JP2008527985A - 糸状菌細胞において目的の化合物を産生させるための方法 - Google Patents
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Abstract
から選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳終結配列、および/またはヌクレオチドの多義コード:v(A/C/G);n(A/C/G/T)を使用して、次のリストの配列:gctnccyycから選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳イニシエータコード配列、好ましくは、5’−GCT TCC TTC−3’のような制御配列を含んでなる。本発明はさらに、コンセンサス翻訳イニシエータ配列:5’−mwChkyCAmv−3’に関し、好ましくは、翻訳イニシエータ配列は:5’−mwChkyCAAA−3’、5’−mwChkyCACA−3’、および5’−mwChkyCAAG−3’からなるリストから選択される。
【選択図】なし
Description
本発明は、糸状菌細胞において目的の化合物を産生させるための方法であって、ここで、目的の化合物をコードするヌクレオチド配列および/またはそれに操作可能に会合した制御ヌクレオチド配列は、目的の化合物をコードするヌクレオチド配列の改善された発現および/または目的の化合物の改善された産生が得られるように改変されている、方法に関する。
本発明は、目的の化合物を産生させるための改善された方法に関する。タンパク質過剰発現および/または産生のための株を作製することにおいて、今までに多数のアプローチが適用されている。これは、目的の化合物をコードするマルチコピーの遺伝子を伴う株を作製すること、および強力なプロモーター配列を適用することを含むが、これらに限定されない。
糸状菌細胞における目的の化合物の産生を改善するための新規のアプローチは、タンパク質をコードする配列またはタンパク質コード配列の改変および場合により、翻訳効率および/または目的の化合物の産生の効率に影響を及ぼし得る関連する「非コード」配列または制御配列に基づいて提唱される。
本発明の第1の態様に従えば、以下を含んでなるヌクレオチド配列が提供される:
・生来のコドンが同義コドンと交換されている(前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表1において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する)ような最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列;場合により、前記ヌクレオチド配列は、以下のような制御配列を含んでなる:
・次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳終結配列、および/または
次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳イニシエータコード配列。
[ここで、gはヌクレオチドコード配列、|g|はその長さ、g(k)はそのk番目のコドンを表し、
は、コドンc(k)の所望される割合、
はヌクレオチドコード配列gにおける実際の割合である]
によって算出される、配列である。
・予め決定されたアミノ酸配列をコードする野生型ヌクレオチド配列、
・コドンに対する無作為選択を使用する天然に存在するアミノ酸配列の逆翻訳、
・既知のアミノ酸配列に対して相同性を示す天然に存在しないアミノ酸配列、例えば、シャッフルした配列、
・例えば、融合配列において使用されるべき上記の配列の一部。
好ましくは、翻訳イニシエータコード配列は、核酸配列:5’−GCT TCC TTC−3’(即ち、配列番号21)を有する。
を、コドンckの所望される割合(または頻度)、および
を先と同様に遺伝子gにおける実際の割合とし、次いで、単一のコドン適応度は以下のように規定される:
[ここで、gはヌクレオチドコード配列、|g|はその長さ、g(k)はそのk番目のコドンを表し、
は、コドンc(k)の所望される割合、
はヌクレオチドコード配列gにおける算出された割合である]。
第2の態様では、本発明は、翻訳イニシエータ配列に関する。翻訳イニシエータ配列は、タンパク質の開始部をコードする核酸領域であり、翻訳イニシエータ配列の生物学的活性は、アミノ酸配列がmRNAのヌクレオチド配列によって特定されるポリペプチドのリボソーム仲介産生を開始すべきである。真核生物では、ATGの前の翻訳イニシエータコンセンサス配列(6−12ヌクレオチド)は、この論題に対する最初の研究(コザック,M.(Kozak,M.)(1987年):「an analysis of 5’−noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs」Nucl.Acid Res.15(20):8125−47)により、しばしば、コザックコンセンサス配列と呼ばれる。コザック(Kozak)によって誘導される+4ヌクレオチドを含む本来のコザックコンセンサス配列CCCGCCGCCrCC(ATG)Gは、高等真核生物における翻訳の開始と関連する。本発明に関して、用語「翻訳イニシエータ配列」は、ポリペプチドをコードするDNA配列のオープンリーディングフレームのイニシエータまたは開始コドンのすぐ上流の10個のヌクレオチドとして規定される。イニシエータまたは開始コドンは、AAメチオニンをコードする。イニシエータコドンは、典型的に、ATGであるが、また、GTGのような任意の機能的開始コドンであってもよい。ウラシル、Uが、RNAでは、デオキシヌクレオチドのチミン、Tに取って代わることは当該分野において周知である。
