CN103459600B

CN103459600B - 用于生产感兴趣的化合物的方法

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Publication number: CN103459600B
Application number: CN201180032987.XA
Authority: CN
Inventors: 诺尔·尼可拉斯·玛利亚·伊丽莎白·佩奇·范; 马库斯·汉斯; 马帝那·贝舒森; 迪克·希珀; 德罗伯特斯·安东尼厄斯·马金德尔特·霍文·范; 罗伯特斯·安东尼厄斯·马金德尔特·霍文·范德; 奥利弗·莱昂纳德斯·舒恩
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2010-07-01
Filing date: 2011-07-01
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2031-07-01
Also published as: DK2588616T3; US8945898B2; WO2012001169A1; AU2011273351A1; US20130144034A1; EA201300074A1; CN103459600A; EP2588616A1; CA2803222A1; EP2588616B1

Abstract

本发明涉及通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其中使用的微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本发明还涉及微生物宿主细胞，所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。本发明还涉及感兴趣的化合物。

Description

用于生产感兴趣的化合物的方法

技术领域

本发明涉及通过微生物发酵生产感兴趣化合物的方法，其中使用的微生物宿主细胞的基因组已被修饰，使得所述宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合成酶的产生缺失。本发明还涉及其基因组已被修饰的微生物宿主细胞，使得所述微生物宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合成酶的产生缺失。本发明还涉及感兴趣的化合物。

发明背景

通过工业规模的微生物发酵产生了数目不断增加的化合物。这种感兴趣的化合物范围从初级和次级代谢产物(例如分别为柠檬酸和抗生素)至蛋白、酶以及甚至完整的微生物(例如以面包酵母或生物质的形式)。

在工业规模微生物发酵下，可能出现若干问题，最后导致感兴趣的化合物的产率减少和/或感兴趣的化合物的成本增加。所述问题可例如涉及发酵期间发酵液的粘度、发酵期间的氧传递或不想要的副产物比如草酸盐的形成。在使用某些宿主系统，比如真菌的微生物发酵中遇到的问题是产生有毒产物，比如真菌毒素。WO00/39322描述了提供缺失毒素产生的Aspergillus突变体及其在生产感兴趣的多肽的方法中的用途。其他问题尤其是微生物发酵中遇到的问题有妨碍下游处理期间的产物的过滤以及由于发酵期间由微生物细胞产生的不想要的不可溶的副产物而导致的发酵设备的涂覆(coating)。

为了减少发酵期间的问题，可优化针对具体产物的发酵和下游加工条件。但是，这种对每一产物的优化不允许对发酵和下游加工方案标准化。当典型地很多不同的产物在一个设施内生产时，发酵和下游加工方案的标准化导致设施实质上更有效的利用以及因而更有效的生产。

因而仍需要用于通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的改进的方法，所述方法允许标准化的发酵方案和改进的下游加工。

附图描述

图1描绘一般的克隆载体pGBDEL，其用于构建实施例中的缺失载体。pGBDEL包含amdS双向选择标记。

图2描绘通过基因替代介导的基因或基因片段缺失对微生物宿主细胞的基因组修饰的一般策略。使用的DNA构建体包含amdS选择标记，其侧翼将被缺失基因的同源区域(5’和3’)(1)。通过在对应的基因组基因座处的双同源重组(X)来整合构建体(2)并替代基因组的基因拷贝(基因替代)(3)。随后，在正向重复(U)上重组去除amdS标记，导致将被缺失的基因或基因片段的精确切除(4)。

图3描绘根据图2的缺失策略的改良。这是促使大序列缺失的改良的策略。基因打断的目标区域是基因的5’部分和将被打断的NRPS基因的内部片段。用于去除标记的重复序列含有与将被打断的基因的3’部分同源的序列(1)。这样构建的线性DNA片段在目标序列的同源基因座处通过双交换整合进基因组中，因而由amdS基因置换将被缺失的基因的5’部分(2)。转化后，通过(第二次)同源重组事件，为将被打断的基因的3’部分的产生的正向重复允许去除选择标记(3)，通过所述同源重组事件，缺失了将被去除的基因的额外片段(4)。

图4描绘质粒pGBDEL-NRPS，其用于缺失编码NRPS的npsE基因，布局代表其他缺失构建体的质粒。

图5描绘质粒pGBTOPPLA-1，其用于表达猪磷脂酶A₂。

图6描绘用过本发明的Aspergillus niger菌株产生的酶产物，在啤酒中的诱导喷涌的测试。

序列表描述

SEQ ID NO：1描绘了Aspergillus niger的npsA基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID NO：2的cDNA。

SEQ ID NO：2描绘了Aspergillus niger npsA的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：3描绘了Aspergillus niger npsA的mRNA序列。

SEQ ID NO：4描绘了Aspergillus niger npsA的蛋白序列。

SEQ ID NO：5描绘了肽VVFF的序列。

SEQ ID NO：6描绘了肽VVFY的序列。

SEQ ID NO：7描绘了Aspergillus niger的npsB基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID NO：8的cDNA。

SEQ ID NO：8描绘了Aspergillus niger npsB的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：9描绘了Aspergillus niger npsB的mRNA序列。

SEQ ID NO：10描绘了Aspergillus niger npsB的蛋白序列。

SEQ ID NO：11描绘了Aspergillus niger的npsC基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。该基因组序列包含根据SEQ ID NO：12的cDNA。

SEQ ID NO：12描绘了Aspergillus niger npsC的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：13描绘了Aspergillus niger npsC的mRNA序列。

SEQ ID NO：14描绘了Aspergillus niger npsC的蛋白序列。

SEQ ID NO：15描绘了Aspergillus niger的npsD基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID NO：16的cDNA。

SEQ ID NO：16描绘了Aspergillus niger npsD的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：17描绘了Aspergillus niger npsD的mRNA序列。

SEQ ID NO：18描绘了Aspergillus niger npsD的蛋白序列。

SEQ ID NO：19描绘了Aspergillus niger的npsE基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。基因组序列包含根据SEQ ID NO：20的cDNA。

SEQ ID NO：20描绘了Aspergillus niger npsE的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：21描绘了Aspergillus niger npsE的mRNA序列。

SEQ ID NO：22描绘了Aspergillus niger npsE的蛋白序列。

SEQ ID NO：23描绘了肽VVWY的序列。

SEQ ID NO：24描绘了肽VLYW的序列。

SEQ ID NO：25描绘了肽VLFY的序列。

SEQ ID NO：26描绘了肽LLFY的序列。

SEQ ID NO：27描绘了肽VVFW的序列。

SEQ ID NO：28描绘了肽VLFF的序列。

SEQ ID NO：29描绘了密码子优化的Penicillium chrysogenum葡萄糖氧化酶基因的序列。

SEQ ID NO：30描绘了Penicillium chrysogenum葡萄糖氧化酶的蛋白序列。

SEQ ID NO：31描绘了Penicillium chrysogenum的Pc 16g04690基因的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。该基因组序列包含根据SEQ ID NO：32的cDNA。

SEQ ID NO：32描绘了Penicillium chrysogenum Pc16g04690的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：33描绘了Penicillium chrysogenum Pc16g04690的mRNA序列。

SEQ ID NO：34描绘了Penicillium chrysogenum Pc16g04690的蛋白序列。

SEQ ID NO：35描绘了Aspergillus niger的npsE基因的更新的基因组序列，其包括2kb侧翼区域。该基因组序列包含根据SEQ ID NO：20的cDNA。

SEQ ID NO：36描绘了Aspergillus niger npsE的更新的cDNA(编码序列)。

SEQ ID NO：37描绘了Aspergillus niger npsE的更新的mRNA序列。

SEQ ID NO：38描绘了Aspergillus niger npsE的更新的蛋白序列。

SEQ ID NO：39-48描绘了PCR引物。

发明详述

现已令人吃惊地发现，当使用的微生物宿主细胞的基因组已被修饰，使得该微生物宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失时，在通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法中获得了显著优势。

非核糖体肽合酶参与肽合成，其中所述合成包括氨基酸直接连接来形成肽，而不使用RNA模板。尤其在Fischbach and Walsh，Chem.Rev.2006，3468-3496：Assembly-lineenzymology for polyketide and nonribosomal peptideantibiotics：logic，machineryand mechanics中综述了非核糖体肽合酶(还称为合成酶)，在Stack et al.，Microbiology(2007)153，1297-1306中综述了Aspergillus fumigatus中的非核糖体肽合酶。Cramer etal.，Eukaryotic Cell，June 2006，972-980公开了编码对A.fumigatus中胶霉毒素产生负责的非核糖体肽合酶的gliP基因的打断。

在本发明上下文中，术语“合酶”和“合成酶”可互换使用并具有相同的含义。

因此，本发明提供了通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其包括：

a.提供微生物宿主细胞，

b.在有助于感兴趣的化合物表达的条件下培养所述微生物宿主细胞，

c.从培养基中分离感兴趣的化合物，

其中所述微生物宿主细胞的基因组已被修饰，使得所述微生物宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。所述方法在本文中称作根据本发明的方法。所述微生物宿主细胞在本文中被称作根据本发明的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞的基因组已被修饰使得所述微生物宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。

根据本发明的方法的优势的一个例子是改进的感兴趣的化合物的下游加工，因为例如在发酵期间可通过微生物宿主细胞产生更少的不可溶副产物，并且因而由于更少的过滤器堵塞而可导致改进发酵液的过滤性能。另一例子是通过所述不可溶的副产物对装置的涂覆可被减少或可不会发生。而且，含有感兴趣的化合物的经滤过的发酵液可较不混浊。

根据本发明的方法的其他优势可以是包含根据本发明的微生物宿主细胞的发酵液的粘度降低，其可有助于发酵罐中宿主细胞培养物的搅拌。另外，例如，根据本发明的微生物宿主细胞的使用可导致发酵中改进的氧传递。而且，可改进使用根据本发明的方法产生的感兴趣的化合物的产率和/或纯度。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可对所述肽产物的氨基酸的化学结构修饰。优选地，使用LC/MS分析进行肽产物的分析。

更优选地，在根据本发明的方法中，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽产生减少，如优选地使用如实验部分所述的和说明书后面简要讨论的用于环状四肽测量的LC/MS分析所测量的。任选地，可通过其他技术，比如通过NMR和/或HPLC测量所述四肽或环状四肽。优选地，四肽从环状VVFF(SEQ ID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQID NO：25)、环状LLFY(SEQ IDNO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

本文中使用的发酵表示使用本领域中已知的方法，在适于生产感兴趣的化合物的营养培养基中培养微生物细胞。例如，可通过在合适的培养基中、允许感兴趣的化合物被产生和/或分离的条件下进行摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模的发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。培养发生于包含碳源和氮源以及无机盐的合适营养培养基中，使用本领域已知的方法来进行(见，例如Bennett，J.W.andLaSure，L.，eds.，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991)。合适的培养基可从商业供货商处获得，或者使用已公开的组成(例如，American Type CultureCollection目录中的)来制备。如果感兴趣的化合物分泌进营养培养基中，可直接从培养基中分离化合物。如果感兴趣的化合物不分泌，可从细胞裂解物中对其进行分离。

可通过本领域已知的方法来分离感兴趣的化合物。例如，可通过传统方法，包括但不限于，离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养培养基分离感兴趣的化合物。然后可通过本领域已知的各种方法对经分离的感兴趣的化合物进一步纯化，所述方法包括但不限于，色谱(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和尺寸排除)、电泳程序(例如制备等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)或萃取(见，例如ProteinPurification，J.-C.Jansonand Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。在一些应用中，可使用基本上没有从培养发酵液中分离的感兴趣的化合物；将培养基与生物质分离可能是足够的。

微生物宿主细胞在至少一种非核糖体肽合酶的产生中缺失在本文中定义为表型特征，其中所述细胞由于其基因组的修饰，当在基本上相同的条件下分析时，较之根据本发明的其基因组未被修饰的亲本微生物宿主细胞：a)产生更少的非核糖体肽合酶和/或b)具有减少的从编码非核糖体肽合酶的基因转录的mRNA的表达水平和/或c)产生具有减小的蛋白活性或减小的特异性蛋白活性的非核糖体肽合酶和/或d)产生更少的由非核糖体肽合酶产生的产物，以及这些可能的事件的一种或多种组合。

