tgtaagcgcg 2040

attttaccag aactagatgg cgctcgtgat cctgaaacgg ggagaaattt tgagaacacc 2100

gctttattag gcgaagcggt gggcacagct cacgcgtaag gtgttcccat tatttctcaa 2160

agtgatgcga atttcagaga acacattaac ctgggggcca taaacgcgac gtgctaccat 2220

tttcgttacg tatacttagg ccagagatta caacatgact actaatatca aacataactc 2280

tatatataag ggatgaagat gtatgctttc ttagaatttc aaacatgttc cgttaaagtt 2340

ttacttttcg atttcaattt cgactgcatg atgcttttct tagagagtgt tttgttatta 2400

aatagtatca taaattcttg tctttttaca taagaattag gaaagtacag aacaagagca 2460

aatttaatat ataatgggta aaaagcctga actcaccgcg acgtctgtcg agaagtttct 2520

gatcgaaaag ttcgacagcg tctccgacct gatgcagctc tcggagggcg aagaatctcg 2580

tgctttcagc ttcgatgtag gagggcgtgg atatgtcctg cgggtaaata gctgcgccga 2640

tggtttctac aaagatcgtt atgtttatcg gcactttgca tcggccgcgc tcccgattcc 2700

ggaagtgctt gacattgggg aattcagcga gagcctgacc tattgcatct cccgccgtgc 2760

acagggtgtc acgttgcaag acctgcctga aaccgaactg cccgctgttc tgcagccggt 2820

cgcggaggca atggatgcga tcgctgcggc cgatcttagc cagacgagcg ggttcggccc 2880

attcggaccg caaggaatcg gtcaatacac tacatggcgt gatttcatat gcgcgattgc 2940

tgatccccat gtgtatcact ggcaaactgt gatggacgac accgtcagtg cgtccgtcgc 3000

gcaggctctc gatgagctga tgctttgggc cgaggactgc cccgaagtcc ggcacctcgt 3060

gcacgcggat ttcggctcca acaatgtcct gacggacaat ggccgcataa cagcggtcat 3120

tgactggagc gaggcgatgt tcggggattc ccaatacgag gtcgccaaca tcttcttctg 3180

gaggccgtgg ttggcttgta tggagcagca gacgcgctac ttcgagcgga ggcatccgga 3240

gcttgcagga tcgccgcggc tccgggcgta tatgctccgc attggtcttg accaactcta 3300

tcagagcttg gttgacggca atttcgatga tgcagcttgg gcgcagggtc gatgcgacgc 3360

aatcgtccga tccggagccg ggactgtcgg gcgtacacaa atcgcccgca gaagcgcggc 3420

cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cgccgatagt ggaaaccgac gccccagcac 3480

tcgtccgagg gcaaaggaat aaacagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac 3540

ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg 3600

atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa 3660

gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac 3720

taacgccgcc atccagtgtc gacctcacgc tttccggcat cttccagacc acagtatatc 3780

catccgcctc ctgttggtgc acatggcatt accaccatat acatatccat atctaatctt 3840

acttatatgt tgtggaaatg taaagagccc cattatctta gcctaaaaaa accttctctt 3900

tggaactttc agtaatacgc ttaactgctc attgctatat tgaagtacgg attagaagcc 3960

gccgagcggg cgacagccct ccgacggaag tctctcctcc gtgcgtcctc gtgttcaccg 4020

gtcgcgttcc tgaaacgcag atgtgcctcg cgccgcactg ctccgaacaa taaagattct 4080

acaatactag cttttatggt tatgaagagg aaaaattggc agtaacctgg ccccacaaac 4140

cttcaaatca acgaatcaaa ttaacaacca taggataata atgcgattag ttttttagcc 4200

ttatttctgg ggtaattaat cagcgaagcg atgatttttg atctattaac agatatataa 4260

atgcaaaagc tgcataacca ctttaactaa tactttcaac attttcggtt tgtattactt 4320

cttattcaaa tgtcataaaa gtatcaacaa aaaattgtta atatacctct atactttaac 4380

gtcaaggaga aaaaactata aatgtctaga gccccaaaga agaagagaaa agttagaccc 4440

ggggataaga aatactctat tggtttggct atcggtacaa actctgttgg ttgggctgtt 4500

attactgatg aatacaaggt tccatccaag aagttcaagg ttttgggtaa cactgataga 4560

cactccatca aaaagaactt gattggtgcc ttgttgttcg attctggtga aactgctgaa 4620

gctactagat tgaaaagaac cgctagaaga agatacacca gaagaaagaa cagaatctgc 4680

tacttgcaag aaatcttctc caacgaaatg gccaaggttg atgattcatt cttccacaga 4740

ttggaagaat ccttcttggt cgaagaagat aagaagcacg aaagacatcc aatcttcggt 4800

aacatcgttg atgaagttgc ttaccacgaa aagtacccaa ctatctacca tttgagaaag 4860

aagttggttg actctaccga taaggctgat ttgagattga tctatttggc tttggcccac 4920

atgattaagt tcagaggtca tttcttgatc gaaggtgatt tgaacccaga taactccgat 4980

gttgataagt tgttcatcca attagtccaa acctacaatc aattattcga agaaaaccca 5040

atcaacgcct ctggtgttga tgctaaagct attttgtctg ccagattgtc caagtccaga 5100

agattagaaa atttgatcgc ccaattacca ggtgaaaaga agaatggttt gttcggtaat 5160

ttgattgcct tgtctttggg tttgactcca aacttcaagt ccaatttcga tttggctgaa 5220

gatgccaagt tgcaattatc taaggatacc tacgatgacg atttggataa cttgttggct 5280

caaatcggtg atcaatacgc tgatttgttt ttggctgcta agaacttgtc cgatgccatt 5340

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caacaattac ctgaaaagta caaagaaatt ttcttcgatc aatccaagaa cggttacgcc 5520

ggttatattg atggtggtgc ttctcaagaa gaattttaca agttcatcaa gccaatcttg 5580

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gcaattttga gaagacaaga agatttttat ccattcttga aggacaacag agaaaagatc 5760

gaaaagattc tgaccttcag aatcccttac tacgttggtc cattggctag aggtaattca 5820

agatttgcct ggatgactag aaagtccgaa gaaactatta ctccttggaa cttcgaagaa 5880

gttgtagata agggtgcttc tgcccaatcc tttattgaaa gaatgaccaa cttcgacaag 5940

aacttgccaa acgaaaaggt tttgccaaag cactctttgt tgtacgaata cttcaccgtc 6000

tacaacgaat tgactaaggt taagtacgtc accgaaggta tgagaaaacc agctttttta 6060

tccggtgaac aaaagaaggc tatcgtcgat ttgttgttca agaccaacag aaaggttact 6120

gtcaagcaat taaaagaaga ttacttcaag aaaatcgaat gcttcgactc cgttgaaatt 6180

tctggtgtcg aagatagatt caatgcctct ttaggtactt accatgactt gttgaaaatc 6240

atcaaggaca aggatttctt ggacaacgaa gaaaacgaag atattttgga agatattgtc 6300

ttgacattga ccttgtttga agatagagaa atgattgaag aaagattgaa aacctacgcc 6360

cacttgttcg atgataaggt tatgaagcaa ttaaagagaa gaagatacac tggttggggt 6420

agattgtcca gaaaattgat taacggtatc agagacaagc aatccggtaa gaccattttg 6480

gactttttga agtctgatgg tttcgctaac agaaacttca tgcaattaat ccacgacgat 6540

tccttgactt tcaaagaaga tatacaaaag gcccaagtct ctggtcaagg tgattcttta 6600

catgaacata tcgctaactt ggctggttct ccagctatta agaagggtat tttacaaacc 6660

gttaaggtcg ttgacgaatt ggtcaaagtt atgggtagac ataagccaga aaacatcgtt 6720

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gttgaaaaca cccaattaca aaacgaaaag ttgtacttgt actacttgca aaacggtaga 6900

gatatgtacg ttgaccaaga attggacatc aacagattgt ctgattacga tgttgacgct 6960

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gataagaata gaggtaagtc cgataacgtt ccatctgaag aagtcgttaa gaaaatgaag 7080

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ttagtagaaa ccagacaaat caccaagcac gttgctcaaa ttttggatag tagaatgaac 7260

actaagtacg acgaaaacga caaattgatc agagaagtta aggtcattac cttgaagtcc 7320

aagttggttt ccgatttcag aaaggacttc caattctaca aggtcagaga aatcaacaac 7380

taccatcatg cacatgatgc ttacttgaat gctgttgttg gtactgcctt gattaagaag 7440

tatccaaagt tggaatccga atttgtctac ggtgattaca aggtttacga cgttagaaag 7500

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ccattgattg aaactaatgg tgaaacaggt gaaatcgttt gggataaggg tagagatttt 7680

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tactctgttt tggttgttgc taaggtcgaa aagggtaaga gtaagaagtt gaagtccgtc 7920

aaagaattat taggtatcac tatcatggaa agatcctcat tcgaaaagaa tcctatcgac 7980

tttttggaag ccaagggtta caaagaagtc aagaaggact tgatcattaa gttgccaaag 8040

tacagtttgt tcgaattgga aaatggtaga aagagaatgt tggcttctgc cggtgaatta 8100

caaaagggta atgaattggc tttgccatcc aagtacgtta atttcttata cttggcctcc 8160

cactacgaaa aattgaaagg ttctcctgaa gataacgaac aaaagcaatt atttgtcgaa 8220

caacacaagc actacttgga cgaaatcatt gaacaaattt ccgaattttc caaaagagtc 8280

attttggctg acgccaattt ggacaaagtt ttgtcagctt acaacaagca cagagataag 8340

ccaattagag aacaagctga aaacatcatt cacttgttca ctttgactaa cttgggtgct 8400

ccagctgctt ttaagtattt cgataccact atcgacagaa agagatacac ctctaccaaa 8460

gaagttttgg acgctacttt gatccaccaa tctattactg gtttgtacga aactagaatc 8520

gacttgtctc aattaggtgg tgatgaggga gctcccaaga aaaagcgcaa ggtaggtagt 8580

tccaagcttg gcggcagcgg cggcagcatg gaacgtgtga gaatgattaa tgtgcaaagg 8640

ctgttagaag ccgcagagtt tttagaaaga agagaaagag aatgcgaaca cgggtatgcc 8700

agttctttcc ctagcatgcc ctctcccaga ggcgagggta ggggtagtct gttgacttgt 8760

ggggacgttg aggagaatcc tggacccatg ccaaagaaga aaaggaaggt tcgtcctggg 8820

aacacgatta acatcgctaa gaacgacttc tctgacatcg aactggctgc tatcccgttc 8880

aacactctgg ctgaccatta cggtgagcgt ttagctcgcg aacagttggc ccttgagcat 8940

gagtcttacg agatgggtga agcacgcttc cgcaagatgt ttgagcgtca acttaaagct 9000

ggtgaggttg cggataacgc tgccgccaag cctctcatca ctaccctact ccctaagatg 9060

attgcacgca tcaacgactg gtttgaggaa gtgaaagcta agcgcggcaa gcgcccgaca 9120

gccttccagt tcctgcaaga aatcaagccg gaagccgtag cgtacatcac cattaagacc 9180

actctggctt gcctaaccag tgctgacaat acaaccgttc aggctgtagc aagcgcaatc 9240

ggtcgggcca ttgaggacga ggctcgcttc ggtcgtatcc gtgaccttga agctaagcac 9300

ttcaagaaaa acgttgagga acaactcaac aagcgcgtag ggcacgtcta caagaaagca 9360

tttatgcaag ttgtcgaggc tgacatgctc tctaagggtc tactcggtgg cgaggcgtgg 9420

tcttcgtggc ataaggaaga ctctattcat gtaggagtac gctgcatcga gatgctcatt 9480

gagtcaaccg gaatggttag cttacaccgc caaaatgctg gcgtagtagg tcaagactct 9540

gagactatcg aactcgcacc tgaatacgct gaggctatcg caacccgtgc aggtgcgctg 9600

gctggcatct ctccgatgtt ccaaccttgc gtagttcctc ctaagccgtg gactggcatt 9660

actggtggtg gctattgggc taacggtcgt cgtcctctgg cgctggtgcg tactcacagt 9720

aagaaagcac tgatgcgcta cgaagacgtt tacatgcctg aggtgtacaa agcgattaac 9780

attgcgcaaa acaccgcatg gaaaatcaac aagaaagtcc tagcggtcgc caacgtaatc 9840

accaagtgga agcattgtcc ggtcgaggac atccctgcga ttgagcgtga agaactcccg 9900

atgaaaccgg aagacatcga catgaatcct gaggctctca ccgcgtggaa acgtgctgcc 9960

gctgctgtgt accgcaagga caaggctcgc aagtctcgcc gtatcagcct tgagttcatg 10020

cttgagcaag ccaataagtt tgctaaccat aaggccatct ggttccctta caacatggac 10080

tggcgcggtc gtgtttacgc tgtgtcaatg ttcaacccgc aaggtaacga tatgaccaaa 10140

ggactgctta cgctggcgaa aggtaaacca atcggtaagg aaggttacta ctggctgaaa 10200

atccacggtg caaactgtgc gggtgtcgat aaggttccgt tccctgagcg catcaagttc 10260

attgaggaaa accacgagaa catcatggct tgcgctaagt ctccactgga gaacacttgg 10320

tgggctgagc aagattctcc gttctgcttc cttgcgttct gctttgagta cgctggggta 10380

cagcaccacg gcctgagcta taactgctcc cttccgctgg cgtttgacgg gtcttgctct 10440

ggcatccagc acttctccgc gatgctccga gatgaggtag gtggtcgcgc ggttaacttg 10500

cttcctagtg aaaccgttca ggacatctac gggattgttg ctaacacgat taacatcgct 10560

aagaacgaag aaagtcaacg agattctaca agcagacgca atcaatggga ccgataaata 10620

ggctaatatg aatgtatttg atctctattt tattaatacg aaacccctta ataattgata 10680

ttttcgatac atatttggca gtagttagct acgtaacaga gtattatttt catttcaagt 10740

tatgcatgaa ctctctaatt tcacatacca tgctaccact acccttggag gttttgttca 10800

tatcttttat aataaagcta aaaccgaaaa ggtgaaggga aaaaaaacta ttagagcctg 10860

tttcttgtat atagtaatat gtaatatttg cttcgtacgc ttagtcctca ttttactttt 10920

tttagaatga cctgttcccg acactatgta agatctagct tttaacatat tatggaaacc 10980

tgaaatgtaa aatctgaatt tttgtatatg tgtttatatt tgggtagttc ttttgaggaa 11040

agcatgcata gacttgctgt acgaacttta tgtgacttgt agtgacgctg tttcatgaga 11100

ctttagccct ttgaacatat tatcatatct cagcttgaaa tactatagat ttacttttgc 11160

agccatttct tggtgctcca aggttgtgcg tatctattac ttaatttctg tccttgccaa 11220

gttttgcagc agggcggtca caa 11243

<210> 7

<211> 6063

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the SNR52 gRNA expression vector

pRN1120-AG1

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(21)

<223> guide-sequence (genomic target sequence)

<400> 7

catatattta ttaatcaaac agttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggctagt 60

ccgttatcaa cttgaaaaag tggcaccgag tcggtgcttt tgtttttttg ttttttatgt 120

ctggggggcc cggtacccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattcc gagcttggcg 180

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 240

ataggagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag gtaactcaca 300

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 360

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 420

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 480

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 540

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 600

ctcggccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 660

acaggactat aaagatacca ggcgttcccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 720

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 780

tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 840

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 900

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 960

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 1020

tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 1080

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 1140

tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 1200

acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 1260

tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 1320

agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 1380

tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tgcccgtcgt gtagataact 1440

acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 1500

tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 1560

ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 1620

agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 1680

tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt 1740

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actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 1920

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aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 2220

tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 2280

tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 2340

gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 2400

ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 2460

gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg 2520

tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta 2580

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gccctcctcc ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc 2880

cattagtatc aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat 2940

aaatgtatgt agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa 3000

tttcgtgtcg tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacacct aggatccgtc 3060

gacactggat ggcggcgtta gtatcgaatc gacagcagta tagcgaccag cattcacata 3120

cgattgacgc atgatattac tttctgcgca cttaacttcg catctgggca gatgatgtcg 3180

aggcgaaaaa aaatataaat cacgctaaca tttgattaaa atagaacaac tacaatataa 3240

aaaaactata caaatgacaa gttcttgaaa acaagaatct ttttattgtc agtactaggg 3300

gcagggcatg ctcatgtaga gcgcctgctc gccgtccgag gcggtgccgt cgtacagggc 3360

ggtgtccagg ccgcagaggg tgaaccccat ccgccggtac gcgtggatcg ccggtgcgtt 3420

gacgttggtg acctccagcc agaggtgccc ggcgccccgc tcgcgggcga actccgtcgc 3480

gagccccatc aacgcgcgcc cgaccccgtg cccccggtgc tccggggcga cctcgatgtc 3540

ctcgacggtc agccggcggt tccagccgga gtacgagacg accacgaagc ccgccaggtc 3600

gccgtcgtcc ccgtacgcga cgaacgtccg ggagtccggg tcgccgtcct ccccggcgtc 3660

cgattcgtcg tccgattcgt cgtcggggaa caccttggtc aggggcgggt ccaccggcac 3720

ctcccgcagg gtgaagccgt ccccggtggc ggtgacgcgg aagacggtgt cggtggtgaa 3780

ggacccatcc agtgcctcga tggcctcggc gtcccccggg acactggtgc ggtaccggta 3840

agccgtgtcg tcaagagtgg tcattttaca tggttgttta tgttcggatg tgatgtgaga 3900

actgtatcct agcaagattt taaaaggaag tatatgaaag aagaacctca gtggcaaatc 3960

ctaacctttt atatttctct acaggggcgc ggcgtgggga caattcaacg cgtctgtgag 4020

gggagcgttt ccctgctcgc aggtctgcag cgaggagccg taatttttgc ttcgcgccgt 4080

gcggccatca aaatgtatgg atgcaaatga ttatacatgg ggatgtatgg gctaaatgta 4140

cgggcgacag tcacatcatg cccctgagct gcgcacgtca agactgtcaa ggagggtatt 4200

ctgggcctcc atgtcgctgg ccgggtgacc cggcggggac gaggccttaa gttcgaacgt 4260

acgagctccg gcattgcgaa taccgctttc cacaaacatt gctcaaaagt atctctttgc 4320

tatatatctc tgtgctatat ccctatataa cctacccatc cacctttcgc tccttgaact 4380

tgcatctaaa ctcgacctct acatttttta tgtttatctc tagtattact ctttagacaa 4440

aaaaattgta gtaagaacta ttcatagagt gaatcgaaaa caatacgaaa atgtaaacat 4500

ttcctatacg tagtatatag agacaaaata gaagaaaccg ttcataattt tctgaccaat 4560

gaagaatcat caacgctatc actttctgtt cacaaagtat gcgcaatcca catcggtata 4620

gaatataatc ggggatgcct ttatcttgaa aaaatgcacc cgcagcttcg ctagtaatca 4680

gtaaacgcgg gaagtggagt caggcttttt ttatggaaga gaaaatagac accaaagtag 4740

ccttcttcta accttaacgg acctacagtg caaaaagtta tcaagagact gcattataga 4800

gcgcacaaag gagaaaaaaa gtaatctaag atgctttgtt agaaaaatag cgctctcggg 4860

atgcattttt gtagaacaaa aaagaagtat agattctttg ttggtaaaat agcgctctcg 4920

cgttgcattt ctgttctgta aaaatgcagc tcagattctt tgtttgaaaa attagcgctc 4980

tcgcgttgca tttttgtttt acaaaaatga agcacagatt cttcgttggt aaaatagcgc 5040

tttcgcgttg catttctgtt ctgtaaaaat gcagctcaga ttctttgttt gaaaaattag 5100

cgctctcgcg ttgcattttt gttctacaaa atgaagcaca gatgcttcgt taacaaagat 5160

atgctattga agtgcaagat ggaaacgcag aaaatgaacc ggggatgcga cgtgcaagat 5220

tacctatgca atagatgcaa tagtttctcc aggaaccgaa atacatacat tgtcttccgt 5280

aaagcgctag actatatatt attatacagg ttcaaatata ctatctgttt cagggaaaac 5340

tcccaggttc ggatgttcaa aattcaatga tgggtaacaa gtacgatcgt aaatctgtaa 5400

aacagtttgt cggatattag gctgtatctc ctcaaagcgt attcgaatat cattgagaag 5460

ctgcagcgtc acatcggata ataatgatgg cagccattgt agaagtgcct tttgcatttc 5520

tagtctcttt ctcggtctag ctagttttac tacatcgcga agatagaatc ttagatcaca 5580

ctgcctttgc tgagctggat caatagagta acaaaagagt ggtaaggcct cgttaaagga 5640

caaggacctg agcggaagtg tatcgtacag tagacggagt atactaggta tagtctatag 5700

tccgtggaat taattctcat gtttgacagc ttatcatcga taatccggag ctagcatgcg 5760

gccgctctag aactagtgga tcccccgggc tgcagtcttt gaaaagataa tgtatgatta 5820

tgctttcact catatttata cagaaacttg atgttttctt tcgagtatat acaaggtgat 5880

tacatgtacg tttgaagtac aactctagat tttgtagtgc cctcttgggc tagcggtaaa 5940

ggtgcgcatt ttttcacacc ctacaatgtt ctgttcaaaa gattttggtc aaacgctgta 6000

gaagtgaaag ttggtgcgca tgtttcggcg ttcgaaactt ctccgcagtg aaagataaat 6060

gat 6063

<210> 8

<211> 5906

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the T7 gRNA expression vector pAG701

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

<223> T7 promoter

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(38)

<223> guide-sequence (genomic target sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(118)

<223> guide RNA structural component

<220>

<221> misc_feature

<222> (119)..(186)

<223> self-cleaving ribozyme (HDVr)

<220>

<221> misc_feature

<222> (187)..(233)

<223> T7 terminator

<400> 8

taatacgact cactatagat atatttatta atcaaacagt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcttttgg 120

ccggcatggt cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca acatgcttcg gcatggcgaa 180

tgggacaaaa aatcaaactg gctcaccttc gggtgggcct ttttgcgttt ataggggggc 240

ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga gggttaattc cgagcttggc gtaatcatgg 300

tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa cataggagcc 360

ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga ggtaactcac attaattgcg 420

ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 480

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 540

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 600

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 660

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctcggcccc 720

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 780

taaagatacc aggcgttccc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 840

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc 900

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 960

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1020

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1080

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1140

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1200

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1260

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 1320

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 1380

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 1440

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 1500

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctgcccgtcg tgtagataac tacgatacgg 1560

