CN105671027A - 在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法 - Google Patents

在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法 Download PDF

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CN105671027A CN201610051551.XA CN201610051551A CN105671027A CN 105671027 A CN105671027 A CN 105671027A CN 201610051551 A CN201610051551 A CN 201610051551A CN 105671027 A CN105671027 A CN 105671027A
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Abstract

本发明涉及在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法，具体地涉及在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因缺失、破坏或插入丝状真菌细胞基因的方法。

Description

在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法
本发明申请是基于申请日为2009年9月30日、申请号为“200980146945.1”(国际申请号为PCT/US2009/059107)、名称为“在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法”的发明专利申请的分案申请。
对序列表的提述
本申请含有计算机可读形式的序列表。通过提述将该计算机可读形式并入本文。
发明背景
发明领域
本发明涉及在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法。
相关技术描述
表达特定表型的选择性标记基因作为表达载体的一部分广泛应用于重组DNA技术以供鉴定和分离已引入基因的宿主细胞。选择性标记基因的产物可提供杀生物剂或病毒抗性，对重金属等的抗性，或可将原养性赋予营养缺陷型。阳性选择性基因用于鉴定和/或分离保留引入的基因的细胞，而阴性选择性基因提供消除保留引入基因的细胞的手段。
由阳性选择性基因赋予的表型(例如，对特定抗生素的抗性)，以及因此所述选择性标记基因在细胞/宿主中的存在，取决于所述细胞/宿主的最终用途，可为不合意的，例如，在商业生产株中的潮霉素B抗性基因。为此原因，双向选择性标记基因如构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶(amdS)基因，代表着有吸引力的替代方案。amdS基因是显性双向选择性标记，因为该基因在阳性和阴性方向都是显性的。amdS基因的优点在于其可方便地从宿主细胞利用显性阴性选择(dominantnegativeselection)加以缺失或消除(cure)，这可通过将细胞涂布于含氟代乙酰胺(fluoroacetamide)的生长培养基中来达成。氟代乙酰胺由携带amdS的细胞代谢为氟代乙酸，其对于细胞是有毒的。仅那些失去amdS基因的细胞可在阴性选择条件下生长。然而，使用amdS作为选择性标记的一个主要问题在于其相当广泛地遍布在真菌界中，且野生型宿主株中该基因任何活性内源拷贝必须在使用amdS基因作为选择性标记之前失活或缺失。可获得相对少的其它双向选择性标记基因(例如pyrG、sC、niaD和oliC)，但其遭受需要在其利用之前生成营养缺陷型突变体的不利之处，其可将未知的和不合意的突变引入宿主基因组，且这些系统可能无法在所有真菌中起作用。举例而言，一些镰孢属(Fusarium)菌株可代谢5-氟代乳清酸，使得pyrG作为双向选择性标记是无效的。因此，本领域中有对在丝状真菌中使用阳性和阴性表型的新方法的需要。
美国专利6,555,370号公开了双功能性选择性融合基因的用途。
本领域中还有对提供用于去除引入经遗传工程改造的丝状真菌的外源DNA例如选择性标记从而使得所述真菌仅含有最小痕量至不含(minimaltracetonone)用于生成重组株的DNA的不同方法的需要。任何提供此类DNA去除的技术在本领域中是有价值的。
本发明提供了在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法。
发明内容
本发明涉及在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和
(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分；
(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。
本发明还涉及用于将目标多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)目标第一多核苷酸；
(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和
(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组，以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；
(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞，以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第二和第三多核苷酸。
本发明还涉及此类核酸构建体和包含此类核酸构建体的载体和丝状真菌细胞。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.一种用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)第一多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(ii)第二多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iii)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和
(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失所述基因或其部分并用核酸构建体替代所述基因或其部分；
(b)通过施以阳性选择来选择并分离具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第一和第二多核苷酸。
2.项1的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
3.项1的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
4.项1-3任一项的方法，还包括(d)将编码目标多肽的多核苷酸引入步骤(c)的分离的细胞。
5.项1-4任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
6.项1的方法，其中整个基因完全缺失，不留下外源DNA。
7.一种用于缺失丝状真菌细胞基因组中的基因或其部分的核酸构建体，包含：
(i)第一多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(ii)第二多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iii)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和
(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；且所述第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失所述第一和第二多核苷酸。
8.项7的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
9.项7的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
10.项7-9任一项所述的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
11.一种重组丝状真菌细胞，包含项7-10任一项所述的核酸构建体。
12.一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)目标第一多核苷酸；
(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iv)第一重复序列，其位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和
(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；
(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组从而缺失第二和第三多核苷酸。
13.项12的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
14.项12的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
15.项12-14中任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
16.一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组中的核酸构建体，其包含：
(i)目标第一多核苷酸；
(ii)第二多核苷酸，其包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(iii)第三多核苷酸，其包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iv)第一重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，其位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而编码目标多肽的第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和
(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；而且所述第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。
17.项16的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
18.项16的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
19.项16-18任一项所述的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
20.一种重组丝状真菌细胞，包含项16-19任一项所述的核酸构建体。
21.一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照项1-6任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。
22.一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照项12-15任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。
23.一种分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，选自下组：(a)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中等严格条件下，更优选至少中等严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选地，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列。
24.项23的分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段组成。
25.一种分离的多核苷酸，其编码项23或24的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶。
26.一种产生项23或24的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的方法，包括：在有助于产生乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述构建体包含编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核苷酸序列。
附图简述
图1显示pJaL504-[BamHI]的限制图谱。
图2显示pJaL504-[BglII]的限制图谱。
图3显示pJaL574的限制图谱。
图4显示pWTY1449-02-01的限制图谱。
图5显示pEJG61的限制图谱。
图6显示pEmY21的限制图谱。
图7显示pDM156.2的限制图谱。
图8显示pEmY23的限制图谱。
图9显示pWTY1470-19-07的限制图谱。
图10显示pWTY1515-02-01的限制图谱。
图11显示pJfyS1540-75-5的限制图谱。
图12显示pJfyS1579-1-13的限制图谱。
图13显示pJfyS1579-8-6的限制图谱。
图14显示pJfyS1579-21-16的限制图谱。
图15显示pAlLo1492-24的限制图谱。
图16显示pJfyS1579-35-2的限制图谱。
图17显示pJfyS1579-41-11的限制图谱。
图18显示pJfyS1604-55-13的限制图谱。
图19显示pJfyS1579-93-1的限制图谱。
图20显示pJfyS1604-17-2的限制图谱。
图21显示pEJG69的限制图谱。
图22显示pEJG65的限制图谱。
图23显示pMStr19的限制图谱。
图24显示pEJG49的限制图谱。
图25显示pEmY15的限制图谱。
图26显示pEmY24的限制图谱。
图27显示pDM257的限制图谱。
图28显示pDM258的限制图谱。
图29显示镶片镰孢(Fusariumvenenatum)amyA缺失株的转化体的相对乳糖氧化酶产率。
图30显示镶片镰孢amyA缺失株的转化体的相对α-淀粉酶活性。
图31显示pJfyS1698-65-15的限制图谱。
图32显示pJfyS1698-72-10的限制图谱。
图33显示镶片镰孢alpA缺失株的转化体的相对碱性蛋白酶活性。
图34显示pJfyS1879-32-2的限制图谱。
图35显示pJfyS111的限制图谱。
图36显示pJfyS2010-13-5的限制图谱。
图37显示pJfyS120的限制图谱。
定义
选择性标记：本文中术语“选择性标记”定义为编码能够赋予抗生素抗性表型、提供自养型需求(用于显性阳性选择)或激活毒性代谢物(用于阴性选择)的蛋白质的基因。
显性阳性选择性标记：本文中术语“显性阳性选择性标记”定义为当转化入丝状真菌细胞之后表达允许阳性选择转化体的显性表型的基因。
显性阳性选择性表型：本文中术语“显性阳性选择性表型”定义为允许阳性选择转化体的表型。
阴性选择性标记：本文中术语“阴性选择性标记”定义为当转化入丝状真菌细胞之后表达允许阴性选择(即，消除)转化体的表型的基因。
阴性选择性表型：本文中术语“阴性选择性表型”定义为允许阴性选择(即，消除)转化体的表型。
基因：本文中术语“基因”定义为细胞基因组DNA的区，其控制分立的遗传特征，通常对应于单一蛋白质或RNA。术语“基因”涵盖了整个功能性单元，包括编码序列、非编码序列、内含子、启动子和编码改变表达的蛋白质的其它调节序列。
其部分：本文中术语“其部分”定义为基因整个功能性单元的组分，如开读框(ORF)、启动子、内含子序列和其它调节序列；或其部分。
位于第一和第二多核苷酸的5’或3’：本文中术语“位于第一和第二多核苷酸的5’”和位于第一和第二多核苷酸的3’”定义为优选距第一和第二多核苷酸1000至5000bp之内，更优选100至1000bp之内，甚至更优选10至100bp之内，最优选1至10bp之内，甚至最优选紧邻第一和第二多核苷酸。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。
位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’或3’：本文中术语“位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’”和位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’”定义为优选距组分(i)、(ii)和(iii)1000至5000bp之内，更优选100至1000bp之内，甚至更优选10至100bp之内，最优选1至10bp之内，甚至最优选紧邻组分(i)、(ii)和(iii)。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。
位于基因或其部分的5’或3’：本文中术语“位于基因或其部分的5’”和位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’”定义为优选距基因或其部分1000至5000bp之内，更优选100至1000bp之内，甚至更优选10至100bp之内，最优选1至10bp之内，甚至最优选紧邻基因或其部分。然而，其位置甚至可相距大于5000bp。
分离的多核苷酸：本文中术语“分离的多核苷酸”指从来源分离的多核苷酸。在一个优选的方面，如通过琼脂糖电泳测定的，所述多核苷酸为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多核苷酸：本文中术语“基本上纯的多核苷酸”指多核苷酸制备物，其不含其它外来的或不期望的核苷酸，并且处于适合于在遗传工程蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯，优选至少92％纯，更优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，甚至更优选至少98％纯，最优选至少99％，并且甚至最优选至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选为基本上纯的形式，即所述多核苷酸制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。
编码序列：当用于本文中，术语“编码序列”意指直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的核苷酸序列，或它们的任意组合。