在上下文中，基因定义为含有开放阅读框(ORF)和其转录控制元件(启动子和终止子)的多核苷酸，所述ORF是基因上的将被转录并且翻译为蛋白序列的区域。

因而，若与基因组未被修饰的亲本宿主细胞相比较，微生物宿主细胞的缺失可通过测定由基因组被修饰的微生物宿主细胞产生的非核糖体肽合酶的量和/或(特异性)活性来测量和/或其可通过测定从编码非核糖体肽合酶的基因转录的mRNA的量来测量和/或其可通过测定如上文定义的基因组被修饰的微生物宿主细胞中的非核糖体肽合酶产生的产物的量来测量和/或其可通过基因或基因组测序来测量。可使用对技术人员而言可得到的任何检验，比如转录表达谱、Northern印迹RT-PCR、Q-PCR和Western印迹来测量非核糖体肽合酶的产生缺失。

优选地，使用如本文前面定义的对肽产物的LC/MS分析，来测量非核糖体肽合酶的产生。更优选地，使用针对如在实验部分所述的和本文后面简要讨论的针对环状四肽测量的LC/MS分析，来测量非核糖体肽合酶的产生缺失量。该检验测量非核糖体肽合酶涉及的产物。

简而言之，根据在实验部分中进一步描述的针对环状四肽的LC/MS分析，在连有Accela泵的正电离模式中的LTQ-Orbitrap质谱仪上进行LC/MS分析，其中含有环状四肽的样品在TFA中溶解，掺混内标物Val-Val-D-Phe-Tyr。在水∶乙腈∶甲酸为50∶50∶0.1中稀释，使用InertsilODS-33μ 2.1*150mm柱(注入体积25μl，流速200μl/min，柱温度40℃)分离环肽，其使用洗脱液A：在(Milli Q)水中0.1％甲酸，洗脱液B：在乙腈中0.1％甲酸，使用50％洗脱液B的梯度两分钟，在10分钟内逐渐增加至80％洗脱液B，保持80％洗脱液B 2分钟，通过用于准确的质量测定的Orbitrap中的仝扫描分析和LTQ中的MS/MS分析，获得关于各个环肽的信息。环状VVFF(cVVFF-SEQ ID NO：5)(m/z 493)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为465、394、346和247的产物离子。cVVFY(SEQ IDNO：6)(m/z 509)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为481、410、346和247的产物离子。cVVWY(SEQ ID NO：23)(m/z 548)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为520、449、385和286的产物离子。cVLYW(SEQ ID NO：24)(m/z 562)特征在于在MS/MS模式中通过具有m/z值为534、449、399和350的产物离子。cVLFY(SEQ ID NO：25)(m/z 523)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为495、424、410、360和311的产物离子。cLLFY(SEQ ID NO：26)(m/z 537)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为509、424、374和311的产物离子。cVVFW(SEQ ID NO：27)(m/z 532)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为504、433、385和334的产物离子。cVLFF(SEQ ID NO：28)(m/z 507)特征在于在MS/MS模式中具有m/z值为479、408、394、360和295的产物离子。

微生物宿主细胞的基因组修饰在本文中被定义为导致细胞的基因组的多核苷酸序列改变的任何事件。修饰解释为一个或多个修饰。可通过典型的菌株改进，随机诱变随后选择，引入修饰。可通过引入(插入)、置换或去除(缺失)核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，来完成修饰。该修饰可例如在对多核苷酸的转录或翻译而言必需的编码序列或调节元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以引入终止密码子、去除起始密码子或使编码序列的开放阅读框改变或移码。编码序列或其调节元件的修饰可通过定点或随机诱变、DNA改组方法、DNA再组装方法、基因合成(见例如Young andDong，(2004)，Nucleic Acids Research32，(7)electronic accesshttp://nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59 orGupta et al.(1968)，Proc.Natl.Acad.Sci USA，60：1338-1344；Scarpulla et al.(1982)，Anal.Biochem.121：356-365；Stemmer et al.(1995)，Gene 164：49-53)或根据本领域中已知的方法PCR产生的诱变完成。随机诱变程序的例子是本领域中熟知的，例如化学(例如NTG)诱变或物理(例如UV)诱变。定向诱变程序的例子是QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)、‘The AlteredII体外诱变系统’(Promega Corporation)或在Gene.1989 Apr 15；77(1)：51-9.(Ho SN，Hunt HD，HortonRM，Pullen JK，Pease LR“Site-directed mutagenesis by overlap extension usingthe polymerase chainreaction”)中描述的使用PCR或使用如在Molecular Biology：CurrentInnovations and Future Trends.(Eds.A.M.Griffin and H.G.Griffin.ISBN 1-898486-01-8；1995 Horizon Scientific Press，PO Box 1，Wymondham，Norfolk，U.K.)中描述的使用PCR通过重叠延伸来进行。

可通过将修饰的细胞的DNA序列与未修饰的细胞的序列比较，确定基因组中的修饰。可使用对本领域技术人员而言已知的标准方法，例如使用Sanger测序技术和/或下一代测序技术比如如在Elaine R.Mardis(2008)，Next-GenerationDNASequencing Methods，Annual Review of Genomics andHuman Genetics，9：387-402.(doi：10.1146/annurev.genom.9.081307.164359)中评述的Illumina GA2，Roche 454等等，进行DNA测序和基因组测序。

修饰的优选的方法是以基因替代、基因缺失或基因打断技术为基础。

例如，在多核苷酸替代、核酸构建体或表达盒的情况下，可在将被替代的靶基因座处引入适当的DNA序列。合适的DNA序列优选地在克隆载体上存在。优选的整合型克隆载体包含下述DNA片段，所述DNA片段与多核苷酸同源和/或与用于靶向克隆载体与该预测定的基因座整合的将被替代的基因座侧翼的多核苷酸具有同源性。为了促进定位整合，优选地在转化细胞之前对克隆载体线性化。优选地，线性化进行至如下程度：使得克隆载体的至少一端，但优选地，任意一端侧翼有与将被替代的DNA序列(或侧翼序列)同源的序列。该方法被称为同源重组并且还可使用该技术以实现(部分)基因缺失或基因打断。

例如，对于基因打断，可通过缺陷型多核苷酸替代对应于内源多核苷酸的多核苷酸，所述缺陷型多核苷酸是未能产生(仝功能)蛋白的多核苷酸。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替代内源多核苷酸。下述是期望的，缺陷型多核苷酸还编码标记，所述标记可用于选择其中核酸序列已被修饰的转化体。

可选地，或与其它提到的技术一起，可使用基于在E.coli中的粘粒的体内重组的技术，如A rapid method for efficient gene replacement in thefilamentous fungusA.nidulans(2000)Chaveroche，M-K.，Ghico，J-M.andd′Enfert C；Nucleic acidsResearch，vol 28，no 22中所述的。

或者，可通过使用与多核苷酸的核酸序列互补的核苷酸序列进行已建立起来的反义技术，来进行修饰，所述修饰为所述宿主细胞产生了更少的由多核苷酸编码的蛋白(比如非核糖体肽合酶)或所述宿主细胞缺失由多核苷酸编码的蛋白(比如非核糖体肽合酶)的产生。更具体地，可通过引入与多核苷酸互补的核苷酸序列(其可在细胞中转录，并且能与细胞中产生的mRNA杂交)来降低或去除宿主细胞对多核苷酸的表达。在允许互补反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译出的蛋白的量由此减少或消失。表达反义RNA的例子展示于Appl.Environ.Microbiol.2000 Feb；66(2)：775-82.(Characterization of a foldase，protein disulfide isomerase A，inthe protein secretory pathway of Aspergillusniger.Ngiam C，Jeenes DJ，PuntPJ，Van Den Hondel CA，Archer DB)or(Zrenner R，Willmitzer L，Sonnewald U.Analysis of the expression of potatouridinediphosphate-glucosepyrophosphorylase and its inhibition by antisenseRNA.Planta.(1993)；190(2)：247-52.)中。

此外，可通过RNA干扰(RNAi)技术(FEMS Microb.Lett.237(2004)：317-324)来获得对多核苷酸的修饰、下调或失活。在该方法中，核苷酸序列(其表达将受到影响的)的同样的正义或反义部分被依次克隆，中间是核苷酸间隔，并且插入到表达载体中。此种分子转录后，小的核苷酸片段的形成将导致将受到影响的mRNA的定位降解。对特定mRNA的去除可进行至多种不同的程度。WO2008/053019、WO2005/05672A1、WO2005/026356A1、Oliveira etal.，“Efficient cloningsystem for construction of gene silencing vectors inAspergillus niger”(2008)Appl.Microbiol.and Biotechnol.80(5)：917-924和/或Barnes et al.，“siRNA asa molecular tool for use in Aspergillus niger”(2008)Biotechnology Letters 30(5)：885-890描述的RNA干扰技术可用于对多核苷酸的下调、修饰或失活。

优选的修饰方法是在本文实验部分中描述的方法。

在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞可以是任何宿主细胞。就在微生物宿主细胞中产生的化合物的具体用途而言，可根据此类用途对宿主细胞进行选择。例如当在根据本发明的宿主细胞中产生的化合物用在食品应用中时，宿主细胞可从食品级生物比如Saccharomyces cerevisiae中选择。具体用途包括但不限于，食品、(动物)例料、药物、农业比如作物保护，和/或个人护理用品。

在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞可以是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物。合适的细菌可从例如Escherichia、Anabaena、Caulobactert、Gluconobacter、Rhodobacter、Pseudomonas、Paracoccus、Bacillus、Brevibacterium、Corynebacterium、Rhizobium(Sinorhizobium)、Flavobacterium、Klebsiella、Enterobacter、Lactobacillus、Lactococcus、Methylobacterium、Staphylococcus或Streptomyces中选择。优选地，细菌细胞从由B.subtilis、B.amyloliquefaciens、B.licheniformis、B.puntis、B.megaterium、B.halodurans、B.pumilus、G.oxydans、Caulobactert crescentusCB 15、Methylobacterium extorquens、Rhodobacter sphaeroides、Pseudomonaszeaxanthinifaciens、Paracoccus denitrificans、E.coli、C.glutamicum、Staphylococcus carnosus、Streptomyces lividans、Sinorhizobiummelioti andRhizobium radiobacter组成的组中选择。

根据一种实施方式，根据本发明的宿主细胞是真核宿主细胞。优选地，真核细胞是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf21细胞及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，即酵母细胞，比如Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株。更优选地来自Kluyveromyces lactis、S.cerevisiae、Hansenulapolymorpha、Yarrowia lipolytica和Pichia pastoris或丝状真菌细胞。最优选地，真核细胞是丝状真菌细胞。

丝状真菌包括亚门Eumycota和Oomycota的所有丝状形式(如Hawksworth et al.，In，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，8thedition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK所定义的)。丝状真菌的特征是由甲壳质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝体壁。植物性生长通过菌丝延长进行，碳分解代谢是专性需氧的。丝状真菌菌株包括但不限于，Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus、Schizophyllum、Talaromyces、Thermoascus、Thielavia、Tolypocladium和Trichoderma的菌株。

优选的丝状真菌细胞属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Thielavia、Fusarium种或Trichoderma属和最优选地Aspergillus niger、Acremonium alabamense、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromycesemersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporiumlucknowense、Fusarium oxysporum、Myceliophthora thermophila、Trichoderma reesei、Thielavia terrestris或Penicillium chrysogenum种。更优选的宿主细胞属于Aspergillus属，更优选地宿主细胞属于Aspergillus niger种。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS 513.88、CBS124.903或其衍生物。

丝状真菌的若干菌株在许多培养物收集中心，比如American TypeCultureCollection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS)、Agricultural Research ServicePatent Culture Collection、Northern RegionalResearch Center(NRRL)和俄罗斯莫斯科，俄罗斯科学院的所有俄罗斯微生物收集处(俄语中缩写为VKM，英语中缩写为RCM)(All-RussianCollection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences，Moscow，Russia)可被公众容易地获得。在本发明上下文中有用的菌株可以是Aspergillus nigerCBS 513.88、CBS 124.903，Aspergillus oryzae ATCC20423、IFO 4177、ATCC 1011、CBS205.89、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892，P.chrysogenum CBS455.95，P.chrysogenum Wisconsin54-1255(ATCC28089)，Penicillium citrinumATCC38065、Penicillium chrysogenum P2，Thielavia terrestris NRRL8126，Talaromyces emersonii CBS 124.902，Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC26921，Aspergillus sojaeATCC 11906，Myceliophthora thermophila C1、Garg 27K、VKM-F 3500D、Chrysosporiumlucknowense C1、Garg 27K、VKM-F 3500D、ATCC44006及其衍生物。