・最適コドン頻度および/または以下のような制御配列の改変を使用することによる同義ヌクレオチドコード配列:
・次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された翻訳終結配列、および/または
・次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された翻訳イニシエータコード配列、および/または
翻訳イニシエータ配列であって、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード:m(A/C);r(A/G);w(A/T);s(C/G);y(C/T);k(G/T);v(A/C/G);h(A/C/T);d(A/G/T);b(C/G/T);n(A/C/G/T)を使用するコンセンサス翻訳イニシエータ配列:5’−mwChkyCAmv−3’によって規定される核酸配列を含んでなり、好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、次のリスト:5’−mwChkyCAAA−3’、5’−mwChkyCACA−3’、および5’−mwChkyCAAG−3’から選択されるものであり、より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、5’−CACCGTCAAA−3’または5’−CGCAGTCAAG−3’である。
第3の態様に従えば、本発明は、先のセクションにおいて規定される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物または発現ベクターに関する:
・最適コドン頻度および場合により、以下のような制御配列の改変を使用することによる同義ヌクレオチドコード配列:
・次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳終結配列、および/または
次のリストの配列:
から選択される5’から3’方向へ配向された1つの翻訳イニシエータコード配列、および/または
翻訳イニシエータ配列、前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード:m(A/C);r(A/G);w(A/T);s(C/G);y(C/T);k(G/T);v(A/C/G);h(A/C/T);d(A/G/T);b(C/G/T);n(A/C/G/T)を使用して、コンセンサス翻訳イニシエータ配列:5’−mwChkyCAmv−3’によって規定される核酸配列を含んでなり、
好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、次のリスト:5’−mwChkyCAAA−3’、5’−mwChkyCACA−3’および5’−mwChkyCAAG−3’から選択されるものである。これらの好適な配列は、次の配列のいずれか1つに対応する:
より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、5’−CACCGTCAAA−3’または5’−CGCAGTCAAG−3’である。
より好ましくは、翻訳イニシエータ配列は、5’−CACCGTCAAA−3’または5’−CGCAGTCAAG−3’である。
第4の態様に従えば、本発明は糸状菌宿主細胞に関する。本発明の糸状菌宿主細胞は、当業者に既知の任意の糸状菌宿主細胞宿主細胞であり得る。
本発明は、目的の化合物を産生させるために使用され得る。目的の化合物は、好ましくは、ポリペプチドである。あるいは、目的の化合物は代謝物であってもよい。この場合、代謝物の合成に関与する酵素をコードするヌクレオチド配列が、本発明に従って改変される。用語「代謝物」は一次および二次代謝物の両方を包含し;代謝物はいずれの代謝物であってもよい。好適な代謝物はクエン酸である。別の好適な代謝物はカロテノイドである。代謝物は、例えば、生合成または代謝経路において、1つもしくはそれ以上の遺伝子によってコードされ得る。一次代謝物は、エネルギー代謝、増殖、および構造に関係する細胞の一次または全体的代謝の産物である。二次代謝物は、二次代謝の産物である(例えば、R.B.ハーバード(R.B.Herbert)、「The Biosynthesis of Secondary Metabolites」チャップマン(Chapman)およびホール(Hall)、ニューヨーク、1981年を参照のこと)。一次代謝物として、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド、またはビタミンがあり得るが、これらに限定されない。二次代謝物として、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチド、またはテルペンがあり得るが、これらに限定されない。二次代謝物は、抗生物質、摂食阻害剤、アトラクタント、殺菌剤(bacteriocide)、殺真菌剤、ホルモン、殺虫剤、または殺鼠剤であってもよい。好適な抗生物質は、セファロスポリン系薬剤およびβ−ラクタム系薬剤である。