cDNA：术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自mRNA的cDNA缺乏任何内含子序列。
核酸构建体：术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(nototherwiseexist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段或所述核酸分子是合成的。
调控序列(controlsequence)：术语“调控序列”在本文定义为包括表达编码多肽的多核苷酸必需的所有组分。每个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或每个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。此类调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的为引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。
可操作地连接：术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。
引入：本文中术语“引入”及其变型定义为将DNA转移入丝状真菌细胞。将DNA引入丝状真菌细胞可通过本领域任何已知方法(如转化)来达成。
转化：本文中术语“转化”定义为将分离的DNA引入丝状真菌细胞从而使得DNA作为染色体整合体或自主复制的染色体外载体而维持。
分离的多肽：术语“分离的多肽”用于本文中指从来源分离的多肽。在一个优选的方面，如通过SDS-PAGE测定的，所述多肽为至少1％纯，优选至少5％纯，更优选至少10％纯，更优选至少20％纯，更优选至少40％纯，更优选至少60％纯，甚至更优选至少80％纯，并且最优选至少90％纯。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10％，优选至多8％，更优选至多6％，更优选至多5％，更优选至多4％，更优选至多3％，甚至更优选至多2％，最优选至多1％，并且甚至最优选至多0.5％的与其天然或重组结合的(associated)其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计是至少92％纯，优选至少94％纯，更优选至少95％纯，更优选至少96％纯，更优选至少97％纯，更优选至少98％纯，甚至更优选至少99％纯，最优选至少99.5％纯，并且甚至最优选100％纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过如下实现：通过公知的重组方法或通过经典纯化方法制备多肽。
发明详述
本发明涉及在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括：(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞的基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞的基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞的基因的5’或3’，其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。
在一个方面，使整个基因完全缺失，不留下外源DNA。
本发明还涉及用于将目标多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括：(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。
本发明描述了双功能性阳性和阴性选择系统，其赋予任何丝状真菌能够干净地(clean)、最不显著地(minimallymarked)进行基因缺失或插入的能力。这是作为将转化DNA片段整合入基因组并由所述DNA片段上携带的侧翼DNA序列和对应的宿主基因组序列之间的双交换(doublecrossover)事件而导致基因缺失或基因插入的结果而达成的。内部重组发生在所述直接重复之间，导致间插序列的切出，其结果为缺失了宿主基因组中的靶基因，或插入了编码目标多肽的多核苷酸，或多核苷酸插入了基因而没有留下残余的DNA或仅留下单独的重复。
在一个方面，所述双重标记系统对于任何对潮霉素B敏感而对5-氟代脱氧尿苷有抗性的丝状真菌提供了通用系统(universalsystem)。本发明允许对潮霉素B敏感而对5-氟代脱氧尿苷有抗性的任何丝状真菌菌株充当为了下述目的而用携带双重阳性和阴性选择性盒的载体转化的候选物：(1)生成携带一个或多个(几个)干净的或最不显著的基因缺失的株或(2)将一个或多个(几个)基因引入丝状真菌细胞，而不在所述丝状真菌细胞中留下转化DNA或仅留下最少的转化DNA。
显性阳性和阴性选择性标记
在本发明的方法中，可使用任何显性阳性选择性标记。
在一个方面，所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(ptrA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶(dsdA)基因的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因的编码序列编码的。
所述阳性选择性标记可从任何可用的来源获得。例如，编码潮霉素B磷酸转移酶(EC2.7.1.119；UniProtKB/Swiss-ProtP09979)的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)可从吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)(Zalacain等,1986,NucleicAcidsResearch14:1565-1581)和大肠杆菌(E.coli)(Lino等,2007,ActaCrystallogr.Sect.FStruct.Biol.Cryst.Commun.63:685-688)获得。编码草胺膦N-乙酰转移酶(EC2.3.1.183；UniProtKB/Swiss-ProtP16426)的草胺膦乙酰转移酶基因(pat)可从吸水链霉菌(White等,1990,NucleicAcidsResearch18:1062；andThompson等,1987,EMBOJ.6:2519-2523)和绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)(Lutz等,2001,PlantPhysiol.125:1585-1590；和Strauch等,1988,Gene63:65-74)获得。由例如ble(UniProtKB/Swiss-ProtP13081)和bleO(UniProtKB/Swiss-ProtP67925)编码的博来霉素抗性蛋白质(BRP)可分别从肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)(Mazodier等,1985,NucleicAcidsResearch13:195-205)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)(Oskam等,1991,Plasmid26:30-39)获得。乙酰胺酶基因(amdS)(EC3.5.1.4；UniProtKB/Swiss-ProtP08158)可从构巢翘孢霉(Emericellanidulans)(构巢曲霉(Aspergillusnidulans))(Corrick等,1987,Gene53:63-71)、黑曲霉(Aspergillusniger)和产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)(EP758,020)获得。编码线粒体噻唑生物合成酶(UniProtKB/Swiss-ProtQ9UUZ9)的吡啶硫胺抗性基因(ptrA或thiA)可从米曲霉(Aspergillusoryzae)(Kubodera等,2000,Biosci.Biotechnol.Biochem.64:1416-1421)获得。编码嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶(NCBI登录号:CAB42570)的pac基因可从大肠杆菌(WO1998/11241)获得。乙酰CoA合酶基因(acuA/facA；EC6.2.1.1)可从黑曲霉(UniProtA2QK81)、构巢翘孢霉(构巢曲霉)(UniprotP16928)(Papadopoulou和Sealy-Lewis,1999,FEMSMicrobiologyLetters178:35-37；以及Sandeman和Hynes,1989,Mol.Gen.Genet.218:87-92)和布拉克胡须霉(Phycomycesblakesleeanus)(UniProtKB/Swiss-ProtQ01576)(Garre等,1994,Mol.Gen.Gen.244:278-286)获得。编码D-丝氨酸脱水酶(EC4.3.1.18；UniProtKB/Swiss-ProtA1ADP3)的dsdA基因可从大肠杆菌(Johnson等,2007,J.Bacteriol.189:3228-3236)获得。编码ATP硫解酶(NCBI登录号:AAN04497)的sC基因可从黑曲霉获得(Varadarajalu和Punekar,2005,Microbiol.Methods.61:219-224)。线粒体ATP合酶亚基9(oliC)基因(UniProtKB/Swiss-ProtP16000)可从构巢翘孢霉(构巢曲霉)(Ward和Turner,1986,Mol.Gen.Genet.205:331-338)。氨基糖苷磷酸转移酶3′(I和II)(aph(3′)I和II)基因(EC2.7.1.95；InterproIPR002575)可从环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)和灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)(分别见Sarwar和Akhtar,1991,Biochem.J.273:807；以及Trower和Clark,1990,N.A.R.18:4615)获得。
在本发明的方法中，可使用任何阴性选择性标记。
在一个方面，所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
在另一个方面，所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。在另一个方面，所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列所编码的。在另一个方面，所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列所编码的。
所述阴性选择性标记可为来自任何可用的来源。例如，胸苷激酶基因(tk)(EC2.7.1.21；UniProtKB/Swiss-ProtP03176)可从人单纯疱疹(Herpessimplex)病毒1获得(McKnight,1980,NucleicAcidsResearch8:5949-5964)。乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)(EC4.1.1.23；UniProtKB/Swiss-ProtP07817)可从黑曲霉获得(Wilson等,1988,N.A.R.16:2339)。胞嘧啶脱氨酶基因(codA)(EC3.5.4.1；UniProtKB/Swiss-ProtCODA_ECOLI)可从大肠杆菌(K12株)获得(Danielsen等,1992,MolecularMicrobiology6:1335-1344)。
在核酸构建体中，编码阳性和阴性选择性标记的多核苷酸可为相对于彼此的任何顺序，无论例如其是否命名为第一和第二多核苷酸或者第二或第三多核苷酸。此外，编码所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸可为相同的取向或为相反的取向。
在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(ptrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列编码的。
在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(ptrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)的编码序列编码的。
在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由草胺膦乙酰转移酶基因(pat)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble/bleO)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰胺酶基因(amdS)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由吡啶硫胺抗性基因(ptrA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由乙酰CoA合酶基因(acuA/facA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由ATP硫酰酶基因(sC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。在另一个方面，所述显性阳性选择性标记是由氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因的编码序列编码的，而所述阴性选择性标记是由胞嘧啶脱氨酶基因(codA)的编码序列编码的。
本发明还涉及选自下组的分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶：(a)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％相同，且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同的氨基酸序列；(b)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由在优选至少中等严格条件下，更优选至少中-高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交的多核苷酸编码；和(c)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一个优选的方面，所述乳清苷-5’-磷酸脱羧酶包含SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段组成。在另一个方面，所述乳清苷-5’-磷酸脱羧酶包含SEQIDNO:52或由SEQIDNO:52组成。
本发明还涉及选自下组的包含编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核苷酸序列的分离的多核苷酸：(a)多核苷酸，其包含编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核苷酸序列，所述乳清苷-5’-磷酸脱羧酶包含与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)多核苷酸，其编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，所述多核苷酸包含在优选至少中等严格条件下，更优选至少中高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下，且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:51或其全长互补链杂交的核苷酸序列；和(c)多核苷酸，其编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列。
在一个优选的方面，编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的多核苷酸包含SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列，或由SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列组成。在另一个优选的方面，编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的多核苷酸包含SEQIDNO:51或由SEQIDNO:51组成。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸在本领域是已知的，且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备或其组合。从此类基因组DNA克隆本发明的多核苷酸可例如通过使用公知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共同结构特征的克隆的DNA片段来实施。参见，例如Innis等,1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可使用其它核酸扩增方法如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。
SEQIDNO:51的核苷酸序列，或其亚序列；以及SEQIDNO:52的氨基酸序列，或其片段；可用于根据本领域公知的方法设计核酸探针以从不同属或种的株鉴定并克隆编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的DNA。具体而言，此类探针可用于遵循标准的Southern印迹方法与目标属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定并分离其中的对应基因。此类探针可明显短于完整序列，但其长度应为至少14，优选至少25，更优选至少35，且最优选至少70个核苷酸。然而，优选所述核酸探针长度为至少100个核苷酸。例如，所述核酸探针长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少500个核苷酸。甚至可使用更长的探针，例如长度优选为至少600个核苷酸，更优选至少700个核苷酸，甚至更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针两者均可使用。通常标记探针以供检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。本发明涵盖此类探针。
因此，可就与上述探针杂交并编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的DNA对从一个株制备的基因组DNA或cDNA文库进行筛选。来自此类其它株的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移至并固化于硝酸纤维素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其亚序列同源的克隆或DNA，载体材料优选用于Southern印迹。