优选地，其基因组已经被修饰使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失的根据本发明的微生物宿主细胞物未被修饰来打断编码负责胶霉毒素产生的非核糖体肽合酶的gliP基因。优选地，其基因组已经被修饰使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失的根据本发明的微生物宿主细胞不是已被修饰来打断编码负责胶霉毒素产生的非核糖体肽合酶的gliP基因的Asperigllus fumigatus宿主细胞。

优选地，当在根据本发明的方法中使用的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，其基因组已经被修饰使得其导致至少一种非核糖体肽合酶、优选地根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、如在SEQID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA以及在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的产生缺失的宿主细胞额外地在基因组中包含编码从下述组中选择的产物的多核苷酸一个或多个修饰：葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素和蛋白酶转录调节物prtT，所述修饰使得宿主细胞缺失由包含该修饰的多核苷酸编码的至少一种产物。

因而真菌宿主细胞额外地包含基因组的修饰，其使得所述细胞缺失葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(比如赭曲霉素和烟曲霉素)，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素，更优选地赭曲霉素A和/或烟曲霉素B2和蛋白酶转录调节物prtT的至少一种。优选地，宿主细胞额外地在基因组中包含编码主要胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的多核苷酸的一种或多种修饰，所述修饰使得所述宿主细胞缺失主要天冬氨酸蛋白酶PepA。例如根据本发明的宿主细胞还可包含编码主要胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的打断。优选地根据本发明的宿主细胞额外地在基因组中包含hdfA编码基因的多核苷酸一个或多个修饰，使得宿主细胞缺失hdfA。例如，根据本发明的宿主细胞还可包含对hdfA基因的打断。

优选地宿主细胞额外地包含适于整合编码感兴趣的化合物的多核苷酸的一个或多个拷贝的至少两个基本上同源的DNA结构域，其中改造至少两种基本上同源的DNA结构域的至少之一，以较之其所来源的基本上同源的DNA结构域，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好，并且其中改造的基本上同源DNA结构域所来源的基本上同源DNA结构域的基因转变率比至少两个基本上同源DNA结构域的基本上同源DNA结构域的另一个的高至少10％。这些细胞已在WO2011/009700中描述。含有这些基本上同源DNA结构域的两个或多个拷贝的菌株在下文还被称为含有两个或多个扩增子的菌株。包含此种扩增子的宿主细胞的例子有，例如在vanDijck et al，2003，Regulatory Toxicology and Pharmacology28；27-35：On thesafety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzymeproduction strains中描述的。在van Dijck et al中，描述了包含7个扩增的葡糖淀粉酶基因座，即7个扩增子的Aspergillus niger菌株。在上下文中，可含有两个或多个扩增子的优选的宿主细胞属于Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Thielavia、Fusarium或Trichoderma属的种，更优选地属于Aspergillus niger、Acremoniumalabamense、Aspergillus awamori、Aspergillusfoetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lueknowense、Fusarium oxysporum、Myceliophthorathermophila、Trichoderma reesei、Thielavia terrestris或Penicilliumchrysogenum种。在上下文中优选的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，优选地A.niger宿主细胞，其包含两个或多个扩增子，优选地两个或多个ΔglaA扩增子(优选地包含3、4、5、6、7个ΔglaA扩增子)，其中具有最高基因转变频率的扩增子已被改造以较之其来源的扩增子对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。可根据在WO2011/009700(其全部通过引用并入本文)中描述的方法之任一方法，进行扩增子的改造。在WO2011/009700中描述的这些宿主细胞的例子是包含三个ΔglaA扩增子——BamHI截短的扩增子、SalI截短的扩增子和BglII截短的扩增子的宿主细胞并且其中BamHI扩增子已被改造以较之其来源的BamHI扩增子对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。包含两个或多个扩增子，其中一个扩增子已被改造，以较之其来源的扩增子对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好的宿主细胞在下文还被称为包含经改造的扩增子的宿主细胞。

优选地，根据本发明的宿主细胞额外地包含Sec61修饰。优选的SEC61修饰是导致SEC61的单向突变体的修饰；即其中重新合成的蛋白可通过SEC61进入ER，但是蛋白不能通过SEC61离开ER的突变体。此种修饰在WO2005/123763中广泛描述。最优选地，SEC 61修饰是其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变。

在根据本发明的方法中使用的，缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA以及在SEQID NO：38中描绘的nrps蛋白)的优选的丝状真菌宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)和草酸水解酶(oahA)。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失如上文定义的非核糖体肽合酶的另一优选的宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)和hdfA。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失如上文定义的非核糖体肽合酶的另一优选的宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(比如赭曲霉素和/或烟曲霉素)和hdfA。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失如上文定义的非核糖体肽合酶的另一优选的宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(比如赭曲霉素和/或烟曲霉素)和hdfA。优选地，这些宿主细胞还缺失prtT。因而，本文上文定义的缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失非核糖体肽合酶的另一优选的宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素(比如赭曲霉素和/或烟曲霉素)、prtT和hdfA。

缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的宿主细胞额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、烟曲霉素、prtT、hdfA并且包含其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变的SEC61修饰。

优选地这些宿主细胞是包含如上文定义的经改造的扩增子的丝状真菌细胞，更优选地A niger宿主细胞。因而，缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的在根据本发明的方法中使用的宿主细胞是额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)和草酸水解酶(oahA)并且包含如上文定义的经改造的扩增子的丝状真菌宿主细胞，优选地A.niger宿主细胞。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ IDNO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的丝状真菌宿主细胞比如A.niger宿主细胞，额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)和hdfA并且包含如上文定义的经改造的扩增子。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ IDNO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的丝状真菌宿主细胞比如A.niger宿主细胞，额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或多种毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素，以及hdfA并且包含如上文定义的经改造的扩增子。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的丝状真菌宿主细胞比如A.niger宿主细胞，额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或多种毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素，以及hdfA并且包含如上文定义的经改造的扩增子。缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的丝状真菌宿主细胞比如A.niger宿主细胞，额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或多种毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素prtT，以及hdfA并且包含如上文定义的经改造的扩增子。

缺失非核糖体肽合酶、优选地缺失根据本发明的非核糖体肽合酶、更优选地缺失非核糖体肽合酶npsE(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的另一优选的丝状真菌宿主细胞比如A.niger宿主细胞，额外地缺失pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或多种毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素，prtT、hdfA；包含其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变的SEC 61修饰并且包含如上文定义的经改造的扩增子。

在根据本发明的方法中感兴趣的化合物可以是任何生物学化合物。生物学化合物可以是生物质或任何生物聚合物或代谢产物。生物学化合物可以是任何生物聚合物或代谢产物。生物学化合物可由包含生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码，或可以是单个多核苷酸的直接产物或一系列多核苷酸的产物。生物学化合物对宿主细胞可以是天然的或异源的。

术语“异源生物学化合物”在本文定义为对宿主细胞而言不是天然生物学化合物；或其中已经进行了结构修饰以改变天然生物学化合物的天然生物学化合物。

术语“生物聚合物”在本文定义为相同、相似或不相似亚单元(单体)的链(或多聚体)。生物聚合物可以是任何生物聚合物。生物聚合物可以是例如，但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。

生物聚合物可以是多肽。多肽可以是具有感兴趣生物学活性的任何多肽。术语“多肽”在本文并非意指特定长度的被编码的产物，并因此包含肽、寡肽和蛋白。多肽还包括上述多肽和杂交多肽的天然存在的等位和设计的变异。多肽对给定的宿主细胞可以是天然的或异源的。术语“异源多肽”在本文定义为对给定宿主细胞并非天然的多肽。多肽可以是胶原或明胶，或其变体或杂种。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝固因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、受体或转运蛋白、分泌过程涉及的蛋白、折叠过程涉及的蛋白、伴侣分子、肽氨基酰转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白。细胞内蛋白可以是酶，比如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨基肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨基肽酶、脂酶。多肽可以是细胞外分泌的酶。这类酶可以属于氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、葡聚糖酶、酯酶。酶可以是糖酶，例如纤维素酶如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶或胶质水解酶如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶、果胶酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂合酶或淀粉酶；水解酶、异构酶或连接酶，磷酸酶如植酸酶，酯酶如脂酶，蛋白水解酶，氧化还原酶如氧化酶、转移酶或异构酶。酶可以是植酸酶。酶可以是氨基肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶过氧化氢酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、加卤酶、蛋白脱氨酶、转化酶、漆酶、脂酶、甘露糖苷酶、变构水解酶(mutanase)、氧化酶、胶质水解酶、过氧化物酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。

根据本发明，多肽或酶还可以是如WO2010/102982所述的产物。根据本发明，多肽还可以是在多肽或其片段的N-末端或C-末端处与另一多肽融合的融合多肽或杂种多肽。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一多肽的核酸序列融合来产生融合多肽。

用于产生融合多肽的技术为本领域已知，其包括：连接编码多肽的编码序列，使得其符合读码框并且使得融合多肽的表达位于相同的启动子和终止子调控下。杂种多肽可包含得自至少两个不同多肽的多肽序列的部分或全部的组合，其中一个或多个可以与宿主细胞异源。融合多肽和信号序列融合例子有例如在WO2010/121933中所述

生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何多糖，包括但不仅限于粘多糖(例如肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如壳多糖)。在更优选的选择中，多糖为透明质酸。

根据本发明的感兴趣的多核苷酸可编码参与初级或次级代谢产物，比如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗生素和维生素合成的酶。此类代谢产物可认作是根据本发明的生物学化合物。

术语“代谢产物”包括初级和次级代谢产物二者；所述代谢产物可以是任何代谢产物。优选的代谢产物为柠檬酸、葡糖酸、延胡索酸、衣康酸和琥珀酸。

代谢产物可由比如在生物合成或代谢途径中的一个或多个基因编码。初级代谢产物是细胞的初级或一般代谢的产物，其涉及能量代谢、生长和结构。次级代谢产物是次级代谢的产物(见例如R.B.Herbert，TheBiosynthesis of Secondary Metabolites，Chapmanand Hall，New York，1981)。

初级代谢产物可以是，但不仅限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或维生素。

次级代谢产物可以是，但不仅限于生物碱、香豆素、黄酮类、聚酮化合物、奎宁、类固醇、肽或萜。次级代谢产物可以是抗生素、抗饲育剂、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀鼠剂。优选的抗生素为头孢菌素和内酰胺。其他优选的代谢产物是外代谢产物(exo-metabolite)。外代谢产物的例子是Aurasperone B、Funalenone、克他命(Kotanin)、Nigragillin、Orlandin、其他的萘并-γ-避难酮、Pyranonigrin A、TensidolB、烟曲霉素B2和赭曲霉素A。

生物学化合物还可以是可选择标记的产物。可选择标记是感兴趣的多核苷酸的产物，所述产物提供针对抗微生物剂或病毒的抗性、对重金属抗性、对营养缺陷的原营养等的产物。可选择标记包括，但不仅限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清苷-51-磷酸盐脱羧酶)、sC(硫酸腺嘌呤基转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、ble(腐草霉素抗性蛋白)、hyg(潮霉素)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)及其等效物。

根据本发明，在根据本发明的方法中感兴趣的化合物优选地是如本文所述的多肽。

优选地，在根据本发明的方法中的多肽是如本文所述的酶。

根据本发明，在根据本发明的方法中的感兴趣的化合物优选地是代谢产物。

当感兴趣的化合物是如本文前面所定义的生物聚合物时，微生物细胞已能产生该生物聚合物。还可提供有编码参与生产感兴趣的化合物的多肽的同源或异源表达构建体的微生物细胞。本领域技术人员知道怎样修饰微生物宿主细胞，使得所述细胞能产生参与生产感兴趣的化合物的多肽。

“核酸构建体”在本文中被定义为单链或双链的核酸分子，其是从天然存在的基因分离出的，或已经过修饰以含有以自然界中不存在的方式组合及并置的核酸片断。当核酸构建体含有编码序列表达所需的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。当核酸构建体含有编码序列表达所需的全部调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义，其中所述控制序列可操作地与所述编码序列连接。