(a)目的の化合物の産生に適する栄養培地において、糸状菌宿主細胞を培養すること;および
(b)糸状菌宿主細胞の栄養培地から目的の化合物を回収すること。
本発明のさらなる態様に従えば、本発明の第1の態様のヌクレオチド配列を産生させるための方法が提供され、以下の工程を含んでなる:
・本発明の第1の態様において規定される最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、および場合により、
・場合により、前記同義ヌクレオチドコード配列を、本発明の第1の態様で規定される制御配列に連結させること。
・システインは、常にTGCによって;
・フェニルアラニンはTTCによって;
・ヒスチジンはCACによって;
・リジンはAAGによって;
・アスパラギンはAACによって;
・グルタミンはCAGによって;
・チロシンはTACによってコードされる。
・アラニンはGCT、GCC、GCA、またはGCGによって;
・アスパラギン酸はGAT、GACによって;
・グルタミン酸はGAA、GAGによって;
・グリシンはGGT、GGC、GGA、GGGによって;
・イソロイシンはATT、ATC、ATAによって;
・ロイシンはTTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTGによって;
・プロリンはCCT、CCC、CCA、CCGによって;
・アルギニンはCGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGGによって;
・セリンはTCT、TCC、TCA、TCG、AGT、AGCによって;
・スレオニンはACT、ACC、ACA、ACGによって;
・バリンはGTT、GTC、GTA、GTGによってコードされる。
グループ3 AAおよびそれらの異なる対応するコドンについて、所定のコード配列内のそれぞれの可能なコドンの最適な発生の算出は、好ましくは、以下の方法論に従って実施される:
i.それぞれのグループ3 AAのそれぞれについて、所定の配列においてコードされる残基の総数を合計する、
ii.それぞれのAAおよび該AAをコードするコドンについて、該AAについての総数に、表1における最適コドン分布を乗じ、一般的に10進数を含有し得る生のコドン分布を求める、
iii.数字を取り出すことによって、生のコドン分布(ii)の値を丸め、丸められたコドン分布を求める、
iv.AAのそれぞれについて、丸められたコドン分布(iii)において示されるAAの総数を合計する、
v.所定の配列(i)においてコードされる残基の総数を、丸められたコドン分布(iv)において示されるAAの総数で引くことによって、丸められたコドン分布におけるそれぞれのAAのそれぞれについての残基の失われた総数を算出する、
vi.それぞれのコドンについて、減法によって、生のコドン分布(ii)と丸められたコドン分布(iii)との間の10進数の差異を算出する、
vii.それぞれのコドンについて、10進数の差異(vi)および表1における最適コドン分布を乗じ、それぞれのコドンに対するウェイト値を得る、
viii.それぞれのAAのそれぞれについて、失われた残基の量(v)、最も高いウェイト値を有するコドンのそれぞれの量(vii)を選択する、
ix.ポリペプチドをコードする所定の配列内の最終最適コドン分布の算出は、丸められたコドン分布(iii)およびそれぞれのコドンについて失われた残基(viii)の選択された量を合計することによって、算出される。
・上記の方法を使用する本発明の第1の態様において規定される最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、
・上記の方法を使用して、本発明の第2の態様に従って、翻訳イニシエータ配列を伴うヌクレオチド配列を提供すること、および場合により
・場合により、前記同義ヌクレオチドコード配列を、本発明の第1の態様で規定される制御配列に連結させること。
株
WT1:このA.niger(A.ニガー)株を野生型株として使用する。この株は、寄託番号CBS513.88でCBS Instituteに寄託される。
A.ニガー(A.niger)株を、国際公開第99/32617号パンフレットの実施例:「A.ニガー(A.niger)振盪フラスコ発酵」に記載のように、20ml前培養培地において前培養した。1晩増殖後、10mlのこの培養物を、α−アミラーゼ発酵のために、発酵培地1(FM1)およびホスホリパーゼA1発酵のために発酵培地2(FM2)のに移した。発酵は、全体的に国際公開第99/32617号パンフレットに記載のように、100ml発酵ブロスを伴うバッフル付500mlフラスコにおいて、34℃および170rpmで、示された日数の間、実施される。