就本发明而言，杂交表明核苷酸序列与对应于SEQIDNO:51或其亚序列的标记的核酸探针在非常低至非常高严格条件下杂交。在这些条件下与核酸探针杂交的分子可使用例如X射线片来检测。
在一个优选的方面，所述核酸探针是SEQIDNO:51。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQIDNO:52或其亚序列的多核苷酸序列。在另一个优选的方面，所述核酸探针是编码SEQIDNO:52的多核苷酸序列。
对于长度至少为100个核苷酸的探针，非常低至非常高严格条件定义为在42℃在5XSSPE，0.3％SDS，200μg/ml经剪切和变性的鲑精DNA中进行预杂交和杂交，且对于非常低和低严格条件，使用25％甲酰胺，对于中等和中等-高严格条件，使用35％甲酰胺，或者对于高或非常高严格条件，使用50％甲酰胺，根据标准Southern印迹方法进行最佳12至24小时。
对于长度至少为100个核苷酸的探针，使用2XSSC，0.2％SDS，优选在45℃(非常低严格度)，更优选在50℃(低严格度)，更优选在55℃(中等严格度)，更优选在60℃(中-高严格度)，甚至更优选在65℃(高严格度)，且最优选在70℃(非常高严格度)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。
本发明还涉及包含此种乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核酸构建体、重组表达载体和重组丝状真菌细胞。
本发明还涉及产生乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的方法，包括：在有助于产生乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的条件下，培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，所述宿主细胞是丝状真菌细胞。
重复序列
在本发明的在丝状真菌基因组中缺失基因的方法中，包含编码显性阳性选择性标记的第一多核苷酸和编码阴性选择性标记的第二多核苷酸的核酸构建体还包含位于第一和第二多核苷酸5’的第一重复序列和位于第一和第二多核苷酸3’的第二重复序列。
在本发明将目标多核苷酸引入丝状真菌基因组的方法中，包含目标第一多核苷酸、编码显性阳性选择性标记的第二多核苷酸和编码阴性选择性标记的第三多核苷酸的核酸构建体还包含位于第二和第三多核苷酸5’的第一重复序列和位于第二和第三多核苷酸3’的第二重复序列，其中所述目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’。
两种方法的重复序列均优选包含相同序列从而使得第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失编码所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸。
所述重复序列可为任何多核苷酸序列。在一个方面，所述重复序列为丝状真菌细胞天然的序列。在另一个方面，所述重复序列为对于所述丝状真菌细胞为外源(异源)的序列。所述重复序列可为非编码或编码的多核苷酸序列。在另一个方面，所述重复序列为丝状真菌细胞天然的多核苷酸序列。在另一个方面，所述重复序列与3’侧翼序列或5’侧翼序列相同以确保规则的(clean)基因缺失、破坏或插入。
为了增加发生分子内同源重组以缺失所述阳性和阴性选择性标记的多核苷酸的可能性，重复序列应含有足够数量的核酸，如优选20至10,000个碱基对，50至10,000个碱基对，100至10,000个碱基对，200至10,000个碱基对，更优选400至10,000个碱基对，and最优选800至10,000个碱基对。
侧翼序列
在本发明的在丝状真菌基因组中缺失目标基因的方法中，包含编码显性阳性选择性标记的第一多核苷酸、编码阴性选择性标记的第二多核苷酸、第一重复序列和第二重复序列的核酸构建体还包含位于上述多核苷酸5’的第一侧翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二侧翼序列。
为了缺失目标基因，第一侧翼序列与位于丝状真菌细胞基因5’端的第一区域相同，而第二侧翼序列与位于该基因3’端的第二区域相同。所述第一和第二侧翼序列分别与丝状真菌细胞基因组的所述第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失所述基因，并用所述核酸构建体替代所述基因。
在本发明的将目标多核苷酸引入丝状真菌基因组的方法中，包含目标多核苷酸，编码显性阳性选择性标记的第二多核苷酸，编码阴性选择性标记的第三多核苷酸，第一重复序列和第二重复序列的核酸构建体还包含位于上述多核苷酸5’的第一侧翼序列和位于上述多核苷酸3’的第二侧翼序列。
为了引入目标多核苷酸，第一侧翼序列与丝状真菌细胞基因组的第一区域相同，而第二侧翼序列与丝状真菌细胞基因组的第二区域相同。所述第一和第二侧翼序列分别与丝状真菌细胞基因组的所述第一和第二区域发生分子间同源重组以将包含目标多核苷酸的核酸构建体引入丝状真菌细胞的基因组。
在一个方面，第一区域位于丝状真菌细胞基因的5’，而第二区域位于丝状真菌细胞基因的3’。在另一个方面，第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的一个基因之内。在另一个方面，第一和第二区域之一位于丝状真菌细胞的一个基因之内而另一个位于该基因的5’或3’。
在另一个方面，所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
为了增加在准确位置整合的可能性，侧翼序列应优选含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，且最优选800至10,000个碱基对，足以确保同源重组。侧翼序列可为任何与丝状真菌细胞基因组中的靶序列相同的序列。此外，侧翼序列可为非编码或编码核苷酸序列。
多核苷酸
在本发明的方法中，目标多核苷酸可为任何DNA。所述DNA对于目标丝状真菌细胞可为天然的或异源的(外源的)。
所述多核苷酸可编码任何具有目标生物活性的多肽。所述多肽对于目标丝状真菌细胞可以是天然的或异源的(外源的)。术语“异源多肽”在本申请中定义为对于丝状真菌细胞不是天然的多肽；其中进行了结构性修饰例如缺失、取代和/或插入以改变天然多肽的天然多肽；或其表达作为通过重组DNA技术操纵编码多肽的DNA的结果而发生定量改变的天然多肽。多肽可为下述多肽和杂合多肽的天然存在的等位基因变体和工程变体。
术语“多肽”在本文并非指特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽和蛋白质。术语“多肽”还包括杂合多肽和融合多肽。多肽还可为多肽的天然存在的等位基因变体和工程变体。
在一个方面，所述多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、激素、免疫调节剂(immunodilator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。
在另一个方面，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在另一个方面，所述多肽是α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。
在另一个方面，所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。
在另一个方面，所述多肽是杂合多肽，其包含从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合，其中一种或多种对于所述丝状真菌细胞可为异源的。
在另一个方面，所述多肽是融合多肽，其中另一个多肽融合于所述多肽或其片段的N-端或C-端。融合多肽是通过将编码一种多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于编码另一种多肽的核苷酸序列(或其部分)而产生的。用于产生融合多肽的技术在本领域中是已知的，且包括将编码多肽的编码序列连接从而使得其在框内(inframe)，且融合多肽的表达是在相同的启动子和终止子的控制之下。
编码目标多肽的多核苷酸可以获得自任何原核、真核或其它来源。就本发明而言，用于本申请与给定的来源有关的术语“获得自”，应表示所述多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。
用于分离或克隆编码目标多肽的多核苷酸的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用公知的聚合酶链式反应(PCR)实现从这种基因组DNA克隆目标多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。所述克隆方法可涉及切出和分离包含编码所述多肽的核酸序列的所需核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入突变体真菌细胞，其中所述核酸序列的多个拷贝或克隆会被复制。所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。
编码目标多肽的多核苷酸可以多种方式操纵以提供所述多核苷酸在合适的丝状真菌细胞中的表达。构建编码目标多肽的DNA的重组表达载体和核酸构建体可如本文中所述加以实施。
多核苷酸还可为用于操纵目标基因表达的调控序列，例如启动子。调控序列的非限定性实例如本文所述。
所述多核苷酸还可为任何可用于破坏丝状真菌基因组中基因的核酸分子。所述多核苷酸可为编码或非编码的多核苷酸。所述多核苷酸可编码除了之前公开的那些之外的另一种选择性标记。所述多核苷酸可编码多肽如上述那些。所述多核苷酸可简单地为其长度足够破坏基因的任何核酸分子。
多核苷酸的范围并不受上面公开的具体实例的限制，因为这些实例意欲作为本发明的几个方面的说明。
核酸构建体
本发明还涉及用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的核酸构建体，包含(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’，其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分或用核酸构建体替代基因或其部分。
本发明还涉及用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的核酸构建体，包含：(i)目标第一多核苷酸；(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而且目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；且第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失所述第二和第三多核苷酸。
编码目标多肽、显性阳性选择性标记或阴性选择性标记的分离的多核苷酸可以以多种方式操纵以供其表达。在将其插入载体之前操纵此种多核苷酸序列取决于表达载体可为合意的或必需的。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术在本领域中是公知的。
所述调控序列可为任何适当的启动子序列，其为由丝状真菌细胞识别用于表达编码目标多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述启动子序列含有介导多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的丝状真菌细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码对于该丝状真菌细胞是同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于在丝状真菌细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢amyA、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其为由丝状真菌细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码多肽的核酸序列的3’末端可操作地连接。在所选的丝状真菌细胞中有功能的任何终止子可用于本发明。
对于丝状真菌细胞优选的终止子从以下各项的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于丝状真菌细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’末端。可以将在所选丝状真菌细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。
对于丝状真菌细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。
调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其为与核苷酸序列的3’末端可操作地连接的序列，并且当其转录时，丝状真菌细胞将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。在所选丝状真菌宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本发明。
对于丝状真菌细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。
调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的信号肽序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者，编码序列5’端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码序列。外源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选丝状真菌细胞的分泌途径(即分泌入培养基)的任何信号肽编码序列可用于本发明。
对于丝状真菌细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。
调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。前肽编码序列可从如下酶的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO95/33836)的基因获得。
当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着(nextto)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其使得能够相对于丝状真菌细胞的生长来调节多肽表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组表达载体。所述重组表达载体可为任何可方便地对其进行重组DNA方法并可导致多核苷酸序列表达的质粒。载体的选择通常取决于载体与待引入的丝状真菌细胞之间的相容性。载体优选为直链的，从而使得第一和第二侧翼序列与丝状真菌细胞的第一和第二区域发生有效的分子间同源重组。
用于构建本发明的重组表达载体的方法对于本领域技术人员是公知的(参见，例如Sambrook等,1989,见上)。
丝状真菌细胞
本发明还涉及包含本发明核酸构建体的重组丝状真菌细胞。
在本发明的方法中，所述丝状真菌细胞可为任何丝状真菌细胞。术语“丝状真菌细胞”涵盖任何由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的后代。
“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门(如由Hawksworth等,于AinsworthandBisby’sDictionaryoftheFungi,第8版,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。
在一个方面，所述丝状真菌细胞是枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
在一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)或米曲霉(Aspergillusoryzae)细胞。在另一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)或镶片镰孢(Fusariumvenenatum)细胞。在另一个更优选的方面，所述丝状真菌细胞是黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、干拟蜡菌、Ceriporiopsiscaregiea、Ceriporiopsisgilvescens、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiuminops、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningji)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。
在一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢NRRL30747。在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是镶片镰孢ATCC20334。
在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是黑曲霉细胞。
在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是米曲霉细胞。
在另一个最优选的方面，所述丝状真菌细胞是里氏木霉细胞。
丝状真菌可通过本身已知的方式以涉及原生质体形成、原生质体转化和再生细胞壁的方法来进行转化。转化曲霉属和木霉属细胞的合适方法描述于EP238023和Yelton等,1984,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA81:1470-1474。转化镰孢属菌种的合适方法如Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787所述。
产生方法
本发明还涉及产生目标多肽的方法，包括：(a)在有助于所述多肽形成的条件下培养如本文中所述获得的丝状真菌细胞；和(b)回收多肽。