术语“可操作地相连”在本文中被定义为下述构象，其中，控制序列以相对于DNA序列的编码序列的下述位置被合适地放置，所述位置使得控制序列能指导多肽的生产。

术语“控制序列”在本文中被定义为体外或在宿主细胞中的包括对于mRNA和/或多肽表达来说必须的或有利的所有组分。每种控制序列对编码多肽的核酸序列而言可以天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于，引导序列、Shine-Delgarno序列、最优翻译起始序列(如Kozak，1991，J.Biol.Chem.266：19867-19870所述)、聚腺苷化序列、前肽(pro-peptide)序列、前原肽(pre-pro-peptide)序列、启动子、信号序列和转录终止子。就最小程度而言，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可针对其具体目的而被优化，在本发明中使用的优选的优化控制序列是在WO2006/077258中描述的那些，WO2006/077258通过引用被并入本文。

就引入特异性限制性位点以协助控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区域连接的目的而言，控制序列可与连接子(linker)一起提供。

控制序列可以是合适的启动子序列(启动子)。

控制序列还可以是合适的转录终止子序列(终止子)，这是能被丝状真菌细胞识别用来终止转录的序列。终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地相连。在细胞中具有功能的任何终止子可用于本发明。

优选用于丝状真菌细胞的终止子序列可从编码A.oryzae TAKA-淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶(glucoamylase，glaA)、A.nidulans邻氨基苯甲酸盐/酯合酶、A.niger α-葡糖苷酶、trpC基因和Fusarium oxysporum胰蛋白酶类似蛋白酶的基因获得。

控制序列还可以是合适的引导序列(leaders)，这是mRNA的非翻译区域，其对于通过丝状真菌细胞的翻译来说是重要的。引导序列与编码多肽的核酸序列的5’末端可操作地相连。在细胞中具有功能的任何引导序列都可用于本发明。

优选用于丝状真菌细胞的引导序列可从编码A.oryzae TAKA-淀粉酶和A.nidulans丙糖磷酸酯异构酶以及A.niger glaA和植酸酶的多核苷酸获得。

其它控制序列可从青霉菌IPNS基因或pcbC基因、beta微管蛋白基因获得。WO 01/021779中提到的所有控制序列通过引用并入本文。

控制序列还可以是聚腺苷化序列，这是与核酸序列3’末端可操作地相连，并且当被转录时能被丝状真菌细胞作为信号识别以向经转录mRNA加上聚腺苷残基的序列。在细胞中具有功能的任何聚腺苷化序列都可用于本发明。

优选用于丝状真菌细胞的聚腺苷化序列从编码A.oryzae TAKA-淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans邻氨基苯甲酸盐/酯合酶、Fusariumoxysporum胰蛋白酶类似蛋白酶和A.nigerα-葡糖苷酶的基因获得。

术语“启动子”在本文中定义为下述DNA序列，所述DNA序列与RNA聚合酶结合，并指导所述聚合酶至编码生物学化合物的核酸序列的下游正确的转录起始位点以起始转录。RNA聚合酶能有效催化与编码区适当DNA链互补的信使RNA的装配。术语“启动子”还应被理解为包括用于转录为mRNA后翻译的5’非编码区(在启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录调控元件(如增强子)和能够与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。

启动子可以是适用于真核或原核宿主细胞的任何合适的启动子序列，其显示转录活性，包括突变、截短和杂种的启动子，并且可得自编码对细胞而言同源(天然)或异源(外源)的细胞外或细胞内多肽的多核苷酸。启动子可以是组成型或诱导型启动子。

可以使用的诱导型启动子的例子是淀粉诱导型启动子、纤维素诱导型启动子、半纤维素诱导型(比如木聚糖和/或木糖诱导型)启动子、铜诱导型启动子、油酸诱导型启动子。启动子可选自下组，所述组包括但不限于下述启动子，所述启动子得自编码以下的多核苷酸：A.oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定性α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、T.reesei纤维二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂酶、A.oryzae碱性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、Fusarium venenatum Dania(WO 00/56900)、Fusarium venenatumQuinn(WO 00/56900)、Fusarium oxysporum胰蛋白酶类似蛋白酶(WO96/00787)、Trichoderma reesei β-葡糖苷酶、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶II、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶III、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶IV、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶V、Trichodermareesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II、Trichoderma reesei β-木糖苷酶以及NA2-tpi启动子(来自编码A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂种)，及其突变、截短和杂种的启动子。其他启动子的例子是WO2006/092396和WO2005/100573中描述的启动子，所述参考文献通过引用并入本文。启动子的用途的甚至其他的例子在WO2008/098933中描述。

为了促进表达，编码涉及生产感兴趣的化合物的多肽的多核苷酸可以是合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可以经过密码子使用方面的优化，优选地，根据WO2006/077258和/或PCT/EP2007/055943(作为WO2008/000632公开)(其通过引用并入本文)所述的方法来进行。PCT/EP2007/055943提出了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法：其中，在其密码子使用方面(特别是所用的密码子对)对编码多肽的核苷酸序列进行了修饰，以使编码多肽的核苷酸序列表达有所改进和/或对编码的多肽的生产有所改进。密码子对被定义为编码序列中两个随后的(subsequent)三体(密码子)的组。

为了促进表达和/或翻译，编码多肽产物的基因可包含在表达载体中，使得编码感兴趣的多肽产物的基因与用于在体外或丝状真菌宿主细胞中表达和/或翻译的适当控制序列可操作地连接。

表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，可对其便利地进行重组DNA程序，并且可导致编码感兴趣的多肽的核酸序列的表达。载体的选择典型地应取决于载体与引入所述载体的细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。自主维持的克隆载体可包含AMA1-序列(见例如Aleksenko andClutterbuck(1997)，Fungal Genet.Biol.21：373-397)。

或者，载体可以是在引入宿主细胞后被整合进基因组中并与整合了所述载体的染色体一起复制的载体。整合型克隆载体可在宿主细胞染色体中随机整合，或在预定的靶基因座处整合。在本发明的一个优选的实施方式中，整合型克隆载体包含与宿主细胞基因组中预定的靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，从而将克隆载体整合至该预定的基因座。为了促进靶向整合，在转化细胞之前优选地将克隆载体线性化。优选地以下述方式进行线性化，所述方式使得克隆载体的至少一端，优选地任一端的侧翼是与靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选地至少为30bp，优选地至少为50bp，优选地至少为0.1kb，进一步优选地至少为0.2kb，更优选地至少为0.5kb，进一步更优选地至少为1kb，最优选地至少2kb。优选地，通过宿主细胞增强的同源重组能力提高了靶向整合进宿主细胞基因组中(即在预定的靶基因座中整合)的效率。

优选地，克隆载体中与靶基因座同源的同源侧翼DNA序列源自高度表达的基因座，即它们源自能够在宿主细胞中具有高表达水平的基因。能够具有高表达水平的基因(即高度表达的基因)在本文中被定义为例如在被诱导的条件下，其mRNA能够组成总细胞mRNA的至少0.5％(w/w)的基因，或者其基因产物能够组成总细胞蛋白质的至少1％(w/w)的基因，或者在分泌型基因产物的情况下，可以分泌到至少0.1g/l的水平(如EP 357127B1中所述)。

通过举例给出了大量优选的高度表达的真菌基因：来自Aspergilli、Chrysosporium或Trichoderma的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脱氢酶、木聚糖酶、磷酸甘油醛脱氢酶或纤维二糖水解酶(cbh)基因。用于这些目的的最优选的高度表达的基因是葡糖淀粉酶基因，优选地为A.niger葡糖淀粉酶基因、A.oryzae TAKA-淀粉酶基因、A.nidulans gpdA基因、Trichoderma reesei cbh基因，优选地为来自P.chrysogenum的cbh1、Chrysosporiumlucknowense cbh基因或cbh基因。

可以向细胞中插入多于一个拷贝的核酸序列，以提高由所述序列编码的产物的生产(过表达)。这可以如下完成：优选地通过向其基因组中整合进多个拷贝的DNA序列来完成，更优选地通过将DNA序列的整合靶向至在前一段中定义的高度表达的基因座之一处来完成。或者这可以如下完成：包括可扩增的可选择标记物基因与核酸序列，其中含有被扩增的可选择标记物基因拷贝、从而存在额外的核酸序列拷贝的细胞可以通过在存在适当的可选择试剂时培养细胞而被选择。为了进一步提高要过表达的DNA序列的拷贝数，可以使用如WO98/46772中所述的基因转化基因。

载体系统可以是单个载体或质粒，或两个或更多的载体或质粒，它们一起含有要被引入宿主细胞基因组中的总DNA，或是转座子。

载体优选地含有一个或多个可选择标记物，所述可选择标记物允许容易地选择被转化的细胞。可选择标记物是一种基因，其产物提供杀生物性或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的自养型等等。可在作为表达盒的表达载体上将可选择标记物引入细胞或在单独的表达载体上将可选择标记物引入细胞。

丝状真菌细胞中使用的可选择标记物可选自下组，所述组包括但不限于：amdS(乙酰胺酶)，argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)，bar(膦丝菌素乙酰转移酶)，bleA(腐草霉素结合)，hygB(潮霉素磷酸转移酶)，niaD(硝酸还原酶)，pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)，sC(硫酸腺嘌呤基转移酶)、NAT或NTC(诺尔丝菌素)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及来自其他物种的等同物。优选用于Aspergillus和Penicillium细胞中的是A.nidulans或A.oryzae的amdS(见例如EP 635574 B1、EP0758020A2、EP1799821A2、WO 97/06261A2)和pyrG基因，和Streptomyceshygroscopicus的bar基因。更优选地使用amdS基因，进一步更优选地使用来自A.nidulans或A.niger的amdS基因。最优选的可选择标记物基因是与A.nidulans gpdA启动子融合的A.nidulans amdS编码序列(见EP635574 B1)。其他优选的AmdS标记物是WO2006/040358中所述的那些。也可以使用来自其他丝状真菌的AmdS基因(WO 97/06261)。

用于连接上文所述元件从而构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员公知的(见例如Sambrook & Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3rdEd.，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；andAusubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley InterScience，NY，1995)。

而且，标准分子克隆技术比如DNA分离、凝胶电泳、对核酸的酶促限制性修饰、Southern分析、转化细胞等等对技术人员而言是已知的，且例如Sambrook et al.(1989)″Molecular Cloning：a laboratory manual″，ColdSpring Harbor Laboratories，ColdSpring Harbor，New York and Innis et al.(1990)″PCR protocols，a guide tomethods and applications″Academic Press，San Diego所述的。

可按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者可选择地，基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，来扩增核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析加以表征。

优选地，对宿主细胞修饰以改进基因的表达来增强感兴趣的多肽的产生。

优选地，靶向整合进宿主细胞基因组的效率，即，整合进预定靶基因座的效率可由宿主细胞的增加的同源重组能力来增加。细胞的此类表型优选地包括如WO2005/095624所述的hdfA或hdfB缺陷型。WO2005/095624公开了获得包含增加的靶向整合效率的丝状真菌细胞的方法。

任选地，宿主细胞已被修饰，以包含提高的解折叠蛋白应答(UPR)，来增强对感兴趣多肽的生产能力。可通过US2004/0186070A1和/或US2001/0034045A1和/或WO01/72783A2和/或WO2005/123763所述的技术来增加UPR。更具体地，HAC1和/或IRE1和/或PTC2的蛋白水平已被调节，和/或SEC61蛋白可被工程改造，以获得具有提高的UPR的宿主细胞。

本领域技术人员知道怎样用一种或多种表达盒和选择标记转化细胞。例如，技术人员可使用一个或多个表达载体，其中一个或多个克隆载体包含表达盒和选择标记。

可通过任何合适的已知方法，包括例如电穿孔方法、离子轰击或微粒轰击、原生质体方法和Agrobacterium介导的转化(AMT)，进行细胞转化。优选地，使用原生质体方法。J.R.S.Fincham，Transformation in fungi.1989，Microbiological reviews.53，148-170描述了转化程序。