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 1620

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 1680

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 1740

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 1800

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 1860

cccatgttgt gaaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 1920

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 1980

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 2040

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 2100

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 2160

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 2220

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 2280

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 2340

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 2400

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa 2460

gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag gccctttcgt 2520

ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc 2580

acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt 2640

gttggcgggt gtcggggctg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg 2700

caccatatcg actacgtcgt aaggccgttt ctgacagagt aaaattcttg agggaacttt 2760

caccattatg ggaaatggtt caagaaggta ttgacttaaa ctccatcaaa tggtcaggtc 2820

attgagtgtt ttttatttgt tgtatttttt tttttttaga gaaaatcctc caatatcaaa 2880

ttaggaatcg tagtttcatg attttctgtt acacctaact ttttgtgtgg tgccctcctc 2940

cttgtcaata ttaatgttaa agtgcaattc tttttcctta tcacgttgag ccattagtat 3000

caatttgctt acctgtattc ctttactatc ctcctttttc tccttcttga taaatgtatg 3060

tagattgcgt atatagtttc gtctacccta tgaacatatt ccattttgta atttcgtgtc 3120

gtttctatta tgaatttcat ttataaagtt tatgtacacc taggatccgt cgacactgga 3180

tggcggcgtt agtatcgaat cgacagcagt atagcgacca gcattcacat acgattgacg 3240

catgatatta ctttctgcgc acttaacttc gcatctgggc agatgatgtc gaggcgaaaa 3300

aaaatataaa tcacgctaac atttgattaa aatagaacaa ctacaatata aaaaaactat 3360

acaaatgaca agttcttgaa aacaagaatc tttttattgt cagtactagg ggcagggcat 3420

gctcatgtag agcgcctgct cgccgtccga ggcggtgccg tcgtacaggg cggtgtccag 3480

gccgcagagg gtgaacccca tccgccggta cgcgtggatc gccggtgcgt tgacgttggt 3540

gacctccagc cagaggtgcc cggcgccccg ctcgcgggcg aactccgtcg cgagccccat 3600

caacgcgcgc ccgaccccgt gcccccggtg ctccggggcg acctcgatgt cctcgacggt 3660

cagccggcgg ttccagccgg agtacgagac gaccacgaag cccgccaggt cgccgtcgtc 3720

cccgtacgcg acgaacgtcc gggagtccgg gtcgccgtcc tccccggcgt ccgattcgtc 3780

gtccgattcg tcgtcgggga acaccttggt caggggcggg tccaccggca cctcccgcag 3840

ggtgaagccg tccccggtgg cggtgacgcg gaagacggtg tcggtggtga aggacccatc 3900

cagtgcctcg atggcctcgg cgtcccccgg gacactggtg cggtaccggt aagccgtgtc 3960

gtcaagagtg gtcattttac atggttgttt atgttcggat gtgatgtgag aactgtatcc 4020

tagcaagatt ttaaaaggaa gtatatgaaa gaagaacctc agtggcaaat cctaaccttt 4080

tatatttctc tacaggggcg cggcgtgggg acaattcaac gcgtctgtga ggggagcgtt 4140

tccctgctcg caggtctgca gcgaggagcc gtaatttttg cttcgcgccg tgcggccatc 4200

aaaatgtatg gatgcaaatg attatacatg gggatgtatg ggctaaatgt acgggcgaca 4260

gtcacatcat gcccctgagc tgcgcacgtc aagactgtca aggagggtat tctgggcctc 4320

catgtcgctg gccgggtgac ccggcgggga cgaggcctta agttcgaacg tacgagctcc 4380

ggcattgcga ataccgcttt ccacaaacat tgctcaaaag tatctctttg ctatatatct 4440

ctgtgctata tccctatata acctacccat ccacctttcg ctccttgaac ttgcatctaa 4500

actcgacctc tacatttttt atgtttatct ctagtattac tctttagaca aaaaaattgt 4560

agtaagaact attcatagag tgaatcgaaa acaatacgaa aatgtaaaca tttcctatac 4620

gtagtatata gagacaaaat agaagaaacc gttcataatt ttctgaccaa tgaagaatca 4680

tcaacgctat cactttctgt tcacaaagta tgcgcaatcc acatcggtat agaatataat 4740

cggggatgcc tttatcttga aaaaatgcac ccgcagcttc gctagtaatc agtaaacgcg 4800

ggaagtggag tcaggctttt tttatggaag agaaaataga caccaaagta gccttcttct 4860

aaccttaacg gacctacagt gcaaaaagtt atcaagagac tgcattatag agcgcacaaa 4920

ggagaaaaaa agtaatctaa gatgctttgt tagaaaaata gcgctctcgg gatgcatttt 4980

tgtagaacaa aaaagaagta tagattcttt gttggtaaaa tagcgctctc gcgttgcatt 5040

tctgttctgt aaaaatgcag ctcagattct ttgtttgaaa aattagcgct ctcgcgttgc 5100

atttttgttt tacaaaaatg aagcacagat tcttcgttgg taaaatagcg ctttcgcgtt 5160

gcatttctgt tctgtaaaaa tgcagctcag attctttgtt tgaaaaatta gcgctctcgc 5220

gttgcatttt tgttctacaa aatgaagcac agatgcttcg ttaacaaaga tatgctattg 5280

aagtgcaaga tggaaacgca gaaaatgaac cggggatgcg acgtgcaaga ttacctatgc 5340

aatagatgca atagtttctc caggaaccga aatacataca ttgtcttccg taaagcgcta 5400

gactatatat tattatacag gttcaaatat actatctgtt tcagggaaaa ctcccaggtt 5460

cggatgttca aaattcaatg atgggtaaca agtacgatcg taaatctgta aaacagtttg 5520

tcggatatta ggctgtatct cctcaaagcg tattcgaata tcattgagaa gctgcagcgt 5580

cacatcggat aataatgatg gcagccattg tagaagtgcc ttttgcattt ctagtctctt 5640

tctcggtcta gctagtttta ctacatcgcg aagatagaat cttagatcac actgcctttg 5700

ctgagctgga tcaatagagt aacaaaagag tggtaaggcc tcgttaaagg acaaggacct 5760

gagcggaagt gtatcgtaca gtagacggag tatactaggt atagtctata gtccgtggaa 5820

ttaattctca tgtttgacag cttatcatcg ataatccgga gctagcatgc ggccgctcta 5880

gaactagtgg atcccccggg ctgcag 5906

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the 20-nt guide-sequence that targets the

Saccharomyces bayanus TDH3 (SbTDH3) promoter that was used for

constitutive expression of GFP in tester strains AG1 and AG2

<400> 9

atatatttat taatcaaaca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a random 20-nt guide-sequence that was

used for normalization

<400> 10

gctagatgga cttgccgctg 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a strong T7 promoter that was used for

gRNA expression; this sequence replaced the T7 promoter sequence

that is indicated in bold in SEQ ID NO: 8

<400> 11

taatacgact cactataggg gaa 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a medium strength T7 promoter that was

used for gRNA expression; this sequence replaced the T7 promoter

sequence that is indicated in bold in SEQ ID NO: 8

<400> 12

taatacgact cactataggg gaa 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a weak strength T7 promoter that was used

for gRNA expression; this sequence replaced the T7 promoter

sequence that is indicated in bold in SEQ ID NO: 8

<400> 13

taatacgact cactaatact gaa 23

<210> 14

<211> 5441

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of CAS9 including a C-terminal SV40 nuclear

localization signal codon pair optimized for expression in S.

cerevisiae. The sequence includes the Kl11 promoter from K.

lactis and GND2 terminator sequence from S. cerevisiae.

<400> 14

ttttcttttt ttgcggtcac ccccatgtgg cggggaggca gaggagtagg tagagcaacg 60

aatcctacta tttatccaaa ttagtctagg aactcttttt ctagattttt tagatttgag 120

ggcaagcgct gttaacgact cagaaatgta agcactacgg agtagaacga gaaatccgcc 180

ataggtggaa atcctagcaa aatcttgctt accctagcta gcctcaggta agctagcctt 240

agcctgtcaa atttttttca aaatttggta agtttctact agcaaagcaa acacggttca 300

acaaaccgaa aactccactc attatacgtg gaaaccgaaa caaaaaaaca aaaaccaaaa 360

tactcgccaa tgagaaagtt gctgcgtttc tactttcgag gaagaggaac tgagaggatt 420

gactacgaaa ggggcaaaaa cgagtcgtat tctcccatta ttgtctgcta ccacgcggtc 480

tagtagaata agcaaccagt caacgctaag acaggtaatc aaaataccag tctgctggct 540

acgggctagt ttttacctct tttagaaccc actgtaaaag tccgttgtaa agcccgttct 600

cactgttggc gttttttttt ttttggttta gtttcttatt tttcattttt ttctttcatg 660

accaaaaaca aacaaatctc gcgatttgta ctgcggccac tggggcgtgg ccaaaaaaat 720

gacaaattta gaaaccttag tttctgattt ttcctgttat gaggagatat gataaaaaat 780

attactgctt tattgttttt tttttatcta ctgaaataga gaaacttacc caaggaggag 840

gcaaaaaaaa gagtatatat acagcagcta ccattcagat tttaatatat tcttttctct 900

tcttctacac tattattata ataattttac tatattcatt tttagcttaa aacctcatag 960

aatattattc ttcagtcact cgcttaaata cttatcaaaa atggacaaga aatactctat 1020

tggtttggat atcgggacca actccgtcgg ttgggctgtc atcaccgacg aatacaaggt 1080

tccatccaag aaattcaagg tcttgggtaa cactgacaga cactctatca agaagaattt 1140

gatcggtgct ttgttgttcg actccggtga aaccgctgaa gctaccagat tgaagcgtac 1200

cgctcgtcgt agatacacta gacgtaaaaa ccgtatttgt tacttgcaag aaatcttttc 1260

taacgaaatg gccaaggttg acgactcttt cttccacaga ttggaagaat ctttcttggt 1320

tgaagaagac aagaagcacg aaagacatcc aatcttcggt aacatcgttg acgaagttgc 1380

ttaccacgaa aaatacccta ccatctacca tttgagaaag aagttggtcg attccaccga 1440

caaggctgat ttgagattga tctatttggc cttggctcac atgatcaagt tcagaggtca 1500

cttcttgatt gaaggtgact tgaacccaga caactctgac gtcgacaaat tgttcatcca 1560

attggtccaa acctacaacc aattattcga ggaaaaccca attaacgctt ctggtgttga 1620

tgctaaggcc atcttatctg cccgtttgtc caagtctaga cgtttggaaa acttgattgc 1680

tcaattgcct ggtgaaaaga aaaacggttt gttcggtaac ttgatcgctt tgtccttggg 1740

tttgacccca aacttcaagt ccaacttcga cttggctgaa gatgccaagt tgcaattgtc 1800

caaggacacc tacgacgacg acttagacaa cttgttggct caaatcggtg accaatacgc 1860

cgacttgttc ttggctgcca aaaacttatc tgacgctatc ttgttgtctg acatcttgag 1920

agttaacact gaaattacca aggctccatt gtctgcttct atgatcaaaa gatacgacga 1980

acaccaccaa gatctgactt tgttgaaggc tttggttaga caacaattgc cagaaaagta 2040

caaggaaatc ttcttcgacc aatccaaaaa tggttacgcc ggttacattg acggtggtgc 2100

ttctcaggaa gaattctaca agttcatcaa gccaattttg gaaaagatgg atggtactga 2160

agaattattg gttaagttga acagagaaga cttattgaga aagcaacgta ccttcgataa 2220

cggttctatc ccacaccaaa tccacttggg tgaattgcac gccattttga gaagacagga 2280

agatttctat ccattcctaa aggacaacag agaaaagatc gaaaagatct taactttcag 2340

aatcccatac tacgtcggtc cattggccag aggtaattct agattcgctt ggatgaccag 2400

aaagtctgaa gaaaccatca ccccatggaa cttcgaagaa gtcgtcgaca agggtgcttc 2460

tgcccaatct ttcatcgaaa gaatgaccaa ctttgataag aacttgccaa acgagaaggt 2520

cttgccaaag cactctttgt tgtacgaata cttcaccgtc tacaacgaat taaccaaggt 2580

taaatacgtt actgaaggta tgagaaagcc agctttccta tccggtgaac aaaagaaggc 2640

tattgttgac ttgttgttta agaccaacag aaaggtcact gttaagcaat tgaaggaaga 2700

ctacttcaag aagattgaat gtttcgattc cgtcgaaatc tccggtgttg aagaccgttt 2760

caatgcttct ttgggcacct accacgattt gttaaagatc atcaaggaca aggacttttt 2820

agataacgaa gaaaacgaag acatcttgga agatatcgtt ttgaccttga ctcttttcga 2880

ggacagagaa atgattgaag agagattgaa gacctacgct cacttgttcg acgataaagt 2940

tatgaagcaa ctaaagagaa gaagatacac tggttggggt agattgtcca gaaagttgat 3000

taacggtatc agagacaagc aatccggtaa gactatttta gactttttga aatccgatgg 3060

tttcgctaac agaaacttta tgcaattgat tcacgacgat tctttgactt tcaaggaaga 3120

cattcaaaaa gcccaagtct ctggtcaagg tgattctttg cacgaacaca tcgctaactt 3180

ggctggttct ccagctatta agaagggtat cttacaaacc gtcaaggtcg ttgatgaatt 3240

ggtcaaagtc atgggtagac acaagccaga aaatattgtc atcgaaatgg ctagagaaaa 3300

ccaaactact caaaagggtc aaaagaactc tagagaacgt atgaagagaa ttgaagaagg 3360

tatcaaggag ttgggttctc aaattttgaa agaacaccca gtcgaaaaca ctcaattaca 3420

aaacgaaaag ctatacttgt actacttgca aaacggtcgt gacatgtacg tcgaccaaga 3480

attggatatc aacagattgt ctgactacga tgtcgatcat atcgtcccac aatcgttctt 3540

gaaggacgat tccattgaca acaaagtttt gactagatct gacaagaaca gaggtaagtc 3600

tgataacgtt ccatctgaag aagttgttaa gaagatgaag aactactgga gacaattgtt 3660

gaatgctaag ttgatcactc aaagaaagtt cgacaacttg accaaggctg aaagaggtgg 3720

tttgtccgaa ttggacaaag ccggtttcat caagagacaa ttagtcgaaa ctagacaaat 3780

caccaagcat gttgctcaaa tcttggattc cagaatgaac actaagtacg atgaaaacga 3840

caaactaatt agagaagtta aggtcatcac tttgaagtct aagttggttt ctgacttcag 3900

aaaggacttc caattttaca aggtcagaga aatcaacaac taccatcacg ctcacgatgc 3960

ctacttgaac gctgttgtcg gtactgcctt aatcaaaaag tacccaaagt tggaatctga 4020

attcgtttac ggtgactaca aggtttacga tgttagaaag atgatcgcca agtctgaaca 4080

agaaattggt aaggccactg ctaagtactt cttctactct aacatcatga actttttcaa 4140

gactgaaatc actttagcta acggtgaaat tagaaagcgt ccattgattg aaaccaatgg 4200

tgaaactggt gaaattgtct gggacaaggg tagagatttc gctaccgtca gaaaggtttt 4260

gtctatgcca caagttaaca tcgtcaagaa gactgaagtt caaactggtg gtttctctaa 4320

ggaatccatt ttgccaaaga gaaactctga caagttgatt gctagaaaga aggactggga 4380

tcctaagaag tacggtggtt tcgactctcc aactgttgct tactccgttt tggtcgttgc 4440

taaggttgaa aagggtaagt ctaagaagtt gaagtctgtt aaggaattgt tgggtatcac 4500

catcatggaa agatcctcct tcgaaaagaa cccaatcgac tttttggaag ctaagggtta 4560

caaggaagtc aagaaggatt tgatcattaa gttaccaaaa tactccttgt tcgaattgga 4620

aaacggtaga aagagaatgt tggcctccgc tggtgaacta caaaaaggta acgaattggc 4680

tttaccatct aagtacgtta acttcttgta cttggcttcc cactacgaaa agttgaaagg 4740

ttccccagaa gacaacgaac aaaagcaatt gtttgttgaa caacacaagc actacttgga 4800

tgaaattatt gaacaaatct ccgaattctc caagagagtc attttggctg atgctaactt 4860

agataaggtt ttatccgctt acaacaagca cagagacaaa ccaatcagag aacaagctga 4920

aaacatcatt catttgttca ctttaaccaa cttgggtgct ccagctgctt tcaaatactt 4980

cgacactacc attgacagaa agagatacac ttccaccaaa gaagttttag atgctacttt 5040

gattcaccaa tctattaccg gtttgtacga aaccagaatt gacttgtctc aattgggtgg 5100

tgattccaga gctgatccaa agaagaagag aaaggtgtaa aggagttaaa ggcaaagttt 5160

tcttttctag agccgttccc acaaataatt atacgtatat gcttcttttc gtttactata 5220

tatctatatt tacaagcctt tattcactga tgcaatttgt ttccaaatac ttttttggag 5280

atctcataac tagatatcat gatggcgcaa cttggcgcta tcttaattac tctggctgcc 5340

aggcccgtgt agagggccgc aagaccttct gtacgccata tagtctctaa gaacttgaac 5400

aagtttctag acctattgcc gcctttcgga tcgctattgt t 5441

<210> 15

<211> 11742

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of vector pCSN061.

<400> 15

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240

atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300

aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360

gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420

tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480

atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540

cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600

agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660

atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720

ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780

ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840

actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900

attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960

gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020

atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080

agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140

aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260

ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320

atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380

gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440

gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500

aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560

ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620

gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680

ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1800

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 1860

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtacct tttctttttt tgcggtcacc 1920

cccatgtggc ggggaggcag aggagtaggt agagcaacga atcctactat ttatccaaat 1980

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cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc 8040

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acaaaacata aaaataaata aacacagagt aaattcccaa attattccat cattaaaaga 11640

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cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tc 11742

<210> 16

<211> 5712

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of vector pRN1120

<400> 16

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cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

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accattatgg gaaatggttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 300

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ctcgacctct acatttttta tgtttatctc tagtattact ctttagacaa aaaaattgta 2040

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tagtatatag agacaaaata gaagaaaccg ttcataattt tctgaccaat gaagaatcat 2160

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cggatattag gctgtatctc ctcaaagcgt attcgaatat cattgagaag ctgcagcgtc 3060

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cgacaggact ataaagatac caggcgttcc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 4020

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ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 4320

gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 4380

aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 4440

tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 4500

ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 4560

tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 4620

aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 4680

tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actgcccgtc gtgtagataa 4740

ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 4800

gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 4860

gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 4920

taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 4980

tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 5040

ttacatgatc ccccatgttg tgaaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 5100

tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 5160

ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 5220

tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 5280

ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 5340

aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 5400

actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 5460

aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 5520

tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 5580

aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 5640

ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 5700

ggccctttcg tc 5712

<210> 17

<211> 3705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of T7-RNA polymerase (T7 RNAP) expression

unit. The sequence includes the codon pair optimized T7 RNAP gene

under control of TDH3 promoter and EnoI terminator sequence for

expression in S. cerevisiae

<400> 17

cgagctcata acttcgtata atgtatgcta tacgaacggt agaattcgaa tcagatccac 60

tagtgtgctt agtcaaaaaa ttagcctttt aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa 120

tagggggcgg gttacacaga atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc 180

tggcatccac taaatataat ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa 240

tcccagcacc aaaatattgt tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc attctcttag 300

cgcaactaca gagaacaggg gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg 360

atgcaacctg cctggagtaa atgatgacac aaggcaattg acccacgcat gtatctatct 420

cattttctta caccttctat taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa 480

aggttgaaac cagttccctg aaattattcc cctacttgac taataagtat ataaagacgg 540

taggtattga ttgtaattct gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc tacttttata 600

gttagtcttt tttttagttt taaaacacca agaacttagt ttcgaataaa cacacataaa 660

caaacaaaat gaacacaatc aatattgcca aaaatgaccc caagaaaaaa cgtaaggttt 720

ttagcgatat cgagctagct gcaattcctt tcaacacgct agctgatcat tatggtgagc 780

gtctggcaag agaacagctg gccctagagc acgaaagtta tgaaatggga gaagccaggt 840

ttagaaaaat gttcgaaaga caactaaaag ccggcgaggt ggctgacaac gcagccgcta 900

agcccctgat cacgacatta ctaccaaaaa tgattgcccg tataaacgac tggtttgagg 960

aggtgaaagc taagcgtggc aagaggccca cagcgttcca gttccttcaa gaaattaagc 1020

ctgaagcggt cgcatatatt acgattaaaa ccactctagc ttgtcttaca agcgcggata 1080

acacaacagt acaggctgta gctagcgcga taggcagggc aatagaggac gaggccaggt 1140

tcgggcgtat tcgtgatcta gaagctaaac attttaaaaa aaacgtggaa gaacagttaa 1200

acaagagagt tgggcatgtg tacaagaaag cgttcatgca ggtcgtggag gctgacatgc 1260

tttcaaaagg cctgttggga ggagaagcat ggagtagctg gcacaaggag gactcaatcc 1320

atgtcggcgt gaggtgtatt gagatgttga tagagagtac aggcatggtg tcattacacc 1380

gtcaaaacgc aggtgttgtg ggccaagatt ctgagacgat cgaattagca ccagaatacg 1440

cggaggccat agcgactcgt gccggggcgt tggcaggaat atctccaatg tttcagccat 1500

gtgtagtacc tccgaagcca tggactggaa ttaccggtgg gggctattgg gctaatggta 1560

gaaggccgtt ggcactggtc agaacccact caaaaaaagc tttgatgcgt tatgaagatg 1620

tttacatgcc cgaggtctat aaggctatca atatcgctca aaacactgcg tggaaaatta 1680

ataagaaagt tttggctgtt gcgaacgtta taacaaagtg gaaacactgc ccagtcgagg 1740

acatccctgc gatcgagcgt gaagaattgc ccatgaaacc tgaagatatt gatatgaacc 1800

ctgaagctct gacagcgtgg aaaagagcag cagccgctgt ttacagaaaa gataaggcaa 1860

gaaaaagtag gaggatctca ctagagttca tgcttgagca ggccaataag tttgccaacc 1920

acaaggccat ctggtttcct tataacatgg actggcgtgg tagggtttac gcagtctcca 1980

tgtttaatcc tcaaggcaac gatatgacca aggggctgct taccttagca aaggggaaac 2040

ccattgggaa ggagggatac tactggctaa aaatacatgg tgcaaattgt gcaggggttg 2100

ataaagtccc atttccggaa agaataaaat tcattgagga gaaccatgag aacataatgg 2160

cctgtgctaa atcaccactt gagaatacat ggtgggcgga gcaagacagt cccttttgtt 2220

ttctggcatt ctgctttgag tatgcagggg tgcagcacca tggattgagc tataactgtt 2280

cactaccctt ggcatttgat gggagttgta gtgggattca acatttcagc gctatgttga 2340

gggatgaagt cggaggtagg gccgtcaatc ttctaccgtc tgagacggtt caagacattt 2400

acgggatagt ggctaaaaaa gtcaacgaga ttcttcaggc cgacgcgatt aatggcactg 2460

ataacgaggt agtaacagtg actgacgaaa acacgggaga aatatccgag aaagttaaac 2520

ttgggaccaa ggcgctggca ggtcaatggc tggcgtacgg cgttacgagg tctgttacga 2580

aaaggagtgt catgacatta gcgtatggat ctaaggaatt tggatttaga cagcaggtac 2640

tggaggacac catacagcca gcgatcgact ctggcaaagg tttaatgttt acacaaccca 2700

accaggctgc tgggtatatg gcaaaattga tctgggaatc cgtttcagta actgtagtag 2760

ctgcagttga ggctatgaac tggctgaaaa gcgccgccaa actgttagcg gcagaggtaa 2820

aggacaagaa aacgggcgaa atattgagaa agagatgcgc ggtccattgg gtcacgcctg 2880

atgggttccc agtctggcag gaatacaaga aaccaattca aaccagactg aaccttatgt 2940

ttctggggca gtttcgtttg cagcccacca tcaataccaa caaagattca gaaattgacg 3000

cgcacaaaca agagtcaggg atagctccaa acttcgtgca ttcacaagac gggagtcacc 3060

tgagaaagac ggtggtttgg gcccatgaga agtatggtat cgagtctttc gccctgattc 3120

acgactcctt tggtactata ccagcagacg ctgcaaacct tttcaaagct gttagagaga 3180

ctatggtcga cacatatgag tcttgcgatg tattagctga cttctatgac caattcgcgg 3240

accagctaca tgaatcccag ctagacaaaa tgccggcatt acccgccaaa gggaatctga 3300

atctaagaga tattctggaa agcgatttcg ccttcgctta aaagcttttg attaagcctt 3360

ctagtccaaa aaacacgttt ttttgtcatt tatttcattt tcttagaata gtttagttta 3420

ttcattttat agtcacgaat gttttatgat tctatatagg gttgcaaaca agcatttttc 3480

attttatgtt aaaacaattt caggtttacc ttttattctg cttgtggtga cgcgtgtatc 3540

cgcccgctct tttggtcacc catgtattta attgcataaa taattcttaa aagtggagct 3600

agtctatttc tatttacata cctctcattt ctcatttcct cccctcccgc ggtggagctc 3660

cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgta 3705

<210> 18

<211> 3705

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of T7-RNApolymerase (T7 RNAP) expression