在本发明的产生方法中，将细胞在适于产生多肽的营养培养基中使用本领域公知方法来培养。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在包含碳源和氮源和无机盐的合适营养培养基中进行培养。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公布的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌至营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌至培养基中，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzymeassay)可用于确定所述多肽的活性。
所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden编,VCHPublishers,NewYork,1989)。
本发明进一步由下述实施例来描述，其不应视为限制本发明的保护范围。
实施例
材料
用作缓冲剂和底物的化学物为至少试剂级的商业产品。所有的引物和寡核苷酸由MWGBiotech,Inc.,HighPoint,NC,USA提供。
真菌菌株
镶片镰孢株WTY842-1-11描述于美国专利7368271号。镶片镰孢株EmY1154-46-4.3是镶片镰孢株WTY842-1-11的Δtri5、amdS+、ΔpyrG衍生物。镶片镰孢株WTY1449-03-03是镶片镰孢株WTY842-1-11的Δtri5、amdS+、bar+、tk+转化体。镶片镰孢株WTY1449-09-01是镶片镰孢株WTY1449-03-03的Δtri5、amdS+、bar+、tk-消除的衍生物。镰孢属株A3/5，现在重新分类为镶片镰孢(Yoder和Christianson,1998,FungalGeneticsandBiology23:62-80；O'Donnell等,1998,FungalGeneticsandBiology23:57-67)从Dr.AnthonyTrinci,UniversityofManchester,Manchester,England获得。该株的保藏可从美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA,USA)以镰孢属株ATCC20334或AgriculturalResearchServicePatentCultureCollection(农业研究机构专利培养物保藏中心)(NRRL),NorthernRegionalResearchCenter(北区研究中心),Peoria,IL,USA作为镰孢属株NRRL30747获得。里氏木霉RutC30如Montenecourt和Eveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301所述。
培养基和溶液
LB板由每升10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaCl和15g的细菌用琼脂组成。
NZY顶层琼脂由每升5g的NaCl、5g的酵母提取物、10g的NZ胺、2g的MgSO4和7g的琼脂糖组成。
M400培养基由每升50g的麦芽糊精、2g的MgSO4·7H2O、2g的KH2PO4、4g的柠檬酸、8g的酵母提取物、2g的尿素、0.5g的CaCl2和0.5ml的AMG痕量金属溶液，pH6.0组成。
AMG痕量金属溶液由每升14.3g的ZnSO4·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、0.5g的NiCl2、13.8g的FeSO4、8.5g的MnSO4和3.0g的柠檬酸组成。
2XYT培养基由每升16g的胰蛋白胨、10g的酵母提取物、5g的NaCl和5g的细菌用琼脂组成。
YP培养基由每升10g的酵母提取物和20g的细菌用蛋白胨组成。
YPG2％培养基由每升10g的酵母提取物、20g的细菌用蛋白胨和20g的葡萄糖组成。
YPG5％培养基由每升10g的酵母提取物、20g的细菌用蛋白胨和50g的葡萄糖组成。
RA培养基由每升50g的琥珀酸、12.1g的NaNO3、1g的葡萄糖和20ml的50XVogels盐溶液(无C、无NaNO3)组成。
RA+尿苷培养基由每升50g的琥珀酸、12.1g的NaNO3、1g的葡萄糖和20ml的50XVogels盐溶液(无C、无NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，将过滤灭菌的尿苷添加至终浓度为10mM。
RA+BASTATM培养基由每升50g的琥珀酸、12.1g的NaNO3、1g的葡萄糖和20ml的50XVogels盐溶液(无C、无NaNO3)组成。在RA培养基的过滤灭菌之后，使用250mg/ml的工作储液将过滤灭菌的BASTATM(草铵膦(glufosinate)，HoechstScheringAgrEvo,Frankfurt,Germany)添加至终浓度为6mg/ml。
50XVogels盐溶液(无C、无NaNO3)由每升250g的KH2PO4、10g的MgSO4·7H2O、5g的CaCl2 .2H2O、2.5ml的生物素溶液和5ml的Vogels痕量元素溶液组成。
生物素储液由100ml50％乙醇中的5mg生物素组成。
Vogels痕量元素溶液由每100ml5g的柠檬酸、5g的ZnSO4·7H2O、1g的Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、0.25g的CuSO4·5H2O、0.05g的MnSO4·H2O、0.05g的H3BO3和0.05g的Na2MoO4·2H2O组成。
PDA板由每升39g的PotatoDextroseAgar(马铃薯右旋糖琼脂)(BDBiosciences、SanJose、CA、USA)组成。
PDA+1M蔗糖板由每升39g的马铃薯右旋糖琼脂(BDBiosciences、SanJose、CA、USA)和342g的蔗糖组成。
VNO3RLMT板由每升20ml的50XVogels盐溶液(25mMNaNO3)、273.33g的蔗糖和15g的LMT琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO，USA)组成。
50XVogels盐溶液(25mMNaNO3)由每升125g的柠檬酸钠、250g的KH2PO4、106.25g的NaNO3、10g的MgSO4·7H2O、5g的CaCl2 .2H2O、2.5ml的生物素储液和5ml的Vogels痕量元素溶液组成。
VNO3RLMT-BASTATM板由每升20ml的50XVogels盐溶液(25mMNaNO3)、273.33g的蔗糖和15g的LMT琼脂糖组成。在高压灭菌和冷却之后，添加BASTATM至终浓度为6mg/ml。
COVE盐溶液由每升26gKCl、26gMgSO47H2O、76gKH2PO4、50mlCOVE痕量元素组成。
COVE痕量元素溶液由每升0.004g的Na2B4O710H2O、0.4g的CuSO45H2O、1.2g的FeSO47H2O、0.7g的MnSO4H2O、0.8gNa2MoO22H2O、10g的ZnSO47H2O组成。
TrMM培养基由20ml的COVE盐溶液、0.6g的CaCl2、6g的(NH4)2SO4、30g的蔗糖和25gAgarNoble组成。
TrMM-G由20ml的COVE盐溶液、0.6g的CaCl2、6g的(NH4)2SO4、25g的AgarNoble组成，高压灭菌、冷却并添加40ml的50％葡萄糖。
STC由0.8M山梨醇、2.5mMTrispH8和5mMCaCl2组成。
TrSTC由1M山梨醇、10mMTrispH8和10mMCaCl2组成。
PEG由50％PEG4000、10mMTrispH7.5和10mMCaCl2组成。
STC由0.8M山梨醇、25或50mMTrispH8和50mMCaCl2组成。
SPTC由40％聚乙二醇4000、0.8M山梨醇、25或50mMTrispH8和50mMCaCl2组成。
SY50培养基(pH6.0)由每升50g的蔗糖、2.0g的MgSO4·7H2O、10g的KH2PO4、2.0g的K2SO4、2.0g的柠檬酸、10g的酵母提取物、2.0g的尿素、0.5g的CaCl2·2H2O和5ml的200XAMG痕量金属溶液(不含镍)组成。
200XAMG痕量金属溶液(不含镍)由每升3.0g的柠檬酸、14.3g的ZnSO4·7H2O、2.5g的CuSO4·5H2O、13.8g的FeSO4·7H2O和8.5g的MnSO4·H2O组成。
20XSSC由0.3M柠檬酸钠pH7和3M氯化钠组成。
DNA测序
DNA测序是用ABI3700DNAAnalyzer(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA,USA)进行的。
实施例1：镶片镰孢WTY842-1-11对5-氟代脱氧尿苷(FdU)的敏感性测试
为了使胸苷激酶(tk)能够用作阴性选择性标记，真菌必需对相当高浓度的核苷类似物5-氟代脱氧尿苷(FdU)不敏感。为了确定镶片镰孢WTY842-1-11对FdU的敏感程度，通过将取自在-140℃储藏的10％甘油储备的菌株的集落琼脂糖栓(colonizedagarplug)铺于VNO3RLMT板并在ChexAllInstantSealSterilizationPouch(FisherScientific,Pittsburgh,PA,USA)中在26-28℃培育7日来制备镶片镰孢WTY842-1-11的一周龄培养物。在7日之后，从一周龄培养物将栓靠近边缘切出(cutsub-marginally)，并朝下置于6孔板中补充了不同浓度的FdU(0至500μM)(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)的VNO3RLMT培养基上。将板在打开的袋(S.C.JohnsonHomeStorage,Inc.,Racine,WI,USA)中在26-28℃温育14日，之后记录在每个FdU浓度的生长程度。
发现镶片镰孢WTY842-1-11对所有测试的FdU浓度均不敏感，尽管当浓度超过100μM时，与50μM以下的浓度相比生长略微减少。
实施例2：构建质粒pJaL574
质粒pDV8(美国专利6,806,062号)携带单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK；tk)基因(DNA序列为SEQIDNO:37而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:38)，其为插入构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpdA)启动子的1.0kbXhoI/BglII片段和携带三功能性构巢曲霉吲哚甘油磷酸酯合酶、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶和谷氨酰胺氨基转移酶(trpC)转录终止子的1.8kbBamHI/HindIII片段之间的1.2kbBglII/BamHI片段。将质粒pDV8用BamHI消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)填充(fillin)。将消化的质粒使用QUICKLIGATIONTMKit(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的实验方案重新连接，用GelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)处理，并将所得的连接产物使用BluntCloningKit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)依照生产商的指示克隆入(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。将克隆反应物根据生产商的指示转化入ONE化学感受态TOP10细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。使用9600(QIAGENInc,Valencia,CA,USA)从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用XhoI/BamHI和XhoI/HindIII限制消化来筛选。来自两个具有正确限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证了两者均携带所需序列。一个命名为pJaL504-[BamHI](图1)。
将质粒pJaL504-[BamHI]用BglII消化，用酚-氯仿提取，用乙醇沉淀，然后使用Klenow聚合酶填充。将消化的质粒依照生产商的实验方案使用QUICKLIGATIONTMKit重新连接，用ReactionCleanupKit处理，然后将所得的连接物使用BluntCloningKit依照生产商的指示克隆入将克隆反应物依照生产商的指示转化入ONE化学感受态TOP10细胞。使用9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用XhoI/BglII和XhoI/HindIII的限制消化筛选。来自两个具有正确地限制性消化样式的转化体的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为pJaL504-[BglII](图2)。Punt等(1990,Gene3:101-109)之前显示可缺失构巢曲霉gpdA启动子的364bp而不影响该启动子的强度。基于这些作者的观察，设计如下所示的引物#172450以截短构巢曲霉gpdA启动子并减少载体的大小。
引物172450：
5’-GACGAATTCTCTAGAAGATCTCTCGAGGAGCTCAAGCTTCTGTACAGTGACCGGTGACTC-3’(SEQIDNO:1)
下划线序列对应于gpdA启动子序列。剩余序列是携带下述限制性位点的手柄(handle)：EcoRI、XbaI、BglII、XhoI和HindIII。
为了截短构巢曲霉trpC终止子(同样为了减少载体大小)，设计了携带EcoRI手柄的如下所示的引物#172499。
引物172499：
5’-GACGAATTCCGATGAATGTGTGTCCTG-3’(SEQIDNO:2)
下划线序列对应于trpC终止子序列。使用引物172499和172450的扩增将启动子截短了364bp而将trpC终止子序列截短了239bp。
PCR用上述两个引物使用pJaL504-[BglII]作为模板实施以生成由构巢曲霉gpdA启动子的截短形式、HSV1-TK基因的编码序列和构巢曲霉trpC终止子的截短形式组成的2.522kb片段。
扩增反应物由5μl10XBuffer(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)、0.4μl25mMdNTPs、1.25μl引物172450(100ng/μl)、1.25μl引物172499(100ng/μl)、0.5μlpJaL504-[BglII](100ng/μl)、2μlPfuDNA聚合酶(PromegaCorporation,Madison,WI,USA)(2.5U/μl)和39.6μl灭菌蒸馏水组成。将扩增反应物在(Stratagene,LaJolla,CA,USA)中温育，其程序为在95℃进行1个循环45秒，然后进行28个循环，每个在95℃进行45秒，57℃进行45秒和72℃进行5分钟。在72℃进行10分钟的最终延伸。
对扩增反应物使用低熔点琼脂糖凝胶在50mMTris-50mM硼酸-1mMEDTA二钠(TBE)缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳。从凝胶切出2522bp片段，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)提取。然后将凝胶纯化的DNA使用BluntCloningKit依照生产商的指示插入将克隆反应物根据生产商的指示转化入ONE化学感受态TOP10细胞。使用9600从八个所得的转化体提取质粒DNA，并通过使用EcoRI和BglII的限制消化筛选。来自两个具有正确限制消化样式的质粒DNA的DNA测序确证两者均携带所需序列。一个命名为pJaL574(图3)。
实施例3：构建质粒pWTY1449-02-01
将质粒pJaL574依照生产商推荐的试验方案转化入感受态大肠杆菌SCS110细胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。使用9600从二十四个所得的转化体提取质粒DNA，然后使用EcoRI和BglII对其进行分析性消化。之后的DNA序列分析导致了具有正确序列的克隆的鉴定，其命名为pWTY1449-02-01(图4)。
实施例4：构建质粒pEJG61
将质粒pEJG61(图5)如美国专利7368271所述进行构建，只是倒转了bar盒的取向(即，核苷酸5901-5210编码amdS启动子，核苷酸5209-4661编码bar编码序列，而核苷酸4660-4110编码黑曲霉葡糖淀粉酶(AMG)终止子)。
实施例5：镶片镰孢WTY842-01-11的孢子和原生质体的生成
为了生成镶片镰孢WTY842-01-11的孢子，将如实施例1中所述的16个来自新鲜琼脂糖培养(大约一周龄)的琼脂栓(大约1cmx1cm)接种入2.8LFernbach瓶中的500mlRA培养基，并在26.5℃以150rpm振荡温育24小时，然后在28.5℃再温育12小时。然后将培养物经过灭菌塑料漏斗中的灭菌MIRACLOTHTM(CalBiochem,SanDiego,CA,USA)经过0.45μM过滤器过滤入1升过滤单元的基部(base)。将在过滤器上收集的孢子用500ml灭菌蒸馏水洗涤，然后重悬于10ml灭菌蒸馏水中，并使用血细胞计数器计数。将浓度调整至2x108/ml。
将新鲜生成的孢子用于接种500ml带挡板的摇瓶，每个含有100mlYPG5％培养基，以1ml新鲜孢子(2x108/ml)接种。将摇瓶在23.5℃以150rpm振荡温育15小时，此时种系物(germline)大约长为3-5个孢子长度。将在1MMgSO4中过滤灭菌的二十ml的每ml5mg的NOVOZYMETM234(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)等分入八个灭菌的50ml管。然后将种系物经过灭菌漏斗中的灭菌MIRACLOTHTM过滤，并用100ml灭菌蒸馏水继以100ml灭菌1MMgSO4润洗。使用灭菌刮铲将经润洗的种系物轻柔地刮入含有在1MMgSO4中的NOVOZYMETM234的管中，并轻柔地混合。将管横置楔入夹子中在29℃以90rpm振荡温育多至1小时。将三十ml的1M山梨醇添加至每个管，并将管在室温(大约24-28℃)以377xg在SorvallRT6000B浮筒式离心机(Thermo-FischerScientific,Waltham,MA,USA)中离心10分钟。在倾去上清之后，将沉淀轻柔地重悬于1ml1M山梨醇中。然后添加三十ml的1M山梨醇，并将试管轻柔地颠倒若干次。将其在室温以377xg离心5分钟，并将沉淀轻柔地重悬于1ml1M山梨醇。在轻柔地颠倒试管若干次之后，添加30ml1M山梨醇，并将试管轻柔地混合。在此时点从每个试管移出100μl的等分试样，并添加至含有900μlSTC的管以供计算原生质体浓度。将剩余的悬液在室温(大约24-28℃)以377xg离心5分钟。去除上清，并将沉淀重悬于STC:SPTC:DMSO(9:1:0.1)从而使得原生质体的终浓度为每ml5x107。立即将原生质体用于共转化。
实施例6：将pEJG61和pWTY1449-01-02共转化入镶片镰孢WTY842-01-11