优选地，通过本领域中熟知的技术(见Sambrook & Russell；Ausubel，上述)，通过将在表达载体或核酸构建体上的多核苷酸引入细胞，进行宿主细胞转化。转化可包括由本身已知的方式的原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生组成的方法。在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedingsof the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述了用于转化Aspergillus细胞的合适的程序。使用Agrobacteriumtumefaciens用于转化Aspergillus和其他丝状真菌宿主细胞的合适的程序描述在例如DeGroot etal.，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentousfungi.Nat Biotechnol.1998，16：839-842.Erratum in：Nat Biotechnol 199816：1074中。转化Fusarium物种的合适的方法由Malardier et al.，1989，Gene78：147156或WO 96/00787A描述。可应用其他方法，比如使用如在下述中描述的基因枪转化方法：Christiansenet al.，Biolistic transformation of theobligate plant pathogenic fungus，Erysiphe graminis f.sp.hordei.1995，CurrGenet.29：100-102。使用Becker andGuarente，In Abelson，J.N.and Simon，M.I.，editors，Guideto Yeast Genetics andMolecular Biology，Methods inEnzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito etal.，1983，Journal of Bacteriology 153：163；and Hinnen etal.，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75：1920描述的程序转化酵母。

为了提高感兴趣的多核苷酸(基因)的拷贝量，可需要对宿主细胞多次转化。以这种方式，可影响通过宿主细胞产生的不同酶的比率。表达载体还可包含多个表达盒以增加将被转化的多核苷酸的拷贝量。

另一种方式可以是针对不同多核苷酸选择不同控制序列，其取决于选择，可引起期望多肽的更高或更低的生产量。

基于选择标记的存在与否，可选择具有选择标记转化的细胞。一旦(Aspergillus)细胞转化，通常当细胞同时用所有核酸材料转化时，当存在选择标记时，也存在编码期望多肽的多核苷酸。

优选地，在根据本发明的方法中，如优选地使用在实验部分所述的和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，通过微生物宿主细胞的至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失是产生减少至少20％，更优选地至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，尤其至少70％，更尤其至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，如优选地使用所述肽产物的LC/MS分析所测量的，肽产物产生的减少是至少20％，更优选地至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，尤其至少70％，更尤其至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％。

更优选地，至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致四肽的产生减少。优选地，如优选地使用在实验部分和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，四肽产生减少是减少至少20％，更优选地至少30％，更优选地至少40％，甚至更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，尤其至少70％，更尤其至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％。

优选地，四肽从环状VVFF(SEQ ID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQ ID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

优选地，在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞是丝状真菌。

更优选地，微生物宿主细胞是Aspergillus或Penicillium。甚至更优选地，微生物宿主细胞是Aspergillus niger或Penicillium chrysogenum。最优选地，微生物宿主细胞是Aspergillus niger。

就本发明目的而言，本文中定义了下述，为了测定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比同一性，为最优比较目的比对全部序列。为了优两条序列之间的比对，可在被比较的两条序列的任一条中引入缺口。在被比较的仝长序列上进行该比对。同一性在报告的比对区域上两条序列之间相同匹配的百分比。

使用数学算法，完成序列比较和两条序列间的百分比同一性测定。技术人员将意识到下述事实，可得到若干不同的计算机程序来比对两条序列并测定两条序列之间的同源性(Kruskal，J.B.(1983)An overview ofsequence comparison In D.Sankoff andJ.B.Kruskal，(ed.)，Time warps，stringedits and macromolecules：the theory andpractice of sequence comparison，pp.1-44 Addison Wesley)。可使用用于比对两条序列的Needleman和Wunsch算法，测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性。(Needleman，S.B.andWunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。已在计算机程序NEEDLE中应用Needleman-Wunsch算法。就本发明目的而言，使用了来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高版本，EMBOSS：The European MolecularBiology Open Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends inGenetics 16，(6)pp276-277，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白序列，EBLOSUM62用于置换矩阵。对于核苷酸序列，使用了EDNAFULL。可指定其他矩阵。就本发明目的而言，比对氨基酸序列使用的参数是10的缺口开放惩罚和0.5的缺口衍生惩罚。技术人员将意识到所有这些不同的参数将产生些微不同的结果，但是当使用不同的算法时，两条序列的总百分比同一性不显著改变。本文中提到的蛋白序列还可用作“查询序列”，以对序列数据库进行搜索，例如来鉴定其他家族成员或相关序列。可使用BLAST程序进行此类查询。进行BLAST分析的软件通过Naional Center for BiotechnologyInformation(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)是公众可得到的。BLASTP用于氨基酸序列和BLASTN用于核苷酸序列。在BLAST程序中，可使用下述缺省设置：

-开放缺口的开销：缺省＝5用于核苷酸/11用于蛋白

-延伸缺口的开销：缺省＝2用于核苷酸/1用于蛋白

-核苷酸错配惩罚：缺省＝-3

-核苷酸匹配奖励：缺省＝1

-期望值：缺省＝10

-字长：缺省＝11用于核苷酸/28用于megablast/3用于蛋白

本文中提到的核酸序列还可用作“查询序列”以对公用数据库进行搜索，例如，来鉴定其他家族成员或相关的序列。使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。

本文中提供的序列信息不应这样严格地解释为需要包括错误鉴定的碱基。本文中公开的具体序列可容易地用于从丝状真菌，尤其是A.niger分离全部基因，其随后可容易地进行进一步的序列分析从而鉴定测序错误。

除非另外指出，使用自动DNA序列仪，测定本文中通过对DNA分子测序测定的所有核苷酸序列，并且通过翻译如上文测定的核酸序列，预测本文中通过测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列。因而，本领域已知对于通过该自动化方法测序的DNA，本文测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。通过自动测定的核苷酸序列典型地与测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少约90％一致，更优选地至少约95％，至少约99.9％一致。通过本领域中熟知的其他方法包括手动DNA测序方法测定的实际序列可更精确。如还在本领域中已知的，较之实际序列，测定的核苷酸序列中的单个插入或缺失会引起核苷酸序列的翻译移码使得从该插入或缺失的位置点开始，由测定的核苷酸序列编码的预测的氨基酸序列会完全不同于由测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。

本领域技术人员能鉴定此种错误鉴定的碱基并知道怎样纠正此种错误。

优选地，用于根据本发明的方法的微生物宿主细胞基因组中的修饰是基因组中的编码下述非核糖体肽合酶的至少一个核酸序列的至少一个位置的修饰，所述非核糖体肽合酶与从由根据SEQ ID NO：4的多肽、根据SEQ ID NO：10的多肽、根据SEQ ID NO：14的多肽、根据SEQ ID NO：18的多肽、根据SEQ ID NO：22的多肽、根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQID NO：38的多肽组成的组中选择的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性，例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是导致至少一种下述mRNA的量减少的修饰，所述mRNA与从根据SEQ ID NO：3的mRNA、根据SEQ IDNO：9的mRNA、根据SEQ IDNO：13的mRNA、根据SEQ ID NO：17的mRNA、根据SEQ ID NO：21的mRNA、根据SEQ ID NO：33的mRNA和根据SEQ ID NO：37的mRNA的组中选择的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性，例如至少92％同一性，例如至少93％同一性，例如至少94％同一性，例如至少95％同一性，例如至少96％同一性，例如至少97％同一性，例如至少98％同一性，例如至少99％同一性，例如100％同一性。优选地，多肽是根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQ IDNO：38的多肽之一并且mRNA是根据SEQ ID NO：33的mRNA和根据SEQ ID NO：37的mRNA之一。

因而，在优选的实施方式中，在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是基因组中的编码理述非核糖体肽合酶的核酸序列的至少一个位置的修饰，所述非核糖体肽合酶与根据SEQ ID NO：38的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是导致下述mRNA的量减少的修饰，所述mRNA与根据SEQ ID NO：37的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性、例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性。

在另一优选的实施方式中，在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是基因组中的编码下述非核糖体肽合酶的核酸序列的至少一个位置的修饰，所述非核糖体肽合酶与根据SEQ ID NO：34的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是导致下述mRNA的量的减少的修饰，所述mRNA与根据SEQ ID NO：33的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性。

在一种备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：22的多肽，mRNA是根据SEQ IDNO：21的mRNA。

在另一备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：18的多肽，mRNA是根据SEQ IDNO：17的mRNA。

在另一备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：14的多肽，mRNA是根据SEQ IDNO：13的mRNA。

在另一备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：10的多肽，mRNA是根据SEQ IDNO：9的mRNA。

在另一备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：4的多肽，mRNA是根据SEQ IDNO：3的mRNA。

优选地，如优选地使用如在实验部分和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，所述修饰导致至少一种非核糖体肽合酶的产生减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。优选地，非核糖体多肽合酶是根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQ IDNO：38的多肽之一。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，如优选地使用LC/MS分析所测量的，肽产物产生减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。

更优选地，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽产生减少。优选地，如优选地使用如在实验部分和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，四肽产生减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。

在一些应用中，可使用产生的感兴趣的化合物而基本上不用从培养发酵液中分离；将培养基与生物质分离可能是足够的。本发明提供了此类化合物。

与在相同的条件下的其基因组未被修饰的亲本微生物宿主细胞中产生的所述感兴趣的化合物比较，根据本发明产生的感兴趣的化合物因此包含更少的至少一种肽产物，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导，其中在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，感兴趣的化合物包含至少少20％、更优选地至少少30％、更优选地至少少40％、甚至更优选地至少少50％、甚至更优选地至少少60％、尤其至少少70％、更尤其至少少80％，例如至少少85％、例如至少少90％、例如至少少95％、例如至少少100％、例如至少少500％、例如至少少1000％的所述肽产物。优选地，使用所述肽产物的LC/MS，进行肽产物量的分析。

更优选地，如优选地使用如在实验部分和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，感兴趣的化合物包含更少的四肽。优选地，四肽从环状VVFF(SEQID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQ ID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ IDNO：6)。优选地，感兴趣的化合物包含至少少20％、更优选地至少少30％、更优选地至少少40％、甚至更优选地至少少50％、甚至更优选地至少少60％、尤其至少少70％、更尤其至少少80％，例如至少少85％、例如至少少90％、例如至少少95％、例如至少少100％、例如至少少500％、例如至少少1000％的所述四肽。

本发明还涉及基因组已经被修饰的微生物宿主细胞，使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。宿主细胞可以是任何宿主细胞并且优选地是本文前面定义的一种。基因组已经被修饰使得其导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失的所述微生物宿主细胞在本文中称作根据本发明的宿主细胞。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，使用LC/MS，进行肽产物量的分析。

更优选地，如优选地使用如在实验部分所述的和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，在根据本发明的宿主细胞中，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽的产生减少。优选地，四肽从环状VVFF(SEQ ID NO：5)、环状VVFY(SEQ IDNO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

当感兴趣的化合物是如本文前面定义的生物聚合物时，微生物细胞已能产生生物聚合物。还可通过本文前面描述的方法，为所述微生物细胞提供编码参与生产感兴趣的化合物的多肽的同源或异源的表达构建体。

优选地，如优选地使用如在实验部分所描述和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，通过根据本发明的微生物宿主细胞的至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失是产生减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，如优选地使用所述肽产物的LC/MS分析所测量的，肽产物产生减少至少20％，更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。

更优选地，如优选地使用如在实验部分所描述和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽的产生减少。优选地，四肽产生减少至少20％、更优选地减少至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。优选地，四肽从环状VVFF(SEQ ID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

优选地，根据本发明的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是基因组中的编码下述非核糖体肽合酶的至少一种核酸序列的至少一个位置的修饰，所述非核糖体肽合酶与从由根据SEQ ID NO：4的多肽、根据SEQ ID NO：10的多肽、根据SEQ ID NO：14的多肽、根据SEQID NO：18的多肽、根据SEQ ID NO：22的多肽、根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQ ID NO：38的多肽组成的组中选择的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组的修饰是导致至少一种mRNA的量减少的修饰，所述mRNA与从根据SEQ ID NO：3的mRNA、根据SEQ ID NO：9的mRNA、根据SEQ ID NO：13的mRNA、根据SEQ ID NO：17的mRNA、根据SEQID NO：21的mRNA、根据SEQ ID NO：33的mRNA和根据SEQ IDNO：37的mRNA的组中选择的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性。优选地，多肽是根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQ ID NO：38的多肽之一，且mRNA是根据SEQ ID NO：33的mRNA和根据SEQ ID NO：37的mRNA之一。