A.ニガー(A.niger)培養ブロスにおけるホスホリパーゼPLA1活性(pla1)を分光学的に決定するために、人工基質:1,2−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリン(diC8、基質)を使用する。pla1は、A1位でスルフィド結合を加水分解し、チオ−オクタン酸を解離させる。チオ−オクタン酸は、4,4ジチオピリジン(発色試薬、4−DTDP)と反応し、4−チオピリドンを形成する。4−チオピリドンは、4−メルカプトピリジンと互変異性平衡であり、334nmの波長を有する照射を吸収する。該波長での消光変化を測定する。1単位は、37℃およびpH4.0で1分間あたり1,2−ジチオジオクタノイルホスファチジルコリンから1nmolチオ−オクタン酸を遊離させる酵素の量である。
A.ニガー(A.niger)培養ブロスにおけるα−アミラーゼ活性を決定するために、供給者のプロトコルに従って、Megazyme cereal alpha−amylase kit(Megazyme,CERALPHA alpha amylase assay kit、カタログ参照K−CERA、2000−2001年)を使用する。測定される活性は、過剰のグルコアミラーゼおよびα−グルコシダーゼの存在下で、非還元末端をブロックしたp−ニトロフェニルマルトヘプタオシドの加水分解に基づく。形成されるp−ニトロフェノールの量は、サンプル中に存在するα−アミラーゼ活性に対する測定値である。
ホスホリパーゼA1タンパク質をコードするpla1遺伝子のDNA配列は、特開平10−155493−A/1号公報において開示され、また、受託番号E16314下でEMBL Nucleotide Sequence Database(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html)から回収することができる。生来の麹菌(A.oryzae)pla1遺伝子のゲノム配列を配列番号1として示す。pla1の対応するコード配列を配列番号2として示す。配列番号2の翻訳された配列は、配列番号3として割り当てられ、麹菌(A.oryzae)ホスホリパーゼA1を表す。
2.1.A.ニガー(A.niger)における発現のための麹菌(A.oryzae)ホスホリパーゼA1コード配列のコドン頻度またはコドン使用頻度の改善
本発明の方法を、麹菌(A.oryzae)のPLA1遺伝子のコドン使用の改善に、以後適用した。この方法は、任意のヌクレオチド配列のコドン使用の改善のための同じ様式で適用することができる。pla1のヌクレオチドコード配列を配列番号2として示す。
i.それぞれのグループ3 AAのそれぞれについて、所定の配列においてコードされる残基の総数を合計する、カラムA1(表3)を参照のこと、
ii.それぞれのAAおよび該AAをコードするコドンについて、該AAについての総数に、表1における最適コドン分布を乗じ、一般的に10進数を含有し得る生のコドン分布を求める、カラムA2(表4)を参照のこと、
iii.数字を取り出すことによって、生のコドン分布(ii)の値を丸め、丸められたコドン分布を求める、カラムA3(表4)を参照のこと、
iv.AAのそれぞれについて、丸められたコドン分布(iii)において示されるAAの総数を合計する、カラムA4(表3)を参照のこと、
v.所定の配列(i)においてコードされる残基の総数を、丸められたコドン分布(iv)において示されるAAの総数で引くことによって、丸められたコドン分布におけるそれぞれのAAのそれぞれについての残基の失われた総数を算出する、カラムA5(表3)を参照のこと、
vi.それぞれのコドンについて、減法によって、生のコドン分布(ii)と丸められたコドン分布(iii)との間の10進数の差異を算出する、カラムA6(表4)を参照のこと、
vii.それぞれのコドンについて、10進数の差異(vi)および表1における最適コドン分布を乗じ、それぞれのコドンに対するウェイト値を得る、カラムA7(表4)を参照のこと、
viii.それぞれのAAのそれぞれについて、失われた残基の量(v)、最も高いウェイト値を有するコドンのそれぞれの量(vii)を選択する、カラムA8(表4)を参照のこと、
ix.ポリペプチドをコードする所定の配列内の最終最適コドン分布の算出は、丸められたコドン分布(iii)およびそれぞれのコドンについて失われた残基(viii)の選択された量を合計することによって、算出される、カラムA9(表4)を参照のこと。
麹菌(A.oryzae)ホスホリパーゼA1をコードする生来のpla1遺伝子は、「TAG」終止コドン、続いて、導入されるSnaBI制限部位のTACGTAを含有する。多くの合成構築物では、5’−TAGT−3’翻訳終結配列は、TAAAに続いてSnaBI制限部位の同じTACGTAによって置き換えられる。この置き換えは、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号35の配列において行われている。この結果として、発現構築物pGBFINPLA−1d、pGBFINPLA−1e、pGBFINPLA−1f、pGBFINPLA−1gおよびpGBFINPLA−1hは、本発明に従う改変型翻訳終結配列を有する。