将两ml新鲜生成的镶片镰孢WTY842-01-11原生质体(5x107/ml)与体积80μl中的环状pEJG61和pWTY1449-02-01各50μg(每种40μl)一同添加至50ml灭菌的离心管。将原生质体和DNA轻柔地混合，然后在冰上温育30分钟。缓慢添加一百μlSPTC并轻柔地混合。将试管在室温(26℃)温育10分钟。缓慢添加八ml的SPTC并通过轻柔地涡旋混合。然后将试管在室温(26℃)温育10分钟。然后将反应物分至十个灭菌的50ml管(1ml/管)。然后将三十五ml的VNO3RLMT培养基(顶层琼脂糖)逐次添加至一个管，并通过轻柔地颠倒三次来混合。然后将每个试管的内容物倾至含有35ml补充以每ml12mg的BASTATM的VNO3RLMT培养基的预倾板之上。将板储藏于ChexAllInstantSealSterilizationPouches3-4日，然后转移至塑料袋中再储藏7-8日。将板上产生的菌落亚培养于VNO3RLMT-BASTATM板。推定的转化体命名为镶片镰孢WTY1449-03-01至29。
实施例7：BASTATM抗性转化体的表型分析
将镶片镰孢转化体WTY1449-03-01至29在另外三个培养基上筛选：(1)补充以不同浓度的FdU(0–500μM)的VNO3RLMT培养基；(2)VNO3RLMT-BASTATM和(3)VNO3RLMT-BASTATM-FdU(后者补充以0至500μM的FdU)。将板在开放的塑料袋中在环境温度(26℃)温育多至15日。推定的转化体的百分之四十是共转化体(表型上)，即能够在VNO3RLMT-BASTATM上生长，但不能在补充了不同浓度的FdU的VNO3RLMT培养基或补充了不同浓度的FdU的VNO3RLMT-BASTATM培养基上生长。
实施例8：推定的bar+,tk+共转化体的基因型分析
对于五个表型为bar+,tk+的共转化体(实施例7)，将四个小栓从生长于VNO3RLMT+BASTATM培养基上的7日龄培养物(描述于实施例1)切出，并接种入含有25mlM400培养基的带挡板的125ml摇瓶中以生成用于DNA提取的生物质。将摇瓶在28℃以150rpm振荡温育4日。然后通过灭菌的MIRACLOTHTM收获生物质。将生物质用200ml灭菌蒸馏水彻底润洗，使用戴手套的手挤压，并使用干净的长镊子浸于液氮中。将冰冻的生物质立即加工或在-80℃在灭菌的50ml塑料管中暂时储存。在杵和研钵中磨碎生物质之后，使用PlantMaxiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照生产商的指示只是将起始裂解温育(由生产商建议的10分钟)延长至90分钟来提取基因组DNA。DNA使用ND-1000Spectrophotometer(ThermoScientific,Wilmington,DE,USA)定量。然后将含有8μgDNA的来自每个储备的等分试样使用Concentrator(Thermo-ElectronCorp.,Waltham,MA,USA)浓缩至干燥，其后将60μl10mMTrispH8.0添加至每个样品并混合。
将来自每个菌株的八微克DNA用EcoRI消化，对选定菌株还用BamHI消化。EcoRI反应物由1XEcoRI缓冲液，8μgDNA，65单位EcoRI，并用灭菌水调至终体积100μl组成。在37℃温育10小时之后，添加上样缓冲液(40％蔗糖，5mMEDTA，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯蓝)，并将样品上样至四个1％琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中在60伏运行5小时。BamHI限制性消化物由1XNEB缓冲液3(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，8μgDNA，65单位BamHI，每ml100μg牛血清白蛋白并用灭菌水调至终体积100μl组成。在37℃温育10小时之后，添加上样缓冲液，并将样品上样至1％琼脂糖凝胶上，然后在60伏在TBE缓冲液中运行5小时。
在溴化乙锭染色并脱色之后，从凝胶使用HYBONDTMN尼龙膜(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)如下制备Southern印迹。脱嘌呤是在0.25NHCl中在26℃轻柔振荡10分钟继以在26℃在灭菌蒸馏水中进行5分钟洗涤来进行的。在洗涤之后，进行两个变性反应：使用0.5NNaOH/1.5MNaCl轻柔振荡反应15分钟(第一反应)和20分钟(第二反应)。之后进行另一次洗涤：在灭菌水中在24-26℃轻柔振荡洗涤2分钟。最终洗涤之后进行两次中和反应，分别在24-26℃使用1.5MNaCl，0.5MTrispH7.5和0.001MEDTA轻柔振荡反应30分钟。然后将膜使用TURBOBLOTTERTMKit(Schleicher&Schuell,Keene,NH,USA)在24-26℃在10XSSC中印迹过夜。将膜在24-26℃在2XSSC中振荡洗涤5分钟。然后将膜在24-26℃空气干燥10分钟，使用STRATALINKERTM(Stratagene,LaJolla,CA,USA)(用自动设定，其生成120mJ/cm2的总剂量)的UV交联，并最终在真空烤箱中在80℃烘烤1小时。
如下所示的用于产生bar-和tk基因特异性探针的引物是使用Vector软件(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)设计的。
bar基因正向引物#996023：
5’-CGAGTGTAAACTGGGAGTTG-3’(SEQIDNO:3)
bar基因反向引物#996024：
5’-GAGCAAGCCCAGATGAGAAC-3’(SEQIDNO:4)
tk基因正向引物#998744：
5’-GGCGATTGGTCGTAATCCAG-3’(SEQIDNO:5)
tk基因反向引物#998745：
5’-TCTTCGACCGCCATCCCATC-3”(SEQIDNO:6)
将bar和tk基因的DIG标记的探针使用PCRDIGProbeSynthesisKit依照生产商的实验方案(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)生成。在循环之后，将反应物置于冰上，在微离心机中短暂离心，然后上样于1％琼脂糖凝胶。在TBE缓冲液中电泳之后，将预计大小的条带切出，并使用GelExtractionKit凝胶纯化。
将滤纸在35mlDIGEasyHyb(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)中在玻璃管中在42℃预杂交3小时，之后去除DIGEasyHyb，并用7.5ml新鲜DIGEasyHyb加上10μl标记的探针替代，将其煮沸5分钟然后置于冰上(即，使用了得自PCR反应的凝胶纯化的DNA的大约30％)。在杂交炉中在42℃实施12小时杂交。在室温在2XSSC，0.1％SDS中实施两次5分钟的杂交后洗涤，然后在65℃在0.2XSSC，0.1％SDS中两次15分钟洗涤。后续的洗涤和检测是使用DIGWash和BlockSet、Anti-Digoxigenin-APFabFragmentsCDP-StarChemi-luminescent底物(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的推荐进行的。通过表型(实施例7)和Southern(此实施例)分析确证为真正的bar+,tk+共转化体的一个镶片镰孢菌株命名为镶片镰孢WTY1449-03-03。
实施例9：从镶片镰孢bar+,tk+共转化体消除tk基因
如实施例5中所述，在RA+BASTATM培养基中诱导镶片镰孢菌株WTY1449-03-03的孢子形成。然后对所述孢子就其在补充FdU的培养基上的生长(其应诱导tk基因的丧失)进行筛选。通过用四个切自该株的新鲜培养物的栓接种25mlRA培养基，获得了1.06x108个孢子。使用该孢子储备以制备一系列稀释物以供铺板于15mm直径补充FdU的VNO3RLMT板和未补充的VNO3RLMT板(后者用于存活率估计)。将孢子(100至1x107个)铺于重复的板上，并在大约26℃在ChexAllInstantSealSterilizationPouch中温育5日。
对五个选定的菌落进行了Southern分析(使用实施例8中所述的bar和tk探针)，当使用实施例7中所述的方法将所述菌落亚培养于25μMFdU中时其能够生长。其结果解释了所有五个单一孢子分离物均消除了tk基因。一个菌株命名为镶片镰孢WTY1449-09-01。
实施例10：确证尿苷的补充抵消了tk携带转化体的FdU敏感表型
为了优化用于pyrG-缺失菌株(其需要尿苷补充以供存活)的基因缺失系统，确定对生长培养基补充尿苷是否干扰tk+株的FdU敏感性的机理是重要的。
为此，使bar+,tk+株镶片镰孢WTY1449-03-03在VNO3RLMT-BASTATM板(如实施例1中所述)上再生，并如实施例5中所述诱导产生孢子。在收获和洗涤之后，将孢子铺板(每14cm直径板50,000个孢子)于含有50μMFdU和不同浓度的尿苷(0.1-1mM)的补充了FdU的VNO3RLMT板。将这些板在28℃在ChexAllInstantSealSterilizationPouch中温育6日，之后就生长对其进行评价。
尽管未在无尿苷的补充了FdU的VNO3RLMT板上观察到生长，但在补充了所有浓度(0.1-1mM)的尿苷和FdU的VNO3RLMT上均发生了tk+株的大量生长。该情况使得在含有FdU的培养基上分辨tk-株与tk+株变得困难或不可能。其结果，必需优化尿苷和FdU浓度以确定是否存在会使得tk+和tk-株在补充了FdU和尿苷的培养基上能够分辨的任何组合(实施例15和16)。
实施例11：pEmY21的生成
从质粒pPHTI(Cummings等,1999,CurrentGenetics36:371-382)使用下述引物扩增大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因(DNA序列为SEQIDNO:7而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:8)。
正向引物：
5’-GGGttcgaaTTCATTTAAACGGCT-3’(SEQIDNO:9)
反向引物：
5’-GGGagcgctCAATATTCATCTCTC-3’(SEQIDNO:10)
将由下划线序列表示的限制性位点BstBI(正向引物)和Eco47III(反向引物)工程引入所述引物以供克隆。
(用于扩增hpt基因)的PCR反应物由1XThermoPolBuffer(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)，200μMdNTPs，50pmol正向和反向引物，100pgpPHT1，1单位DNA聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MAUSA)并用灭菌蒸馏水调至总体积100μl组成。该扩增反应使用实施，其程序为在95℃进行1个循环2分钟，25个循环，每个在95℃进行1分钟，51℃进行1分钟和72℃进行2分钟，并在72℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物在40mMTris碱-20mM乙酸钠-1mMEDTA二钠(TAE)缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离。将1.8kb片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit提取琼脂糖。然后将凝胶纯化的片段使用BluntCloningKit克隆入-BluntII-(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。所得的质粒命名为pEmY10。
使用Site-DirectedMutagenesisKit(Stratagene,LaJolla,CA,USA)依照生产商的指示使用如下所示的引物将EcoRI位点从pEmY10中hpt基因的编码序列去除，所述引物中小写字母代表靶EcoRI位点的未突变的核苷酸而下划线字母代表突变的核苷酸。所得的质粒命名为pBK3。
正向引物：
5'-GGGTACCCCAAGGGCgTattcTGCAGATGGG-3'(SEQIDNO:11)
反向引物：
5’-CCCATCTGCAgaatAcGCCCTTGGGGTACCC-3'(SEQIDNO:12)
将所得不含所述EcoRI位点的hpt基因从pBK3使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。
正向引物：
5’-GGggtaccTTCATTTAAACGGCTTCAC-3’(SEQIDNO:13)
反向引物：
5’-GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3’(SEQIDNO:14)
下划线部分代表引入用于克隆的KpnI位点。
将米曲霉pyrG基因的部分用于生成直接重复，并使用下述引物从pSO2(WO98/12300)进行PCR扩增：
重复1：
正向引物：
5’-TCCcccgggTCTCTGGTACTCTTCGATC-3’(SEQIDNO:15)
反向引物：
5’-GGggtaccCGACCAGCAGACGGCCC-3’(SEQIDNO:16)
重复2：
正向引物:
5’-GGggtaccTCTCTGGTACTCTTCGATC-3’(SEQIDNO:17)
反向引物:
5’-TCCcccgggCGACCAGCAGACGGCCC-3’(SEQIDNO:18)
下划线部分代表引入用于克隆的限制性位点SmaI(cccggg)或KpnI(ggtacc)。
将三个片段(hpt，重复#1和重复#2)在不同的反应(各50μl)中扩增，所述反应物由1XThermoPolBuffer，200μMdNTPs，0.25μM每种引物，50ng模板DNA和1单位DNA聚合酶组成。所述扩增反应使用进行，其程序为在95℃进行一个循环2分钟，30个循环，每个在95℃进行1分钟，61℃的进行1分钟和72℃进行2分钟，并在72℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物在TAE缓冲液中通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2kb的扩增的hpt片段和大约0.2kb的重复片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将两个pyrG重复片段用KpnI消化，用小牛小肠磷酸酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)脱磷酸，并用ReactionCleanupKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)依照生产商的指示处理。然后将携带重复#1和hpt的片段使用QUICKLIGATIONTMKit依照生产商的指示连接在一起，用ReactionCleanupKit处理，并使用BluntCloningKit克隆入-BluntII-序列分析确证了一个其中重复#1和hpt片段连接在一起的克隆。该质粒命名为pEmY18。
为了将第二个重复克隆入pEmY18，用EcoRV消化pEmy18，并将消化物在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化。将5.6kb片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将0.2kb重复2片段(如上所述)和消化的pEmY18使用QUICKLIGATIONTMKit连接在一起。将连接混合物用于转化GoldSupercompetentCells(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。序列分析鉴定了其中三个组分(重复#1、hpt和重复#2)为所需的顺序和取向且无PCR错误的质粒。所得的质粒命名为pEmY20。
为了确保后续用EcoRI对pEmY20的消化会释放单一片段，使用Site-DirectedMutagenesisKit依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物去除EcoRI位点。在序列验证之后，所得的质粒命名为pEmY21(图6)。
正向引物：
5'-GGGTACCCCAAGGGCQTATTCTGCAGATGGG-3'(SEQIDNO:19)
反向引物：
5'-CCCATCTGCAGAATACGCCCTTGGGGTACCC-3'(SEQIDNO:20)
实施例12：构建质粒pDM156.2，其携带并入镶片镰孢乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶(pyrG)基因的基因组DNA片段
粗糙脉孢菌乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶(pyr-4)基因的探针(DNA序列为SEQIDNO:21而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:22)通过掺入异羟基洋地黄毒甙元标记的脱氧尿苷三磷酸(dUTP)的PCR使用下述引物来制备。
引物(有义)：
5’-GTCAGGAAACGCAGCCACAC-3’(SEQIDNO:23)
引物(反义)：
5’-AGGCAGCCCTTGGACGACAT-3’(SEQIDNO:24)
将质粒pFB6(Buxton等,1983,MolecularandGeneralGenetics190:403-405)用HindIII消化，并将消化物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化。将1.1kbpyr-4片段切出，并使用GelExtractionKit依照生产商建议的实验方案进行琼脂糖提取。
扩增反应物由1XTaqDNAPolymeraseBuffer(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，5μlPCRDIGLabelingMix(BoehringerMannheim,Manheim,Germany)，10ng的1.1kbHindIIIpyr-4片段，10pmol的有义引物，10pmol反义引物，以及1单位TaqDNA聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)组成。将反应物在中温育，其程序为在95℃进行1个循环3分钟，然后35个循环，每个在95℃进行30秒，55℃进行1分钟，和72℃进行1分钟。在72℃实施5分钟的最终延伸。
将扩增翻译产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳纯化。将大约0.78kb的异羟基洋地黄毒甙元(DIG)标记的探针从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
如WO99/60137所述，生成镶片镰孢株A3/5的基因组DNA文库，并克隆入lambda载体EMBL4。