因而在一种优选的实施方式中，在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是基因组中的编码下述非核糖体肽合酶的核酸序列的至少一个位置上的修饰。所述非核糖体肽合酶与根据SEQ ID NO：38的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是导致mRNA的量减少的修饰，所述mRNA与根据SEQ ID NO：37的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性。

在另一优选的实施方式中，在根据本发明的方法中使用的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是基因组中的编码非核糖体肽合酶的核酸序列的至少一个位置上的修饰，所述非核糖体肽合酶与根据SEQ ID NO：34的多肽具有至少35％同一性、更优选地至少40％同一性、更优选地至少45％同一性、更优选地至少50％同一性、甚至更优选地至少55％同一性、甚至更优选地至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性；和/或在根据本发明的方法中的微生物宿主细胞的基因组中的修饰是导致mRNA的量减少的修饰，所述mRNA与根据SEQ ID NO：33的mRNA具有至少60％同一性、甚至更优选地至少65％同一性、甚至更优选地至少70％同一性、甚至更优选地至少75％同一性、甚至更优选地至少80％同一性、甚至更优选地至少85％同一性、甚至更优选地至少90％同一性，例如至少91％同一性、例如至少92％同一性、例如至少93％同一性、例如至少94％同一性、例如至少95％同一性、例如至少96％同一性、例如至少97％同一性、例如至少98％同一性、例如至少99％同一性、例如100％同一性。

在一种备选的实施方式中，多肽是根据SEQ ID NO：22的多肽，并且mRNA是根据SEQID NO：21的mRNA。

优选地，如优选地使用如在实验部分所描述和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，所述修饰导致至少非核糖体肽合酶的产生减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。优选地，非核糖体多肽合酶是根据SEQ ID NO：34的多肽和根据SEQ ID NO：38的多肽之一。

优选地，所述修饰导致编码非核糖体肽合酶的mRNA的量减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。优选地，mRNA是根据SEQ ID NO：33的mRNA和根据SEQ ID NO：37的mRNA之一。

优选地，至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；在连接之前和/或之后，可修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。优选地，如优选地使用所述肽产物的LC/MS分析所测量的，肽产物产生减少是减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％，例如至少100％。

更优选地，非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽的产生减少。优选地，如优选地使用如在实验部分所描述和说明书前面简要概述的针对环状四肽测量的LC/MS分析所测量的，四肽产生减少是减少至少20％、更优选地至少30％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、尤其至少70％、更尤其至少80％，例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少100％。优选地，四肽从环状VVFF(SEQID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQ IDNO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择。更优选的四肽是环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

本发明还涉及用于制备根据本发明的微生物宿主细胞，即如本文前面所述的缺失至少一种非核糖体肽合酶产生的所述宿主细胞的方法，所述方法优选地包括如本文前面所述的对亲本宿主细胞的基因组修饰。

本发明的优选的实施方式

1.通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其包括：

a.提供微生物宿主细胞，

b.在有助于表达所述感兴趣的化合物的条件下培养所述微生物宿主细胞，

c.从培养基中分离所述感兴趣的化合物，

其中所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得所述微生物宿主细胞的至少一种非核糖体肽合酶的产生出现缺失。

2.根据实施方式1所述的方法，其中所述微生物宿主细胞的基因组的至少一条核酸序列的至少一个位置的已经被修饰，所述核酸序列编码与选自下述组的多肽具有至少30％同一性的非核糖体肽合酶，所述组由根据SEQ ID NO：38的多肽、根据SEQ ID NO：34的多肽、根据SEQ ID NO：10的多肽、根据SEQ ID NO：14的多肽、根据SEQ ID NO：18的多肽、根据SEQ ID NO：22的多肽和根据SEQ ID NO：4的多肽组成；和/或其中所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得与从下述组中所选择的mRNA具有至少60％同一性的至少一种mRNA的量减少，所述组为根据SEQ IDNO：37的mRNA、根据SEQ ID NO：33的mRNA、根据SEQ ID NO：9的mRNA、根据SEQ ID NO：13的mRNA、根据SEQ ID NO：17的mRNA、根据SEQ ID NO：21的mRNA和根据SEQ ID NO：3的mRNA。

3.根据实施方式1或2所述的方法，其中所述多肽是根据SEQ ID NO：38的多肽或根据SEQ ID NO：34的多肽之一，和/或所述mRNA是根据SEQ ID NO：37的mRNA或根据SEQ IDNO：33的mRNA之一。

4.根据实施方式1至3的任一项所述的方法，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失是产生减少至少40％。

5.根据实施方式1至4的任一项所述的方法，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；并且其中在连接之前和/或之后，可任选地修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。

6.根据实施方式5所述的方法，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致四肽，优选地环状四肽产生减少。

7.根据实施方式6所述的方法，其中所述四肽选自由下述组成的组：环状VVFF(SEQID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQ ID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)，更优选地所述四肽选自由下述组成的组：环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)。

8.根据实施方式5至7的任一项所述的方法，其中所述肽产物产生减少、优选地所述四肽产生减少、更优选地所述环状四肽产生减少至少20％。

9.根据实施方式1至8任一项所述的方法，其中所述微生物宿主细胞是真核细胞，更优选地所述微生物宿主细胞是真菌细胞，甚至更优选地所述微生物宿主细胞是丝状真菌。

10.根据实施方式9所述的方法，其中所述丝状真菌是Aspergillus、Acremonium、Thielavia、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma，优选地Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillusoryzae、Chrysosporiumlucknowense、Fusarium oxysporum、Trichoderma reesei、Acremoniumalabamense、Myceliophthora thermophila、Thielavia terrestris或Penicilliumchrysogenum的种。

11.根据实施方式10所述的方法，其中所述微生物宿主细胞属于Aspergillus或Penicillium属，更优选地所述微生物宿主细胞是Aspergillusniger或Penicilliumchrysogenum，最优选地所述微生物宿主细胞是Aspergillus niger。

12.根据实施方式9至11的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，其额外地在基因组中包含编码选自下述组的产物的多核苷酸的一个或多个修饰，所述组为葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素，优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素和蛋白酶转录调节物prtT，使得所述宿主细胞缺失由包含所述修饰的多核苷酸编码的至少一种产物。

13.根据实施方式1至12的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的打断。

14.根据实施方式1至13的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含hdfA基因打断。

15.根据实施方式1至14的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含适于整合编码感兴趣的化合物的多核苷酸的一个或多个拷贝的至少两个基本上同源DNA结构域，其中所述至少两个基本上同源DNA结构域的至少一个被改造，以较之其来源的所述基本上同源DNA结构域，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好，并且其中所述经改造的基本上同源DNA结构域来源的基本上同源DNA结构域的基因转变率比所述至少两个基本上同源DNA结构域的另一个高至少10％。

16.根据实施方式15所述的方法，其中所述宿主细胞，优选地A.niger宿主细胞是包含两个或多个扩增子，优选地两个或多个ΔglaA扩增子的宿主细胞，并且其中具有最高基因转化频率的所述扩增子已被改造，以较之其来源的所述扩增子，对所述编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。

17.根据实施方式1至16的任一项所述方法，其中所述宿主细胞额外地包含Sec61修饰，优选地所述SEC 61修饰是其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变。

18.根据实施方式1至17的任一项所述方法，其中所述感兴趣的化合物是从由生物质、生物聚合物、代谢产物组成的组中选择的生物学化合物，优选地是从核酸、多胺、多元醇、多肽(比如蛋白、优选地酶)或聚酰胺或多糖中选择的生物聚合物或是从初级代谢产物或次级代谢产物中选择的代谢产物。

19.微生物宿主细胞，其基因组已经被修饰，使得所述细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。

20.根据实施方式19所述的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞的基因组中的至少一条核酸序列的至少一个位置已经被修饰，所述核酸序列编码与选自下述组的多肽具有至少30％同一性的非核糖体肽合酶，所述组为根据SEQ ID NO：38的多肽、根据SEQID NO：34的多肽、根据SEQ ID NO：10的多肽、根据SEQ ID NO：14的多肽、根据SEQ ID NO：18的多肽、根据SEQ ID NO：22的多肽和根据SEQ ID NO：4的多肽；和/或其中所述微生物宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致与从下述组中所选择的mRNA具有至少60％同一性的至少一种mRNA的量减少，所述组为根据SEQ ID NO：37的mRNA、根据SEQ ID NO：33的mRNA、根据SEQ ID NO：9的mRNA、根据SEQ ID NO：13的mRNA、根据SEQ IDNO：17的mRNA、根据SEQ IDNO：21的mRNA和根据SEQ ID NO：3的mRNA。

21.根据实施方式20所述的微生物宿主细胞，其中所述多肽是根据SEQ ID NO：38的多肽或根据SEQ ID NO：34的多肽之一，和/或所述mRNA是根据SEQ ID NO：37的mRNA和根据SEQ ID NO：33的mRNA之一。

22.根据实施方式19至21的任一项所述的微生物宿主细胞，其中通过所述微生物宿主细胞的所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失为产生减少至少40％。

23.根据实施方式19至22任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致至少一种肽产物的产生减少，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；并且其中在连接之前和/或之后，可任选地修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。

24.根据实施方式19至23任一项所述的微生物宿主细胞，其中至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致四肽，优选地环状四肽，更优选地从环状VVFF(SEQ ID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择的四肽，更优选地环状VVFF(SEQ IDNO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)四肽的产生减少。

25.根据实施方式23或24任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述肽产物产生减少，优选地四肽产生减少，更优选地环状四肽产生减少至少20％。

26.根据实施方式19至25任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述微生物宿主细胞是丝状真菌，优选地是选自Aspergillus、Acremonium、Myceliophthora、ThielaviaChrysosporium、Penicillium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma，优选地Aspergillusniger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromycesemersonii、Aspergillus oryzae、Acremonium alabamense、Myceliophthorathermophila、Thielavia terrestris Chrysosporium lucknowense、Fusariumoxysporum、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum种的丝状真菌。

27.根据实施方式26所述的微生物宿主细胞，其中所述丝状真菌属于Aspergillus或Penicillium属，更优选地所述微生物宿主细胞是Aspergillusniger或Penicilliumchrysogenum，最优选地所述微生物宿主细胞是Aspergillus niger。

28.根据实施方式26或27任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，其额外地在基因组中包含编码选自下述组的产物的多核苷酸的一个或多个修饰，所述组为葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定性α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素、优选地赭曲霉素和/或烟曲霉素和蛋白酶转录调节物prtT，使得所述宿主细胞缺失由包含所述修饰的多核苷酸编码的至少一种产物。

29.根据实施方式26至28任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的打断。

30.根据实施方式26至29任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含hdfA基因的打断。

31.根据实施方式26至30任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含适于整合编码感兴趣的化合物的多核苷酸的一个或多个拷贝的至少两个基本上同源DNA结构域，其中所述至少两个基本上同源DNA结构域的至少一个被改造，以较之其来源的所述基本上同源DNA结构域，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好，并且其中所述经改造的基本上同源DNA结构域来源的基本上同源DNA结构域的基因转变率比所述至少两个基本上同源DNA结构域的另一个高至少10％。

32.根据实施方式31所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞是包含两个或多个扩增子，优选地两个或多个ΔglaA扩增子的宿主细胞，优选地A.niger宿主细胞，并且其中具有最高基因转化频率的所述扩增子已被改造，以较之其来源的扩增子，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。

33.根据实施方式26至32任一项所述的微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含Sec61修饰，优选地所述SEC 61修饰是其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变。

34.感兴趣的化合物，所述化合物较之在基因组未被使得所述宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶产生缺失而进行修饰的亲本微生物宿主细胞在相同的条件下产生的所述感兴趣的化合物包含更少的至少一种肽产物，其中所述肽产物由至少两个连接的氨基酸组成，其中所述连接由所述至少一种非核糖体肽合酶介导；并且其中在连接之前和/或之后，可选地修饰所述肽产物的氨基酸的化学结构。

35.根据实施方式34所述的感兴趣的化合物，其是从由生物质、生物聚合物、代谢产物组成的组中选择的生物学化合物，优选地是从核酸、多胺、多元醇、多肽，比如蛋白，优选地酶、或聚酰胺或多糖选择的生物聚合物或是从初级代谢产物或次级代谢产物中选择的代谢产物。