A.ニガー(A.niger)における酵素の過剰発現のために、pGBFIN発現構築物を使用して、強力なglaAプロモーターが適用される。PglaAのATG開始コドンを含む翻訳開始配列は、5’−CACCTCAGCA ATG−3’である。PglaAの翻訳開始配列は、5’−CACCGTCAAA−3’または5’−CGCAGTCAAG−3’に改変されている。これにより、EcoRI部位の下流にそれぞれ配列番号25および26において同定され得るようなグルコアミラーゼプロモーター配列を生じる。この置き換えは、配列番号9、配列番号10、配列番号12、配列番号13および配列番号14の配列において実施した。この結果として、発現構築物pGBFINPLA−1b、pGBFINPLA−1c、pGBFINPLA−1e、pGBFINPLA−1fおよびpGBFINPLA−1gは、本発明に従う改変型翻訳終結配列を有する。米国特許第6,461,837B1号明細書に記載の翻訳イニシエータ配列は、発現構築物pGBFINPLA−1hを生じる配列番号35の配列において試験されている。
翻訳開始コード配列の改変は、コドン最適化および/または翻訳開始コード配列の改善と組み合わせることができる。ただ1つのコドンが最適であり、即ち、コドンはアラニンをコードするGCTによって置き換えられるため、コード配列における第2のコドンの置換は明白である。第3のコドンは、4つの選択肢:それぞれセリン、プロリン、スレオニン、およびアルギニンをコードするTCC;CCC;ACC;GCCを有する。TTCを選択した。第4のコドンは、フェニルアラニンに対するTTC、セリンに対するTTC、ロイシンに対するCTC、またはプロリンに対するCCCのいずれかであり得る。TCCを選択した。これは、開始コドンを含む改変型翻訳開始コード配列として5’−ATGGCTTCCTTC−3’をもたらす。これにより、EcoRI部位の下流かつ翻訳開始コード配列を伴う配列番号27において同定され得るようなグルコアミラーゼプロモーター配列を生じる。この改変型配列は、配列番号14において使用される。この結果として、発現構築物pGBFINPLA−1gは、本発明に従う改変型翻訳開始コード配列を有する。
産生させようとするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現は、コドン使用頻度、ならびに/あるいはコンセンサス翻訳イニシエータコード配列ならびに/あるいはコンセンサス翻訳イニシエータ配列および/または最適翻訳終結配列を含んでなる制御DNA配列を最適化することによって、改善され得る。一連の8つの構築物(表5)を分析して、本発明の多くの実施態様を試験した。
3.1.A.ニガー(A.niger)における発現のためのα−アミラーゼコード配列amyAのコドン頻度またはコドン使用頻度の改善
本発明の方法を、A.ニガー(A.niger)のamyA遺伝子のコドン使用の改善に、以後適用した。この方法は、任意のヌクレオチド配列のコドン使用の改善のための同じ様式で適用することができる。生来のamyAのヌクレオチドコード配列を配列番号29として示す。
本実施例では、A.ニガー(A.niger)におけるαアミラーゼ酵素の過剰発現のために、pGBFINに基づく発現構築物を使用して、強力なamyAプロモーターが適用される。PamyAのATG開始コドンを含む翻訳開始配列は、5’−GGCATTTATG ATG−3’または5’−GAAGGCATTT ATG−3’であり、どのATGが開始コドンとして選択されるかに依存する。PamyAの翻訳開始配列は、5’−CACCGTCAAAATG−3’に改変されている。この置き換えは、配列番号33および配列番号34の配列において行われている。この結果として、発現構築物pGBFINFUA−2およびpGBFINFUA−3は、本発明に従う改変型翻訳開始配列を有する。
発現させようとするポリペプチドをコードする配列の発現は、コドン使用頻度ならびに/あるいはコンセンサス翻訳イニシエータ配列および/または最適翻訳終結配列を含んでなる制御DNA配列を最適化することによって、改善され得る。一連の3つの構築物(表7)を構築して、本発明の多くの実施態様を試験した。
4.1.実施例2.1〜2.5に従う麹菌(A.oryzae)ホスホリパーゼA1を発現する改変型pla1発現ベクターの構築
pGBFINPLA−1aのクローニングされたEcoRI−SnaBIフラグメントのDNA配列を、配列番号8として示す。グルコアミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるEcoRIフラグメントのDNA配列を、配列番号9および配列番号10として示す。これらの改変型遺伝子フラグメントを完全に合成し、配列解析によって配列を確認した。
pGBFINFUA−1(図4)のXhoI−PacIフラグメントのDNA配列を、配列番号31として示し、野生型amyAプロモーターおよび野生型amyA cDNA配列を含んでなり、改変型翻訳終止配列(TAAA)を伴う。α−アミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるDNA配列を、配列番号33として示す。α−アミラーゼエンコーディングamyA遺伝子に対するコドン最適化コード配列と組み合わされたα−アミラーゼプロモーターの翻訳開始配列の変種を含んでなるDNA配列を、配列番号34として示す。これらの改変型遺伝子フラグメントをインビトロで完全に合成し、配列解析によって配列を確認した。