使用DIG标记的探针筛选克隆入lambda载体EMBL4的镶片镰孢A3/5DNA的基因组文库。将lambda噬菌体与大肠杆菌K802细胞(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)一同铺板于具有NYZ顶层琼脂糖的LB板。使用Sambrook等(MolecularCloning,ALaboratoryManual,第2版；J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis；ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)的技术进行噬菌斑上移(plaquelift)至HYBONDTM尼龙膜。DNA通过UV交联使用UVSTRATALINKERTM结合于膜。然后将滤纸与0.78kbDIG标记的粗糙脉孢菌pyr-4探针杂交。pyrG克隆的杂交和检测依照GENIUSTMSystemUser'sGuide(BoehringerHammheim,Manheim,Germany)在42℃用由5XSSC，35％甲酰胺，0.1％L-月桂酰肌氨酸(lauroylsarcosine)，0.02％SDS和1％封闭试剂(BoehringerHammheim,Manheim,Germany)组成的杂交溶液来实施。使用的DIG标记的探针的浓度是2.5ng每ml杂交溶液。杂交DNA用碱性磷酸酶偶联的抗异羟基洋地黄毒甙元抗体(BoehringerHammheim,Manheim,Germany)免疫检测，并用化学发光底物(BoehringerHammheim,Manheim,Germany)Lumiphos530来显现。DNA制备物是从推定的阳性lambda克隆使用LambdaMidiKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)来制备的。
将来自上述鉴定的克隆的lambdaDNA用EcoRI消化，并将其在TAE缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳。将3.9kb片段切出，并使用QIAEXGelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA)进行琼脂糖提取。然后将该片段克隆入pUC118(Viera和Messing,1987,MethodsinEnzymology153:3-11)的EcoRI位点。并用2μl克隆反应物转化ONETOP10感受态细胞。通过DNA测序分析来自八个所得的转化体的质粒DNA。选取一个具有所需序列的克隆并命名为pDM156.2(图7)。pyrG片段携带整个编码区加上1.3kb的启动子和1.5kb的终止子。
实施例13：构建镶片镰孢pyrG缺失载体pEmY23
将镶片镰孢pyrG编码序列(2678bp，DNA序列为SEQIDNO:51，而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:52)通过用EcoRV和StuI的消化从pDM156.2切出(实施例12)，并使用GelExtractionKit依照生产商的指示进行凝胶纯化。分离pEmY21的SmaI片段并使用GelExtractionKit进行凝胶纯化，并使用QUICKLIGATIONTMKit依照生产商的指示将两个凝胶纯化的片段连接在一起，并用ReactionCleanupKit处理，并将2μl所得的连接物用于依照生产商的指示转化ONE化学感受态TOP10细胞。
使用9600从八个所得的转化体提取质粒DNA。对这些DNA筛选插入物的取向，就错误不存在进行测序，并选取一个具有正确插入序列的克隆，并命名为pEmY23(图8)。
实施例14：构建pyrG缺失的株EmY1154-46-4.3
将质粒pEmY23用EcoRI和XmnI消化，并对其在TAE缓冲液中进行1％琼脂糖凝胶电泳以分离3.6kb的DNA片段。使用GelExtractionKit依照生产商的指示凝胶纯化该3.6kb片段，并将其用于转化镶片镰孢WTY842-1-11的原生质体，如实施例6中所述，有两点不同：第一，仅使用一种类型的转化DNA(3.6kb的经EcoRI-XmnI消化的pEmY23片段)，以及第二，转化体是在补充了1mM尿苷和每ml0.125mg潮霉素B(Roche,Indianapolis,IN,USA)的VNO3RLMT上选择的。选取十个转化体以供在25ml未补充的M400液体培养基中进行筛选，并还在VNO3RLMT+1mM尿苷(用于生长的阳性对照)，VNO3RLMT+1mM尿苷+每ml0.125mg的潮霉素B(用于转化的阳性对照)和未补充的VNO3RLMT(筛选pyrG缺失)上的表型筛选中进行筛选。尿苷原养型的候选物可在三日内在液体培养基上鉴定，而在七日内通过基于板的表型筛选中鉴定。一个选用于进一步筛选和孢子纯化的候选物命名为EmY1154-46-4。对来源于该菌株的孢子纯化的分离物(如实施例21中所述获得，只是琼脂培养基是补充了10mM尿苷的VNO3RLMT)进行如上所述相同的筛选实验方案，并选取两个单独的孢子分离物用于Southern杂交分析以供与亲本株比较。这些孢子纯化的株命名为镶片镰孢EmY1154-46-4.3和EmY1154-46-4.5。
如实施例8中所述从存在pyrG和缺乏hpt的镶片镰孢WTY842-1-11(对照株)、主要转化体镶片镰孢EmY1154-46-4和单一孢子分离物镶片镰孢EmY1154-46-4.3和EmY1154-46-4.5制备基因组DNA。将来自每个株的八微克DNA用StuI和MfeI消化。StuI反应物由1XNEB缓冲液2(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，8μgDNA，65单位StuI，并用灭菌水调至总体积100μl组成。在37℃温育10小时之后，添加上样缓冲液(40％蔗糖，5mMEDTA，0.025％溴酚蓝，0.025％二甲苯蓝)，并将样品上样于两个1％琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中以60伏运行5小时。MfeI限制性消化物由1XNEB缓冲液4(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，8μgDNA，65单位MFeI并用灭菌水调至总体积100μl组成。在37℃温育10小时之后，添加上样缓冲液，并将样品上样于1％琼脂糖凝胶上，将其在TBE缓冲液中以60伏运行5小时。
在溴乙锭染色和脱色之后，从凝胶使用HYBONDTMN尼龙膜如下所述制备Southern印迹。脱嘌呤是在0.25NHCl中在26℃轻柔振荡10分钟继以在26℃在灭菌蒸馏水中进行5分钟洗涤来进行的。在洗涤之后，进行两个变性反应：使用0.5NNaOH/1.5MNaCl轻柔振荡反应15分钟(第一反应)和20分钟(第二反应)。之后进行另一次洗涤：在灭菌水中在26℃轻柔振荡洗涤2分钟。最终洗涤之后进行两次中和反应，分别在26℃使用1.5MNaCl，0.5MTrispH7.5和0.001MEDTA轻柔振荡反应30分钟。然后将膜使用TURBOBLOTTERTMKit在26℃在10XSSC中印迹过夜。将膜在26℃在2XSSC中振荡洗涤5分钟。然后将在26℃膜空气干燥10分钟，使用STRATALINKERTM(用自动设定，其生成120mJ/cm2的总剂量)UV交联，并最终在真空炉中在80℃烘烤1小时。
如下所示的用于产生pyrG和hpt基因特异性探针的引物是使用Vector软件(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)设计的。
镶片镰孢pyrG正向引物:
5’-GCCATGCGATCCAGCGTTTGAATCC-3’(SEQ.IDNO:25)
镶片镰孢pyrG反向引物:
5’-GCGTCCGCAACTGACGATGGTCCTC-3’(SEQ.IDNO:26)
大肠杆菌hpt正向引物:
5’-CAGATACCACAGACGGCAAGC-3’(SEQ.IDNO:27)
大肠杆菌hpt反向引物:
5’-GGGCAGTTCGGTTTCAGG-3’(SEQ.IDNO:28)
将pyrG和hpt基因的DIG标记的探针使用PCRDIGProbeSynthesisKit依照生产商的实验方案生成。在循环之后，将反应物置于冰上，在微离心机中短暂离心，然后上样于1％琼脂糖凝胶。在TBE缓冲液中电泳之后，将预计大小的条带切出，并使用GelExtractionKit凝胶纯化。将滤纸在35mlDIGEasyHyb(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)中在玻璃管中在42℃预杂交3小时，之后去除DIGEasyHyb，并用7.5ml新鲜DIGEasyHyb加上10μl标记的探针替代(由PCR反应扩增的凝胶纯化的DNA的大约30％)，将其煮沸5分钟然后置于冰上。在杂交炉中在42℃实施12小时杂交。在室温在2XSSC，0.1％SDS中实施两次5分钟的杂交后洗涤，然后是在65℃在0.2XSSC，0.1％SDS中的两次15分钟洗涤。后续的洗涤和检测是使用DIGWash和BlockSet、Anti-Digoxigenin-APFabFragments和CDP-StarChemi-luminescent底物(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的推荐进行的。
Southern杂交结果揭示镶片镰孢EmY1154-46-4及其两个单孢子分离物EmY1154-46-4.3和EmY1154-46-4.5保持了pyrG缺失事件，并携带hpt基因。
实施例15：pyrG缺失的镶片镰孢株EmY1154-46-4.3的孢子在补充尿苷和FdU的培养基上的萌发效率
测试了来自pyrG缺失的镶片镰孢株EmY1154-46-4.3的孢子在补充尿苷和FdU的培养基上的萌发效率。镶片镰孢EmY1154-46-4.3的孢子如实施例5中所述使用补充了10mM尿苷的RA培养基生成。将200μl体积的五十个孢子等分至45个补充了0、25或50μMFdU和0、0.01、0.05、0.1或0.25mM尿苷的VNO3RLMT板(14cm直径)上。设置每种FdU和尿苷组合的三次重复的板并将其在26℃在ChexAllInstantSealSterilizationPouch中温育10日。
当尿苷浓度为0.01mM时，镶片镰孢EmY1154-46-4.3的孢子并不在25或50μMFdU的存在下萌发，但其在FdU不存在时在相同的培养基上容易地萌发。然而，当尿苷浓度为0.1mM时，pyrG缺失株的孢子在25和50μMFdU存在下可以以大约25％的频率萌发(与FdU不存在时的75％的频率相比较)。
实施例16：在低尿苷浓度在FdU补充基本培养基上分辨tk+和tk-株
为了确定非常低的尿苷浓度是否在tk+株中赋予对FdU的抗性，实施了重构实验。使用了tk+株镶片镰孢WTY1449-3-3和tk-株镶片镰孢WTY1449-9-1。诱导每株的孢子并将其以每板50个孢子(镶片镰孢WTY1449-9-1)或每14cm直径板50,000个孢子(镶片镰孢WTY1449-3-3)铺板。此外，将WTY1449-3-3和WTY1449-9-1孢子(分别为50个和50,000)的组合混合并铺板。所有板含有补充了50μMFdU的VNO3RLMT。板中尿苷浓度为1、0.5、0.25或0.1mM。每种处理以三次重复实施。
tk+株在所有板上以均一的雾状(haze)生长，唯独在缺乏尿苷的培养基上不生长。tk-株在所有浓度的尿苷，以及缺乏尿苷的培养基上生长良好。在混合板上，结果为纯的tk+和tk-株的板的结果的组合。在每个含有尿苷的板上，明显的tk-菌落重叠在tk+株雾状的背景生长之上。
将出现在tk+和tk-孢子的混合物铺板的板上的菌落亚培养至补充了50μMFdU(不含尿苷)的新鲜VNO3RLMT培养基板。还从背景生长(每个混合板3个菌落)将相同数量的样品亚培养至VNO3RLMT+50μMFdU(不含尿苷)。此外，将菌落和背景生长从纯tk-板和纯tk+板亚培养至VNO3RLMT+50μMFdU(不含尿苷)板。这是为了评价(1)混合板上的背景生长(假定的FdU敏感、tk+株)之后是否会在缺乏尿苷情况下表现出预计的表型(对FdU敏感)；和(2)假定的FdU抗性、tk-菌株是否会在这些情况下正常生长。在温育之后，显然tk+株绝对无法在50μMFdU存在下在缺乏尿苷的培养基上生长，而tk-株在50μMFdU存在下在缺乏尿苷的培养基上正常生长。尽管tk+在含有尿苷的混合板上有背景雾状生长，但tk-株是容易分辨的，并可容易地将其从补充了0.1mM尿苷的含FdU培养基亚培养至不含尿苷的培养基，而没有被tk+株污染的危险，这正是要求保护的双重选择技术所需的。
结果阐明了可成功地将tk基因在补充了尿苷的生长条件下用作阴性选择性标记(与尿苷的补充消除了对FdU抑制作用的发表论断，例如Sachs等,1997,NucleicAcidsResearch25:2389-2395相反)。
实施例17：构建质粒pWTY1470-19-07
将携带镶片镰孢trichodiene合酶(tri5)基因的5’和3’侧翼序列(DNA序列为SEQIDNO:29，推导的氨基酸序列为SEQIDNO:30)的质粒pJRoy40(美国专利7,332,341号)用作模板以供扩增5’tri5基因侧翼序列的部分。PCR反应物在终体积50μl中含有200μMdNTPs，1XTaqDNA聚合酶缓冲液，125pgpJRoy40DNA，50pmol每种下示引物和1单位TaqDNA聚合酶。
正向引物：
5’-GGGAGATCTTCGTTATCTGTGCC-3’(SEQIDNO:31)
反向引物：
5’-GGGAGATCTTAGTAGTCGGCATTTGAAAC-3’(SEQIDNO:32)
(下划线的核苷酸显示引入的BglII位点)。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环3分钟；10个循环，每个在95℃进行30秒，在52℃进行45秒和在72℃进行2分钟；20个循环，每个在95℃进行30秒，在52℃进行45秒和在72℃进行5分钟；以及在72℃进行1个循环7分钟。
PCR产物通过使用TBE缓冲液的1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约600bp的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将片段使用TACloningKit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)插入(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，并用2μl克隆反应物转化ONETOP10感受态细胞。将来自八个所得的转化体的质粒DNA用EcoRI和BglII在不同的反应中消化，且三个具有正确的限制消化样式的转化体的插入通过DNA测序得到确证。选取一个具有所需序列的克隆并命名为pWTY1470-09-05。
通过用BglII消化从pWTY1470-09-05释放出携带tri5基因5’重复的608bpBglII片段，通过使用TBE缓冲液的1.0％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
质粒pJRoy40通过BglII消化线性化，之后将其使用虾碱性磷酸酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的指示脱磷酸，并使用PCRPurificationKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化。将线性化的pJRoy40和凝胶纯化的BglII片段使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)依照生产商的指示连接在一起。大肠杆菌化学感受态细胞(Stratagene,LAJolla,CA,USA)的转化依照生产商的指示加以实施。一个转化体通过DNA测序确证含有所需的载体，即携带tri55’和3’侧翼序列并另外含有5’侧翼序列一部分的重复。所得的质粒命名为pWTY1470-19-07(图9)。
实施例18：构建质粒pWTY1515-02-01
对质粒pWTY1470-19-07使用Site-DirectedMutagenesisKit依照生产商的指示以及如下所示的正向和反向引物进行体外诱变。
正向引物：
5’-CAAGTAACAGACGCGACAGCTTGCAAAATCTTCGTTATCTGTG-3’(SEQIDNO:33)
反向引物：
5’-CACAGATAACGAAGATTTTGCAAGCTGTCGCGTCTGTTACTTG-3’(SEQIDNO:34)
该诱变去除了1779bp处的BglII位点，并使得2386bp处的BglII位点变成唯一，并可用于后续的操作中以插入携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒的片段。将该诱变反应用于依照生产商推荐的实验方案转化试剂盒提供的大肠杆菌XL10-Ultra-感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。
一个根据序列分析验证的携带如上所示的突变的转化体，命名为pWTY1515-02-01(图10)，并用作实施例19中的骨架。
实施例19：tri5缺失载体pJfyS1579-21-16的生成
使用GCGenomicPCRKit(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)和如下所示的基因特异性正向和反向引物从质粒pEmY23PCR扩增大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因盒。反向引物中的下划线部分是用于克隆的BglII位点。
正向引物：
5’-TTGAACTCTCAGATCCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3’(SEQIDNO:35)
反向引物：
5’-CAGATAACGAAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3’(SEQIDNO:36)
PCR反应物在50μl的终体积中含有362ngpEmY23作为DNA模板，200μmdNTPs，1.1mM乙酸镁，0.4μM引物，1XGCReactionBuffer(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)，0.5MGCMelt(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)和1XGCGenomicPolymeraseMix(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)。
将扩增反应物在(Eppendorf,Munich,Germany)中温育，其程序为在95℃进行1个循环2分钟；25个循环，每个在94℃进行30秒和66℃进行3分钟；和在66℃进行1个循环3分钟；以及在4℃维持。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1.9kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)进行琼脂糖提取。将所述片段使用TACloningKit依照生产商的指示克隆入将ONETOP10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用2μlTA反应物转化。来自8个转化体的质粒DNA的序列分析确证了与预计序列并无偏差，且该质粒命名为pJfyS1540-75-5(图11)。