unit. The sequence includes the codon pair optimized T7 RNAP gene

under control of enoI promoter and EnoI terminator sequence for

expression in S. cerevisiae

<400> 18

cgagctcata acttcgtata atgtatgcta tacgaacggt agaattcgaa tcagatccac 60

tagtgtgccc gcggaaccgc cagatattca ttacttgacg caaaagcgtt tgaaataatg 120

acgaaaaaga aggaagaaaa aaaaagaaaa ataccgcttc taggcgggtt atctactgat 180

ccgagcttcc actaggatag cacccaaaca cctgcatatt tggacgacct ttacttacac 240

caccaaaaac cactttcgcc tctcccgccc ctgataacgt ccactaattg agcgattacc 300

tgagcggtcc tcttttgttt gcagcatgag acttgcatac tgcaaatcgt aagtagcaac 360

gtgtcaaggt caaaactgta tggaaacctt gtcacctcac ttaattctag ctagcctacc 420

ctgcaagtca agaggtgtcc gtgattccta gccacctcaa ggtatgcctc tccccggaaa 480

ctgtggcctt ttctggcaca catgatctcc acgatttcaa catataaata gcttttgata 540

atggcaatat taatcaaatt tattttactt ctttcttgta acatctctct tgtaatccct 600

tattccttct agctattttt cataaaaaac caagcaactg cttatcaaca cacaaacact 660

aaatcaaaat gaacacaatc aatattgcca aaaatgaccc caagaaaaaa cgtaaggttt 720

ttagcgatat cgagctagct gcaattcctt tcaacacgct agctgatcat tatggtgagc 780

gtctggcaag agaacagctg gccctagagc acgaaagtta tgaaatggga gaagccaggt 840

ttagaaaaat gttcgaaaga caactaaaag ccggcgaggt ggctgacaac gcagccgcta 900

agcccctgat cacgacatta ctaccaaaaa tgattgcccg tataaacgac tggtttgagg 960

aggtgaaagc taagcgtggc aagaggccca cagcgttcca gttccttcaa gaaattaagc 1020

ctgaagcggt cgcatatatt acgattaaaa ccactctagc ttgtcttaca agcgcggata 1080

acacaacagt acaggctgta gctagcgcga taggcagggc aatagaggac gaggccaggt 1140

tcgggcgtat tcgtgatcta gaagctaaac attttaaaaa aaacgtggaa gaacagttaa 1200

acaagagagt tgggcatgtg tacaagaaag cgttcatgca ggtcgtggag gctgacatgc 1260

tttcaaaagg cctgttggga ggagaagcat ggagtagctg gcacaaggag gactcaatcc 1320

atgtcggcgt gaggtgtatt gagatgttga tagagagtac aggcatggtg tcattacacc 1380

gtcaaaacgc aggtgttgtg ggccaagatt ctgagacgat cgaattagca ccagaatacg 1440

cggaggccat agcgactcgt gccggggcgt tggcaggaat atctccaatg tttcagccat 1500

gtgtagtacc tccgaagcca tggactggaa ttaccggtgg gggctattgg gctaatggta 1560

gaaggccgtt ggcactggtc agaacccact caaaaaaagc tttgatgcgt tatgaagatg 1620

tttacatgcc cgaggtctat aaggctatca atatcgctca aaacactgcg tggaaaatta 1680

ataagaaagt tttggctgtt gcgaacgtta taacaaagtg gaaacactgc ccagtcgagg 1740

acatccctgc gatcgagcgt gaagaattgc ccatgaaacc tgaagatatt gatatgaacc 1800

ctgaagctct gacagcgtgg aaaagagcag cagccgctgt ttacagaaaa gataaggcaa 1860

gaaaaagtag gaggatctca ctagagttca tgcttgagca ggccaataag tttgccaacc 1920

acaaggccat ctggtttcct tataacatgg actggcgtgg tagggtttac gcagtctcca 1980

tgtttaatcc tcaaggcaac gatatgacca aggggctgct taccttagca aaggggaaac 2040

ccattgggaa ggagggatac tactggctaa aaatacatgg tgcaaattgt gcaggggttg 2100

ataaagtccc atttccggaa agaataaaat tcattgagga gaaccatgag aacataatgg 2160

cctgtgctaa atcaccactt gagaatacat ggtgggcgga gcaagacagt cccttttgtt 2220

ttctggcatt ctgctttgag tatgcagggg tgcagcacca tggattgagc tataactgtt 2280

cactaccctt ggcatttgat gggagttgta gtgggattca acatttcagc gctatgttga 2340

gggatgaagt cggaggtagg gccgtcaatc ttctaccgtc tgagacggtt caagacattt 2400

acgggatagt ggctaaaaaa gtcaacgaga ttcttcaggc cgacgcgatt aatggcactg 2460

ataacgaggt agtaacagtg actgacgaaa acacgggaga aatatccgag aaagttaaac 2520

ttgggaccaa ggcgctggca ggtcaatggc tggcgtacgg cgttacgagg tctgttacga 2580

aaaggagtgt catgacatta gcgtatggat ctaaggaatt tggatttaga cagcaggtac 2640

tggaggacac catacagcca gcgatcgact ctggcaaagg tttaatgttt acacaaccca 2700

accaggctgc tgggtatatg gcaaaattga tctgggaatc cgtttcagta actgtagtag 2760

ctgcagttga ggctatgaac tggctgaaaa gcgccgccaa actgttagcg gcagaggtaa 2820

aggacaagaa aacgggcgaa atattgagaa agagatgcgc ggtccattgg gtcacgcctg 2880

atgggttccc agtctggcag gaatacaaga aaccaattca aaccagactg aaccttatgt 2940

ttctggggca gtttcgtttg cagcccacca tcaataccaa caaagattca gaaattgacg 3000

cgcacaaaca agagtcaggg atagctccaa acttcgtgca ttcacaagac gggagtcacc 3060

tgagaaagac ggtggtttgg gcccatgaga agtatggtat cgagtctttc gccctgattc 3120

acgactcctt tggtactata ccagcagacg ctgcaaacct tttcaaagct gttagagaga 3180

ctatggtcga cacatatgag tcttgcgatg tattagctga cttctatgac caattcgcgg 3240

accagctaca tgaatcccag ctagacaaaa tgccggcatt acccgccaaa gggaatctga 3300

atctaagaga tattctggaa agcgatttcg ccttcgctta aaagcttttg attaagcctt 3360

ctagtccaaa aaacacgttt ttttgtcatt tatttcattt tcttagaata gtttagttta 3420

ttcattttat agtcacgaat gttttatgat tctatatagg gttgcaaaca agcatttttc 3480

attttatgtt aaaacaattt caggtttacc ttttattctg cttgtggtga cgcgtgtatc 3540

cgcccgctct tttggtcacc catgtattta attgcataaa taattcttaa aagtggagct 3600

agtctatttc tatttacata cctctcattt ctcatttcct cccctcccgc ggtggagctc 3660

cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgta 3705

<210> 19

<211> 2673

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the codon pair optimized T7 RNAP gene for

expression in yeast

<400> 19

atgaacacaa tcaatattgc caaaaatgac cccaagaaaa aacgtaaggt ttttagcgat 60

atcgagctag ctgcaattcc tttcaacacg ctagctgatc attatggtga gcgtctggca 120

agagaacagc tggccctaga gcacgaaagt tatgaaatgg gagaagccag gtttagaaaa 180

atgttcgaaa gacaactaaa agccggcgag gtggctgaca acgcagccgc taagcccctg 240

atcacgacat tactaccaaa aatgattgcc cgtataaacg actggtttga ggaggtgaaa 300

gctaagcgtg gcaagaggcc cacagcgttc cagttccttc aagaaattaa gcctgaagcg 360

gtcgcatata ttacgattaa aaccactcta gcttgtctta caagcgcgga taacacaaca 420

gtacaggctg tagctagcgc gataggcagg gcaatagagg acgaggccag gttcgggcgt 480

attcgtgatc tagaagctaa acattttaaa aaaaacgtgg aagaacagtt aaacaagaga 540

gttgggcatg tgtacaagaa agcgttcatg caggtcgtgg aggctgacat gctttcaaaa 600

ggcctgttgg gaggagaagc atggagtagc tggcacaagg aggactcaat ccatgtcggc 660

gtgaggtgta ttgagatgtt gatagagagt acaggcatgg tgtcattaca ccgtcaaaac 720

gcaggtgttg tgggccaaga ttctgagacg atcgaattag caccagaata cgcggaggcc 780

atagcgactc gtgccggggc gttggcagga atatctccaa tgtttcagcc atgtgtagta 840

cctccgaagc catggactgg aattaccggt gggggctatt gggctaatgg tagaaggccg 900

ttggcactgg tcagaaccca ctcaaaaaaa gctttgatgc gttatgaaga tgtttacatg 960

cccgaggtct ataaggctat caatatcgct caaaacactg cgtggaaaat taataagaaa 1020

gttttggctg ttgcgaacgt tataacaaag tggaaacact gcccagtcga ggacatccct 1080

gcgatcgagc gtgaagaatt gcccatgaaa cctgaagata ttgatatgaa ccctgaagct 1140

ctgacagcgt ggaaaagagc agcagccgct gtttacagaa aagataaggc aagaaaaagt 1200

aggaggatct cactagagtt catgcttgag caggccaata agtttgccaa ccacaaggcc 1260

atctggtttc cttataacat ggactggcgt ggtagggttt acgcagtctc catgtttaat 1320

cctcaaggca acgatatgac caaggggctg cttaccttag caaaggggaa acccattggg 1380

aaggagggat actactggct aaaaatacat ggtgcaaatt gtgcaggggt tgataaagtc 1440

ccatttccgg aaagaataaa attcattgag gagaaccatg agaacataat ggcctgtgct 1500

aaatcaccac ttgagaatac atggtgggcg gagcaagaca gtcccttttg ttttctggca 1560

ttctgctttg agtatgcagg ggtgcagcac catggattga gctataactg ttcactaccc 1620

ttggcatttg atgggagttg tagtgggatt caacatttca gcgctatgtt gagggatgaa 1680

gtcggaggta gggccgtcaa tcttctaccg tctgagacgg ttcaagacat ttacgggata 1740

gtggctaaaa aagtcaacga gattcttcag gccgacgcga ttaatggcac tgataacgag 1800

gtagtaacag tgactgacga aaacacggga gaaatatccg agaaagttaa acttgggacc 1860

aaggcgctgg caggtcaatg gctggcgtac ggcgttacga ggtctgttac gaaaaggagt 1920

gtcatgacat tagcgtatgg atctaaggaa tttggattta gacagcaggt actggaggac 1980

accatacagc cagcgatcga ctctggcaaa ggtttaatgt ttacacaacc caaccaggct 2040

gctgggtata tggcaaaatt gatctgggaa tccgtttcag taactgtagt agctgcagtt 2100

gaggctatga actggctgaa aagcgccgcc aaactgttag cggcagaggt aaaggacaag 2160

aaaacgggcg aaatattgag aaagagatgc gcggtccatt gggtcacgcc tgatgggttc 2220

ccagtctggc aggaatacaa gaaaccaatt caaaccagac tgaaccttat gtttctgggg 2280

cagtttcgtt tgcagcccac catcaatacc aacaaagatt cagaaattga cgcgcacaaa 2340

caagagtcag ggatagctcc aaacttcgtg cattcacaag acgggagtca cctgagaaag 2400

acggtggttt gggcccatga gaagtatggt atcgagtctt tcgccctgat tcacgactcc 2460

tttggtacta taccagcaga cgctgcaaac cttttcaaag ctgttagaga gactatggtc 2520

gacacatatg agtcttgcga tgtattagct gacttctatg accaattcgc ggaccagcta 2580

catgaatccc agctagacaa aatgccggca ttacccgcca aagggaatct gaatctaaga 2640

gatattctgg aaagcgattt cgccttcgct taa 2673

<210> 20

<211> 604

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the S. cerevisiae tdh3 promoter (Ptdh3)

<400> 20

gtgcttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg 60

gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc 120

atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc 180

agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca 240

actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc 300

aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt 360

ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt 420

tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa agacggtagg 480

tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact tttatagtta 540

gtcttttttt tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca cataaacaaa 600

caaa 604

<210> 21

<211> 604

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the S. cerevisiae enoI promoter (PenoI)

<400> 21

gtgcccgcgg aaccgccaga tattcattac ttgacgcaaa agcgtttgaa ataatgacga 60

aaaagaagga agaaaaaaaa agaaaaatac cgcttctagg cgggttatct actgatccga 120

gcttccacta ggatagcacc caaacacctg catatttgga cgacctttac ttacaccacc 180

aaaaaccact ttcgcctctc ccgcccctga taacgtccac taattgagcg attacctgag 240

cggtcctctt ttgtttgcag catgagactt gcatactgca aatcgtaagt agcaacgtgt 300

caaggtcaaa actgtatgga aaccttgtca cctcacttaa ttctagctag cctaccctgc 360

aagtcaagag gtgtccgtga ttcctagcca cctcaaggta tgcctctccc cggaaactgt 420

ggccttttct ggcacacatg atctccacga tttcaacata taaatagctt ttgataatgg 480

caatattaat caaatttatt ttacttcttt cttgtaacat ctctcttgta atcccttatt 540

ccttctagct atttttcata aaaaaccaag caactgctta tcaacacaca aacactaaat 600

caaa 604

<210> 22

<211> 305

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the S. cerevisiae enoI terminator (TenoI)

<400> 22

aagcttttga ttaagccttc tagtccaaaa aacacgtttt tttgtcattt atttcatttt 60

cttagaatag tttagtttat tcattttata gtcacgaatg ttttatgatt ctatataggg 120

ttgcaaacaa gcatttttca ttttatgtta aaacaatttc aggtttacct tttattctgc 180

ttgtggtgac gcgtgtatcc gcccgctctt ttggtcaccc atgtatttaa ttgcataaat 240

aattcttaaa agtggagcta gtctatttct atttacatac ctctcatttc tcatttcctc 300

ccctc 305

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer to the 5' transition of the

pCSN061 backbone to the T7 RNAP expression cassette

<400> 23

ctgtcgattc gatactaacg c 21

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer to the 5' transition of the

pCSN061 backbone to the T7 RNAP expression cassette

<400> 24

ctgcgttgtc agccacctc 19

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer to the 3' transition of the

pCSN061 backbone to the T7 RNAP expression cassette

<400> 25

cacacaggaa acagctatga c 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer to the 3' transition of the

pCSN061 backbone to the T7 RNAP expression cassette

<400> 26

ccggcattac ccgccaaagg 20

<210> 27

<211> 15307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of vector pCSN070

<400> 27

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataaacg acattactat atatataata taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat 240

atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa 300

aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg atccggagct tttctttttt tgccgattaa 360

gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag agggccaaga gggagggcat tggtgactat 420

tgagcacgtg agtatacgtg attaagcaca caaaggcagc ttggagtatg tctgttatta 480

atttcacagg tagttctggt ccattggtga aagtttgcgg cttgcagagc acagaggccg 540

cagaatgtgc tctagattcc gatgctgact tgctgggtat tatatgtgtg cccaatagaa 600

agagaacaat tgacccggtt attgcaagga aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa 660

atagttcagg cactccgaaa tacttggttg gcgtgtttcg taatcaacct aaggaggatg 720

ttttggctct ggtcaatgat tacggcattg atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt 780

ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc cagttattaa aagactcgta tttccaaaag 840

actgcaacat actactcagt gcagcttcac agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg 900

attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt tggattggaa ctcgatttct gactgggttg 960

gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa 1020

atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg 1080

agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat 1140

aggttattac tgagtagtat ttatttaagt attgtttgtg cacttgccta tgcggtgtga 1200

aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt 1260

ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa 1320

atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca 1380

gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc 1440

gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg 1500

aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg 1560

ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg 1620

gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg 1680

ccgctacagg gcgcgtcgcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1740

tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1800

ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgag 1860

cgcgcgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggtacct tttctttttt tgcggtcacc 1920

cccatgtggc ggggaggcag aggagtaggt agagcaacga atcctactat ttatccaaat 1980

tagtctagga actctttttc tagatttttt agatttgagg gcaagcgctg ttaacgactc 2040

agaaatgtaa gcactacgga gtagaacgag aaatccgcca taggtggaaa tcctagcaaa 2100

atcttgctta ccctagctag cctcaggtaa gctagcctta gcctgtcaaa tttttttcaa 2160

aatttggtaa gtttctacta gcaaagcaaa cacggttcaa caaaccgaaa actccactca 2220

ttatacgtgg aaaccgaaac aaaaaaacaa aaaccaaaat actcgccaat gagaaagttg 2280

ctgcgtttct actttcgagg aagaggaact gagaggattg actacgaaag gggcaaaaac 2340

gagtcgtatt ctcccattat tgtctgctac cacgcggtct agtagaataa gcaaccagtc 2400

aacgctaaga caggtaatca aaataccagt ctgctggcta cgggctagtt tttacctctt 2460

ttagaaccca ctgtaaaagt ccgttgtaaa gcccgttctc actgttggcg tttttttttt 2520

tttggtttag tttcttattt ttcatttttt tctttcatga ccaaaaacaa acaaatctcg 2580

cgatttgtac tgcggccact ggggcgtggc caaaaaaatg acaaatttag aaaccttagt 2640

ttctgatttt tcctgttatg aggagatatg ataaaaaata ttactgcttt attgtttttt 2700

ttttatctac tgaaatagag aaacttaccc aaggaggagg caaaaaaaag agtatatata 2760

cagcagctac cattcagatt ttaatatatt cttttctctt cttctacact attattataa 2820

taattttact atattcattt ttagcttaaa acctcataga atattattct tcagtcactc 2880

gcttaaatac ttatcaaaaa tggacaagaa atactctatt ggtttggata tcgggaccaa 2940

ctccgtcggt tgggctgtca tcaccgacga atacaaggtt ccatccaaga aattcaaggt 3000

cttgggtaac actgacagac actctatcaa gaagaatttg atcggtgctt tgttgttcga 3060

ctccggtgaa accgctgaag ctaccagatt gaagcgtacc gctcgtcgta gatacactag 3120

acgtaaaaac cgtatttgtt acttgcaaga aatcttttct aacgaaatgg ccaaggttga 3180

cgactctttc ttccacagat tggaagaatc tttcttggtt gaagaagaca agaagcacga 3240

aagacatcca atcttcggta acatcgttga cgaagttgct taccacgaaa aataccctac 3300

catctaccat ttgagaaaga agttggtcga ttccaccgac aaggctgatt tgagattgat 3360

ctatttggcc ttggctcaca tgatcaagtt cagaggtcac ttcttgattg aaggtgactt 3420

gaacccagac aactctgacg tcgacaaatt gttcatccaa ttggtccaaa cctacaacca 3480

attattcgag gaaaacccaa ttaacgcttc tggtgttgat gctaaggcca tcttatctgc 3540

ccgtttgtcc aagtctagac gtttggaaaa cttgattgct caattgcctg gtgaaaagaa 3600

aaacggtttg ttcggtaact tgatcgcttt gtccttgggt ttgaccccaa acttcaagtc 3660

caacttcgac ttggctgaag atgccaagtt gcaattgtcc aaggacacct acgacgacga 3720

cttagacaac ttgttggctc aaatcggtga ccaatacgcc gacttgttct tggctgccaa 3780

aaacttatct gacgctatct tgttgtctga catcttgaga gttaacactg aaattaccaa 3840

ggctccattg tctgcttcta tgatcaaaag atacgacgaa caccaccaag atctgacttt 3900

gttgaaggct ttggttagac aacaattgcc agaaaagtac aaggaaatct tcttcgacca 3960

atccaaaaat ggttacgccg gttacattga cggtggtgct tctcaggaag aattctacaa 4020

gttcatcaag ccaattttgg aaaagatgga tggtactgaa gaattattgg ttaagttgaa 4080

cagagaagac ttattgagaa agcaacgtac cttcgataac ggttctatcc cacaccaaat 4140

ccacttgggt gaattgcacg ccattttgag aagacaggaa gatttctatc cattcctaaa 4200

ggacaacaga gaaaagatcg aaaagatctt aactttcaga atcccatact acgtcggtcc 4260

attggccaga ggtaattcta gattcgcttg gatgaccaga aagtctgaag aaaccatcac 4320

cccatggaac ttcgaagaag tcgtcgacaa gggtgcttct gcccaatctt tcatcgaaag 4380

aatgaccaac tttgataaga acttgccaaa cgagaaggtc ttgccaaagc actctttgtt 4440

gtacgaatac ttcaccgtct acaacgaatt aaccaaggtt aaatacgtta ctgaaggtat 4500

gagaaagcca gctttcctat ccggtgaaca aaagaaggct attgttgact tgttgtttaa 4560

gaccaacaga aaggtcactg ttaagcaatt gaaggaagac tacttcaaga agattgaatg 4620

tttcgattcc gtcgaaatct ccggtgttga agaccgtttc aatgcttctt tgggcaccta 4680

ccacgatttg ttaaagatca tcaaggacaa ggacttttta gataacgaag aaaacgaaga 4740

catcttggaa gatatcgttt tgaccttgac tcttttcgag gacagagaaa tgattgaaga 4800

gagattgaag acctacgctc acttgttcga cgataaagtt atgaagcaac taaagagaag 4860

aagatacact ggttggggta gattgtccag aaagttgatt aacggtatca gagacaagca 4920

atccggtaag actattttag actttttgaa atccgatggt ttcgctaaca gaaactttat 4980

gcaattgatt cacgacgatt ctttgacttt caaggaagac attcaaaaag cccaagtctc 5040

tggtcaaggt gattctttgc acgaacacat cgctaacttg gctggttctc cagctattaa 5100

gaagggtatc ttacaaaccg tcaaggtcgt tgatgaattg gtcaaagtca tgggtagaca 5160

caagccagaa aatattgtca tcgaaatggc tagagaaaac caaactactc aaaagggtca 5220

aaagaactct agagaacgta tgaagagaat tgaagaaggt atcaaggagt tgggttctca 5280

aattttgaaa gaacacccag tcgaaaacac tcaattacaa aacgaaaagc tatacttgta 5340

ctacttgcaa aacggtcgtg acatgtacgt cgaccaagaa ttggatatca acagattgtc 5400

tgactacgat gtcgatcata tcgtcccaca atcgttcttg aaggacgatt ccattgacaa 5460

caaagttttg actagatctg acaagaacag aggtaagtct gataacgttc catctgaaga 5520

agttgttaag aagatgaaga actactggag acaattgttg aatgctaagt tgatcactca 5580

aagaaagttc gacaacttga ccaaggctga aagaggtggt ttgtccgaat tggacaaagc 5640

cggtttcatc aagagacaat tagtcgaaac tagacaaatc accaagcatg ttgctcaaat 5700

cttggattcc agaatgaaca ctaagtacga tgaaaacgac aaactaatta gagaagttaa 5760

ggtcatcact ttgaagtcta agttggtttc tgacttcaga aaggacttcc aattttacaa 5820

ggtcagagaa atcaacaact accatcacgc tcacgatgcc tacttgaacg ctgttgtcgg 5880

tactgcctta atcaaaaagt acccaaagtt ggaatctgaa ttcgtttacg gtgactacaa 5940

ggtttacgat gttagaaaga tgatcgccaa gtctgaacaa gaaattggta aggccactgc 6000

taagtacttc ttctactcta acatcatgaa ctttttcaag actgaaatca ctttagctaa 6060

cggtgaaatt agaaagcgtc cattgattga aaccaatggt gaaactggtg aaattgtctg 6120

ggacaagggt agagatttcg ctaccgtcag aaaggttttg tctatgccac aagttaacat 6180

cgtcaagaag actgaagttc aaactggtgg tttctctaag gaatccattt tgccaaagag 6240

aaactctgac aagttgattg ctagaaagaa ggactgggat cctaagaagt acggtggttt 6300

cgactctcca actgttgctt actccgtttt ggtcgttgct aaggttgaaa agggtaagtc 6360

taagaagttg aagtctgtta aggaattgtt gggtatcacc atcatggaaa gatcctcctt 6420

cgaaaagaac ccaatcgact ttttggaagc taagggttac aaggaagtca agaaggattt 6480

gatcattaag ttaccaaaat actccttgtt cgaattggaa aacggtagaa agagaatgtt 6540

ggcctccgct ggtgaactac aaaaaggtaa cgaattggct ttaccatcta agtacgttaa 6600

cttcttgtac ttggcttccc actacgaaaa gttgaaaggt tccccagaag acaacgaaca 6660

aaagcaattg tttgttgaac aacacaagca ctacttggat gaaattattg aacaaatctc 6720

cgaattctcc aagagagtca ttttggctga tgctaactta gataaggttt tatccgctta 6780

caacaagcac agagacaaac caatcagaga acaagctgaa aacatcattc atttgttcac 6840

tttaaccaac ttgggtgctc cagctgcttt caaatacttc gacactacca ttgacagaaa 6900

gagatacact tccaccaaag aagttttaga tgctactttg attcaccaat ctattaccgg 6960

tttgtacgaa accagaattg acttgtctca attgggtggt gattccagag ctgatccaaa 7020

gaagaagaga aaggtgtaaa ggagttaaag gcaaagtttt cttttctaga gccgttccca 7080

caaataatta tacgtatatg cttcttttcg tttactatat atctatattt acaagccttt 7140

attcactgat gcaatttgtt tccaaatact tttttggaga tctcataact agatatcatg 7200

atggcgcaac ttggcgctat cttaattact ctggctgcca ggcccgtgta gagggccgca 7260

agaccttctg tacgccatat agtctctaag aacttgaaca agtttctaga cctattgccg 7320

cctttcggat cgctattgtt gcggccgcca gctgaagctt cgtacgctgc aggtcgacga 7380

attctaccgt tcgtataatg tatgctatac gaagttatag atctgtttag cttgcctcgt 7440

ccccgccggg tcacccggcc agcgacatgg aggcccagaa taccctcctt gacagtcttg 7500

acgtgcgcag ctcaggggca tgatgtgact gtcgcccgta catttagccc atacatcccc 7560

atgtataatc atttgcatcc atacattttg atggccgcac ggcgcgaagc aaaaattacg 7620

gctcctcgct gcagacctgc gagcagggaa acgctcccct cacagacgcg ttgaattgtc 7680

cccacgccgc gcccctgtag agaaatataa aaggttagga tttgccactg aggttcttct 7740

ttcatatact tccttttaaa atcttgctag gatacagttc tcacatcaca tccgaacata 7800

aacaaccatg ggtaaggaaa agactcacgt ttcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga 7860

tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat 7920

ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag 7980

cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc 8040

tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc 8100

gatccccggc aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat 8160

tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc 8220

ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt 8280

ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa 8340

agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc 8400

acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg ttggacgagt 8460

cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc 8520

tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg atatgaataa 8580

attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gtactgacaa taaaaagatt 8640

cttgttttca agaacttgtc atttgtatag tttttttata ttgtagttgt tctattttaa 8700

tcaaatgtta gcgtgattta tatttttttt cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag 8760

ttaagtgcgc agaaagtaat atcatgcgtc aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg 8820