36.根据实施方式34或35任一项所述的感兴趣的化合物，其包含更少的四肽，优选地更少的环状四肽，更优选地更少的从环状VVFF(SEQID NO：5)、环状VVFY(SEQ ID NO：6)、环状VVWY(SEQ ID NO：23)、环状VLYW(SEQ ID NO：24)、环状VLFY(SEQ ID NO：25)、环状LLFY(SEQ ID NO：26)、环状VVFW(SEQ ID NO：27)和环状VLFF(SEQ ID NO：28)的组中选择的四肽，更优选地更少为环状VVFF(SEQ ID NO：5)或环状VVFY(SEQ ID NO：6)的四肽。

37.用于制备根据实施方式19至33任一项所述的微生物宿主细胞的方法，所述方法包括亲本宿主细胞的基因组的修饰，使得所述宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失。

实施例

菌株

WT 1：该Aspergillus niger菌株用作野生型菌株。该菌株以保藏号CBS 513.88保藏在CBS Institute。

WT 2：该A.niger菌株是包含编码葡糖淀粉酶(glaA)的基因缺失的WT 1菌株。通过使用如EP 0 635 574 B1所述的“MARKER-GENEFREE”方法构建WT 2。在该专利中，其广泛描述了怎样在CBS 513.88基因组中缺失的glaA特异性DNA序列。所述程序产生无标记基因的(MARKER-GENE FREE)ΔglaA重组体A.niger CBS 513.88菌株，该菌株最终不具有任何外源DNA序列。

WT 3：如van den Hombergh et al.(van den Hombergh JP，SollewijnGelpkeMD，van de Vondervoort PJ，Buxton FP，Visser J.(1997)-Disruption ofthree acidproteases in Aspergillus niger-effects on protease spectrum，intracellularproteolysis，and degradation of target proteins-Eur J Biochem.247(2)：605-13)所述的，该A.niger菌株是包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因缺失的WT 2菌株。该程序导致具有在WT 2菌株背景中失活的pepA基因的无标记基因的WT 3菌株。

WT 4：使用如之前在WO05/095624中详细描述的方法，该A.niger菌株是包含hdfA基因缺失的无标记基因的WT 3菌株。

Wisconsin 54-1255(ATCC 28089)：这是在实施例6和7中使用的Penicilliumchrysogenum菌株。

分子生物学技术

在这些菌株中，使用对技术人员而言已知的分子生物技术(见，Sambrook &Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Ed.，CSHLPress，Cold SpringHarbor，NY，2001)，如下所述的使若干基因过表达且使其他基因下调。用于基因过表达的表达载体和用于下调的打断载体的一般设计、转化、标记物的使用和选择性培养基的例子可在WO199846772、WO199932617、WO2001121779、WO2005095624、EP 635574B和WO2005100573中找到。

A.niger摇瓶发酵

如WO2010/102982所述的，将A.niger菌株预培养并在34℃和170rpm下培养。如WO2010/102982中更详细描述的，在20ml CSL预培养基中预培养并在过夜生长之后，将10ml的该培养物转移至100ml的发酵培养基(FM)，培养指定的时间。

用于发酵液样品的LC/MS分析的样品制备。

在针对环肽的发酵液的该分析中，将上清液与球团部分分离并分别分析。在LC/MS分析之前，将2ml的发酵液样品离心(13,000rpm)并将上清液和球团分离。用2ml MilliQ水将获得的球团洗涤3次。然后，添加1ml的TFA。将样品匀质处理并离心(在13,000rpm下)。由于特定的环肽在水∶乙腈∶甲酸(MQ∶ACN∶FA 50∶50∶0.1)的混合物中有限的溶解性和在TFA中的良好的溶解性，上清液和球团样品的所有随后的稀释在TFA中进行。分析之前，在起始的洗脱剂MilliQ水∶乙腈∶甲酸50∶50∶0.1(v/v/v)中进行100x的最终稀释步骤。所有样品掺混内标物VV-Dphe-Y。

用于环状四肽测量的LC/MS分析

与Accela泵(ThermoFisher Scientific^TM，Breda，the Netherlands)相连的在正电离模式中操作的LTQ-Orbitrap质谱仪(ThermoElectron^TM，Breda，the Netherlands)用于表征并测量环肽VVFF(SEQ ID NO：5)(M＝492.27366Da)和VVFY(SEQ ID NO：6)(M＝508.26857Da)。使用Inertsil ODS-33μ2.1*150mm柱(GL Sciences Inc.C/N 5020-04415)，使用用于洗脱的在MilliQ水中的0.1％甲酸(Millipore，Bedford，MA，USA；溶液A)和在乙腈中的0.1％甲酸(溶液B)的梯度，将环肽分离。开始梯度为50％的溶液B两分钟并在10分钟内增加至80％的溶液B，并以后者的比率保持另一2分钟。使用的注入体积为25微升，流速为每分钟200微升，将柱温保持在40℃。通过用于准确的质量测定的Orbitrap中的全扫描分析和用于氨基酸序列信息的LTQ中的MS/MS分析，获得关于各个环肽的详细信息。

含有VVFF(SEQ ID NO：5)和VVFY(SEQ ID NO：6)二者的标准物溶解在三氟乙酸(TFA)中并进一步在MilliQ水∶乙腈∶甲酸50∶50∶0.1(v/v/v)中稀释。使用TFA，因为观察到环肽在MilliQ水中实际上是不可溶的。获得的溶液用来调整MS模式中的最优灵敏度和MS/MS模式中的最优片段化，所述溶液进行20μg/ml的恒定注入，导致在MS/MS模式中的最优碰撞能量为约20％。在MS/MS模式中，环状VVFF(cVVFF-SEQ ID NO：5)(m/z 493)的特征在于产物离子具有465、394、346和247的m/z值。在MS/MS模式中，cVVFY(SEQ ID NO：6)(m/z 509)特征在于产物离子具有481、410、346和247的m/z值。在MS/MS模式中，cVVWY(SEQ ID NO：23)(m/z 548)特征在于产物离子具有520、449、385和286的m/z值。在MS/MS模式中，cVLYW(SEQID NO：24)(m/z 562)特征在于产物离子具有534、449、399和350的m/z值。在MS/MS模式中，cVLFY(SEQ IDNO：25)(m/z 523)特征在于产物离子具有495、424、410、360和311的m/z值。在MS/MS模式中，cLLFY(SEQ ID NO：26)(m/z 537)特征在于产物离子具有509、424、374和311的m/z值。在MS/MS模式中，cVVFW(SEQ ID NO：27)(m/z 532)特征在于产物离子具有504、433、385和334的m/z值。在MS/MS模式中，cVLFF(SEQ ID NO：28)(m/z 507)特征在于产物离子具有479、408、394、360和295的m/z值。

酶活性测量

为了以分光光度法测定Aspergillus niger培养发酵液中的磷脂酶PLA2活性(PLA2)，使用了人工底物：1，2-二硫代二辛酰基卵磷脂(diC8，底物)。在WO2006/040312中描述了该检验的更多细节。

如WO2009/106575的“活性测量”部分所述的，测量脂酶活性。

如Witteveen et al.1990，“Glucose oxidase overproducing andnegativemutants of Aspergillus niger”，Appl Microbiol Biotechnol 33：683-686所述的，测量葡萄糖氧化酶活性。

实施例1产生酶的Aspergillus niger菌株的构建

选择Penicillium chrysogenum葡萄糖氧化酶(具有如在SEQ ID NO：29中描绘的密码子对优化的编码序列和如SEQ ID NO：30中描绘的蛋白序列)、如WO2009/106575中详述的脂肪分解L01酶、猪磷脂酶A2(PLA2)蛋白作为用于在A.niger WT 4中酶表达的模型蛋白。

使用如WO 98/46772和WO 99/32617所述的技术，将P.chrysogenumgox基因和编码脂肪分解酶的基因克隆进A.niger pGBTOP-表达载体中，所述载体在葡糖淀粉酶启动子的控制下，产生pGBTOPGOX-1和pGBTOPLIP-1。将用于过表达PLA2的片段制作为A.niger的proPLA2和天然葡糖淀粉酶A基因的融合，并且其如Roberts et al.(Roberts I.N.，JeenesD.J.，MacKenzie D.A.，Wilkinson A.P.，Sumner I.G.and Archer D.B.(1992)-Heterologous gene expression in Aspergillus niger：a glucoamylase-porcinepancreatic phospholipase A₂ fusion protein is secreted and processed toyieldmature enzyme.Gene 122：155-161)所述的制备。融合蛋白含有kex1剪接位点，以在Golgi中处理。使用如WO 98/46772和WO 99/32617所述的相同技术，将该glaA-pla2融合基因克隆进A.niger pGBTOPPLA-1表达载体(图5)。

通过将WT 4菌株与含有amdS可选择的标记基因的载体pGBAAS-1和pGBTOPGOX-1，pGBTOPLIP-1和pGBTOPPLA-1载体分别共转化，构建针对葡萄糖氧化酶、脂肪分解酶和葡糖淀粉酶-猪胰脏磷脂酶A₂融合蛋白的产生酶的菌株，并随后选择转化体。进行转化和反选择程序(如WO98/46772和WO99/32617所述的)，随后选择下述菌株，所述菌株为导致产生葡萄糖氧化酶、脂酶的(多拷贝)菌株和产生葡糖淀粉酶-猪胰脏磷脂酶A₂融合蛋白的菌株。对于每一背景菌株，选择针对WT 4背景的1种高拷贝产生酶的菌株并命名为PGOX-1、LIP-1和PLA-1。这些菌株在随后的实验中用作产生各自酶的菌株。

实施例2含有缺失的Aspergillus niger GBA菌株的构建方法

根据已知的原理设计下面描述并使用的所有基因替代载体，并根据常规克隆程序构建。用于构建缺失载体的一般克隆载体pGBDEL(图1)的用途和反选择程序都在WO06/040312、EP635574B和WO 98/46772中描述。本质上，缺失载体包含各个ORF序列的约1-2kb目标区域，以靶向在预定的基因组的基因座处的同源重组。另外，它们含有在正向重复之间的用于转化的A.nidulans双向amdS选择标记基因。通过在荧光-乙酰胺培养基上的所谓的反选择，进行amdS基因的去除，产生对无基因标记的菌株选择。使用也如EP 0635574中的“MARKER-GENE FREE”方法所述的该转化策略和随后的反选择，可在菌株修饰程序中无限制地使用amdS标记。在图2中描绘了如本文上文描述的该基因打断的一般程序。

对于如本文实施例中使用的对本发明基因的基因缺失，应用稍微改进的方法(如图3描绘的)。鉴于NRPS基因是非常大的序列，用于基因打断目标区域是基因的5’区域和将被打断的NRPS基因的内部片段。用于标记的去除的重复序列含有与将被打断的基因的3’区域同源的序列。通过双交换，如这样构建的线性DNA片段在目标序列的同源基因座处整合进基因组，因而通过amdS基因置换将被缺失的基因的5’区域(图3)。转化之后，产生的正向重复——将被缺失的基因的3’区域允许通过(第二次)同源重组事件去除选择标记基因，通过所述同源重组事件，将被去除的基因的额外片段被缺失。使用如图3所描绘的改良的策略，大的基因片段或基因组的区域可在基因组序列中有足够的频率缺失。如图2和图3中描绘的敲除和反选择程序在基因组尺度下具有不同的中间结果，但是对于两种方法，反选择之后最终的基因组组成是相同的。

实施例3构建具有打断的编码NRPS酶的基因的本发明的Aspergillusniger菌株

为了能够打断编码非核糖体肽合酶(具有如在SEQ ID NO：35中描绘的基因组序列、在SEQ ID NO：36中描绘的编码序列、在SEQ ID NO：37中描绘的mRNA和在SEQ ID NO：38中描绘的nrps蛋白)的基因(npsE)，如实施例2中上文所述的设计基因替代载体。通过DNA合成来构建载体pGBDEL-NRPS，并包含npsE启动子的约1.3kb目标区域、用于同源重组的npsEORF的一部分和npsE的3’区域，片段的布局和方位如图4中所示。该pGBDEL-NRPS载体被线性化并用来转化Aspergillus niger菌株WT4、PGOX-1、LIP-1和PLA-1。选择在npsE基因座处具有整合片段的正确转化体之后并随后进行反选择，选择菌株WT 4_NPS_E、PGOX-1_NPS_E、LIP-1_NPS_E和PLA-1_NPS_E作为具有在其各自的背景菌株中的失活的npsE基因的代表菌株。可使用相同的方法用于npsA、npsB、npsC和/或npsD基因的打断。