先の段落において調製したpGBFINPLAおよびpGBFINFUA発現構築物を、以下に記載のような形質転換および図5に示されるストラテジーに従って、A.ニガー(A.niger)に導入した。
Claims (25)
- 最適化されたコドン頻度は、少なくとも1つの生来のコドン、好ましくは少なくとも2つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも3つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも4つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも5つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、80%、85%、90%、最も好ましくは少なくとも95%の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、前記同義コドンは生来のコドンと同じアミノ酸をコードし、表1において規定されるコドン使用頻度において生来のコドンより高い頻度を有する、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- 最適化されたコドン頻度は、少なくとも1つの生来のコドン、好ましくは少なくとも2つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも3つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも4つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも5つの生来のコドン、より好ましくは少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、80%、85%、90%、最も好ましくは少なくとも95%の生来のコドンが同義コドンと交換されているようなものであり、同義コドンは、次のリストの最適百分率:TGC(100%)によるシステイン;TTC(100%)によるフェニルアラニン;CAC(100%)によるヒスチジン;AAG(100%)によるリジン;AAC(100%)によるアスパラギン;CAG(100%)によるグルタミン;TAC(100%)によるチロシン;アラニンはGCT(38%)、GCC(51%)、もしくはGCG(11%)によりコードされる;GAC(64%)によるアスパラギン酸;GAG(74%)によるグルタミン酸;GGT(49%)、GGC(35%)、GGA(16%)によるグリシン;ATT(27%)、ATC(73%)によるイソロイシン;TTG(13%)、CTT(17%)、CTC(38%)、CTG(32%)によるロイシン;CCT(36%)、CCC(64%)によるプロリン;CGT(49%)、CGC(51%)によるアルギニン;TCT(21%)、TCC(44%)、TCG(14%)、AGC(21%)によるセリン;ACT(30%)、ACC(70%)によるスレオニンおよび/またはGTT(27%)、GTC(54%)、GTG(19%)によるバリンを適用する、前記頻度における前記同義コドンの百分率と列挙された最適百分率との間の差分絶対値が修飾後により小さくなるようにコドン頻度を変更する、請求項1または2に記載のヌクレオチド配列。
- アミノ酸配列から逆行分析される、請求項4に記載のコドン適応度を伴う同義ヌクレオチドコード配列。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列であって、
同義ヌクレオチドコード配列はシグナル配列を含んでなる、ヌクレオチド配列。 - 少なくとも1つのイントロンおよび請求項1〜6のいずれか一項に記載の同義ヌクレオチドコード配列を含んでなるヌクレオチド配列。
- 好ましくは、翻訳イニシエータ配列を含んでなる請求項1〜7のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列であって、
前記翻訳イニシエータ配列は、ヌクレオチドの多義コード:m(A/C);r(A/G);w(A/T);s(C/G);y(C/T);k(G/T);v(A/C/G);h(A/C/T);d(A/G/T);b(C/G/T);n(A/C/G/T)を使用して、コンセンサス翻訳イニシエータ配列:5’−mwChkyCAmv−3’(即ち、配列番号16)によって規定される核酸配列を含んでなり、好ましくは、コンセンサス翻訳イニシエータ配列は、次のリスト:5’−mwChkyCAAA−3’(即ち、配列番号17)、5’−mwChkyCACA−3’(即ち、配列番号18)、および5’−mwChkyCAAG−3’(即ち、配列番号19)から選択されるものである、ヌクレオチド配列。 - 翻訳イニシエータ配列は5’−CACCGTCAAA−3’(即ち、配列番号22)または5’−CGCAGTCAAG−3’(即ち、配列番号23)である、請求項8に記載のヌクレオチド配列。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列を含んでなる核酸構築物。
- 請求項10に記載の核酸構築物の少なくとも1つのコピーを含んでなる糸状菌宿主細胞。