ctgtcgattc gatactaacg ccgccatcca gtgtcgaaaa cgagctcata acttcgtata 8880

atgtatgcta tacgaacggt agaattcgaa tcagatccac tagtgtgctt agtcaaaaaa 8940

ttagcctttt aattctgctg taacccgtac atgcccaaaa tagggggcgg gttacacaga 9000

atatataaca tcgtaggtgt ctgggtgaac agtttattcc tggcatccac taaatataat 9060

ggagcccgct ttttaagctg gcatccagaa aaaaaaagaa tcccagcacc aaaatattgt 9120

tttcttcacc aaccatcagt tcataggtcc attctcttag cgcaactaca gagaacaggg 9180

gcacaaacag gcaaaaaacg ggcacaacct caatggagtg atgcaacctg cctggagtaa 9240

atgatgacac aaggcaattg acccacgcat gtatctatct cattttctta caccttctat 9300

taccttctgc tctctctgat ttggaaaaag ctgaaaaaaa aggttgaaac cagttccctg 9360

aaattattcc cctacttgac taataagtat ataaagacgg taggtattga ttgtaattct 9420

gtaaatctat ttcttaaact tcttaaattc tacttttata gttagtcttt tttttagttt 9480

taaaacacca agaacttagt ttcgaataaa cacacataaa caaacaaaat gaacacaatc 9540

aatattgcca aaaatgaccc caagaaaaaa cgtaaggttt ttagcgatat cgagctagct 9600

gcaattcctt tcaacacgct agctgatcat tatggtgagc gtctggcaag agaacagctg 9660

gccctagagc acgaaagtta tgaaatggga gaagccaggt ttagaaaaat gttcgaaaga 9720

caactaaaag ccggcgaggt ggctgacaac gcagccgcta agcccctgat cacgacatta 9780

ctaccaaaaa tgattgcccg tataaacgac tggtttgagg aggtgaaagc taagcgtggc 9840

aagaggccca cagcgttcca gttccttcaa gaaattaagc ctgaagcggt cgcatatatt 9900

acgattaaaa ccactctagc ttgtcttaca agcgcggata acacaacagt acaggctgta 9960

gctagcgcga taggcagggc aatagaggac gaggccaggt tcgggcgtat tcgtgatcta 10020

gaagctaaac attttaaaaa aaacgtggaa gaacagttaa acaagagagt tgggcatgtg 10080

tacaagaaag cgttcatgca ggtcgtggag gctgacatgc tttcaaaagg cctgttggga 10140

ggagaagcat ggagtagctg gcacaaggag gactcaatcc atgtcggcgt gaggtgtatt 10200

gagatgttga tagagagtac aggcatggtg tcattacacc gtcaaaacgc aggtgttgtg 10260

ggccaagatt ctgagacgat cgaattagca ccagaatacg cggaggccat agcgactcgt 10320

gccggggcgt tggcaggaat atctccaatg tttcagccat gtgtagtacc tccgaagcca 10380

tggactggaa ttaccggtgg gggctattgg gctaatggta gaaggccgtt ggcactggtc 10440

agaacccact caaaaaaagc tttgatgcgt tatgaagatg tttacatgcc cgaggtctat 10500

aaggctatca atatcgctca aaacactgcg tggaaaatta ataagaaagt tttggctgtt 10560

gcgaacgtta taacaaagtg gaaacactgc ccagtcgagg acatccctgc gatcgagcgt 10620

gaagaattgc ccatgaaacc tgaagatatt gatatgaacc ctgaagctct gacagcgtgg 10680

aaaagagcag cagccgctgt ttacagaaaa gataaggcaa gaaaaagtag gaggatctca 10740

ctagagttca tgcttgagca ggccaataag tttgccaacc acaaggccat ctggtttcct 10800

tataacatgg actggcgtgg tagggtttac gcagtctcca tgtttaatcc tcaaggcaac 10860

gatatgacca aggggctgct taccttagca aaggggaaac ccattgggaa ggagggatac 10920

tactggctaa aaatacatgg tgcaaattgt gcaggggttg ataaagtccc atttccggaa 10980

agaataaaat tcattgagga gaaccatgag aacataatgg cctgtgctaa atcaccactt 11040

gagaatacat ggtgggcgga gcaagacagt cccttttgtt ttctggcatt ctgctttgag 11100

tatgcagggg tgcagcacca tggattgagc tataactgtt cactaccctt ggcatttgat 11160

gggagttgta gtgggattca acatttcagc gctatgttga gggatgaagt cggaggtagg 11220

gccgtcaatc ttctaccgtc tgagacggtt caagacattt acgggatagt ggctaaaaaa 11280

gtcaacgaga ttcttcaggc cgacgcgatt aatggcactg ataacgaggt agtaacagtg 11340

actgacgaaa acacgggaga aatatccgag aaagttaaac ttgggaccaa ggcgctggca 11400

ggtcaatggc tggcgtacgg cgttacgagg tctgttacga aaaggagtgt catgacatta 11460

gcgtatggat ctaaggaatt tggatttaga cagcaggtac tggaggacac catacagcca 11520

gcgatcgact ctggcaaagg tttaatgttt acacaaccca accaggctgc tgggtatatg 11580

gcaaaattga tctgggaatc cgtttcagta actgtagtag ctgcagttga ggctatgaac 11640

tggctgaaaa gcgccgccaa actgttagcg gcagaggtaa aggacaagaa aacgggcgaa 11700

atattgagaa agagatgcgc ggtccattgg gtcacgcctg atgggttccc agtctggcag 11760

gaatacaaga aaccaattca aaccagactg aaccttatgt ttctggggca gtttcgtttg 11820

cagcccacca tcaataccaa caaagattca gaaattgacg cgcacaaaca agagtcaggg 11880

atagctccaa acttcgtgca ttcacaagac gggagtcacc tgagaaagac ggtggtttgg 11940

gcccatgaga agtatggtat cgagtctttc gccctgattc acgactcctt tggtactata 12000

ccagcagacg ctgcaaacct tttcaaagct gttagagaga ctatggtcga cacatatgag 12060

tcttgcgatg tattagctga cttctatgac caattcgcgg accagctaca tgaatcccag 12120

ctagacaaaa tgccggcatt acccgccaaa gggaatctga atctaagaga tattctggaa 12180

agcgatttcg ccttcgctta aaagcttttg attaagcctt ctagtccaaa aaacacgttt 12240

ttttgtcatt tatttcattt tcttagaata gtttagttta ttcattttat agtcacgaat 12300

gttttatgat tctatatagg gttgcaaaca agcatttttc attttatgtt aaaacaattt 12360

caggtttacc ttttattctg cttgtggtga cgcgtgtatc cgcccgctct tttggtcacc 12420

catgtattta attgcataaa taattcttaa aagtggagct agtctatttc tatttacata 12480

cctctcattt ctcatttcct cccctcccgc ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt 12540

gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 12600

atccgctcac aattccacac aacataggag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 12660

cctaatgagt gaggtaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 12720

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 12780

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 12840

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 12900

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 12960

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 13020

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 13080

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 13140

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 13200

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 13260

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 13320

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 13380

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 13440

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 13500

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 13560

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 13620

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 13680

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 13740

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 13800

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 13860

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 13920

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attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 14040

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 14100

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 14160

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 14220

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 14280

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 14340

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 14400

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tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 14520

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tttaaatttt ttaatataaa tatataaatt aaaaatagaa agtaaaaaaa gaaattaaag 14820

aaaaaatagt ttttgttttc cgaagatgta aaagactcta gggggatcgc caacaaatac 14880

taccttttat cttgctcttc ctgctctcag gtattaatgc cgaattgttt catcttgtct 14940

gtgtagaaga ccacacacga aaatcctgtg attttacatt ttacttatcg ttaatcgaat 15000

gtatatctat ttaatctgct tttcttgtct aataaatata tatgtaaagt acgctttttg 15060

ttgaaatttt ttaaaccttt gtttattttt ttttcttcat tccgtaactc ttctaccttc 15120

tttatttact ttctaaaatc caaatacaaa acataaaaat aaataaacac agagtaaatt 15180

cccaaattat tccatcatta aaagatacga ggcgcgtgta agttacaggc aagcgatccg 15240

tcctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc 15300

tttcgtc 15307

<210> 28

<211> 15307

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of vector pCSN071

<400> 28

tgccgaattg tttcatcttg tctgtgtaga agaccacaca cgaaaatcct gtgattttac 60

attttactta tcgttaatcg aatgtatatc tatttaatct gcttttcttg tctaataaat 120

atatatgtaa agtacgcttt ttgttgaaat tttttaaacc tttgtttatt tttttttctt 180

cattccgtaa ctcttctacc ttctttattt actttctaaa atccaaatac aaaacataaa 240

aataaataaa cacagagtaa attcccaaat tattccatca ttaaaagata cgaggcgcgt 300

gtaagttaca ggcaagcgat ccgtcctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 360

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gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 540

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accataaacg acattactat atatataata 600

taggaagcat ttaatagaca gcatcgtaat atatgtgtac tttgcagtta tgacgccaga 660

tggcagtagt ggaagatatt ctttattgaa aaatagcttg tcaccttacg tacaatcttg 720

atccggagct tttctttttt tgccgattaa gaattaattc ggtcgaaaaa agaaaaggag 780

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aaatttcaag tcttgtaaaa gcatataaaa atagttcagg cactccgaaa tacttggttg 1080

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atatcgtcca actgcatgga gatgagtcgt ggcaagaata ccaagagttc ctcggtttgc 1200

cagttattaa aagactcgta tttccaaaag actgcaacat actactcagt gcagcttcac 1260

agaaacctca ttcgtttatt cccttgtttg attcagaagc aggtgggaca ggtgaacttt 1320

tggattggaa ctcgatttct gactgggttg gaaggcaaga gagccccgaa agcttacatt 1380

ttatgttagc tggtggactg acgccagaaa atgttggtga tgcgcttaga ttaaatggcg 1440

ttattggtgt tgatgtaagc ggaggtgtgg agacaaatgg tgtaaaagac tctaacaaaa 1500

tagcaaattt cgtcaaaaat gctaagaaat aggttattac tgagtagtat ttatttaagt 1560

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tggtgttgat gctaaggcca tcttatctgc ccgtttgtcc aagtctagac gtttggaaaa 3960

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gaaggaagac tacttcaaga agattgaatg tttcgattcc gtcgaaatct ccggtgttga 5040

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cgataaagtt atgaagcaac taaagagaag aagatacact ggttggggta gattgtccag 5280

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caaggaagac attcaaaaag cccaagtctc tggtcaaggt gattctttgc acgaacacat 5460

cgctaacttg gctggttctc cagctattaa gaagggtatc ttacaaaccg tcaaggtcgt 5520

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aggtaagtct gataacgttc catctgaaga agttgttaag aagatgaaga actactggag 5940

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tgacttcaga aaggacttcc aattttacaa ggtcagagaa atcaacaact accatcacgc 6240

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ggaatctgaa ttcgtttacg gtgactacaa ggtttacgat gttagaaaga tgatcgccaa 6360

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aaccaatggt gaaactggtg aaattgtctg ggacaagggt agagatttcg ctaccgtcag 6540

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atggccgcac ggcgcgaagc aaaaattacg gctcctcgct gcagacctgc gagcagggaa 8040

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gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 8640

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cgtaaggttt ttagcgatat cgagctagct gcaattcctt tcaacacgct agctgatcat 10020

tatggtgagc gtctggcaag agaacagctg gccctagagc acgaaagtta tgaaatggga 10080

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tggaaaatta ataagaaagt tttggctgtt gcgaacgtta taacaaagtg gaaacactgc 10980

ccagtcgagg acatccctgc gatcgagcgt gaagaattgc ccatgaaacc tgaagatatt 11040

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aacataatgg cctgtgctaa atcaccactt gagaatacat ggtgggcgga gcaagacagt 11460

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tctgttacga aaaggagtgt catgacatta gcgtatggat ctaaggaatt tggatttaga 11880

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caattcgcgg accagctaca tgaatcccag ctagacaaaa tgccggcatt acccgccaaa 12540

gggaatctga atctaagaga tattctggaa agcgatttcg ccttcgctta aaagcttttg 12600

attaagcctt ctagtccaaa aaacacgttt ttttgtcatt tatttcattt tcttagaata 12660

gtttagttta ttcattttat agtcacgaat gttttatgat tctatatagg gttgcaaaca 12720

agcatttttc attttatgtt aaaacaattt caggtttacc ttttattctg cttgtggtga 12780

cgcgtgtatc cgcccgctct tttggtcacc catgtattta attgcataaa taattcttaa 12840

aagtggagct agtctatttc tatttacata cctctcattt ctcatttcct cccctcccgc 12900

ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat 12960

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacataggag 13020

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gaggtaactc acattaattg 13080

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa 13140

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 13200

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 13260

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 13320

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 13380

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 13440

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 13500

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 13560

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 13620

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 13680

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 13740

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 13800

gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 13860

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 13920

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 13980

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 14040

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 14100

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 14160

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 14220

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 14280

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 14340

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 14400

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 14460

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 14520

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 14580

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 14640

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 14700

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 14760

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 14820

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 14880

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 14940

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 15000

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 15060

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgggtcct 15120

tttcatcacg tgctataaaa ataattataa tttaaatttt ttaatataaa tatataaatt 15180

aaaaatagaa agtaaaaaaa gaaattaaag aaaaaatagt ttttgttttc cgaagatgta 15240

aaagactcta gggggatcgc caacaaatac taccttttat cttgctcttc ctgctctcag 15300

gtattaa 15307

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the INT1 genomic target

<400> 29

tattagaacc agggaggtcc 20

<210> 30

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the Hepatitis Delta Virus ribozyme (HDVr)

<400> 30

ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc gccggctggg caacatgctt cggcatggcg 60

aatgggac 68

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the T7 terminator

<400> 31

aaaaaatcaa actggctcac cttcgggtgg gcctttttgc gtttata 47

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a weak strength T7 promoter that was used

for gRNA expression

<400> 32

taatacgact cactaatact gaa 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a medium strength T7 promoter that was

used for gRNA expression

<400> 33

taatacgact cactacggaa gaa 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a strong T7 promoter that was used for

gRNA expression

<400> 34

taatacgact cactataggg gaa 23

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a wild type strength T7 promoter that was

used for gRNA expression

<400> 35

taatacgact cactatag 18

<210> 36

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a guide RNA expression cassette under

control of the strong T7 promoter

<400> 36

taatacgact cactataggg gaatattaga accagggagg tccgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct gggcaacatg cttcggcatg 180

gcgaatggga caaaaaatca aactggctca ccttcgggtg ggcctttttg cgtttata 238

<210> 37

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a guide RNA expression cassette under

control of the medium T7 promoter

<400> 37

taatacgact cactacggaa gaatattaga accagggagg tccgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct gggcaacatg cttcggcatg 180

gcgaatggga caaaaaatca aactggctca ccttcgggtg ggcctttttg cgtttata 238

<210> 38

<211> 238

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a guide RNA expression cassette under

control of the weak T7 promoter

<400> 38

taatacgact cactaatact gaatattaga accagggagg tccgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttggccggc atggtcccag cctcctcgct ggcgccggct gggcaacatg cttcggcatg 180

gcgaatggga caaaaaatca aactggctca ccttcgggtg ggcctttttg cgtttata 238

<210> 39

<211> 233

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of a guide RNA expression cassette under

control of the wildtype T7 promoter

<400> 39

taatacgact cactatagta ttagaaccag ggaggtccgt tttagagcta gaaatagcaa 60

gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgcttttgg 120

ccggcatggt cccagcctcc tcgctggcgc cggctgggca acatgcttcg gcatggcgaa 180

tgggacaaaa aatcaaactg gctcaccttc gggtgggcct ttttgcgttt ata 233

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the forward primer used to obtain the T7

controlled guide RNA fragment used in transformation

<400> 40

catgtttgac agcttatcat c 21

<210> 41

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the reverse primer used to obtain the T7

controlled guide RNA fragment used in transformation

<400> 41

cacacaggaa acagctatga c 21

<210> 42

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the guide RNA fragment controlled by

strong T7 promoter used in transformation flanked by 84 bp

sequence of pRN1120 on the 5' side and 93 bp sequence of pRN1120

on the 3' side for in vivo assembly into the vector pRN1120

<400> 42

catgtttgac agcttatcat cgataatccg gagctagcat gcggccgctc tagaactagt 60

ggatcccccg ggctgcagga attctaatac gactcactat aggggaatat tagaaccagg 120

gaggtccgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 180

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 240

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacaaaaa atcaaactgg ctcaccttcg 300

ggtgggcctt tttgcgttta tactcgaggg ggggcccggt acccagcttt tgttcccttt 360

agtgagggtt aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtg 415

<210> 43

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the guide RNA fragment controlled by

medium T7 promoter used in transformation flanked by 84 bp

sequence of pRN1120 on the 5' side and 93 bp sequence of pRN1120

on the 3' side for in vivo assembly into the vector pRN1120

<400> 43

catgtttgac agcttatcat cgataatccg gagctagcat gcggccgctc tagaactagt 60

ggatcccccg ggctgcagga attctaatac gactcactac ggaagaatat tagaaccagg 120

gaggtccgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 180

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 240

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacaaaaa atcaaactgg ctcaccttcg 300

ggtgggcctt tttgcgttta tactcgaggg ggggcccggt acccagcttt tgttcccttt 360

agtgagggtt aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtg 415

<210> 44

<211> 415

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the guide RNA fragment controlled by weak

T7 promoter used in transformation flanked by 84 bp sequence of

pRN1120 on the 5' side and 93 bp sequence of pRN1120 on the 3'

side for in vivo assembly into the vector pRN1120

<400> 44

catgtttgac agcttatcat cgataatccg gagctagcat gcggccgctc tagaactagt 60

ggatcccccg ggctgcagga attctaatac gactcactaa tactgaatat tagaaccagg 120

gaggtccgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg 180

aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc 240

ggctgggcaa catgcttcgg catggcgaat gggacaaaaa atcaaactgg ctcaccttcg 300

ggtgggcctt tttgcgttta tactcgaggg ggggcccggt acccagcttt tgttcccttt 360

agtgagggtt aattccgagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtg 415

<210> 45

<211> 410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the guide RNA fragment controlled by wild

type T7 promoter used in transformation flanked by 84 bp sequence

of pRN1120 on the 5' side and 93 bp sequence of pRN1120 on the 3'

side for in vivo assembly into the vector pRN1120

<400> 45

catgtttgac agcttatcat cgataatccg gagctagcat gcggccgctc tagaactagt 60

ggatcccccg ggctgcagga attctaatac gactcactat agtattagaa ccagggaggt 120

ccgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa 180

gtggcaccga gtcggtgctt ttggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg 240

ggcaacatgc ttcggcatgg cgaatgggac aaaaaatcaa actggctcac cttcgggtgg 300

gcctttttgc gtttatactc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga 360

gggttaattc cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 410

<210> 46

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of upper strand of the 100 bp left flank

<400> 46

cttcatgcca gcaatagttg cgtgctgagc tcaacagtgc ccaacccttg aagcgacttc 60

caatcgcttt gcatatccag taccacaccc acaggcgttt 100

<210> 47

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the 100 bp left flank in the reverse

orientation complementary to SEQ ID NO: 46

<400> 47

aaacgcctgt gggtgtggta ctggatatgc aaagcgattg gaagtcgctt caagggttgg 60

gcactgttga gctcagcacg caactattgc tggcatgaag 100

<210> 48

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the 100 bp right flank in the forward

orientation

<400> 48

agaaagcctg tatgcgaagc cacaatcctt tccaacagac catactaagt attctttgtc 60

atcagacaac ttgttgagtg gtactaaagg agtgcttttc 100

<210> 49

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the 100 bp right flank in the reverse

orientation complementary to SEQ ID NO: 48

<400> 49

gaaaagcact cctttagtac cactcaacaa gttgtctgat gacaaagaat acttagtatg 60

gtctgttgga aaggattgtg gcttcgcata caggctttct 100

<210> 50

<211> 1726

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the YFP donor DNA expression cassette

<400> 50

aagcgacttc caatcgcttt gcatatccag taccacaccc acaggcgttt gtgcttagtc 60

aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc ccaaaatagg gggcgggtta 120

cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt tattcctggc atccactaaa 180

tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa aaagaatccc agcaccaaaa 240

tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc tcttagcgca actacagaga 300

acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat ggagtgatgc aacctgcctg 360

gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat ctatctcatt ttcttacacc 420

ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga aaaaaaaggt tgaaaccagt 480

tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa agacggtagg tattgattgt 540

aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact tttatagtta gtcttttttt 600

tagttttaaa acaccaagaa cttagtttcg aataaacaca cataaacaaa caaaatgtct 660

aaaggtgaag aattattcac tggtgttgtc ccaattttgg ttgaattaga tggtgatgtt 720

aatggtcaca aattttctgt ctccggtgaa ggtgaaggtg atgctactta cggtaaattg 780

accttaaaat tgatttgtac tactggtaaa ttgccagttc catggccaac cttagtcact 840

actttaggtt atggtttgca atgttttgct agatacccag atcatatgaa acaacatgac 900

tttttcaagt ctgccatgcc agaaggttat gttcaagaaa gaactatttt tttcaaagat 960

gacggtaact acaagaccag agctgaagtc aagtttgaag gtgatacctt agttaataga 1020

atcgaattaa aaggtattga ttttaaagaa gatggtaaca ttttaggtca caaattggaa 1080

tacaactata actctcacaa tgtttacatc actgctgaca aacaaaagaa tggtatcaaa 1140

gctaacttca aaattagaca caacattgaa gatggtggtg ttcaattagc tgaccattat 1200

caacaaaata ctccaattgg tgatggtcca gtcttgttac cagacaacca ttacttatcc 1260

tatcaatctg ccttatccaa agatccaaac gaaaagagag atcacatggt cttgttagaa 1320

tttgttactg ctgctggtat tacccatggt atggatgaat tgtacaaata aaagcttttg 1380

attaagcctt ctagtccaaa aaacacgttt ttttgtcatt tatttcattt tcttagaata 1440

gtttagttta ttcattttat agtcacgaat gttttatgat tctatatagg gttgcaaaca 1500

agcatttttc attttatgtt aaaacaattt caggtttacc ttttattctg cttgtggtga 1560

cgcgtgtatc cgcccgctct tttggtcacc catgtattta attgcataaa taattcttaa 1620

aagtggagct agtctatttc tatttacata cctctcattt ctcatttcct cccctcagaa 1680

agcctgtatg cgaagccaca atcctttcca acagaccata ctaagt 1726

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence forward primer to obtain the 577 bp left

flank for integration of the YFP donor DNA cassette

<400> 51

cactatagca atctggctat atg 23

<210> 52

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence reverse primer to obtain the 577 bp left

flank for integration of the YFP donor DNA cassette

<400> 52

aaacgcctgt gggtgtggta ctggatatgc aaagcgattg gaagtcgctt gactcctctg 60

ccgtcattcc 70

<210> 53

<211> 577

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the left flank for integration of YFP

donor expression cassette in INT1 locus of S. cerevisiae

<400> 53

cactatagca atctggctat atgatatgca gaaaatagtg attactgtgc tctttgctgc 60

atcatgcatc atatgtttgg cattctgtcc tgtcagatga atgggcgaaa caattcgggg 120

agctttgttg cgacttggta cccggcaagc cgcgacctat attttgcatt aaacgagttc 180

atcgtggatt tatcgccatg agccttagct tatcaagcct ctcacagaca attaagcaat 240

gaaaaaggta taccatcggc gcagaatggt taactagtgg gttcatactg ctgtgttata 300

gattgttacc taagtgatca ccaaaaaaaa gtgcaaaaag gaaaaaaaaa taagagacag 360

gtaacttcca caagcttatt cttccaaaaa tcaatcttat cttcatgcca gcaatagttg 420

cgtgctgagc tcaacagtgc ccaacccttg tgcaccgtag aattgtagaa tacaaataca 480

taaataagtg tgttcccgaa ggactaagga atgacggcag aggagtcaag cgacttccaa 540

tcgctttgca tatccagtac cacacccaca ggcgttt 577

<210> 54

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence forward primer to obtain the 581 bp right

flank for integration of the YFP donor DNA expression cassette

<400> 54

agaaagcctg tatgcgaagc cacaatcctt tccaacagac catactaagt aagcgttgaa 60

gtttcctctt tg 72

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence reverse primer to obtain the 581 bp right

flank for integration of the YFP donor DNA expression cassette

<400> 55

tgtcaactgg agagctatcg 20

<210> 56

<211> 581

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the right flank for integration of YFP

donor expression cassette in INT1 locus of S. cerevisiae

<400> 56

agaaagcctg tatgcgaagc cacaatcctt tccaacagac catactaagt aagcgttgaa 60

gtttcctctt tgtatatttg agatcttcat tttatcggat tctttgtcat cagacaactt 120

gttgagtggt actaaaggag tgcttttcat catccttttg gtgaacgatt tcaaatacgt 180

tagtgttttc tgagctagtt ttgatcaatt caggtgattc gttatcagaa ctctcaggtt 240

tgtattcgtg tccagttgtg tagcattcgc ctaacgtgta agcacggatt tcttcctcag 300

aaatttcact gtatggaatc atgcccttct ttctcgcttc ttcgtcggta aatgcaccat 360

agtaatcttt gtcatcatgt ctaacagtaa ttttgaatgg gaagaagaca catagccccc 420

agtaaacgaa aaaagaaatc aaaaaggaga agaaagaatc accataaaag aatttaacaa 480

tacctgagtc gtggaaatag ttattgttga cttcccaagc gataccaggt agaccgggag 540

ccataccaca cacccaggca acgatagctc tccagttgac a 581

<210> 57

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the forward primer for amplification of

the YFP expression cassette

<400> 57

gtgcttagtc aaaaaattag ccttttaatt c 31

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the reverse primer for amplification of

the YFP expression cassette

<400> 58

gaggggagga aatgagaaat gag 23

<210> 59

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the forward primer for amplification of

the YFP donor DNA expression cassette including connector 5 on

the 5' side

<400> 59

aagcgacttc caatcgcttt gcatatccag taccacaccc acaggcgttt gtgcttagtc 60

aaaaaattag cc 72

<210> 60

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the reverse primer for amplification of

the YFP donor DNA expression cassette including connector 3 on

the 3' side

<400> 60

acttagtatg gtctgttgga aaggattgtg gcttcgcata caggctttct gaggggagga 60

aatgagaaat gag 73

<210> 61

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of the guide RNA structural element as

described by DiCarlo

<400> 61

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgctttt 80

<210> 62

<211> 998

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of ordered gBlock donor DNA with fwnA as