将hpt插入物通过用BamHI和BglII的消化而从pJfyS1540-75-05释放，并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离。将1.9kb的片段切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。使用RapidDNALigationKit将该片段连接至经BglII线性化的空tri5缺失载体pWTY1515-02-01(实施例18)，其已经使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将大肠杆菌化学感受态细胞用所述连接反应物转化，并将来自24个所得的转化体的质粒DNA通过用EcoRI的限制性消化分析确证插入的取向。选取了一个携带所需取向的插入的转化体并命名为pJfyS1579-1-13(图12)。
将单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)基因(DNA序列为SEQIDNO:37，而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:38)使用pWTY1449-2-1作为模板和如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。粗体序列代表引入的BglII位点。
正向引物：
5’-GCCGACTACTAGATCGACCGGTGACTCTTTCTGGCATGCG-3’(SEQIDNO:39)
反向引物：
5’-CAGATAACGAAGATCTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGC-3’(SEQIDNO:40)
PCR反应物在50μl的终体积中含有1X反应缓冲液(Stratagene,LaJolla,CA,USA)，200μMdNTPs，55ngpWTY1449-2-1，0.2μM引物，2％DMSO和2.5单位DNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环1分钟；25个循环，每个在94℃进行30秒，在60℃进行30秒，和在68℃进行2分45秒；和在68℃进行1个循环2分45秒；并在4℃维持。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约2.8kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将所述片段使用TACloningKit克隆入将ONETOP10感受态细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用2μlTA反应物转化。来自一个转化体的质粒DNA的序列分析在tk编码序列鉴定了一个突变(C1621G)，其导致甘氨酸至丙氨酸的氨基酸变化。使用IIXLSite-DirectedMutagenesisKit(Stratagene,LaJolla,CA,USA)依照生产商的指示和如下所示的正向和反向引物校正了该突变。小写字母表示所需变化。16个克隆的序列分析导致选取其中一个，命名为pJfyS1579-8-6(图13)。
正向引物：
5’-CCCTGTTTCGGGGCCCCGAGTTGCTGG-3’(SEQIDNO:41)
反向引物：
5’-CCAGCAACTCGGGGCCCCGAAACAGGG-3’(SEQIDNO:42)
将质粒pJfyS1579-08-06用BamHI和BglII消化以释放所述2.8kbtk片段，并如上所述纯化片段。将该片段使用QUICKLIGATIONTMKit连接于经BglII线性化并经小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1579-1-13，并用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌化学感受态细胞。将所得的质粒命名为pJfyS1579-21-16(图14)并用作tri5缺失盒。
实施例20：镶片镰孢转化方法
将一百微克每种下述实施例中所述的缺失盒用BstZ171/BamHI(实施例21)或NotI(实施例24、26、37和39)消化。将每个消化反应物在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用GelExtractionKit提取DNA条带。将所得的纯化DNA在1.5ml微离心管中通过乙醇沉淀来浓缩，即添加10％反应物体积的3M乙酸钠pH5，然后添加2.5体积的冰冷的乙醇(94％)并在冰上温育20分钟。然后将管在5424桌上离心机(Eppendorf,Hamburg,Germany)中以15,000xg离心10分钟。弃去上清，并用1ml冰冷的70％乙醇洗涤沉淀，并将其以15,000xg离心5分钟。弃去上清并使沉淀风干。然后将沉淀重悬于70μl10mMTrispH8缓冲液。所得的含DNA溶液的浓度使用1000分光光度计(ThermoFischerScientific,Waltham,MA,USA)确定。
适当受体株的原生质体是通过下述方法生成。首先通过用含有VNO3RLMT培养基的7日龄培养物的15x1cm2琼脂栓接种2.8LFernbach烧瓶中的500ml的RA培养基(实施例21)或补充了10mM尿苷的RA培养基(实施例24、26、37和39)并将烧瓶在28℃以150rpm振荡温育36小时来获得孢子。将孢子培养物经过灭菌MIRACLOTHTM过滤，并将孢子捕获于0.2μm过滤单元(Millipore,Bellerica,MA,USA)之上。用200ml灭菌玻璃蒸馏水洗涤孢子，并将其重悬于10ml灭菌玻璃蒸馏水。
将一ml的孢子溶液用于接种100ml补充了5％葡萄糖的YP培养基(实施例21)或补充了5％葡萄糖和10mM尿苷的YP培养基(实施例24、26、37和39)。将接种的培养基在17℃以150rpm振荡温育16小时。将培养物经过MIRACLOTHTM过滤以收集菌丝体，然后使用灭菌的刮铲将其转移至50ml聚丙烯管。将菌丝体重悬于20ml在每ml1M的MgSO4中含有每ml5mg的NOVOZYMETM234和5mg的GLUCANEXTM(两者均来自NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)的原生质体化溶液，并转移至50ml聚丙烯管。将管在29.5℃以90rpm振荡温育一小时，之后添加30ml1M山梨醇。然后将管以800xg在SorvallRT6000B浮筒式离心机(ThermoFischerScientific,Waltham,MA,USA)中离心10分钟。弃去上清并将原生质体沉淀用30ml1M山梨醇洗涤两次。将管在800xg离心5分钟并弃去上清。将原生质体以5x107每ml的浓度重悬于过滤灭菌的9:1:0.1(v/v)STC:SPTC:DMSO的溶液中，并以受控冷冻速率使用NALGENETMCryo1℃FreezingContainer(ThermoFischerScientific,Waltham,MA,USA)在-80℃冷冻过夜。
转化通过将原生质体在冰上融化并将200μl原生质体添加至四个14ml管中的每一个来达成。将五μgDNA(以少于10μl)添加至前三个管中，而不将DNA添加至第四个管。然后将750μlSPTC添加至每个管，并将管轻柔倒转6次。将管在室温温育30分钟，并将6mlSTC添加至每个管。将每个转化物分为三部分，并添加至150mm直径板，其含有补充了每ml125μg潮霉素的VNO3RLMT培养基(实施例21)或补充了每ml125μg潮霉素和10mM尿苷的VNO3RLMT培养基(实施例24、26、37和39)，并在室温温育7日。
实施例21：构建Δtri5镶片镰孢株JfyS1604-47-02
将镶片镰孢A3/5原生质体用经BstZ171/BamHI线性化的pJfyS1579-21-16使用实施例20所述方法转化。将转化体在含有每ml125μg潮霉素B的VNO3RLMT板上选择。在第7日之后，将123个转化体中的48个亚培养至含有相同培养基的新板上。然后通过Southern分析来分析八个转化体如下。通过用来自如上所述获得的7日龄转化体的四个1cm琼脂栓接种25ml的M400培养基来生成这些株的真菌生物质。将培养物在28℃以150rpm振荡温育3日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACLOTHTM过滤。将收获的生物质用液氮冷冻，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。
使用PlantMaxiKit依照生产商的指示分离基因组DNA，只是65℃的裂解温育期从10分钟延长至1.5小时。
将二μg基因组DNA用16单位的SphI和22单位的DraI在50μl反应体积中在37℃消化22小时。对消化物进行TAE缓冲液中的1.0％琼脂糖凝胶电泳。将DNA在凝胶中通过用0.25MHCl处理片段化，用1.5MNaCl-0.5MNaOH变性，用1.5MNaCl-1MTrispH8中和，然后在20XSSC中使用TURBOBLOTTERTMKit转移至Supercharge尼龙膜(均来自Whatman,Kent,UK)。将DNA使用UVSTRATALINKERTMUV交联至膜上，并在20mlDIGEasyHyb中在42℃预杂交1小时。
针对tri5基因的3’侧翼序列的PCR探针是使用下述正向和反向引物生成的。
正向引物：
5'-GTGGGAGGATCTGATGGATCACCATGGGC-3'(SEQIDNO:43)
反向引物：
5'-CCGGGTTTCGTTCCGAACGATCTTTACAAGG-3'(SEQIDNO:44)
探针是使用PCRDigProbeSynthesisKit依照生产商的指示生成的。将探针在TAE缓冲液中通过1.2％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并添加至10mlDIGEasyHyb以产生杂交溶液。杂交在42℃实施15-17小时。然后将膜在高严格条件下在室温在2XSSC加0.1％SDS中洗涤，然后在65℃进行两次洗涤，每次在0.1XSSC加0.1％SDS中进行15分钟。探针-靶杂交体通过化学发光测定法(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的指示检测。
将一个如Southern分析确定的在tri5位点携带单一拷贝的缺失盒的转化体镶片镰孢JfyS1579-43-23通过从含有VNO3RLMT培养基的7日龄板使用灭菌牙签切下四个1cm2栓并将其转移至含有25mlRA培养基的125ml带挡板的摇瓶来进行孢子形成。将烧瓶在28℃以150rpm振荡温育48小时。将孢子培养物经过灭菌的MIRACLOTHTM过滤，并收集于50ml聚丙烯管。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将105个孢子(1ml中)转移至含有补充了50μMFdU的VNO3RLMT培养基的150mm板，并在28℃温育4日。使用灭菌牙签挑取孢子分离物，并将其转移至含有补充了10μMFdU的VNO3RLMT培养基的新板，并使其在24-28℃生长7日。
将基因组DNA从7个孢子分离物提取，并如上所述实施Southern分析以确保盒从基因组正确切出。如预计，所有通过Southern印迹分析的孢子分离物切出了盒，留下一个重复序列。将一个孢子分离物通过如前述段落中所述在株中诱导孢子形成来纯化孢子一次，并使用血细胞计数器确定孢子浓度，并稀释至每ml40个孢子。将一ml的稀释孢子溶液铺板于含有VNO3RLMT培养基的150mm板，并将板在28℃温育4日。将孢子分离物亚培养至含有VNO3RLMT培养基的新板，并将一个命名为镶片镰孢JfyS1604-17-02(Δtri5)的孢子分离物用作缺失pyrG基因的起始株。
实施例22：构建携带胸苷激酶(tk)阴性选择性标记和潮霉素磷酸转移酶(hpt)阳性选择性标记的通用缺失载体。
构建了携带胸苷激酶(tk)和潮霉素磷酸转移酶(hpt)标记两者的通用缺失载体以便于装配后续的缺失质粒。靶向缺失的基因的5’和3’区域的侧翼序列在用PmeI或AscI(对于5’侧翼序列)以及SbfI或SwaI(对于3’侧翼序列)消化载体之后可容易地连接于后者。
为了PCR扩增来源于镶片镰孢pyrG基因5’侧翼区域的直接重复，在两个PCR反应物中使用50皮摩尔如下所示的引物，所述反应物在50μl的总体积中含有50ngpDM156.2，1XPfxAmplificationBuffer(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，6μl10mMdNTPs混合物，2.5单位PfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和1μl50mMMgSO4。
引物：
重复#1
有义引物：
5’-GTTTAAACGGCGCGCCCGACAAAACAAGGCTACTGCAGGCAGG-3’(SEQIDNO:45)
反义引物：
5’-TTGTCGCCCGGGAATACTCCAACTAGGCCTTG-3’(SEQIDNO:46)
重复#2
有义引物：
5’-AGTATTCCCGGGCGACAAAACAAGGCTACTGCA-3’(SEQIDNO:47)
反义引物：
5’-ATTTAAATCCTGCAGGAATACTCCAACTAGGCCTTG-3’(SEQIDNO:48)
将扩增反应物在中温育，其程序如下。对于重复#1：在98℃进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行30秒和68℃进行1分钟。接着进行35个循环，每个在94℃进行30秒，在59℃进行30秒和68℃进行1分钟。对于重复#2，循环参数为：在98℃进行1个循环2分钟；然后5个循环，每个在94℃进行30秒，在55℃进行30秒，和68℃进行1分钟。然后是35个循环，每个在94℃进行30秒，在56℃进行30秒，和68℃进行1分钟。在35个循环之后，将两个反应物(即重复#1和#2)在68℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步加工。
将来自两个反应的PCR产物使用TAE缓冲液通过0.8％GTG-琼脂糖(CambrexBioproducts,EastRutherford,NJ,USA)分离。对于重复#1和重复#2，从凝胶切出大约0.26kb的片段，并使用-DA旋转杯(spincup)(Millipore,Billerica,MA,USA)依照生产商的指示纯化。然后将十微升每种纯化的重复用于单一的重叠PCR(overlappingPCR)反应，其反应物在50μl的总体积中含有1XPfx扩增缓冲液，6μl10mMdATP、dTTP、dGTP和dCTP混合物，2.5单位PfxDNA聚合物和1μl50mMMgSO4。
将扩增反应物在中温育，其程序为在98℃进行1个循环2分钟，然后5个循环，每个在94℃进行30秒，在50℃进行30秒和68℃进行1分钟。然后将反应物与预温的溶液混合，所述溶液在50μl的终体积中含有50皮摩尔用于重复#1的有义引物和50皮摩尔用于重复#2的反义引物，1XPfx扩增缓冲液，6μl10mMdNTPs，2.5单位PfxDNA聚合酶和1μl50mMMgSO4。
将新的100μl的扩增反应物在中温育，程序为35个循环，每个在94℃进行30秒，在58℃进行30秒和68℃进行1分钟。在35个循环之后，将反应物在68℃温育10分钟，然后在10℃冷却直至进一步加工。将0.5kbPCR产物(携带所述重复装配体)如上所述通过0.8％GTG-琼脂糖凝胶电泳分离。
将质粒pCR4(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)用作用于构建通用缺失载体的载体骨架的来源。为了去除pCR4DNA的非必需部分，将2.5μg质粒pTter61C(WO2005/074647)顺序用BspLU11I和BstXI消化。然后用Antarctic磷酸酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)处理消化的载体。将3.1kb经消化的骨架如上所述通过0.8％GTG-琼脂糖凝胶电泳来分离。然后将纯化的重复装配体用RapidLigationKit(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)连接于纯化的载体骨架。连接反应物由75ng纯化的载体骨架和3μl纯化的重复装配体组成。将一微升该连接反应物用于使用生产商推荐的实验方案来转化化学感受态Supercompetent细胞(Stratagene,Carlsbad,CA,USA)。将二十四个转化体通过NcoI/PmeI限制性消化分析。二十四个转化体中的二十三个具有预计的限制消化样式。随机选择克隆pFvRs#10用于测序以确证无PCR诱导的错误。序列分析显示克隆pFvRs#10中的重复装配体具有预计的序列，并因此将其选作镶片镰孢通用载体的骨架，并命名为pAlLo1492-24(图15)。
将携带潮霉素磷酸转移酶(htp)基因的盒从pEmY23使用如下所示的基因特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线序列代表XmaI位点，而粗体字母代表BglII位点。在每个5’端的四个“a”使得PCR产物的末端能够进行后续的消化。
正向引物：
5’-aaaacccgggCCTTCATTTAAACGGCTTCACGGGC-3’(SEQIDNO:49)
反向引物：
5’-aaaacccgggAGATCTACGCCCTTGGGGTACCCAATATTC-3’(SEQIDNO:50)
扩增反应物在50μl的终体积中含有60ngpEmY23，200μmdNTPs，1mM乙酸镁，0.4μM引物，1XPfxAmplificationBuffer，0.5MGCMelt和2.5单位Pfx聚合酶。将反应物在 中温育，其程序为在95℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94℃进行30秒，在60℃进行30秒和68℃进行1分50秒；和在68℃进行一个循环7分钟，接着在4℃维持。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1.8kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。随后将经凝胶纯化的PCR产物用XmaI消化，并在1％琼脂糖凝胶上运行并如上所述再次凝胶纯化。将QUICKLIGATIONTMKit用于将hptPCR产物连接于经小牛小肠磷酸酶处理、经XmaI-线性化的pAlLo1492-24。将所得的质粒命名为pJfyS1579-35-2(图16)并用作受体以供插入胸苷激酶基因。
单纯疱疹病毒tk盒的来源是质粒pJfyS1579-08-06(实施例19)，通过用BamHI和BglII的消化将该插入物释放。将消化产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，并将对应于2.8kbtk基因插入物的片段切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将QUICKLIGATIONTMKit用于将tk基因和连接于经小牛小肠磷酸酶处理的、经BglII-线性化的pJfyS1579-35-02。所得的质粒命名为pJfyS1579-41-11(图17)并将其用作起始点以供构建pyrG、amyA、alpA和dps1缺失载体。
实施例23：pyrG缺失载体pJfyS1604-55-13的生成