- 核酸構築物に存在するコード配列および/または制御配列は、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコード配列および/または制御配列の改変前は宿主細胞に対し生来である、請求項11に記載の糸状菌宿主細胞。
- 核酸構築物に存在するコード配列および/または制御配列は、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコード配列および/または制御配列の改変前は宿主細胞に対し異種である、請求項11に記載の糸状菌宿主細胞。
- 請求項10に記載の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる請求項11〜13のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞であって、
ここで、前記核酸構築物によってコードされる産物の発現は、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物によってコードされる同じ産物の産生と比較して増強され、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する、糸状菌宿主細胞。 - アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、フザリウム(Fusarium)、クリスポルム(Chrysporum)またはペニシリウム(Penicillium)種である、請求項11〜14のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞。
- アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、麹菌(Aspergillus oryzae)、アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)、アスペルギルス・テレウス(Aspergillus terreus)、またはトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)、またはクリソスポルム・ラクナウェンス(Chrysosporum lucknowense)、またはペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)である、請求項15に記載のアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、クリソスポルム(Chrysosporum)またはペニシリウム(Penicillium)宿主細胞。
- 請求項11〜16のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞を使用することによって、目的の化合物を産生させ、場合により、それを精製するための方法であって:
・目的の化合物の産生に適する栄養培地において、前記糸状菌宿主細胞を培養すること;および
・糸状菌宿主細胞の栄養培地から目的の化合物を回収すること、
を含んでなる、方法。 - 請求項10に記載の核酸構築物の所定のコピー数を含んでなる本発明の糸状菌宿主細胞によって産生される目的の化合物の収量は、対応する生来のヌクレオチド配列を含んでなる対応する核酸構築物を含んでなる対応する糸状菌宿主細胞によって産生される同じ目的の化合物の産生と比較して、少なくとも1%、5%、10%、25%、50%、100%、200%、300%、400%、より好ましくは少なくとも500%、増加し、前記対応する核酸構築物は、対応する糸状菌宿主細胞において同じコピー数で存在する、請求項17に記載の方法。
- 請求項15または16に記載の糸状菌細胞における目的の化合物の産生は、1リットルあたり0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、より好ましくは0.5g、最も好ましくは、1リットルあたり0.5gを超える目的の化合物の産生を生じる、請求項17に記載の方法。
- 目的の化合物を産生させるための方法における請求項1〜9のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列のいずれか1つの使用。
- 目的の化合物を産生させるための方法における請求項10に記載の核酸構築物の使用。
- 目的の化合物を産生させるための方法における請求項11〜16のいずれか一項に記載の糸状菌宿主細胞のいずれか1つの使用。
- ヌクレオチド配列を産生させるための方法であって、以下の工程:
・請求項1〜7に記載の最適化されたコドン頻度を伴う同義ヌクレオチドコード配列を提供すること、および場合により、
・前記同義ヌクレオチドコード配列を、請求項1に記載の制御配列に操作可能に連結すること、
を含んでなる、方法。 - 請求項8または9に記載のヌクレオチド配列を産生させるための方法。
- 請求項23または24に記載のヌクレオチド配列を産生させるための方法。
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