target

<400> 62

caactggaag caatatcacc aggactttag ctcctctctc caggtcctcc gcctcccagc 60

ctacaagtgg gatctcaaga actactggat tccctatacc aacaacttct gcctgagcaa 120

gggcgctcca gttgcgacag tagcggcagg gccacagcat gagtacctga caaccgcggc 180

tcagaaggtc attgagactc gaagtgatgg agcaacagct acagtcgtga tagagaacga 240

cattgctgat cccgagctca accgcgtcat tcaaggccat aaggtcaacg gtactgcttt 300

gtgtccctca tcactatatg ccgacatctc tcaaacgctt gcagagtatc tcatcaaaaa 360

gtacaagcct gagtacgacg gacttggact ggatgtgtgt gaggtcacag tgccacgacc 420

actgattgcg aaaggcggac agcagctctt tagagtatct gcgacagcgg attgggcgga 480

gaagaagaca acccatatat tcagtcactg ccgaggggaa gaagacggct gaccacgcaa 540

cttgcactgt ccgattcttt gactgcgctg ctgcggaggc ggaatggaaa cgagtttcct 600

accttgtcaa gaggagcatt gaccgactgc atgatatcgc cgaaaatggt gacgctcacc 660

gtcttggtag aggcatggtt tacaaactct tcgctgcctt ggttgattat gacgacaact 720

tcaagtccat tcgcgaggtt attcttgaca gtgaacagca cgaagcgact gcacgcgtca 780

agttccaagc accacaaggc aatttccacc gaaacccgtt ctggattgac agttttggac 840

acctgtctgg gttcatcatg aacgcaagcg atgcaaccga ctccaagaac caggtctttg 900

tcaatcacgg atgggactcc atgcgttgtt tgaagaagtt ctcgcctgat gtcacctaca 960

ggacttatgt tagaatgcag ccttggaaag actccatc 998

<210> 63

<211> 4517

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of TOPO vector with donor DNA (target fwnA)

result of cloning gBlock donor DNA in TOPO-vector

<400> 63

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctat 240

ttaggtgaca ctatagaata ctcaagctat gcatcaagct tggtaccgag ctcggatcca 300

ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc gcccttcaac tggaagcaat atcaccagga 360

ctttagctcc tctctccagg tcctccgcct cccagcctac aagtgggatc tcaagaacta 420

ctggattccc tataccaaca acttctgcct gagcaagggc gctccagttg cgacagtagc 480

ggcagggcca cagcatgagt acctgacaac cgcggctcag aaggtcattg agactcgaag 540

tgatggagca acagctacag tcgtgataga gaacgacatt gctgatcccg agctcaaccg 600

cgtcattcaa ggccataagg tcaacggtac tgctttgtgt ccctcatcac tatatgccga 660

catctctcaa acgcttgcag agtatctcat caaaaagtac aagcctgagt acgacggact 720

tggactggat gtgtgtgagg tcacagtgcc acgaccactg attgcgaaag gcggacagca 780

gctctttaga gtatctgcga cagcggattg ggcggagaag aagacaaccc atatattcag 840

tcactgccga ggggaagaag acggctgacc acgcaacttg cactgtccga ttctttgact 900

gcgctgctgc ggaggcggaa tggaaacgag tttcctacct tgtcaagagg agcattgacc 960

gactgcatga tatcgccgaa aatggtgacg ctcaccgtct tggtagaggc atggtttaca 1020

aactcttcgc tgccttggtt gattatgacg acaacttcaa gtccattcgc gaggttattc 1080

ttgacagtga acagcacgaa gcgactgcac gcgtcaagtt ccaagcacca caaggcaatt 1140

tccaccgaaa cccgttctgg attgacagtt ttggacacct gtctgggttc atcatgaacg 1200

caagcgatgc aaccgactcc aagaaccagg tctttgtcaa tcacggatgg gactccatgc 1260

gttgtttgaa gaagttctcg cctgatgtca cctacaggac ttatgttaga atgcagcctt 1320

ggaaagactc catcaagggc gaattctgca gatatccatc acactggcgg ccgctcgagc 1380

atgcatctag agggcccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg 1440

ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 1500

atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 1560

agttgcgcag cctatacgta cggcagttta aggtttacac ctataaaaga gagagccgtt 1620

atcgtctgtt tgtggatgta cagagtgata ttattgacac gccggggcga cggatggtga 1680

tccccctggc cagtgcacgt ctgctgtcag ataaagtctc ccgtgaactt tacccggtgg 1740

tgcatatcgg ggatgaaagc tggcgcatga tgaccaccga tatggccagt gtgccggtct 1800

ccgttatcgg ggaagaagtg gctgatctca gccaccgcga aaatgacatc aaaaacgcca 1860

ttaacctgat gttctgggga atataaatgt caggcatgag attatcaaaa aggatcttca 1920

cctagatcct tttcacgtag aaagccagtc cgcagaaacg gtgctgaccc cggatgaatg 1980

tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc aaagagaaag caggtagctt 2040

gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt atggacagca agcgaaccgg 2100

aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc ctgcaaagta aactggatgg 2160

ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag ctctgatcaa gagacaggat 2220

gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 2280

tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 2340

tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctgtccggtg 2400

ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 2460

cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 2520

aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 2580

tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 2640

aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt gtcgatcagg 2700

atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 2760

cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 2820

tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 2880

accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 2940

gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 3000

tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt 3060

attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat acaggtggca cttttcgggg 3120

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 3180

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac gtgaggaggg ccaccatggc 3240

caagttgacc agtgccgttc cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag cggtcgagtt 3300

ctggaccgac cggctcgggt tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt 3360

ccgggacgac gtgaccctgt tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac 3420

cctggcctgg gtgtgggtgc gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt 3480

gtccacgaac ttccgggacg cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg 3540

ggggcgggag ttcgccctgc gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg tggccgagga 3600

gcaggactga cacgtgctaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct 3660

ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 3720

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 3780

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 3840

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 3900

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 3960

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 4020

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 4080

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 4140

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 4200

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 4260

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 4320

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg gcttttgctg 4380

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 4440

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 4500

gagcgaggaa gcggaag 4517

<210> 64

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer donor DNA PCR fragment

(target fwnA)

<400> 64

caactggaag caatatcacc agg 23

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer donor DNA PCR fragment

(target fwnA)

<400> 65

gatggagtct ttccaaggct g 21

<210> 66

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer to amplify the Cas9

cassette with additional KpnI-flank for ligation in AMA-vector

<400> 66

cccggtaccg caactctctg gaaatgaagg c 31

<210> 67

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer to amplify the Cas9

cassette with additional KpnI-flank for ligation in AMA-vector

<400> 67

cccggtaccg aggttcatgg tatgggcacg 30

<210> 68

<211> 19569

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of BG-AMA17 (Cas9/hygB) - result of ligation