实施例4分析具有打断的编码NRPS酶的基因的本发明的Aspergillusniger菌株及其产生的酶产物

当表达酶(例如PGOX、LIP、PLA)时，在未产生npsE打断的WT4菌株中，在上清液中的产生的并测量的环状四肽水平可被提高。针对WT 4遗传背景中的许多菌株，对菌丝体球团和培养基上清液的分析表明打断npsE(SEQ ID No.35-38)导致菌丝体部分和培养基上清液中二者中的环状四肽VVFF和VVFY急剧减少。所有结果在表1中示出。在产生各自酶(PGOX，LIP，PLA)的背景菌中的npsE打断菌株的环状四肽产生的分析揭示了，当本发明的npsE基因打断时，细胞外上清液中的产生的环状四肽水平也急剧减少。这表明当打断npsE时，产生的环状四肽急剧减少，而与通过菌株产生的酶产物无关。

表1在FM培养基中的摇瓶发酵之后，上清液和生物质(菌丝体球团)的环状四肽测量值

另外，发现了，在LIP-1的上清液中的处于可检测水平的六种其他环肽——c(VVWY)、c(VLYW)、c(VLFY)、c(LLFY)、c(VVFW)和c(VLFF)，在LIP-1_NPS_E的上清液中在检出限以下(数据未示出)。对产生的酶水平的分析表明，在第4天时可在产生各自酶的和npsE打断的菌株的上清液中测量到大致相等的葡萄糖氧化酶，脂酶和PLA2酶活性水平(数据未示出)。

实施例5用通过本发明的Aspergillus niger菌株产生的酶产物在啤酒中的诱导喷涌的测试

对于环状四肽，可在啤酒中测量测量诱导喷涌的活性。喷涌活性如下测试：使用在室温新打开的啤酒瓶，随后轻轻地添加1ml的培养上清液至在瓶中的啤酒中。可从图6的啤酒泡沫形成中看出，LIP-1菌株的上清液显示了强的喷涌活性，而LIP-1_NPS_E菌株的上清液在啤酒中没有显示喷涌活性。

实施例6Penicillium chrysogenum中的非核糖体肽合酶基因Pc16g04690的打断。

这里使用的菌株是Wisconsin 54-1255(ATCC 28089)。

任何工业Penicillium chrysogenum菌株可用做起始菌株。此类菌株的例子有：CBS 455.95(Gouka，R.J.et al.，1991，J.Biotechnol.20，189-200)；Panlabs P2(Lein，J.，1986，in‘Overproduction of microbial metabolites’，Vanek，Z.et al.(eds.)，105-140；Butterworths，Stoneham，MA.)；E1和AS-P-78(Fierro，F.et al.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92，6200-6204)；BW1890和BW1901(Newbert，R.W.et al.，1997，J.Ind.Microbiol.19，18-27)。

为了打断并因而使Penicillium chrysogenum中的非核糖体肽合酶基因Pc16g04690(NCBI基因库基因ID 8304562)(具有如SEQ ID NO：31中描绘的基因组序列、如SEQ ID NO：32中描绘的编码序列、如SEQ ID NO：33中描绘的mRNA和SEQ ID NO：34中描绘的nrps蛋白)失活，应用了双同源重组策略。对于该策略，将基因Pc16g04690的5’和3’序列用作侧翼以将amdS选择标记靶向该基因座。如果双同源交换发生，转化体会能将乙酰胺用作唯一碳源(这由于存在amdS基因)。在Penicillium chrysogenum中双同源交换是不常发生的事件，但是使用在amdS基因的任一侧具有3kb侧翼的构建体足够获得阳性(即Pc16g04690打断的)克隆。应用的寡核苷酸在表2中列出。PCR扩增后，通过TOPO T/A克隆(Invitrogen)将片段克隆进pCRXL中。随后，用Acc651和NotI消化3kb长度的左侧翼，随后在pBluescriptII SK+(Invitrogen)中连接预消化的Acc651和NotI。用NotI消化获得的左侧翼质粒，以促进用NotI和Eco521预消化的右3kb侧翼的克隆。获得的3kb侧翼的质粒具有在左侧翼和右侧翼之间的唯一的NotI位点，其用来克隆作为选择标记的amdS基因。这通过用NotI消化pHELY-A1(如在WO 04/106347中所述的)并分离3.1kb PgpdA-AnamdS表达盒来获得。用KpnI消化后，分离因而获得的缺失片段并将其转化至青霉素基因簇单拷贝隔离群。就其能在乙酰胺选择平板上生长选择转化体并针对Pc16g04690基因的缺失通过PCR分析；PCR引物在表3中列出。针对产生的小肽，例如本文前面所述的环状四肽VVFY和VVFF，通过LC/MS分析选择的转化体。

表2用于构建双同源交换表达盒的引物对。限制性位点加下划线

表3用于菌落PCR的引物序列

所有推定缺失突变体在针对基因Pc16g04690的PCR中是阴性的，所述基因Pc16g04690编码推定催化上文所述的四肽形成的非核糖体肽合酶；因而表示成功失活(见表4)。

表4对推定Pc16g04690打断突变体的菌落PCR

实施例7具有打断的编码NRPS酶的基因的本发明的Penicilliumchrysogenum菌株的分析

在摇瓶中测试了实施例6中获得的所有突变体，以确认在打断的Penicilliumchrysogenum菌株中环状四肽产生减少，为此，在液态矿物质培养基中接种突变体。如在该文件中针对Aspergillus niger菌株所述的分析样品。如表5中可看出的，野生型Wisconsin54-1255菌株显示了产生并分泌进培养基中的四肽的显著的水平。相反地，分析的缺失突变体没有产生环状四肽或产生了降低量的四肽。这证明了，除了其他因素之外，打断P.chrysogenum基因Pc16g04690导致环状四肽c(VVFY)和c(VVFF)产生减少。

表5摇瓶发酵之后的环状四肽测量

与被保藏的微生物相关的说明

(PCT Rule 13bis)

Form PCT/RO/134(1992年7月)

Claims

1.通过微生物发酵生产感兴趣的化合物的方法，其包括：

a.提供丝状真菌宿主细胞，

b.在有助于表达所述感兴趣的化合物的条件下培养所述丝状真菌宿主细胞，

c.从培养基中分离所述感兴趣的化合物，

其中所述丝状真菌宿主细胞的基因组已经被修饰，使得所述丝状真菌宿主细胞的至少一种非核糖体肽合酶的产生出现缺失，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致四肽产生减少，其中所述丝状真菌宿主细胞的基因组的至少一条核酸序列的至少一个位置的已经被修饰，所述核酸序列编码为以下多肽的非核糖体肽合酶，其中所述多肽是选自根据SEQ ID NO:38的多肽或根据SEQ ID NO:34的多肽的多肽；和/或其中所述丝状真菌宿主细胞的基因组已经被修饰，使得从下述组中所选择的至少一种mRNA的量减少，所述组为根据SEQ ID NO:37的mRNA或根据SEQ ID NO:33的mRNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失是产生减少至少40％。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致环状四肽产生减少。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述四肽选自由下述组成的组：SEQ ID NO:5的环状VVFF或SEQ ID NO:6的环状VVFY。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述四肽产生减少至少20％。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌是Aspergillus、Acremonium、Thielavia、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌是Aspergillus niger、Aspergillusawamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Fusariumoxysporum、Trichoderma reesei、Acremonium alabamense、Myceliophthorathermophila、Thielavia terrestris或Penicillium chrysogenum的种。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞是Aspergillus niger。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞属于Aspergillus或Penicillium属。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述丝状真菌宿主细胞额外地在基因组中包含编码选自下述组的产物的多核苷酸的一个或多个修饰，所述组为葡糖淀粉酶glaA、酸稳定性α-淀粉酶amyA、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、草酸水解酶oahA、毒素和蛋白酶转录调节物prtT，使得所述宿主细胞缺失由包含所述修饰的多核苷酸编码的至少一种产物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述毒素为赭曲霉素和/或烟曲霉素。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的打断。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含hdfA基因打断。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞额外地包含适于整合编码感兴趣的化合物的多核苷酸的一个或多个拷贝的至少两个扩增子，其中所述至少两个扩增子的至少一个被改造，以较之其来源的所述扩增子，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好，并且其中所述经改造的扩增子来源的扩增子的基因转变率比所述至少两个扩增子的另一个高至少10％。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是A.niger宿主细胞，其包含两个或更多个扩增子，并且其中具有最高基因转化频率的所述扩增子已被改造，以较之其来源的所述扩增子，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述扩增子为ΔglaA扩增子。

17.根据权利要求1所述方法，其中所述宿主细胞额外地包含Sec61修饰，所述SEC 61修饰是其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变。

18.根据权利要求1所述方法，其中所述感兴趣的化合物是从由生物质、生物聚合物、代谢产物组成的组中选择的生物学化合物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述感兴趣的化合物是从核酸、多胺、多元醇、多肽或聚酰胺或多糖中选择的生物聚合物或是从初级代谢产物或次级代谢产物中选择的代谢产物。

20.丝状真菌宿主细胞，其基因组已经被修饰，使得所述细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致四肽产生减少，其中所述丝状真菌宿主细胞的基因组中的至少一条核酸序列的至少一个位置已经被修饰，所述核酸序列编码为选自下述组的多肽的非核糖体肽合酶，所述组为根据SEQ ID NO:38的多肽或根据SEQ ID NO:34的多肽；和/或其中所述丝状真菌宿主细胞的基因组已经被修饰，使得其导致从下述组中所选择的至少一种mRNA的量减少，所述组为根据SEQ ID NO:37的mRNA和根据SEQ ID NO:33的mRNA。

21.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中通过所述丝状真菌宿主细胞的所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失为产生减少至少40％。

22.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中至少一种非核糖体肽合酶产生的缺失导致环状四肽的产生减少。

23.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述四肽产生减少至少20％。

24.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其选自Aspergillus、Acremonium、Myceliophthora、Thielavia、Chrysosporium、Penicillium、Talaromyces、Fusarium或Trichoderma。

25.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其选自Aspergillus niger、Aspergillus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、Aspergillusfumigatus、Talaromyces emersonii、Aspergillus oryzae、Acremonium alabamense、Myceliophthora thermophila、Thielavia terrestris Chrysosporium lucknowense、Fusarium oxysporum、Trichoderma reesei或Penicillium chrysogenum种的丝状真菌。

26.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述丝状真菌属于Aspergillus或Penicillium属。

27.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其额外地在基因组中包含编码选自下述组的产物的多核苷酸的一个或多个修饰，所述组为葡糖淀粉酶glaA、酸稳定性α-淀粉酶amyA、中性α-淀粉酶amyBI和amyBII、草酸水解酶oahA、毒素和蛋白酶转录调节物prtT，使得所述宿主细胞缺失由包含所述修饰的多核苷酸编码的至少一种产物。

28.根据权利要求27所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述毒素为赭曲霉素和/或烟曲霉素。

29.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的打断。

30.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含hdfA基因的打断。

31.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含适于整合编码感兴趣的化合物的多核苷酸的一个或多个拷贝的至少两个扩增子，其中所述至少两个扩增子的至少一个被改造，以较之其来源的所述扩增子，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好，并且其中所述经改造的扩增子来源的扩增子的基因转变率比所述至少两个扩增子的另一个高至少10％。

32.根据权利要求31所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是包含两个或更多个扩增子的A.niger宿主细胞，并且其中具有最高基因转化频率的所述扩增子已被改造，以较之其来源的扩增子，对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好。

33.根据权利要求32所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述扩增子为ΔglaA扩增子。

34.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞额外地包含Sec61修饰，所述SEC 61修饰是其中丝氨酸376被色氨酸替代的S376W突变。

35.用于制备根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞的方法，所述方法包括亲本宿主细胞的基因组的修饰，使得所述宿主细胞导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失，其中所述至少一种非核糖体肽合酶的产生缺失导致四肽产生减少。

36.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述四肽为SEQ ID NO:5的环状VVFF或SEQ ID NO:6的环状VVFY。

37.根据权利要求20所述的丝状真菌宿主细胞，其中所述宿主细胞是Aspergillusniger。