PCR-fragment (Cas9-cassette with KpnI-flanks) and BG-AMA8

<400> 68

ggtaccgagg ttcatggtat gggcacgaat gtcaaaaatt ttcaggctca aacgggtatg 60

tattcagtat ctatctccgt gtacgacggc taattgagcc cagctgcatt tcgaactctt 120

ctcccagcgc attttgtgtg ggagttcttc gatgctgacc atgactgcga ggctgctgag 180

ggagtgcgcg gtatctaccc cggcccgtat ctggcttcta caaggagtga aactagttta 240

tactttgtag ttcggaatcc aatgctatta accgttttta ctttttcttt tgttcgagct 300

aagcgcttgt ttaaaccttg cgcttcttct tgggatcggc acgagagtca ccaccgagct 360

gagacaggtc gatacgagtc tcgtacagac cggtaatcga ctggtggatc agagtcgcat 420

caagcacttc cttggtggag gtgtaacgct tgcggtcgat ggtggtgtca aagtacttga 480

aagcagcagg agcacccagg ttggtgaggg tgaacaggtg gatgatgttc tccgcctgct 540

cgcggatggg cttgtcacgg tgcttgttgt aggcagagag gaccttgtca aggttggcat 600

cggccaggat gacacgcttg ctgaactcgg agatctgctc gatgatctca tccaggtagt 660

gcttgtgctg ctcgacaaag agctgcttct gctcgttgtc ctcgggagag cccttgagct 720

tctcgtagtg ggaggccagg tagaggaagt tgacgtactt ggaggggagg gcaagctcgt 780

tacccttctg gagctcaccg gcggaagcaa gcatgcgctt acggccgttc tccagctcga 840

acagagagta cttggggagc ttgatgatga ggtccttctt gacctctttg taacccttgg 900

cctccaggaa gtcgataggg ttcttctcga agctgctgcg ttccatgatg gtgataccga 960

ggagttcctt cacactcttc agcttcttgc tcttgccctt ctcgaccttg gcgacaacca 1020

agacggagta ggcaacggta ggcgaatcga atccaccgta cttcttgggg tcccaatcct 1080

tcttgcgagc gatcagcttg tcggagttgc gcttgggaag aatcgactcc ttggagaaac 1140

caccagtctg cacctcggtc ttcttgacaa tgttgacctg gggcatagaa aggaccttgc 1200

ggacggtagc gaagtcacgg cccttgtccc agacgatctc accggtttcg ccgttagtct 1260

caatcaaggg acgcttgcga atctcgccgt tggccaatgt tatttcggtc ttgaagaagt 1320

tcatgatgtt gctgtagaag aagtacttgg cagtggcctt tccgatctcc tgctcggact 1380

tagcgatcat cttgcgcacg tcgtacacct tgtagtcacc gtagacgaac tcggactcga 1440

gcttgggata cttcttaatc aaagcagtac cgacgacggc gttgaggtag gcatcgtgag 1500

cgtggtggta gttgttgatc tcgcggacct tgtagaactg gaagtctttc ctaaagtcac 1560

tgaccagctt gctctttaag gtgatgacct tgacctcacg gatgagcttg tcgttctcgt 1620

cgtacttggt gttcatgcga gagtccagga tctgggcaac gtgcttagtg atctgacggg 1680

tttcaaccaa ttgacgcttg atgaaaccgg ccttgtcgag ctcggagagt ccgccacgct 1740

cggccttggt aaggttgtcg aacttgcgct gagtgatgag cttagcgttg agcaattgtc 1800

tccagtagtt cttcatcttc ttaacaacct cttccgaggg gacgttatcg ctcttgccac 1860

gattcttgtc ggaacgggtg agcaccttgt tgtcaatgct gtcatccttg aggaaggact 1920

gggggacgat gtggtcaaca tcgtagtcgg agaggcggtt gatatccagc tcctggtcga 1980

cgtacatgtc acgtccgttc tgcaagtagt agaggtagag cttctcattc tgcagctggg 2040

tgttctcgac ggggtgttcc ttgagaatct gggaaccgag ctccttgatg ccttcctcga 2100

tacgcttcat gcgctcacgg ctgttcttct gacccttctg agtggtctgg ttctcacgag 2160

ccatttcgat gacgatgttc tcgggcttgt gacgacccat gaccttcaca agctcgtcaa 2220

caaccttcac agtctgcagg atacccttct tgatagcggg ggaaccagcc aggttggcaa 2280

tgtgttcgtg tagcgagtca ccctggccgg agacttgggc cttctggatg tcctctttga 2340

aggtcagaga gtcgtcgtgg atgagctgca tgaagttgcg gttggcgaag ccgtcggact 2400

tcaggaagtc aaggatggtc ttgccagact gcttatcacg gataccgtta atcaacttgc 2460

gagagaggcg accccagcca gtgtaacggc ggcgcttcaa ctgcttcatg accttgtcgt 2520

cgaagaggtg agcgtaggtc ttcagacgtt cttcgatcat ctcacggtcc tcgaagaggg 2580

tgagggtaag aacaatgtcc tcaagaatgt cttcgttctc ctcgttgtca aggaagtcct 2640

tgtccttgat gatcttgagc agatcgtggt aggtgccgag agaagcgttg aagcggtcct 2700

caacaccgga gatctcaacg gagtcaaagc actcgatctt cttgaagtag tcttccttga 2760

gctgcttgac ggtcaccttg cggttagtct tgaacagcag gtcgacaatg gccttcttct 2820

gttcgccgga gaggaaagca ggcttgcgca tgccctcggt cacgtacttg accttggtca 2880

gctcgttgta gacagtgaag tactcgtaca agagggagtg cttgggcagg actttctcgt 2940

tgggcaggtt cttgtcgaag ttggtcatac gctcaatgaa gctctgagcg gaggcaccct 3000

tgtcgacgac ttcctcgaag ttccaggggg tgatggtttc ctcggacttg cgggtcatcc 3060

aggcgaagcg ggagttaccg cgagccagag gaccgacgta gtaggggata cggaaggtca 3120

ggatcttctc aatcttctca cggttgtcct tcaagaaagg gtagaagtct tcctggcgac 3180

gaaggatggc gtgcaattca cccaggtgga tctggtgggg gatgctgccg ttgtcgaaag 3240

tacgctgctt gcgcagaagg tcctcacggt tcagcttaac aagaagctcc tcagtgccat 3300

ccatcttctc gaggataggc ttaatgaact tgtagaattc ttcctgggaa gcaccaccgt 3360

cgatgtaacc ggcgtagccg ttcttggact ggtcgaagaa gatctccttg tacttttcgg 3420

ggagctgctg gcggaccaga gccttgagta gggtgaggtc ctggtggtgc tcatcgtatc 3480

tcttgatcat agaggcggag agaggggcct tggtgatctc agtgttgaca cggaggatat 3540

ctgacaggag aatggcatcg gagaggttct tggcagctag gaagaggtcg gcgtactgat 3600

ctcctatctg ggcgagaagg ttatcaaggt cgtcgtcgta ggtatccttg gaaagttgta 3660

acttagcatc ctcagcaaga tcgaagttgc tcttgaagtt gggagtcagt ccgagggaca 3720

gggcaataag gttgccgaaa agaccgttct tcttctcacc agggagctgg gcaatcaagt 3780

tctcaagacg gcgggacttg ctcaggcgag cggagaggat ggccttggca tccacgccag 3840

acgcgttgat ggggttttcc tcgaaaagct ggttgtaggt ctgaacgagc tggatgaaga 3900

gtttatcaac atcggagttg tcggggttga ggtcaccctc gatcaggaag tgaccacgga 3960

acttgatcat gtgcgccaga gccaggtaaa tgaggcggag gtcagccttg tcggtgctgt 4020

cgacgagctt tttgcgtagg tggtagatgg tggggtactt ctcgtggtaa gcgacctcat 4080

cgacaatgtt accgaagata gggtgacgct cgtgcttctt gtcttcttca acaaggaacg 4140

actcctccag acggtggaag aaagagtcat caaccttggc catctcgttg gagaaaatct 4200

cctggaggta gcagatacgg ttcttgcggc gagtgtaacg acggcgagcg gtacgcttca 4260

gacgggtggc ctcagcagtc tcaccggagt cgaagagaag cgcaccaatg aggttcttct 4320

tgatggagtg acgatcggtg tttcccagga ccttgaattt cttgctagga accttgtact 4380

cgtcggtgat gacagcccag ccaacggagt tggtgccaat gtccagaccg atgctatact 4440

tcttgtccat tttgacggtg gaaggtgagt tggggttggt gtcatcgtgg gggaagaact 4500

tggcttttat atgggtgcag gtgaggggac ttaagccacg tgaaagttca ttcgagagag 4560

ctaaggcata ttaatgcaca tgtgtgggag ttgcatggaa cttgcatgaa aggtgcatga 4620

aaggtgcatg gtattgcaga atgcgctcgg gggtctgcgg agaaatccgt taggaaaaga 4680

tcgtcatcct tctgctgcat caccgttagc ttgaaattta gttccagcgc tagtcaaggg 4740

cttcagttca gattctgcaa gtatcaggtc catcattact ctcttcagca ggcggatcga 4800

atatcccccg aggcacatgg gaggtcttat tatccgatcg ttgatcacca tgccaatcgc 4860

ttcgaccgac cacaagttgc atcaagcact aactgcctca agcagatgcc gagtcttcat 4920

ctccgatatt taatcccgtt gaatctccgc cccctgtcat ctccaccgtt taatctgggg 4980

tggtggcgga tgtccaccaa ttagccggct aaattatccc catcgtcagc acgctagacc 5040

tgccttggaa ctagcgcttt ggtgagaaat ctcttggttg tgagtctgat accacattcc 5100

ttgacttcca tgttgttctg gaggtgtgaa agtataaaca atgccacaga tggactaatc 5160

tccggagaga tgaccctctt caagactggt gcagtgccta ggatcgctag tatcccaaaa 5220

cttcggggct gccttcattt ccagagagtt gcggtacctt gcccatcgaa cgtacaagta 5280

ctcctctgtt ctctccttcc tttgctttgt gcggagaccg gcttactaaa agccagataa 5340

cagtatgcat atttgcgcgc tgatttttgc ggtataagaa tatatactga tatgtatacc 5400

cgaagtatgt caaaaagagg tatgctatga agcagcgtat tacagtgaca gttgacagcg 5460

acagctatca gttgctcaag gcatatatga tgtcaatatc tccggtctgg taagcacaac 5520

catgcagaat gaagcccgtc gtctgcgtgc cgaacgctgg aaagcggaaa atcaggaagg 5580

gatggctgag gtcgcccggt ttattgaaat gaacggctct tttgctgacg agaacagggg 5640

ctggtgaaat gcagtttaag gtttacacct ataaaagaga gagccgttat cgtctgtttg 5700

tggatgtaca gagtgatatt attgacacgc ccgggcgacg gatggtgatc cccctggcca 5760

gtgcacgtct gctgtcagat aaagtctccc gtgaacttta cccggtggtg catatcgggg 5820

atgaaagctg gcgcatgatg accaccgata tggccagtgt gccggtttcc gttatcgggg 5880

aagaagtggc tgatctcagc caccgcgaaa atgacatcaa aaacgccatt aacctgatgt 5940

tctggggaat ataaggtctc gcctccggat cgatgtacac aaccgactgc acccaaacga 6000

acacaaatct tagcagtgcc ctcgccggat agcttggact gtcctttacc gtcgccagca 6060

caagaagggt atctctgagg tccgtaccgc cttttcttta ccactggatt cgattttcgc 6120

agttggaatg atacatctgg ggactgcgaa tggtttaccc ctcggccgat actatgggtc 6180

gtgaagagat ggaacattcc gaaagtgttt tgcggataac attggtggca tcgaaaacag 6240

aatgctgacc attgatttca acacgaacag gaggttgcca agaagcgtac ccgccgtgtc 6300

gtcaagtccc agcgtgccat cgtcggtgct tccctcgacg tgatcaagga gcgccgctcc 6360

cagcgccccg aggcccgtgc cgccgcccgc cagcaggcca tcaaggacgc caaggagaag 6420

aaggctgccg ctgagtccaa gaagaaggct gagaaggcta agaacgccgc tgctggtgcc 6480

aagggtgctg ctcagcgcat ccagagcaag cagggtgcta agggttctgc tcccaaggtc 6540

gctgccaagt ctcgttaagg aatgaataac ggttcggctt gggattgggt gcggaaggca 6600

agagtttcat ggacgaattt tgggaggtta ctggagctgg aatatgtgtt ttccctacca 6660

ccaaaaatga aatgttccaa aactatcggc gtgcaagacg gcctcttacg ggtttaacgg 6720

ctctcagata agctctatca atcgcgccac ggatgcatga atgaagatcc agatggccgc 6780

gggatatatc gtgctagtgt aattcctaca tgatcttgct gttcactcca tgcgcatcca 6840

gatattccag gggtcgactg ttaattgata tgcctgggct tgagactccg tagacgccca 6900

gtcaatgtgc aattaatacg agggtgctgt tatcggcagc aaccttgtac ttctccataa 6960

gatgggggaa tgccatggac ctgagtgatc aattgacgca agtctcccat aacgcggcgg 7020

cttgacctaa aatccatata ccgccccgtt gagcctccgc gctccagagt cctgtcccgg 7080

aatagggcac aaacctaggc taacctaatt cgtcgtccgc gtctgagttc agacaaaaga 7140

acttccaagt atcagcagag tacgctgata ttgataagta ggcaaacata agaccaataa 7200

gcaagtagaa taaaaaatta taaggacact gcctccataa agcgccctcc caagacctca 7260

gggacaaaac ttctcaagtg gcaattcact gcctcaggcc gtgtccagtg aagtgacgaa 7320

gcgacactgt tgcctgctga ctcagccgct ttccgccctg ccgaatttgc catctcgctt 7380

acaggtcagc actagcgcga ttcgcccaca gatgctcagc gcaaagtggt gactcagtca 7440

aaccccccct acaagattcc acctcgattt ttcaacttcc catctcgatc cgacaagttc 7500

tacatccacc gtcaaaatgg cctccagcga agatgtcatc aaggagttca tgcgcttcaa 7560

ggtccgcatg gaaggatccg tcaacggcca cgagttcgag attgagggtg agggtgaggg 7620

ccgcccctac gaaggcaccc agactgccaa gctcaaggtc accaagggtg gtcctctccc 7680

cttcgcttgg gatatcctgt ctcctcagtt ccagtacggc tccaaggtct acgtcaagca 7740

ccccgccgac atccccgact acaagaagct ttctttcccc gagggtttca agtgggagcg 7800

tgtcatgaac ttcgaggatg gtggtgttgt gaccgttact caggacagca gcttgcagga 7860

tggctctttc atctacaagg tcaagttcat tggtgtcaac ttcccctccg acggccctgt 7920

catgcagaag aagaccatgg gctgggaagc gtcgactgag cgtctgtacc cccgtgacgg 7980

tgttctcaag ggtgagatcc acaaggctct caagctcaag gacggtggtc actaccttgt 8040

tgagttcaag tccatctaca tggccaagaa gcctgtgcag ctgcccggat actactacgt 8100

ggactccaag cttgacatca cctcccacaa cgaagactac accattgttg agcagtacga 8160

gcgtgctgag ggccgccacc acctcttcct gacccacgga atggatgagc tgtacaagtc 8220

gaaactataa ataaatggtt tgcgttgcga ttgactgaaa cgaaaaaaag cgaaaatgat 8280

tctgggaatg aattgataaa gcgcgggctc tgcggtacgg ttacggttgc ggtcgcggac 8340

gaatggactg ggctgagctg ggctggagga agtccatcga acaaggacaa ggggtggaat 8400

atggcacggg tcgattttgt tatacatacc ctaccatcca tctatccatt taaataccaa 8460

atgagttgtt gaatggattc gcggtcttct cggtttattt ttgcttgctt gcgtgcttaa 8520

gggatagtgt gcctcacgct ttccggcatc ttccagacca cagtatatcc atccgcctcc 8580

tgttgaagct tattttttgt atactgtttt gtgatagcac gaagtttttc cacggtatct 8640

tgttaaaaat atatatttgt ggcgggctta cctacatcaa attaataaga gactaattat 8700

aaactaaaca cacaagcaag ctactttagg gtaaaagttt ataaatgctt ttgacgtata 8760

aacgttgctt gtatttatta ttacaattaa aggtggatag aaaacctaga gactagttag 8820

aaactaatct caggtttgcg ttaaactaaa tcagagcccg agaggttaac agaacctaga 8880

aggggactag atatccgggt agggaaacaa aaaaaaaaaa caagacagcc acatattagg 8940

gagactagtt agaagctagt tccaggacta ggaaaataaa agacaatgat accacagtct 9000

agttgacaac tagatagatt ctagattgag gccaaagtct ctgagatcca ggttagttgc 9060

aactaatact agttagtatc tagtctccta taactctgaa gctagaataa cttactacta 9120

ttatcctcac cactgttcag ctgcgcaaac ggagtgattg caaggtgttc agagactagt 9180

tattgactag tcagtgacta gcaataacta acaaggtatt aacctaccat gtctgccatc 9240

accctgcact tcctcgggct cagcagcctt ttcctcctca ttttcatgct cattttcctt 9300

gtttaagact gtgactagtc aaagactagt ccagaaccac aaaggagaaa tgtcttacca 9360

ctttcttcat tgcttgtctc ttttgcatta tccatgtctg caactagtta gagtctagtt 9420

agtgactagt ccgacgagga cttgcttgtc tccggattgt tggaggaact ctccagggcc 9480

tcaagatcca caacagagcc ttctagaaga ctggtcaata actagttggt ctttgtctga 9540

gtctgactta cgaggttgca tactcgctcc ctttgcctcg tcaatcgatg agaaaaagcg 9600

ccaaaactcg caatatggct ttgaaccaca cggtgctgag actagttaga atctagtccc 9660

aaactagctt ggatagctta cctttgccct ttgcgttgcg acaggtcttg cagggtatgg 9720

ttcctttctc accagctgat ttagctgcct tgctaccctc acggcggatc tgcataaaga 9780

gtggctagag gttataaatt agcactgatc ctaggtacgg ggctgaatgt aacttgcctt 9840

tcctttctca tcgcgcggca agacaggctt gctcaaattc ctaccagtca caggggtatg 9900

cacggcgtac ggaccacttg aactagtcac agattagtta gcaactagtc tgcattgaat 9960

ggctgtactt acgggccctc gccattgtcc tgatcatttc cagcttcacc ctcgttgctg 10020

caaagtagtt agtgactagt caaggactag ttgaaatggg agaagaaact cacgaattct 10080

cgacaccctt agtattgtgg tccttggact tggtgctgct atatattagc taatacacta 10140

gttagactca cagaaactta cgcagctcgc ttgcgcttct tggtaggagt cggggttggg 10200

agaacagtgc cttcaaacaa gccttcatac catgctactt gactagtcag ggactagtca 10260

ccaagtaatc tagataggac ttgcctttgg cctccatcag ttccttcata gtgggaggtc 10320

cattgtgcaa tgtaaactcc atgccgtggg agttcttgtc cttcaagtgc ttgaccaata 10380

tgtttctgtt ggcagaggga acctgtcaac tagttaataa ctagtcagaa actagtatag 10440

cagtagactc actgtacgct tgaggcatcc cttcactcgg cagtagactt catatggatg 10500

gatatcaggc acgccattgt cgtcctgtgg actagtcagt aactaggctt aaagctagtc 10560

gggtcggctt actatcttga aatccggcag cgtaagctcc ccgtccttaa ctgcctcgag 10620

atagtgacag tactctgggg actttcggag atcgttatcg cgaatgctcg gcatactaat 10680

cgttgactag tcttggacta gtcccgagca aaaaggattg gaggaggagg aggaaggtga 10740

gagtgagaca aagagcgaaa taagagcttc aaaggctatc tctaagcagt atgaaggtta 10800

agtatctagt tcttgactag atttaaaaga gatttcgact agttatgtac ctggagtttg 10860

gatataggaa tgtgttgtgg taacgaaatg taagggggag gaaagaaaaa gtcggtcaag 10920

aggtaactct aagtcggcca ttcctttttg ggaggcgcta accataaacg gcatggtcga 10980

cttagagtta gctcagggaa tttagggagt tatctgcgac caccgaggaa cggcggaatg 11040

ccaaagaatc ccgatggagc tctagctggc ggttgacaac cccacctttt ggcgtttctg 11100

cggcgttgca ggcgggactg gatacttcgt agaaccagaa aggcaaggca gaacgcgctc 11160

agcaagagtg ttggaagtga tagcatgatg tgccttgtta actaggtcaa aatctgcagt 11220

atgcttgatg ttatccaaag tgtgagagag gaaggtccaa acatacacga ttgggagagg 11280

gcctaggtat aagagttttt gagtagaacg catgtgagcc cagccatctc gaggagatta 11340

aacacgggcc ggcatttgat ggctatgtta gtaccccaat ggaaagcctg agagtccagt 11400

ggtcgcagat aactccctaa attccctgag ctaactctaa gtcgaccatg ccgtttatgg 11460

ttagcgcctc ccaaaaagga atggccgact tagagttacc tcttgaccga ctttttcttt 11520

cctccccctt acatttcgtt accacaacac attcctatat ccaaactcca ggtacataac 11580

tagtcgaaat ctcttttaaa tctagtcaag aactagatac ttaaccttca tactgcttag 11640

agatagcctt tgaagctctt atttcgctct ttgtctcact ctcaccttcc tcctcctcct 11700

ccaatccttt ttgctcggga ctagtccaag actagtcaac gattagtatg ccgagcattc 11760

gcgataacga tctccgaaag tccccagagt actgtcacta tctcgaggca gttaaggacg 11820

gggagcttac gctgccggat ttcaagatag taagccgacc cgactagctt taagcctagt 11880

tactgactag tccacaggac gacaatggcg tgcctgatat ccatccatat gaagtctact 11940

gccgagtgaa gggatgcctc aagcgtacag tgagtctact gctatactag tttctgacta 12000

gttattaact agttgacagg ttccctctgc caacagaaac atattggtca agcacttgaa 12060

ggacaagaac tcccacggca tggagtttac attgcacaat ggacctccca ctatgaagga 12120

actgatggag gccaaaggca agtcctatct agattacttg gtgactagtc cctgactagt 12180

caagtagcat ggtatgaagg cttgtttgaa ggcactgttc tcccaacccc gactcctacc 12240

aagaagcgca agcgagctgc gtaagtttct gtgagtctaa ctagtgtatt agctaatata 12300

tagcagcacc aagtccaagg accacaatac taagggtgtc gagaattcgt gagtttcttc 12360

tcccatttca actagtcctt gactagtcac taactacttt gcagcaacga gggtgaagct 12420

ggaaatgatc aggacaatgg cgagggcccg taagtacagc cattcaatgc agactagttg 12480

ctaactaatc tgtgactagt tcaagtggtc cgtacgccgt gcatacccct gtgactggta 12540

ggaatttgag caagcctgtc ttgccgcgcg atgagaaagg aaaggcaagt tacattcagc 12600

cccgtaccta ggatcagtgc taatttataa cctctagcca ctctttatgc agatccgccg 12660

tgagggtagc aaggcagcta aatcagctgg tgagaaagga accataccct gcaagacctg 12720

tcgcaacgca aagggcaaag gtaagctatc caagctagtt tgggactaga ttctaactag 12780

tctcagcacc gtgtggttca aagccatatt gcgagttttg gcgctttttc tcatcgattg 12840

acgaggcaaa gggagcgagt atgcaacctc gtaagtcaga ctcagacaaa gaccaactag 12900

ttattgacca gtcttctaga aggctctgtt gtggatcttg aggccctgga gagttcctcc 12960

aacaatccgg agacaagcaa gtcctcgtcg gactagtcac taactagact ctaactagtt 13020

gcagacatgg ataatgcaaa agagacaagc aatgaagaaa gtggtaagac atttctcctt 13080

tgtggttctg gactagtctt tgactagtca cagtcttaaa caaggaaaat gagcatgaaa 13140

atgaggagga aaaggctgct gagcccgagg aagtgcaggg tgatggcaga catggtaggt 13200

taataccttg ttagttattg ctagtcactg actagtcaat aactagtctc tgaacacctt 13260

gcaatcactc cgtttgcgca gctgaacagt ggtgaggata atagtagtaa gttattctag 13320

cttcagagtt ataggagact agatactaac tagtattagt tgcaactaac ctggatctca 13380

gagactttgg cctcaatcta gaatctatct agttgtcaac tagactgtgg tatcattgtc 13440

ttttattttc ctagtcctgg aactagcttc taactagtct ccctaatatg tggctgtctt 13500

gttttttttt tttgtttccc tacccggata tctagtcccc ttctaggttc tgttaacctc 13560

tcgggctctg atttagttta acgcaaacct gagattagtt tctaactagt ctctaggttt 13620

tctatccacc tttaattgta ataataaata caagcaacgt ttatacgtca aaagcattta 13680

taaactttta ccctaaagta gcttgcttgt gtgtttagtt tataattagt ctcttattaa 13740

tttgatgtag gtaagcccgc cacaaatata tatttttaac aagataccgt ggaaaaactt 13800

cgtgctatca caaaacagta tacaaaaaat aagctatcga attcctgcag agatcatcct 13860

gtcttcagtc ttaagacttc tctcctatat cacccgcact taccctagag tgccgcttag 13920

gtgctaaggg cacattgagt attggccgtg tagaatatat agcttaagta cggccaagca 13980

gacgggaagc cctgttctcc acaccctatg gtcgtatata tcaggcttct accgggaaac 14040

gattaagagt gtataatgga ctgaaaatca atatgaacgg gacaatgctc aagttaaatt 14100

agttaggcat cctaatctct actaaatgtt ctatctagag atcggggtac tataggcccg 14160

tacgttaatc actctacgct tctctccctt aggtatagtg taggtagggg ctagacattt 14220

atatgagtca gatggtacaa acggtaggca gtgcgggcga agaagtgaag acggagtcgg 14280

ttgaagctac atacaaaaga tgcattggct cgtcatgaag agcctcccgg gtttattcct 14340

ttgccctcgg acgagtgctg gggcgtcggt ttccactatc ggcgagtact tctacacagc 14400

catcggtcca gacggccgcg cttctgcggg cgatttgtgt acgcccgaca gtcccggctc 14460

cggatcggac gattgcgtcg catcgaccct gcgcccaagc tgcatcatcg aaattgccgt 14520

caaccaagct ctgatagagt tggtcaagac caatgcggag catatacgcc cggagccgcg 14580

gcgatcctgc aagctccgga tgcctccgct cgaagtagcg cgtctgctgc tccatacaag 14640

ccaaccacgg cctccagaag aagatgttgg cgacctcgta ttgggaatcc ccgaacatcg 14700

cctcgctcca gtcaatgacc gctgttatgc ggccattgtc cgtcaggaca ttgttggagc 14760

cgaaatccgc gtgcacgagg tgccggactt cggggcagtc ctcggcccaa agcatcagct 14820

catcgagagc ctgcgcgacg gacgcactga cggtgtcgtc catcacagtt tgccagtgat 14880

acacatgggg atcagcaatc gcgcatatga aatcacgcca tgtagtgtat tgaccgattc 14940

cttgcggtcc gaatgggccg aacccgctcg tctggctaag atcggccgca gcgatcgcat 15000

ccatggcctc cgcgaccggc tgcagaacag cgggcagttc ggtttcaggc aggtcttgca 15060

acgtgacacc ctgtgcacgg cgggagatgc aataggtcag gctctcgctg aattccccaa 15120

tgtcaagcac ttccggaatc gggagcgcgg ccgatgcaaa gtgccgataa acataacgat 15180

ctttgtagaa accatcggcg cagctattta cccgcaggac atatccacgc cctcctacat 15240

cgaagctgaa agcacgagat tcttcgccct ccgagagctg catcaggtcg gagacgctgt 15300

cgaacttttc gatcagaaac ttctcgacag acgtcgcggt gagttcaggc attttgacgg 15360

tgggatcctg tgatgtctgc tcaagcgggg tagctgttag tcaagctgcg atgaagtggg 15420

aaagctcgaa ctgaaaggtt caaaggaata agggatggga aggatggagt atggatgtag 15480

caaagtactt acttagggga aataaaggtt cttggatggg aagatgaata tactgaagat 15540

gggaaaagaa agagaaaaga aaagagcagc tggtggggag agcaggaaaa tatggcaaca 15600

aatgttggac tgacgcaacg accttgtcaa ccccgccgac acaccgggcg gacagacggg 15660

gcaaagctgc ctaccaggga ctgagggacc tcagcaggtc gagtgcagag caccggatgg 15720

gtcgactgcc agcttgtgtt cccggtctgc gccgctggcc agctcctgag cggcctttcc 15780

ggtttcatac accgggcaaa gcaggagagg cacgatattt ggacgcccta cagatgccgg 15840

atgggccaat tagggagctt acgcgccggg tactcgctct acctacttcg gagaaggtac 15900

tatctcgtga atcttttacc agatcggaag caattggact tctgtaccta ggttaatggc 15960

atgctatttc gccgacggct atacacccct ggcttcacat tctccttcgc ttactgccgg 16020

tgattcgatg aagctccata ttctccgatg atgcaataga ttcttggtca acgaggggca 16080

caccagcctt tccacttcgg ggcggagggg cggccggtcc cggattaata atcatccact 16140

gcacctcaga gccgccagag ctgtctggcg cagtggcgct tattactcag cccttctctc 16200

tgcgtccgtc cgtctctccg catgccagaa agagtcaccg gtcactgtac agagcggccg 16260

ccaccgcggt ggagctccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacgcgcg ctcactggcc 16320

gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 16380

gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 16440

caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 16500

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 16560

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 16620

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 16680

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 16740

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 16800

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 16860

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 16920

acaatttagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 16980

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 17040

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 17100

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 17160

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 17220

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttcga ccgaataaat 17280

acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg 17340

gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa 17400

ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt tttgagttgt cgagattttc 17460

aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc 17520

ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa 17580

ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa 17640

gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattacg 17700

tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt 17760

tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg 17820

gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt 17880

ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac 17940

cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg 18000

caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc 18060

cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga 18120

gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggttg 18180

ctacgcctga ataagtgata ataagcggat gaatggcaga aattcgaaag caaattcgac 18240

ccggtcgtcg gttcagggca gggtcgttaa atagccgctt atgtctattg ctggtttacc 18300

ggtttattga ctaccggaag cagtgtgacc gtgtgcttct caaatgcctg aggccagttt 18360

gctcaggctc tccccgtgga ggtaataatt gacgatatga tccttttttt ctgatcaaaa 18420

aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt 18480

tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt 18540

tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt 18600

ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 18660

ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta 18720

gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat 18780

aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 18840

ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg 18900

agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 18960

aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 19020

aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 19080

ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 19140

cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 19200

tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 19260

accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 19320

ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 19380

gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 19440

ttacacttta tgctcccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 19500

acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagcgcgcaa ttaaccctca ctaaagggaa 19560

caaaagctg 19569

<210> 69

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of ordered gBlock with T7 gRNA cassette -

T7.pro WT sgRNA fwnA

<400> 69

gggggtctcg gtgctaatac gactcactat agtcagatat attcagtcac tggttttaga 60

gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga 120

gtcggtgctt ttggccggca tggtcccagc ctcctcgctg gcgccggctg ggcaacatgc 180

ttcggcatgg cgaatgggac aaaaaatcaa actggctcac cttcgggtgg gcctttttgc 240

gtttatacct cggagaccgg gg 262

<210> 70

<211> 267

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of ordered gBlock with T7 gRNA cassette -

T7.pro strong sgRNA fwnA

<400> 70

gggggtctcg gtgctaatac gactcactat aggggaatca gatatattca gtcactggtt 60

ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc 120

accgagtcgg tgcttttggc cggcatggtc ccagcctcct cgctggcgcc ggctgggcaa 180

catgcttcgg catggcgaat gggacaaaaa atcaaactgg ctcaccttcg ggtgggcctt 240

tttgcgttta tacctcggag accgggg 267

<210> 71

<211> 19153

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of BG-AMA18 (Cas9/hygB/T7 wt sgRNA fwnA) -

Golden Gate product BG-AMA17 with gBlock T7.pro WT sgRNA fwnA

<400> 71

ggtaccgagg ttcatggtat gggcacgaat gtcaaaaatt ttcaggctca aacgggtatg 60

tattcagtat ctatctccgt gtacgacggc taattgagcc cagctgcatt tcgaactctt 120

ctcccagcgc attttgtgtg ggagttcttc gatgctgacc atgactgcga ggctgctgag 180

ggagtgcgcg gtatctaccc cggcccgtat ctggcttcta caaggagtga aactagttta 240

tactttgtag ttcggaatcc aatgctatta accgttttta ctttttcttt tgttcgagct 300

aagcgcttgt ttaaaccttg cgcttcttct tgggatcggc acgagagtca ccaccgagct 360

gagacaggtc gatacgagtc tcgtacagac cggtaatcga ctggtggatc agagtcgcat 420

caagcacttc cttggtggag gtgtaacgct tgcggtcgat ggtggtgtca aagtacttga 480

aagcagcagg agcacccagg ttggtgaggg tgaacaggtg gatgatgttc tccgcctgct 540

cgcggatggg cttgtcacgg tgcttgttgt aggcagagag gaccttgtca aggttggcat 600

cggccaggat gacacgcttg ctgaactcgg agatctgctc gatgatctca tccaggtagt 660

gcttgtgctg ctcgacaaag agctgcttct gctcgttgtc ctcgggagag cccttgagct 720

tctcgtagtg ggaggccagg tagaggaagt tgacgtactt ggaggggagg gcaagctcgt 780

tacccttctg gagctcaccg gcggaagcaa gcatgcgctt acggccgttc tccagctcga 840

acagagagta cttggggagc ttgatgatga ggtccttctt gacctctttg taacccttgg 900

cctccaggaa gtcgataggg ttcttctcga agctgctgcg ttccatgatg gtgataccga 960

ggagttcctt cacactcttc agcttcttgc tcttgccctt ctcgaccttg gcgacaacca 1020

agacggagta ggcaacggta ggcgaatcga atccaccgta cttcttgggg tcccaatcct 1080

tcttgcgagc gatcagcttg tcggagttgc gcttgggaag aatcgactcc ttggagaaac 1140

caccagtctg cacctcggtc ttcttgacaa tgttgacctg gggcatagaa aggaccttgc 1200

ggacggtagc gaagtcacgg cccttgtccc agacgatctc accggtttcg ccgttagtct 1260

caatcaaggg acgcttgcga atctcgccgt tggccaatgt tatttcggtc ttgaagaagt 1320

tcatgatgtt gctgtagaag aagtacttgg cagtggcctt tccgatctcc tgctcggact 1380

tagcgatcat cttgcgcacg tcgtacacct tgtagtcacc gtagacgaac tcggactcga 1440

gcttgggata cttcttaatc aaagcagtac cgacgacggc gttgaggtag gcatcgtgag 1500

cgtggtggta gttgttgatc tcgcggacct tgtagaactg gaagtctttc ctaaagtcac 1560

tgaccagctt gctctttaag gtgatgacct tgacctcacg gatgagcttg tcgttctcgt 1620

cgtacttggt gttcatgcga gagtccagga tctgggcaac gtgcttagtg atctgacggg 1680

tttcaaccaa ttgacgcttg atgaaaccgg ccttgtcgag ctcggagagt ccgccacgct 1740

cggccttggt aaggttgtcg aacttgcgct gagtgatgag cttagcgttg agcaattgtc 1800

tccagtagtt cttcatcttc ttaacaacct cttccgaggg gacgttatcg ctcttgccac 1860

gattcttgtc ggaacgggtg agcaccttgt tgtcaatgct gtcatccttg aggaaggact 1920

gggggacgat gtggtcaaca tcgtagtcgg agaggcggtt gatatccagc tcctggtcga 1980

cgtacatgtc acgtccgttc tgcaagtagt agaggtagag cttctcattc tgcagctggg 2040

tgttctcgac ggggtgttcc ttgagaatct gggaaccgag ctccttgatg ccttcctcga 2100

tacgcttcat gcgctcacgg ctgttcttct gacccttctg agtggtctgg ttctcacgag 2160

ccatttcgat gacgatgttc tcgggcttgt gacgacccat gaccttcaca agctcgtcaa 2220

caaccttcac agtctgcagg atacccttct tgatagcggg ggaaccagcc aggttggcaa 2280

tgtgttcgtg tagcgagtca ccctggccgg agacttgggc cttctggatg tcctctttga 2340

aggtcagaga gtcgtcgtgg atgagctgca tgaagttgcg gttggcgaag ccgtcggact 2400

tcaggaagtc aaggatggtc ttgccagact gcttatcacg gataccgtta atcaacttgc 2460

gagagaggcg accccagcca gtgtaacggc ggcgcttcaa ctgcttcatg accttgtcgt 2520

cgaagaggtg agcgtaggtc ttcagacgtt cttcgatcat ctcacggtcc tcgaagaggg 2580

tgagggtaag aacaatgtcc tcaagaatgt cttcgttctc ctcgttgtca aggaagtcct 2640

tgtccttgat gatcttgagc agatcgtggt aggtgccgag agaagcgttg aagcggtcct 2700

caacaccgga gatctcaacg gagtcaaagc actcgatctt cttgaagtag tcttccttga 2760

gctgcttgac ggtcaccttg cggttagtct tgaacagcag gtcgacaatg gccttcttct 2820

gttcgccgga gaggaaagca ggcttgcgca tgccctcggt cacgtacttg accttggtca 2880

gctcgttgta gacagtgaag tactcgtaca agagggagtg cttgggcagg actttctcgt 2940

tgggcaggtt cttgtcgaag ttggtcatac gctcaatgaa gctctgagcg gaggcaccct 3000

tgtcgacgac ttcctcgaag ttccaggggg tgatggtttc ctcggacttg cgggtcatcc 3060

aggcgaagcg ggagttaccg cgagccagag gaccgacgta gtaggggata cggaaggtca 3120

ggatcttctc aatcttctca cggttgtcct tcaagaaagg gtagaagtct tcctggcgac 3180

gaaggatggc gtgcaattca cccaggtgga tctggtgggg gatgctgccg ttgtcgaaag 3240

tacgctgctt gcgcagaagg tcctcacggt tcagcttaac aagaagctcc tcagtgccat 3300

ccatcttctc gaggataggc ttaatgaact tgtagaattc ttcctgggaa gcaccaccgt 3360

cgatgtaacc ggcgtagccg ttcttggact ggtcgaagaa gatctccttg tacttttcgg 3420

ggagctgctg gcggaccaga gccttgagta gggtgaggtc ctggtggtgc tcatcgtatc 3480

tcttgatcat agaggcggag agaggggcct tggtgatctc agtgttgaca cggaggatat 3540

ctgacaggag aatggcatcg gagaggttct tggcagctag gaagaggtcg gcgtactgat 3600

ctcctatctg ggcgagaagg ttatcaaggt cgtcgtcgta ggtatccttg gaaagttgta 3660

acttagcatc ctcagcaaga tcgaagttgc tcttgaagtt gggagtcagt ccgagggaca 3720

gggcaataag gttgccgaaa agaccgttct tcttctcacc agggagctgg gcaatcaagt 3780

tctcaagacg gcgggacttg ctcaggcgag cggagaggat ggccttggca tccacgccag 3840

acgcgttgat ggggttttcc tcgaaaagct ggttgtaggt ctgaacgagc tggatgaaga 3900

gtttatcaac atcggagttg tcggggttga ggtcaccctc gatcaggaag tgaccacgga 3960

acttgatcat gtgcgccaga gccaggtaaa tgaggcggag gtcagccttg tcggtgctgt 4020

cgacgagctt tttgcgtagg tggtagatgg tggggtactt ctcgtggtaa gcgacctcat 4080

cgacaatgtt accgaagata gggtgacgct cgtgcttctt gtcttcttca acaaggaacg 4140

actcctccag acggtggaag aaagagtcat caaccttggc catctcgttg gagaaaatct 4200

cctggaggta gcagatacgg ttcttgcggc gagtgtaacg acggcgagcg gtacgcttca 4260

gacgggtggc ctcagcagtc tcaccggagt cgaagagaag cgcaccaatg aggttcttct 4320

tgatggagtg acgatcggtg tttcccagga ccttgaattt cttgctagga accttgtact 4380

cgtcggtgat gacagcccag ccaacggagt tggtgccaat gtccagaccg atgctatact 4440

tcttgtccat tttgacggtg gaaggtgagt tggggttggt gtcatcgtgg gggaagaact 4500

tggcttttat atgggtgcag gtgaggggac ttaagccacg tgaaagttca ttcgagagag 4560

ctaaggcata ttaatgcaca tgtgtgggag ttgcatggaa cttgcatgaa aggtgcatga 4620

aaggtgcatg gtattgcaga atgcgctcgg gggtctgcgg agaaatccgt taggaaaaga 4680

tcgtcatcct tctgctgcat caccgttagc ttgaaattta gttccagcgc tagtcaaggg 4740

cttcagttca gattctgcaa gtatcaggtc catcattact ctcttcagca ggcggatcga 4800

atatcccccg aggcacatgg gaggtcttat tatccgatcg ttgatcacca tgccaatcgc 4860

ttcgaccgac cacaagttgc atcaagcact aactgcctca agcagatgcc gagtcttcat 4920

ctccgatatt taatcccgtt gaatctccgc cccctgtcat ctccaccgtt taatctgggg 4980

tggtggcgga tgtccaccaa ttagccggct aaattatccc catcgtcagc acgctagacc 5040

tgccttggaa ctagcgcttt ggtgagaaat ctcttggttg tgagtctgat accacattcc 5100

ttgacttcca tgttgttctg gaggtgtgaa agtataaaca atgccacaga tggactaatc 5160

tccggagaga tgaccctctt caagactggt gcagtgccta ggatcgctag tatcccaaaa 5220

cttcggggct gccttcattt ccagagagtt gcggtacctt gcccatcgaa cgtacaagta 5280

ctcctctgtt ctctccttcc tttgctttgt gctaatacga ctcactatag tcagatatat 5340

tcagtcactg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 5400

ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ggccggcatg gtcccagcct cctcgctggc 5460

gccggctggg caacatgctt cggcatggcg aatgggacaa aaaatcaaac tggctcacct 5520

tcgggtgggc ctttttgcgt ttatacctcc ggatcgatgt acacaaccga ctgcacccaa 5580

acgaacacaa atcttagcag tgccctcgcc ggatagcttg gactgtcctt taccgtcgcc 5640

agcacaagaa gggtatctct gaggtccgta ccgccttttc tttaccactg gattcgattt 5700

tcgcagttgg aatgatacat ctggggactg cgaatggttt acccctcggc cgatactatg 5760

ggtcgtgaag agatggaaca ttccgaaagt gttttgcgga taacattggt ggcatcgaaa 5820

acagaatgct gaccattgat ttcaacacga acaggaggtt gccaagaagc gtacccgccg 5880

tgtcgtcaag tcccagcgtg ccatcgtcgg tgcttccctc gacgtgatca aggagcgccg 5940

ctcccagcgc cccgaggccc gtgccgccgc ccgccagcag gccatcaagg acgccaagga 6000

gaagaaggct gccgctgagt ccaagaagaa ggctgagaag gctaagaacg ccgctgctgg 6060

tgccaagggt gctgctcagc gcatccagag caagcagggt gctaagggtt ctgctcccaa 6120

ggtcgctgcc aagtctcgtt aaggaatgaa taacggttcg gcttgggatt gggtgcggaa 6180

ggcaagagtt tcatggacga attttgggag gttactggag ctggaatatg tgttttccct 6240

accaccaaaa atgaaatgtt ccaaaactat cggcgtgcaa gacggcctct tacgggttta 6300

acggctctca gataagctct atcaatcgcg ccacggatgc atgaatgaag atccagatgg 6360

ccgcgggata tatcgtgcta gtgtaattcc tacatgatct tgctgttcac tccatgcgca 6420

tccagatatt ccaggggtcg actgttaatt gatatgcctg ggcttgagac tccgtagacg 6480

cccagtcaat gtgcaattaa tacgagggtg ctgttatcgg cagcaacctt gtacttctcc 6540

ataagatggg ggaatgccat ggacctgagt gatcaattga cgcaagtctc ccataacgcg 6600

gcggcttgac ctaaaatcca tataccgccc cgttgagcct ccgcgctcca gagtcctgtc 6660

ccggaatagg gcacaaacct aggctaacct aattcgtcgt ccgcgtctga gttcagacaa 6720

aagaacttcc aagtatcagc agagtacgct gatattgata agtaggcaaa cataagacca 6780

ataagcaagt agaataaaaa attataagga cactgcctcc ataaagcgcc ctcccaagac 6840

ctcagggaca aaacttctca agtggcaatt cactgcctca ggccgtgtcc agtgaagtga 6900

cgaagcgaca ctgttgcctg ctgactcagc cgctttccgc cctgccgaat ttgccatctc 6960

gcttacaggt cagcactagc gcgattcgcc cacagatgct cagcgcaaag tggtgactca 7020

gtcaaacccc ccctacaaga ttccacctcg atttttcaac ttcccatctc gatccgacaa 7080

gttctacatc caccgtcaaa atggcctcca gcgaagatgt catcaaggag ttcatgcgct 7140

tcaaggtccg catggaagga tccgtcaacg gccacgagtt cgagattgag ggtgagggtg 7200

agggccgccc ctacgaaggc acccagactg ccaagctcaa ggtcaccaag ggtggtcctc 7260

tccccttcgc ttgggatatc ctgtctcctc agttccagta cggctccaag gtctacgtca 7320

agcaccccgc cgacatcccc gactacaaga agctttcttt ccccgagggt ttcaagtggg 7380

agcgtgtcat gaacttcgag gatggtggtg ttgtgaccgt tactcaggac agcagcttgc 7440

aggatggctc tttcatctac aaggtcaagt tcattggtgt caacttcccc tccgacggcc 7500

ctgtcatgca gaagaagacc atgggctggg aagcgtcgac tgagcgtctg tacccccgtg 7560

acggtgttct caagggtgag atccacaagg ctctcaagct caaggacggt ggtcactacc 7620

ttgttgagtt caagtccatc tacatggcca agaagcctgt gcagctgccc ggatactact 7680

acgtggactc caagcttgac atcacctccc acaacgaaga ctacaccatt gttgagcagt 7740

acgagcgtgc tgagggccgc caccacctct tcctgaccca cggaatggat gagctgtaca 7800

agtcgaaact ataaataaat ggtttgcgtt gcgattgact gaaacgaaaa aaagcgaaaa 7860

tgattctggg aatgaattga taaagcgcgg gctctgcggt acggttacgg ttgcggtcgc 7920

ggacgaatgg actgggctga gctgggctgg aggaagtcca tcgaacaagg acaaggggtg 7980

gaatatggca cgggtcgatt ttgttataca taccctacca tccatctatc catttaaata 8040

ccaaatgagt tgttgaatgg attcgcggtc ttctcggttt atttttgctt gcttgcgtgc 8100

ttaagggata gtgtgcctca cgctttccgg catcttccag accacagtat atccatccgc 8160

ctcctgttga agcttatttt ttgtatactg ttttgtgata gcacgaagtt tttccacggt 8220

atcttgttaa aaatatatat ttgtggcggg cttacctaca tcaaattaat aagagactaa 8280

ttataaacta aacacacaag caagctactt tagggtaaaa gtttataaat gcttttgacg 8340

tataaacgtt gcttgtattt attattacaa ttaaaggtgg atagaaaacc tagagactag 8400

ttagaaacta atctcaggtt tgcgttaaac taaatcagag cccgagaggt taacagaacc 8460

tagaagggga ctagatatcc gggtagggaa acaaaaaaaa aaaacaagac agccacatat 8520

tagggagact agttagaagc tagttccagg actaggaaaa taaaagacaa tgataccaca 8580

gtctagttga caactagata gattctagat tgaggccaaa gtctctgaga tccaggttag 8640

ttgcaactaa tactagttag tatctagtct cctataactc tgaagctaga ataacttact 8700

actattatcc tcaccactgt tcagctgcgc aaacggagtg attgcaaggt gttcagagac 8760

tagttattga ctagtcagtg actagcaata actaacaagg tattaaccta ccatgtctgc 8820

catcaccctg cacttcctcg ggctcagcag ccttttcctc ctcattttca tgctcatttt 8880

ccttgtttaa gactgtgact agtcaaagac tagtccagaa ccacaaagga gaaatgtctt 8940

accactttct tcattgcttg tctcttttgc attatccatg tctgcaacta gttagagtct 9000

agttagtgac tagtccgacg aggacttgct tgtctccgga ttgttggagg aactctccag 9060

ggcctcaaga tccacaacag agccttctag aagactggtc aataactagt tggtctttgt 9120

ctgagtctga cttacgaggt tgcatactcg ctccctttgc ctcgtcaatc gatgagaaaa 9180

agcgccaaaa ctcgcaatat ggctttgaac cacacggtgc tgagactagt tagaatctag 9240

tcccaaacta gcttggatag cttacctttg ccctttgcgt tgcgacaggt cttgcagggt 9300

atggttcctt tctcaccagc tgatttagct gccttgctac cctcacggcg gatctgcata 9360

aagagtggct agaggttata aattagcact gatcctaggt acggggctga atgtaacttg 9420

cctttccttt ctcatcgcgc ggcaagacag gcttgctcaa attcctacca gtcacagggg 9480

tatgcacggc gtacggacca cttgaactag tcacagatta gttagcaact agtctgcatt 9540

gaatggctgt acttacgggc cctcgccatt gtcctgatca tttccagctt caccctcgtt 9600

gctgcaaagt agttagtgac tagtcaagga ctagttgaaa tgggagaaga aactcacgaa 9660

ttctcgacac ccttagtatt gtggtccttg gacttggtgc tgctatatat tagctaatac 9720

actagttaga ctcacagaaa cttacgcagc tcgcttgcgc ttcttggtag gagtcggggt 9780

tgggagaaca gtgccttcaa acaagccttc ataccatgct acttgactag tcagggacta 9840

gtcaccaagt aatctagata ggacttgcct ttggcctcca tcagttcctt catagtggga 9900

ggtccattgt gcaatgtaaa ctccatgccg tgggagttct tgtccttcaa gtgcttgacc 9960

aatatgtttc tgttggcaga gggaacctgt caactagtta ataactagtc agaaactagt 10020

atagcagtag actcactgta cgcttgaggc atcccttcac tcggcagtag acttcatatg 10080

gatggatatc aggcacgcca ttgtcgtcct gtggactagt cagtaactag gcttaaagct 10140

agtcgggtcg gcttactatc ttgaaatccg gcagcgtaag ctccccgtcc ttaactgcct 10200

cgagatagtg acagtactct ggggactttc ggagatcgtt atcgcgaatg ctcggcatac 10260

taatcgttga ctagtcttgg actagtcccg agcaaaaagg attggaggag gaggaggaag 10320

gtgagagtga gacaaagagc gaaataagag cttcaaaggc tatctctaag cagtatgaag 10380

gttaagtatc tagttcttga ctagatttaa aagagatttc gactagttat gtacctggag 10440

tttggatata ggaatgtgtt gtggtaacga aatgtaaggg ggaggaaaga aaaagtcggt 10500

caagaggtaa ctctaagtcg gccattcctt tttgggaggc gctaaccata aacggcatgg 10560

tcgacttaga gttagctcag ggaatttagg gagttatctg cgaccaccga ggaacggcgg 10620

aatgccaaag aatcccgatg gagctctagc tggcggttga caaccccacc ttttggcgtt 10680

tctgcggcgt tgcaggcggg actggatact tcgtagaacc agaaaggcaa ggcagaacgc 10740

gctcagcaag agtgttggaa gtgatagcat gatgtgcctt gttaactagg tcaaaatctg 10800

cagtatgctt gatgttatcc aaagtgtgag agaggaaggt ccaaacatac acgattggga 10860

gagggcctag gtataagagt ttttgagtag aacgcatgtg agcccagcca tctcgaggag 10920

attaaacacg ggccggcatt tgatggctat gttagtaccc caatggaaag cctgagagtc 10980

cagtggtcgc agataactcc ctaaattccc tgagctaact ctaagtcgac catgccgttt 11040

atggttagcg cctcccaaaa aggaatggcc gacttagagt tacctcttga ccgacttttt 11100

ctttcctccc ccttacattt cgttaccaca acacattcct atatccaaac tccaggtaca 11160

taactagtcg aaatctcttt taaatctagt caagaactag atacttaacc ttcatactgc 11220

ttagagatag cctttgaagc tcttatttcg ctctttgtct cactctcacc ttcctcctcc 11280

tcctccaatc ctttttgctc gggactagtc caagactagt caacgattag tatgccgagc 11340

attcgcgata acgatctccg aaagtcccca gagtactgtc actatctcga ggcagttaag 11400

gacggggagc ttacgctgcc ggatttcaag atagtaagcc gacccgacta gctttaagcc 11460

tagttactga ctagtccaca ggacgacaat ggcgtgcctg atatccatcc atatgaagtc 11520

tactgccgag tgaagggatg cctcaagcgt acagtgagtc tactgctata ctagtttctg 11580

actagttatt aactagttga caggttccct ctgccaacag aaacatattg gtcaagcact 11640

tgaaggacaa gaactcccac ggcatggagt ttacattgca caatggacct cccactatga 11700

aggaactgat ggaggccaaa ggcaagtcct atctagatta cttggtgact agtccctgac 11760

tagtcaagta gcatggtatg aaggcttgtt tgaaggcact gttctcccaa ccccgactcc 11820

taccaagaag cgcaagcgag ctgcgtaagt ttctgtgagt ctaactagtg tattagctaa 11880

tatatagcag caccaagtcc aaggaccaca atactaaggg tgtcgagaat tcgtgagttt 11940

cttctcccat ttcaactagt ccttgactag tcactaacta ctttgcagca acgagggtga 12000

agctggaaat gatcaggaca atggcgaggg cccgtaagta cagccattca atgcagacta 12060

gttgctaact aatctgtgac tagttcaagt ggtccgtacg ccgtgcatac ccctgtgact 12120

ggtaggaatt tgagcaagcc tgtcttgccg cgcgatgaga aaggaaaggc aagttacatt 12180

cagccccgta cctaggatca gtgctaattt ataacctcta gccactcttt atgcagatcc 12240

gccgtgaggg tagcaaggca gctaaatcag ctggtgagaa aggaaccata ccctgcaaga 12300

cctgtcgcaa cgcaaagggc aaaggtaagc tatccaagct agtttgggac tagattctaa 12360

ctagtctcag caccgtgtgg ttcaaagcca tattgcgagt tttggcgctt tttctcatcg 12420

attgacgagg caaagggagc gagtatgcaa cctcgtaagt cagactcaga caaagaccaa 12480

ctagttattg accagtcttc tagaaggctc tgttgtggat cttgaggccc tggagagttc 12540

ctccaacaat ccggagacaa gcaagtcctc gtcggactag tcactaacta gactctaact 12600

agttgcagac atggataatg caaaagagac aagcaatgaa gaaagtggta agacatttct 12660

cctttgtggt tctggactag tctttgacta gtcacagtct taaacaagga aaatgagcat 12720

gaaaatgagg aggaaaaggc tgctgagccc gaggaagtgc agggtgatgg cagacatggt 12780

aggttaatac cttgttagtt attgctagtc actgactagt caataactag tctctgaaca 12840

ccttgcaatc actccgtttg cgcagctgaa cagtggtgag gataatagta gtaagttatt 12900

ctagcttcag agttatagga gactagatac taactagtat tagttgcaac taacctggat 12960

ctcagagact ttggcctcaa tctagaatct atctagttgt caactagact gtggtatcat 13020

tgtcttttat tttcctagtc ctggaactag cttctaacta gtctccctaa tatgtggctg 13080

tcttgttttt tttttttgtt tccctacccg gatatctagt ccccttctag gttctgttaa 13140

cctctcgggc tctgatttag tttaacgcaa acctgagatt agtttctaac tagtctctag 13200

gttttctatc cacctttaat tgtaataata aatacaagca acgtttatac gtcaaaagca 13260

tttataaact tttaccctaa agtagcttgc ttgtgtgttt agtttataat tagtctctta 13320

ttaatttgat gtaggtaagc ccgccacaaa tatatatttt taacaagata ccgtggaaaa 13380

acttcgtgct atcacaaaac agtatacaaa aaataagcta tcgaattcct gcagagatca 13440

tcctgtcttc agtcttaaga cttctctcct atatcacccg cacttaccct agagtgccgc 13500

ttaggtgcta agggcacatt gagtattggc cgtgtagaat atatagctta agtacggcca 13560

agcagacggg aagccctgtt ctccacaccc tatggtcgta tatatcaggc ttctaccggg 13620

aaacgattaa gagtgtataa tggactgaaa atcaatatga acgggacaat gctcaagtta 13680

aattagttag gcatcctaat ctctactaaa tgttctatct agagatcggg gtactatagg 13740

cccgtacgtt aatcactcta cgcttctctc ccttaggtat agtgtaggta ggggctagac 13800

atttatatga gtcagatggt acaaacggta ggcagtgcgg gcgaagaagt gaagacggag 13860

tcggttgaag ctacatacaa aagatgcatt ggctcgtcat gaagagcctc ccgggtttat 13920

tcctttgccc tcggacgagt gctggggcgt cggtttccac tatcggcgag tacttctaca 13980

cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg 14040

gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg 14100

ccgtcaacca agctctgata gagttggtca agaccaatgc ggagcatata cgcccggagc 14160

cgcggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata 14220

caagccaacc acggcctcca gaagaagatg ttggcgacct cgtattggga atccccgaac 14280

atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg 14340

gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc 14400

agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag 14460

tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg 14520

attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc 14580

gcatccatgg cctccgcgac cggctgcaga acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct 14640

tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag atgcaatagg tcaggctctc gctgaattcc 14700

ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa 14760

cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta tttacccgca ggacatatcc acgccctcct 14820

acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg 14880

ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg acagacgtcg cggtgagttc aggcattttg 14940

acggtgggat cctgtgatgt ctgctcaagc ggggtagctg ttagtcaagc tgcgatgaag 15000

tgggaaagct cgaactgaaa ggttcaaagg aataagggat gggaaggatg gagtatggat 15060

gtagcaaagt acttacttag gggaaataaa ggttcttgga tgggaagatg aatatactga 15120

agatgggaaa agaaagagaa aagaaaagag cagctggtgg ggagagcagg aaaatatggc 15180

aacaaatgtt ggactgacgc aacgaccttg tcaaccccgc cgacacaccg ggcggacaga 15240

cggggcaaag ctgcctacca gggactgagg gacctcagca ggtcgagtgc agagcaccgg 15300

atgggtcgac tgccagcttg tgttcccggt ctgcgccgct ggccagctcc tgagcggcct 15360

ttccggtttc atacaccggg caaagcagga gaggcacgat atttggacgc cctacagatg 15420

ccggatgggc caattaggga gcttacgcgc cgggtactcg ctctacctac ttcggagaag 15480

gtactatctc gtgaatcttt taccagatcg gaagcaattg gacttctgta cctaggttaa 15540

tggcatgcta tttcgccgac ggctatacac ccctggcttc acattctcct tcgcttactg 15600

ccggtgattc gatgaagctc catattctcc gatgatgcaa tagattcttg gtcaacgagg 15660

ggcacaccag cctttccact tcggggcgga ggggcggccg gtcccggatt aataatcatc 15720

cactgcacct cagagccgcc agagctgtct ggcgcagtgg cgcttattac tcagcccttc 15780

tctctgcgtc cgtccgtctc tccgcatgcc agaaagagtc accggtcact gtacagagcg 15840

gccgccaccg cggtggagct ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattacg cgcgctcact 15900

ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct 15960

tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc 16020

ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 16080

cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 16140

cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 16200

tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 16260

aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 16320

ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 16380

actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 16440

ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac 16500

gcttacaatt taggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt 16560

ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa 16620

taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt 16680

tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat 16740

gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag 16800

atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt tcgaccgaat 16860

aaatacctgt gacggaagat cacttcgcag aataaataaa tcctggtgtc cctgttgata 16920

ccgggaagcc ctgggccaac ttttggcgaa aatgagacgt tgatcggcac gtaagaggtt 16980

ccaactttca ccataatgaa ataagatcac taccgggcgt attttttgag ttgtcgagat 17040

tttcaggagc taaggaagct aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata 17100

tatcccaatg gcatcgtaaa gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct 17160

ataaccagac cgttcagctg gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc 17220

acaagtttta tccggccttt attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat 17280

tacgtatggc aatgaaagac ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca 17340

ccgttttcca tgagcaaact gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt 17400

tccggcagtt tctacacata tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct 17460

atttccctaa agggtttatt gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt 17520

tcaccagttt tgatttaaac gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca 17580

tgggcaaata ttatacgcaa ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc 17640

atgccgtttg tgatggcttc catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg 17700

atgagtggca gggcggggcg taattttttt aaggcagtta ttggtgccct taaacgcctg 17760

gttgctacgc ctgaataagt gataataagc ggatgaatgg cagaaattcg aaagcaaatt 17820

cgacccggtc gtcggttcag ggcagggtcg ttaaatagcc gcttatgtct attgctggtt 17880

taccggttta ttgactaccg gaagcagtgt gaccgtgtgc ttctcaaatg cctgaggcca 17940

gtttgctcag gctctccccg tggaggtaat aattgacgat atgatccttt ttttctgatc 18000

aaaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 18060

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 18120

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 18180

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 18240

gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 18300

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 18360

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 18420

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 18480

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 18540

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 18600

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 18660

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 18720

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 18780

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 18840

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc 18900

gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 18960

gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca 19020

ggctttacac tttatgctcc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 19080

tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag 19140

ggaacaaaag ctg 19153

<210> 72

<211> 19158

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of BG-AMA19 (Cas9/hygB/T7 strong sgRNA fwnA)

G- olden Gate product BG-AMA17 with gBlock T7.pro strong sgRNA

fwnA

<400> 72

ggtaccgagg ttcatggtat gggcacgaat gtcaaaaatt ttcaggctca aacgggtatg 60

tattcagtat ctatctccgt gtacgacggc taattgagcc cagctgcatt tcgaactctt 120

ctcccagcgc attttgtgtg ggagttcttc gatgctgacc atgactgcga ggctgctgag 180

ggagtgcgcg gtatctaccc cggcccgtat ctggcttcta caaggagtga aactagttta 240

tactttgtag ttcggaatcc aatgctatta accgttttta ctttttcttt tgttcgagct 300

aagcgcttgt ttaaaccttg cgcttcttct tgggatcggc acgagagtca ccaccgagct 360

gagacaggtc gatacgagtc tcgtacagac cggtaatcga ctggtggatc agagtcgcat 420

caagcacttc cttggtggag gtgtaacgct tgcggtcgat ggtggtgtca aagtacttga 480

aagcagcagg agcacccagg ttggtgaggg tgaacaggtg gatgatgttc tccgcctgct 540

cgcggatggg cttgtcacgg tgcttgttgt aggcagagag gaccttgtca aggttggcat 600

cggccaggat gacacgcttg ctgaactcgg agatctgctc gatgatctca tccaggtagt 660

gcttgtgctg ctcgacaaag agctgcttct gctcgttgtc ctcgggagag cccttgagct 720

tctcgtagtg ggaggccagg tagaggaagt tgacgtactt ggaggggagg gcaagctcgt 780

tacccttctg gagctcaccg gcggaagcaa gcatgcgctt acggccgttc tccagctcga 840

acagagagta cttggggagc ttgatgatga ggtccttctt gacctctttg taacccttgg 900

cctccaggaa gtcgataggg ttcttctcga agctgctgcg ttccatgatg gtgataccga 960

ggagttcctt cacactcttc agcttcttgc tcttgccctt ctcgaccttg gcgacaacca 1020

agacggagta ggcaacggta ggcgaatcga atccaccgta cttcttgggg tcccaatcct 1080

tcttgcgagc gatcagcttg tcggagttgc gcttgggaag aatcgactcc ttggagaaac 1140

caccagtctg cacctcggtc ttcttgacaa tgttgacctg gggcatagaa aggaccttgc 1200

ggacggtagc gaagtcacgg cccttgtccc agacgatctc accggtttcg ccgttagtct 1260

caatcaaggg acgcttgcga atctcgccgt tggccaatgt tatttcggtc ttgaagaagt 1320

tcatgatgtt gctgtagaag aagtacttgg cagtggcctt tccgatctcc tgctcggact 1380

tagcgatcat cttgcgcacg tcgtacacct tgtagtcacc gtagacgaac tcggactcga 1440

gcttgggata cttcttaatc aaagcagtac cgacgacggc gttgaggtag gcatcgtgag 1500

cgtggtggta gttgttgatc tcgcggacct tgtagaactg gaagtctttc ctaaagtcac 1560

tgaccagctt gctctttaag gtgatgacct tgacctcacg gatgagcttg tcgttctcgt 1620

cgtacttggt gttcatgcga gagtccagga tctgggcaac gtgcttagtg atctgacggg 1680

tttcaaccaa ttgacgcttg atgaaaccgg ccttgtcgag ctcggagagt ccgccacgct 1740

cggccttggt aaggttgtcg aacttgcgct gagtgatgag cttagcgttg agcaattgtc 1800

tccagtagtt cttcatcttc ttaacaacct cttccgaggg gacgttatcg ctcttgccac 1860

gattcttgtc ggaacgggtg agcaccttgt tgtcaatgct gtcatccttg aggaaggact 1920

gggggacgat gtggtcaaca tcgtagtcgg agaggcggtt gatatccagc tcctggtcga 1980

cgtacatgtc acgtccgttc tgcaagtagt agaggtagag cttctcattc tgcagctggg 2040

tgttctcgac ggggtgttcc ttgagaatct gggaaccgag ctccttgatg ccttcctcga 2100

tacgcttcat gcgctcacgg ctgttcttct gacccttctg agtggtctgg ttctcacgag 2160

ccatttcgat gacgatgttc tcgggcttgt gacgacccat gaccttcaca agctcgtcaa 2220

caaccttcac agtctgcagg atacccttct tgatagcggg ggaaccagcc aggttggcaa 2280

tgtgttcgtg tagcgagtca ccctggccgg agacttgggc cttctggatg tcctctttga 2340

aggtcagaga gtcgtcgtgg atgagctgca tgaagttgcg gttggcgaag ccgtcggact 2400

tcaggaagtc aaggatggtc ttgccagact gcttatcacg gataccgtta atcaacttgc 2460

gagagaggcg accccagcca gtgtaacggc ggcgcttcaa ctgcttcatg accttgtcgt 2520

cgaagaggtg agcgtaggtc ttcagacgtt cttcgatcat ctcacggtcc tcgaagaggg 2580

tgagggtaag aacaatgtcc tcaagaatgt cttcgttctc ctcgttgtca aggaagtcct 2640

tgtccttgat gatcttgagc agatcgtggt aggtgccgag agaagcgttg aagcggtcct 2700

caacaccgga gatctcaacg gagtcaaagc actcgatctt cttgaagtag tcttccttga 2760

gctgcttgac ggtcaccttg cggttagtct tgaacagcag gtcgacaatg gccttcttct 2820

gttcgccgga gaggaaagca ggcttgcgca tgccctcggt cacgtacttg accttggtca 2880

gctcgttgta gacagtgaag tactcgtaca agagggagtg cttgggcagg actttctcgt 2940

tgggcaggtt cttgtcgaag ttggtcatac gctcaatgaa gctctgagcg gaggcaccct 3000

tgtcgacgac ttcctcgaag ttccaggggg tgatggtttc ctcggacttg cgggtcatcc 3060

aggcgaagcg ggagttaccg cgagccagag gaccgacgta gtaggggata cggaaggtca 3120

ggatcttctc aatcttctca cggttgtcct tcaagaaagg gtagaagtct tcctggcgac 3180

gaaggatggc gtgcaattca cccaggtgga tctggtgggg gatgctgccg ttgtcgaaag 3240

tacgctgctt gcgcagaagg tcctcacggt tcagcttaac aagaagctcc tcagtgccat 3300

ccatcttctc gaggataggc ttaatgaact tgtagaattc ttcctgggaa gcaccaccgt 3360

cgatgtaacc ggcgtagccg ttcttggact ggtcgaagaa gatctccttg tacttttcgg 3420

ggagctgctg gcggaccaga gccttgagta gggtgaggtc ctggtggtgc tcatcgtatc 3480

tcttgatcat agaggcggag agaggggcct tggtgatctc agtgttgaca cggaggatat 3540

ctgacaggag aatggcatcg gagaggttct tggcagctag gaagaggtcg gcgtactgat 3600

ctcctatctg ggcgagaagg ttatcaaggt cgtcgtcgta ggtatccttg gaaagttgta 3660

acttagcatc ctcagcaaga tcgaagttgc tcttgaagtt gggagtcagt ccgagggaca 3720

gggcaataag gttgccgaaa agaccgttct tcttctcacc agggagctgg gcaatcaagt 3780

tctcaagacg gcgggacttg ctcaggcgag cggagaggat ggccttggca tccacgccag 3840

acgcgttgat ggggttttcc tcgaaaagct ggttgtaggt ctgaacgagc tggatgaaga 3900

gtttatcaac atcggagttg tcggggttga ggtcaccctc gatcaggaag tgaccacgga 3960

acttgatcat gtgcgccaga gccaggtaaa tgaggcggag gtcagccttg tcggtgctgt 4020

cgacgagctt tttgcgtagg tggtagatgg tggggtactt ctcgtggtaa gcgacctcat 4080

cgacaatgtt accgaagata gggtgacgct cgtgcttctt gtcttcttca acaaggaacg 4140

actcctccag acggtggaag aaagagtcat caaccttggc catctcgttg gagaaaatct 4200

cctggaggta gcagatacgg ttcttgcggc gagtgtaacg acggcgagcg gtacgcttca 4260

gacgggtggc ctcagcagtc tcaccggagt cgaagagaag cgcaccaatg aggttcttct 4320

tgatggagtg acgatcggtg tttcccagga ccttgaattt cttgctagga accttgtact 4380

cgtcggtgat gacagcccag ccaacggagt tggtgccaat gtccagaccg atgctatact 4440

tcttgtccat tttgacggtg gaaggtgagt tggggttggt gtcatcgtgg gggaagaact 4500

tggcttttat atgggtgcag gtgaggggac ttaagccacg tgaaagttca ttcgagagag 4560

ctaaggcata ttaatgcaca tgtgtgggag ttgcatggaa cttgcatgaa aggtgcatga 4620

aaggtgcatg gtattgcaga atgcgctcgg gggtctgcgg agaaatccgt taggaaaaga 4680

tcgtcatcct tctgctgcat caccgttagc ttgaaattta gttccagcgc tagtcaaggg 4740

cttcagttca gattctgcaa gtatcaggtc catcattact ctcttcagca ggcggatcga 4800

atatcccccg aggcacatgg gaggtcttat tatccgatcg ttgatcacca tgccaatcgc 4860

ttcgaccgac cacaagttgc atcaagcact aactgcctca agcagatgcc gagtcttcat 4920

ctccgatatt taatcccgtt gaatctccgc cccctgtcat ctccaccgtt taatctgggg 4980

tggtggcgga tgtccaccaa ttagccggct aaattatccc catcgtcagc acgctagacc 5040

tgccttggaa ctagcgcttt ggtgagaaat ctcttggttg tgagtctgat accacattcc 5100

ttgacttcca tgttgttctg gaggtgtgaa agtataaaca atgccacaga tggactaatc 5160

tccggagaga tgaccctctt caagactggt gcagtgccta ggatcgctag tatcccaaaa 5220

cttcggggct gccttcattt ccagagagtt gcggtacctt gcccatcgaa cgtacaagta 5280

ctcctctgtt ctctccttcc tttgctttgt gctaatacga ctcactatag gggaatcaga 5340

tatattcagt cactggtttt agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgtta 5400

tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttggccg gcatggtccc agcctcctcg 5460

ctggcgccgg ctgggcaaca tgcttcggca tggcgaatgg gacaaaaaat caaactggct 5520

caccttcggg tgggcctttt tgcgtttata cctccggatc gatgtacaca accgactgca 5580

cccaaacgaa cacaaatctt agcagtgccc tcgccggata gcttggactg tcctttaccg 5640

tcgccagcac aagaagggta tctctgaggt ccgtaccgcc ttttctttac cactggattc 5700

gattttcgca gttggaatga tacatctggg gactgcgaat ggtttacccc tcggccgata 5760

ctatgggtcg tgaagagatg gaacattccg aaagtgtttt gcggataaca ttggtggcat 5820

cgaaaacaga atgctgacca ttgatttcaa cacgaacagg aggttgccaa gaagcgtacc 5880

cgccgtgtcg tcaagtccca gcgtgccatc gtcggtgctt ccctcgacgt gatcaaggag 5940

cgccgctccc agcgccccga ggcccgtgcc gccgcccgcc agcaggccat caaggacgcc 6000

aaggagaaga aggctgccgc tgagtccaag aagaaggctg agaaggctaa gaacgccgct 6060

gctggtgcca agggtgctgc tcagcgcatc cagagcaagc agggtgctaa gggttctgct 6120

cccaaggtcg ctgccaagtc tcgttaagga atgaataacg gttcggcttg ggattgggtg 6180

cggaaggcaa gagtttcatg gacgaatttt gggaggttac tggagctgga atatgtgttt 6240

tccctaccac caaaaatgaa atgttccaaa actatcggcg tgcaagacgg cctcttacgg 6300

gtttaacggc tctcagataa gctctatcaa tcgcgccacg gatgcatgaa tgaagatcca 6360

gatggccgcg ggatatatcg tgctagtgta attcctacat gatcttgctg ttcactccat 6420

gcgcatccag atattccagg ggtcgactgt taattgatat gcctgggctt gagactccgt 6480

agacgcccag tcaatgtgca attaatacga gggtgctgtt atcggcagca accttgtact 6540

tctccataag atgggggaat gccatggacc tgagtgatca attgacgcaa gtctcccata 6600

acgcggcggc ttgacctaaa atccatatac cgccccgttg agcctccgcg ctccagagtc 6660

ctgtcccgga atagggcaca aacctaggct aacctaattc gtcgtccgcg tctgagttca 6720

gacaaaagaa cttccaagta tcagcagagt acgctgatat tgataagtag gcaaacataa 6780

gaccaataag caagtagaat aaaaaattat aaggacactg cctccataaa gcgccctccc 6840

aagacctcag ggacaaaact tctcaagtgg caattcactg cctcaggccg tgtccagtga 6900

agtgacgaag cgacactgtt gcctgctgac tcagccgctt tccgccctgc cgaatttgcc 6960

atctcgctta caggtcagca ctagcgcgat tcgcccacag atgctcagcg caaagtggtg 7020

actcagtcaa acccccccta caagattcca cctcgatttt tcaacttccc atctcgatcc 7080

gacaagttct acatccaccg tcaaaatggc ctccagcgaa gatgtcatca aggagttcat 7140

gcgcttcaag gtccgcatgg aaggatccgt caacggccac gagttcgaga ttgagggtga 7200

gggtgagggc cgcccctacg aaggcaccca gactgccaag ctcaaggtca ccaagggtgg 7260

tcctctcccc ttcgcttggg atatcctgtc tcctcagttc cagtacggct ccaaggtcta 7320

cgtcaagcac cccgccgaca tccccgacta caagaagctt tctttccccg agggtttcaa 7380

gtgggagcgt gtcatgaact tcgaggatgg tggtgttgtg accgttactc aggacagcag 7440

cttgcaggat ggctctttca tctacaaggt caagttcatt ggtgtcaact tcccctccga 7500

cggccctgtc atgcagaaga agaccatggg ctgggaagcg tcgactgagc gtctgtaccc 7560

ccgtgacggt gttctcaagg gtgagatcca caaggctctc aagctcaagg acggtggtca 7620

ctaccttgtt gagttcaagt ccatctacat ggccaagaag cctgtgcagc tgcccggata 7680

ctactacgtg gactccaagc ttgacatcac ctcccacaac gaagactaca ccattgttga 7740

gcagtacgag cgtgctgagg gccgccacca cctcttcctg acccacggaa tggatgagct 7800

gtacaagtcg aaactataaa taaatggttt gcgttgcgat tgactgaaac gaaaaaaagc 7860

gaaaatgatt ctgggaatga attgataaag cgcgggctct gcggtacggt tacggttgcg 7920

gtcgcggacg aatggactgg gctgagctgg gctggaggaa gtccatcgaa caaggacaag 7980

gggtggaata tggcacgggt cgattttgtt atacataccc taccatccat ctatccattt 8040

aaataccaaa tgagttgttg aatggattcg cggtcttctc ggtttatttt tgcttgcttg 8100

cgtgcttaag ggatagtgtg cctcacgctt tccggcatct tccagaccac agtatatcca 8160

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actagttaga aactaatctc aggtttgcgt taaactaaat cagagcccga gaggttaaca 8460

gaacctagaa ggggactaga tatccgggta gggaaacaaa aaaaaaaaac aagacagcca 8520

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gttagttgca actaatacta gttagtatct agtctcctat aactctgaag ctagaataac 8700

ttactactat tatcctcacc actgttcagc tgcgcaaacg gagtgattgc aaggtgttca 8760

gagactagtt attgactagt cagtgactag caataactaa caaggtatta acctaccatg 8820

tctgccatca ccctgcactt cctcgggctc agcagccttt tcctcctcat tttcatgctc 8880

attttccttg tttaagactg tgactagtca aagactagtc cagaaccaca aaggagaaat 8940

gtcttaccac tttcttcatt gcttgtctct tttgcattat ccatgtctgc aactagttag 9000

agtctagtta gtgactagtc cgacgaggac ttgcttgtct ccggattgtt ggaggaactc 9060

tccagggcct caagatccac aacagagcct tctagaagac tggtcaataa ctagttggtc 9120

tttgtctgag tctgacttac gaggttgcat actcgctccc tttgcctcgt caatcgatga 9180

gaaaaagcgc caaaactcgc aatatggctt tgaaccacac ggtgctgaga ctagttagaa 9240

tctagtccca aactagcttg gatagcttac ctttgccctt tgcgttgcga caggtcttgc 9300

agggtatggt tcctttctca ccagctgatt tagctgcctt gctaccctca cggcggatct 9360

gcataaagag tggctagagg ttataaatta gcactgatcc taggtacggg gctgaatgta 9420

acttgccttt cctttctcat cgcgcggcaa gacaggcttg ctcaaattcc taccagtcac 9480

aggggtatgc acggcgtacg gaccacttga actagtcaca gattagttag caactagtct 9540

gcattgaatg gctgtactta cgggccctcg ccattgtcct gatcatttcc agcttcaccc 9600

tcgttgctgc aaagtagtta gtgactagtc aaggactagt tgaaatggga gaagaaactc 9660

acgaattctc gacaccctta gtattgtggt ccttggactt ggtgctgcta tatattagct 9720

aatacactag ttagactcac agaaacttac gcagctcgct tgcgcttctt ggtaggagtc 9780

ggggttggga gaacagtgcc ttcaaacaag ccttcatacc atgctacttg actagtcagg 9840

gactagtcac caagtaatct agataggact tgcctttggc ctccatcagt tccttcatag 9900

tgggaggtcc attgtgcaat gtaaactcca tgccgtggga gttcttgtcc ttcaagtgct 9960

tgaccaatat gtttctgttg gcagagggaa cctgtcaact agttaataac tagtcagaaa 10020

ctagtatagc agtagactca ctgtacgctt gaggcatccc ttcactcggc agtagacttc 10080

atatggatgg atatcaggca cgccattgtc gtcctgtgga ctagtcagta actaggctta 10140

aagctagtcg ggtcggctta ctatcttgaa atccggcagc gtaagctccc cgtccttaac 10200

tgcctcgaga tagtgacagt actctgggga ctttcggaga tcgttatcgc gaatgctcgg 10260

catactaatc gttgactagt cttggactag tcccgagcaa aaaggattgg aggaggagga 10320

ggaaggtgag agtgagacaa agagcgaaat aagagcttca aaggctatct ctaagcagta 10380

tgaaggttaa gtatctagtt cttgactaga tttaaaagag atttcgacta gttatgtacc 10440

tggagtttgg atataggaat gtgttgtggt aacgaaatgt aagggggagg aaagaaaaag 10500

tcggtcaaga ggtaactcta agtcggccat tcctttttgg gaggcgctaa ccataaacgg 10560

catggtcgac ttagagttag ctcagggaat ttagggagtt atctgcgacc accgaggaac 10620

ggcggaatgc caaagaatcc cgatggagct ctagctggcg gttgacaacc ccaccttttg 10680

gcgtttctgc ggcgttgcag gcgggactgg atacttcgta gaaccagaaa ggcaaggcag 10740

aacgcgctca gcaagagtgt tggaagtgat agcatgatgt gccttgttaa ctaggtcaaa 10800

atctgcagta tgcttgatgt tatccaaagt gtgagagagg aaggtccaaa catacacgat 10860

tgggagaggg cctaggtata agagtttttg agtagaacgc atgtgagccc agccatctcg 10920

aggagattaa acacgggccg gcatttgatg gctatgttag taccccaatg gaaagcctga 10980

gagtccagtg gtcgcagata actccctaaa ttccctgagc taactctaag tcgaccatgc 11040

cgtttatggt tagcgcctcc caaaaaggaa tggccgactt agagttacct cttgaccgac 11100

tttttctttc ctccccctta catttcgtta ccacaacaca ttcctatatc caaactccag 11160

gtacataact agtcgaaatc tcttttaaat ctagtcaaga actagatact taaccttcat 11220

actgcttaga gatagccttt gaagctctta tttcgctctt tgtctcactc tcaccttcct 11280

cctcctcctc caatcctttt tgctcgggac tagtccaaga ctagtcaacg attagtatgc 11340

cgagcattcg cgataacgat ctccgaaagt ccccagagta ctgtcactat ctcgaggcag 11400

ttaaggacgg ggagcttacg ctgccggatt tcaagatagt aagccgaccc gactagcttt 11460

aagcctagtt actgactagt ccacaggacg acaatggcgt gcctgatatc catccatatg 11520

aagtctactg ccgagtgaag ggatgcctca agcgtacagt gagtctactg ctatactagt 11580

ttctgactag ttattaacta gttgacaggt tccctctgcc aacagaaaca tattggtcaa 11640

gcacttgaag gacaagaact cccacggcat ggagtttaca ttgcacaatg gacctcccac 11700

tatgaaggaa ctgatggagg ccaaaggcaa gtcctatcta gattacttgg tgactagtcc 11760

ctgactagtc aagtagcatg gtatgaaggc ttgtttgaag gcactgttct cccaaccccg 11820

actcctacca agaagcgcaa gcgagctgcg taagtttctg tgagtctaac tagtgtatta 11880

gctaatatat agcagcacca agtccaagga ccacaatact aagggtgtcg agaattcgtg 11940

agtttcttct cccatttcaa ctagtccttg actagtcact aactactttg cagcaacgag 12000

ggtgaagctg gaaatgatca ggacaatggc gagggcccgt aagtacagcc attcaatgca 12060

gactagttgc taactaatct gtgactagtt caagtggtcc gtacgccgtg catacccctg 12120

tgactggtag gaatttgagc aagcctgtct tgccgcgcga tgagaaagga aaggcaagtt 12180

acattcagcc ccgtacctag gatcagtgct aatttataac ctctagccac tctttatgca 12240

gatccgccgt gagggtagca aggcagctaa atcagctggt gagaaaggaa ccataccctg 12300

caagacctgt cgcaacgcaa agggcaaagg taagctatcc aagctagttt gggactagat 12360

tctaactagt ctcagcaccg tgtggttcaa agccatattg cgagttttgg cgctttttct 12420

catcgattga cgaggcaaag ggagcgagta tgcaacctcg taagtcagac tcagacaaag 12480

accaactagt tattgaccag tcttctagaa ggctctgttg tggatcttga ggccctggag 12540

agttcctcca acaatccgga gacaagcaag tcctcgtcgg actagtcact aactagactc 12600

taactagttg cagacatgga taatgcaaaa gagacaagca atgaagaaag tggtaagaca 12660

tttctccttt gtggttctgg actagtcttt gactagtcac agtcttaaac aaggaaaatg 12720

agcatgaaaa tgaggaggaa aaggctgctg agcccgagga agtgcagggt gatggcagac 12780

atggtaggtt aataccttgt tagttattgc tagtcactga ctagtcaata actagtctct 12840

gaacaccttg caatcactcc gtttgcgcag ctgaacagtg gtgaggataa tagtagtaag 12900

ttattctagc ttcagagtta taggagacta gatactaact agtattagtt gcaactaacc 12960

tggatctcag agactttggc ctcaatctag aatctatcta gttgtcaact agactgtggt 13020

atcattgtct tttattttcc tagtcctgga actagcttct aactagtctc cctaatatgt 13080

ggctgtcttg tttttttttt ttgtttccct acccggatat ctagtcccct tctaggttct 13140

gttaacctct cgggctctga tttagtttaa cgcaaacctg agattagttt ctaactagtc 13200

tctaggtttt ctatccacct ttaattgtaa taataaatac aagcaacgtt tatacgtcaa 13260

aagcatttat aaacttttac cctaaagtag cttgcttgtg tgtttagttt ataattagtc 13320

tcttattaat ttgatgtagg taagcccgcc acaaatatat atttttaaca agataccgtg 13380

gaaaaacttc gtgctatcac aaaacagtat acaaaaaata agctatcgaa ttcctgcaga 13440

gatcatcctg tcttcagtct taagacttct ctcctatatc acccgcactt accctagagt 13500

gccgcttagg tgctaagggc acattgagta ttggccgtgt agaatatata gcttaagtac 13560

ggccaagcag acgggaagcc ctgttctcca caccctatgg tcgtatatat caggcttcta 13620

ccgggaaacg attaagagtg tataatggac tgaaaatcaa tatgaacggg acaatgctca 13680

agttaaatta gttaggcatc ctaatctcta ctaaatgttc tatctagaga tcggggtact 13740

ataggcccgt acgttaatca ctctacgctt ctctccctta ggtatagtgt aggtaggggc 13800

tagacattta tatgagtcag atggtacaaa cggtaggcag tgcgggcgaa gaagtgaaga 13860

cggagtcggt tgaagctaca tacaaaagat gcattggctc gtcatgaaga gcctcccggg 13920

tttattcctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt 13980

ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag 14040

tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga 14100

aattgccgtc aaccaagctc tgatagagtt ggtcaagacc aatgcggagc atatacgccc 14160

ggagccgcgg cgatcctgca agctccggat gcctccgctc gaagtagcgc gtctgctgct 14220

ccatacaagc caaccacggc ctccagaaga agatgttggc gacctcgtat tgggaatccc 14280

cgaacatcgc ctcgctccag tcaatgaccg ctgttatgcg gccattgtcc gtcaggacat 14340

tgttggagcc gaaatccgcg tgcacgaggt gccggacttc ggggcagtcc tcggcccaaa 14400

gcatcagctc atcgagagcc tgcgcgacgg acgcactgac ggtgtcgtcc atcacagttt 14460

gccagtgata cacatgggga tcagcaatcg cgcatatgaa atcacgccat gtagtgtatt 14520

gaccgattcc ttgcggtccg aatgggccga acccgctcgt ctggctaaga tcggccgcag 14580

cgatcgcatc catggcctcc gcgaccggct gcagaacagc gggcagttcg gtttcaggca 14640

ggtcttgcaa cgtgacaccc tgtgcacggc gggagatgca ataggtcagg ctctcgctga 14700

attccccaat gtcaagcact tccggaatcg ggagcgcggc cgatgcaaag tgccgataaa 14760

cataacgatc tttgtagaaa ccatcggcgc agctatttac ccgcaggaca tatccacgcc 14820

ctcctacatc gaagctgaaa gcacgagatt cttcgccctc cgagagctgc atcaggtcgg 14880

agacgctgtc gaacttttcg atcagaaact tctcgacaga cgtcgcggtg agttcaggca 14940

ttttgacggt gggatcctgt gatgtctgct caagcggggt agctgttagt caagctgcga 15000

tgaagtggga aagctcgaac tgaaaggttc aaaggaataa gggatgggaa ggatggagta 15060

tggatgtagc aaagtactta cttaggggaa ataaaggttc ttggatggga agatgaatat 15120

actgaagatg ggaaaagaaa gagaaaagaa aagagcagct ggtggggaga gcaggaaaat 15180

atggcaacaa atgttggact gacgcaacga ccttgtcaac cccgccgaca caccgggcgg 15240

acagacgggg caaagctgcc taccagggac tgagggacct cagcaggtcg agtgcagagc 15300

accggatggg tcgactgcca gcttgtgttc ccggtctgcg ccgctggcca gctcctgagc 15360

ggcctttccg gtttcataca ccgggcaaag caggagaggc acgatatttg gacgccctac 15420

agatgccgga tgggccaatt agggagctta cgcgccgggt actcgctcta cctacttcgg 15480

agaaggtact atctcgtgaa tcttttacca gatcggaagc aattggactt ctgtacctag 15540

gttaatggca tgctatttcg ccgacggcta tacacccctg gcttcacatt ctccttcgct 15600

tactgccggt gattcgatga agctccatat tctccgatga tgcaatagat tcttggtcaa 15660

cgaggggcac accagccttt ccacttcggg gcggaggggc ggccggtccc ggattaataa 15720

tcatccactg cacctcagag ccgccagagc tgtctggcgc agtggcgctt attactcagc 15780

ccttctctct gcgtccgtcc gtctctccgc atgccagaaa gagtcaccgg tcactgtaca 15840

gagcggccgc caccgcggtg gagctccaat tcgccctata gtgagtcgta ttacgcgcgc 15900

tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 15960

cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 16020

cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca 16080

ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta 16140

gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt 16200

caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac 16260

cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt 16320

tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga 16380

acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg 16440

gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta acgcgaattt taacaaaata 16500

ttaacgctta caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 16560

tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 16620

ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 16680

ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 16740

aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 16800

gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttcgac 16860

cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa ataaatcctg gtgtccctgt 16920

tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga gacgttgatc ggcacgtaag 16980

aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg ggcgtatttt ttgagttgtc 17040

gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat ataccaccgt 17100

tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag ttgctcaatg 17160

tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg taaagaaaaa 17220

taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga atgctcatcc 17280

ggaattacgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg ttcacccttg 17340

ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg aataccacga 17400

cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg gtgaaaacct 17460

ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca atccctgggt 17520

gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg cccccgtttt 17580

caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt 17640

tcatcatgcc gtttgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat tacaacagta 17700

ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac 17760

gcctggttgc tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgaaagc 17820

aaattcgacc cggtcgtcgg ttcagggcag ggtcgttaaa tagccgctta tgtctattgc 17880

tggtttaccg gtttattgac taccggaagc agtgtgaccg tgtgcttctc aaatgcctga 17940

ggccagtttg ctcaggctct ccccgtggag gtaataattg acgatatgat cctttttttc 18000

tgatcaaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 18060

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 18120

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 18180

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 18240

agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 18300

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 18360

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 18420

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 18480

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 18540

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 18600

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 18660

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 18720

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 18780

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 18840

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 18900

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 18960

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 19020

ccccaggctt tacactttat gctcccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 19080

caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcgcgcaat taaccctcac 19140

taaagggaac aaaagctg 19158

<210> 73

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer used to check the cloned T7

gRNA cassette in AMA-vector (BG-AMA18 and BG-AMA19) by GoldenGate

<400> 73

ttgcccatcg aacgtacaag 20

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer used to check the cloned T7

gRNA cassette in AMA-vector (BG-AMA18 and BG-AMA19) by GoldenGate

<400> 74

tgctaagatt tgtgttcgtt tgg 23

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of forward primer to amplify part of the fwnA

gene to produce DNA fragments for sequencing and primer also used

for sequencing reaction to check correct integration of door DNA

in the genome

<400> 75

acagtcttgc gagccttcat c 21

<210> 76

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nucleotide sequence of reverse primer to amplify part of the fwnA

gene to produce DNA fragments for sequencing

<400> 76

caactggagg taggaccgta tcg 23

Claims (34)

1.单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶，用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的用途，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述RNA聚合酶在所述细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

4.根据权利要求1–3中任一项所述的用途，其中所述RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。

5.根据权利要求1–4中任一项所述的用途，其中所述细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或者其中所述细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。

6.根据权利要求1–5中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶从诱导型启动子表达。

7.根据权利要求1–6中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶是密码子优化的RNA聚合酶和/或断裂RNA聚合酶。

8.根据权利要求1–7中任一项所述的用途，其中所述RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在所述RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS。

9.根据权利要求1–8中任一项所述的用途，其中从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达多种不同的指导RNA。

10.根据权利要求1–9中任一项所述的用途，其中所述指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。

11.根据权利要求1–10中任一项所述的用途，其中所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变体启动子，诸如嵌合启动子。

12.根据权利要求1–11中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。

13.根据权利要求1–12中任一项所述的用途，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含所述指导多核苷酸的靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到所述细胞内。

14.根据权利要求1–13中任一项所述的用途，其中所述细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。

15.根据权利要求1–14中任一项所述的用途，其中所述细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在所述细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。

16.一种用于在细胞内表达用于RNA指导的核酸酶系统的指导RNA的方法，其中所述指导RNA由这样的多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，优选病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，更优选T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶启动子，并且其中所述指导RNA的转录由单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，优选由病毒单亚基DNA依赖性RNA聚合酶执行，更优选由T3、SP6、K11或T7RNA聚合酶执行。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述RNA聚合酶在所述细胞内从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒，优选为包含选择性标记的质粒。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述指导RNA从线性核酸构建体表达，从基因组表达或从载体表达，所述载体优选为质粒。

19.根据权利要求16–18中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶系统基于CRISPR，诸如CRISPR/Cas和CRISPR/Cpf1。

20.根据权利要求16–19中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞，优选芽孢杆菌细胞，或者其中所述细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，更优选真菌细胞。

21.根据权利要求16–20中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶从诱导型启动子表达。

22.根据权利要求16–21中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶是密码子优化的RNA聚合酶和/或断裂RNA聚合酶。

23.根据权利要求16–22中任一项所述的方法，其中所述RNA聚合酶在C末端或N末端具有核定位信号(NLS)，更优选地在所述RNA聚合酶的N末端具有SV40NLS。

24.根据权利要求16–23中任一项所述的方法，其中从单个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子或从多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达多种不同的指导RNA。

25.根据权利要求16–24中任一项所述的方法，其中所述指导RNA从来自单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子文库的一个或多个单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子表达。

26.根据权利要求16–25中任一项所述的方法，其中所述单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子是变体单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，诸如嵌合启动子。

27.根据权利要求16–26中任一项所述的方法，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子并且可操作地连接到自加工核酶和/或单亚基DNA依赖性RNA聚合酶终止子。

28.根据权利要求16-27中任一项所述的方法，其中所述指导RNA由多核苷酸编码，所述多核苷酸可操作地连接到单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子，其中所述多核苷酸和单亚基DNA依赖性RNA聚合酶启动子存在于质粒上，并且其中通过将包含所述指导多核苷酸的靶序列的单链或双链寡核苷酸整合到所述质粒中而将所述质粒组装到所述细胞内。

29.根据权利要求16-28中任一项所述的方法，其中所述细胞缺乏NHEJ(非同源末端连接)部件。

30.根据权利要求16–29中任一项所述的方法，其中所述细胞表达功能性异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9，或者其中在所述细胞中存在异源基因组编辑酶，优选Cas酶，优选Cas9、Cas9切口酶或dCas9。

31.一种组合物，包含所述细胞、所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到如在权利要求1–30中任一项所定义的启动子。

32.一种可通过根据权利要求16-30中任一项所述的方法获得的细胞。

33.一种细胞，包含至少所述RNA聚合酶和所述编码指导RNA的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到如在权利要求1-30中任一项所定义的启动子，所述细胞优选能够产生目的化合物。

34.一种用于生产目的化合物的方法，包括在有助于生产所述目的化合物的条件下培养根据权利要求32或33所述的细胞，以及任选地纯化或分离所述目的化合物。