将镶片镰孢A3/5pyrG基因(DNA序列为SEQIDNO:51而推导的氨基酸序列碱SEQIDNO:52)的3’侧翼序列使用HighFidelityPCRSystem(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)和如下所示基因特异性正向和反向引物进行扩增。下划线部分是引入用于克隆的SbfI位点，而斜体部分是引入用于之后的消化以在转化前去除质粒的部分的NotI位点。
正向引物：
5’-aaaaaacctgcaggatcctgcgcggactcttgattattt-3’(SEQIDNO:53)
反向引物：
5’-aaaaaacctgcagggcggccgcaattccattcctgtagctgagtata-3’(SEQIDNO:54)
扩增反应物以50μl的终体积含有125ng镶片镰孢A3/5基因组DNA，200μmdNTPs，0.4μM引物，含5mMMgCl2的1XBuffer(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)和2.5单位DNA聚合酶(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)。将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟，10个循环，每个在94℃进行30秒，54℃进行30秒，和72℃进行1分钟；和20个循环，每个在94℃进行30秒，54℃进行30秒，和72℃进行1分10秒。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离，并将0.7kb片段切出并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
将0.7kbPCR产物用SbfI消化，并通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳消化。将大约0.7kb的片段从凝胶切出，并进一步使用-DA旋转杯(spincup)纯化。将0.7kb片段使用QUICKLIGATIONTMKit连接于pJfyS1579-41-11(其经SbfI消化并使用小牛小肠磷酸酶脱磷酸)，并将连接混合物用于依照生产商的实验方案转化大肠杆菌化学感受态细胞。所得的质粒命名为pJfyS1604-35-13。
将5’pyrG侧翼序列使用HighFidelityPCRSystem和如下所示的基因特异性正向和反向引物来从pEmY23(实施例13)扩增。下划线部分是引入用于克隆的PmeI位点而斜体部分是引入用于之后的消化以在真菌转化前去除β-内酰胺酶基因的NotI位点。
正向引物：
5’-aaaaaagtttaaacgcggccgcctgttgcctttgggccaatcaatg-3’(SEQIDNO:55)
反向引物：
5’-aaaaaagtttaaacctagttggagtattgtttgttctt-3’(SEQIDNO:56)
扩增反应物含有20ngpEmY23，200μmdNTPs，0.4μM引物，含有15mMMgCl2的1XBuffer和2.5单位DNA聚合酶。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94℃进行30秒，53℃进行30秒，和72℃进行40秒；和20个循环，每个在94℃进行30秒，53℃进行30秒，和72℃进行40秒，并在每个后续循环中另外加上10秒。
将PCR产物使用PCRPurificationKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化。将纯化的PCR产物用PmeI消化并通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0.5kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将0.5kb片段使用QUICKLIGATIONTMKit连接于经PmeI消化和小牛小肠磷酸酶处理的pJfyS1604-35-13。连接反应物在20μl反应体积中含有50ng载体，20ng插入物，1XQUICKLIGATIONTMReactionBuffer(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，和10单位QuickT4DNALigase。将反应物在室温温育5分钟并将2μl连接物用于依照生产商的指示转化大肠杆菌化学感受态细胞。使用序列分析鉴定以所需取向含有插入的转化体，并确证无PCR错误。所得的质粒命名为pJfyS1604-55-13(图18)并用作pyrG基因缺失盒。
实施例24：Δtri5ΔpyrG镶片镰孢株JfyS1643-18-2的生成
将依照实施例20中所述的方法用经NotI消化和经凝胶纯化的pJfyS1604-55-13转化的镶片镰孢JfyS1604-17-2(Δtri5)的五十一个推定转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml125μg潮霉素B和10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在24-28℃生长7日。然后对转化体通过将栓转移至两个VNO3RLMT(一个含有或且一个不含尿苷(10mM))中的每一个进行表型分析。将九个在不含尿苷的板上呈现无生长或不良生长的转化体通过Southern分析进行分析。将来自9个转化体中的每一个的基因组DNA如实施例21所述进行提取，并将每个的2μg用28单位MfeI和14单位DraI消化。依照实施例21中所述的方法使用下述正向和反向引物生成了针对pyrG基因3’侧翼序列的PCR探针：
正向引物：
5’-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3’(SEQIDNO:57)
反向引物：
5'-GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3’(SEQIDNO:58)
Southern分析表明9个尿苷自养型中的2个以单一拷贝携带所述缺失盒，而其余维持该盒的异位整合(ectopicintegration)。将一个转化体，镶片镰孢JfyS1604-85-5，如实施例5中所述在含有10mM尿苷的RA培养基中进行孢子形成，并将105个孢子铺板于含有补充了50μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了10μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并随后通过Southern分析进行分析以确保从基因组的正确切出。
经分析的株均正确地切出了所述盒，并将一个株，镶片镰孢JfyS1643-10-3，如前述段落中所述进行孢子形成。使用血细胞计数器确定孢子浓度，并将储液稀释至40个孢子/ml的浓度。将一ml铺板于含有补充了10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm板。将所得的孢子集落亚培养至含有补充了10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板上，并将一个孢子分离物，镶片镰孢JfyS1643-18-2(Δtri5ΔpyrG)用作供缺失镶片镰孢α-淀粉酶A基因(amyA)的株。
实施例25：amyA缺失载体pJfyS1604-17-2的生成
为了获得上游和下游侧翼序列的信息以供完全去除镶片镰孢amyA基因(DNA序列为SEQIDNO:59而推导的氨基酸序列间SEQIDNO:60)，使用了GENOMEWALKERTMUniversalKit(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)。对每个用该试剂盒生成的镶片镰孢A3/5基因组DNA文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行两轮针对5’侧翼序列的PCR。3’侧翼序列使用如下所示的3’基因特异性引物和3’嵌套引物获得。
5’基因特异性引物：
5’-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3’(SEQIDNO:61)
5’嵌套引物：
5’-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3’(SEQIDNO:62)
3’基因特异性引物：
5’-CTACACTAACGGTGAACCCGAGGTTCT-3’(SEQIDNO:63)
3’嵌套引物：
5'-GCGGCAAACTAATGGGTGGTCGAGTTT-3'(SEQIDNO:64)
初级PCR反应物在50μl的反应体积中含有1XReactionBuffer，2μl每种基因组DNA文库(如试剂盒中所述生成)，200nM试剂盒提供的AP1(接头引物1)，200nM基因特异性引物(见上)，200μMdNTPs和2.5单位DNA聚合酶。
初级扩增在中实施，程序为7个循环，每个在94℃进行25秒，72℃进行3分钟，和32个循环，每个在94℃进行25秒，和67℃进行3分钟以及在67℃进行1个循环7分钟。
次级PCR反应物在50μl的反应体积中含有1XReactionBuffer，1μl各初级PCR反应物，200nM试剂盒提供的AP2(接头引物2)，200nM基因特异性嵌套引物(见上)，200μMdNTPs和2.5单位DNA聚合酶。
次级扩增在中实施，程序为5个循环，每个在94℃进行25秒，和72℃进行3分钟，以及20个循环，每个在94℃进行25秒和67℃进行3分钟，以及在67℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0.7kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit依照生产商的指示纯化。将PCR产物使用如上所述相应的嵌套引物和试剂盒提供的引物2直接进行测序。将获得的序列用于设计引物以扩增amyA基因5’侧翼序列的1kb区和3’侧翼序列的0.7kb区以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41-11。
将amyA3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。
正向引物：
5’-AAAAAAcctgcaggTAATGGGTGGTCGAGTTTAAAAGTA-3’(SEQIDNO:65)
反向引物：
5’-AAAAAAcctgcagggcggccgcTTTAAGCATCATTTTTGACTACGCAC-3’(SEQIDNO:66)
下划线字母代表用于之后去除β-内酰胺酶的NotI位点，而斜体字母代表用于载体克隆的SbfI位点。
扩增反应物含有1XReactionBuffer，120ng基因组DNA模板，400nm引物，200μMdNTPs和2.5单位DNA聚合酶。将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分钟；和20个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分10秒。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约0.7kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。用SbfI消化PCR片段以产生粘性末端。将该片段插入经SbfI-线性化、小牛小肠磷酸酶处理的通用缺失载体pJfyS1579-41-11。连接反应物在20μl的反应体积中含有80ng载体，80ng插入物，1XQUICKLIGATIONTMReactionBuffer和10单位QuickT4DNALigase。将1.5μl体积的连接反应物用于依照生产商的指示转化100μl大肠杆菌化学感受态细胞。使用用EcoRI的限制性分析和序列分析就插入物取向筛选克隆，鉴定出不含PCR错误的克隆。该质粒命名为pJfyS1579-93-1(图19)并用作5’amyA侧翼序列插入物的受体。
使用下示的正向和反向引物PCR扩增5’amyA侧翼序列。下划线的碱基代表用于bla基因去除的NotI位点，而其它小写字母代表PmeI位点以确保所述片段是平端的(blunt)以克隆入平端的载体位点。
正向引物：
5’-AAAAAAgtttaaacGCGGCCGCTTGATTATGGGATGACCCCAGACAAGTGGT-3’(SEQIDNO:67)
反向引物：
5’-AAAAAAgtttaaacCCGCACGAGCGTGTTTCCTTTTCATCTCG-3’(SEQIDNO:68)
PCR扩增与上述相似，只是循环参数不同。将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分15秒；和20个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行30秒，和72℃进行1分15秒，并在每个后续的循环额外进行10秒。
PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit从凝胶纯化。用PmeI消化该1kb片段以产生平端，并将该插入物克隆入经PmeI-消化、经小牛小肠磷酸酶脱磷酸的pJfyS1579-93-1。
连接反应物在20μl反应体积中含有75ng载体，100ng插入物，1XQUICKLIGATIONTMReactionBuffer和10单位QuickT4DNALigase。在5分钟的温育之后，将2μl连接反应物用于依照生产商的指示转化100μl大肠杆菌化学感受态细胞。使用序列分析确证插入物为正确的取向并不含PCR错误。鉴定所得的载体命名为pJfyS1604-17-2(图20)。
实施例26：Δtri5ΔpyrGΔamyA镶片镰孢株JfyS1643-95-04的生成
将依照实施例20中所述方法用经NotI消化和凝胶纯化的pJfyS1604-17-02转化的镶片镰孢JfyS1643-18-02(Δtri5ΔpyrG)的五个推定的转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml125μg潮霉素B和10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在24-28℃温育7日。对于Southern分析，将2μg基因组DNA用25单位SspI消化。依照实施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对amyA基因5’侧翼序列的DIG探针。
正向引物：
5’-GGATCATCATGACAGCGTCCGCAAC-3’(SEQIDNO:69)
反向引物：
5'-GGCATAGAAATCTGCAGCGCTCTCT-3’(SEQIDNO:70)
Southern分析如实施例21中所述加以实施，其结果表明五个转化体中的两个用缺失盒的单独整合物替代了编码序列。将命名为镶片镰孢JfyS1643-73-02的初级转化体如实施例5中所述进行孢子形成，并将105个孢子铺板于含有补充了50μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将获得的孢子分离物亚培养至补充了10μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。
对两个镶片镰孢孢子分离物(JfyS1643-83-02和JfyS1643-83-04)进行一次孢子纯化，得到株JfyS1643-95-1和JfyS1643-95-2(来自JfyS1643-83-02)和Jfys1643-95-04(来自JfyS1643-83-04)。将从FdU板挑取的起始孢子分离物，以及其相应的一次孢子纯化分离物通过Southern分析进行分析以确保从基因组的正确切出。所有分析的株正确地切出了该盒。将镶片镰孢JfyS1643-95-04(Δtri5ΔpyrGΔamyA)用作用于缺失镶片镰孢碱性蛋白酶A基因(alpA)的株。
实施例27：构建质粒pEJG69
将Microdochiumnivale乳糖氧化酶(LOx)基因(DNA序列为SEQIDNO:71而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:72)从pEJG33(Xu等,2001,EuropeanJournalofBiochemistry268:1136-1142)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。
正向引物：
5'-CCCGCATGCGTTCTGCATTTATCTTG-3'(SEQIDNO:73)
反向引物：
5'-GGGTTAATTAATTATTTGACAGGGCG-3'(SEQIDNO:74)
下划线部分代表引入用于克隆的SphI(正向)或PacI(反向)位点。
PCR在50μl的终体积中含有200μMdNTPs，1μM每种引物，50ngpEJG33，1XPwo缓冲液(Promega,Madison,WI,USA)和1μl的PwoHotStartPolymerase(Promega,Madison,WI,USA)。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在95℃进行30秒，55℃进行45秒，和72℃进行1分钟；20个循环，每个在95℃进行30秒，55℃进行45秒，和72℃进行1分钟，在每个后续循环中另外进行20秒延伸；和在50℃进行1个循环10分钟。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1.5kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
使用相同的条件重新扩增乳糖氧化酶基因，并如上所述进行纯化，只是将聚合酶和缓冲液分别用TaqDNA聚合酶和TaqDNAPolymeraseBuffer替代，并用经凝胶纯化的上述PCR产物作为模板。将PCR产物使用TACloningKit克隆入以确保无PCR错误。将所得的无错误质粒用SphI消化，用T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)处理，使用NucleotideRemovalKit(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)纯化，并用PacI消化。将该片段在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将大约1.5kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
将质粒pEJG61用BspLU11I消化，依照生产商的指示用KlenowDNA聚合酶(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)处理，然后用PacI消化。将消化的质粒在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将8kb片段切出，并使用GelExtractionKit将其进行琼脂糖提取。
将Lox编码序列使用T4DNALigase依照生产商的指示连接于BspLU11I-和PacI-消化的pEJG61。通过序列分析筛选质粒以确保不含PCR错误，并鉴定了一个所得的质粒，将其命名为pEJG69(图21)。
实施例28：构建质粒pEJG65
将质粒pEJG61(实施例4)用BspLU11I消化，用KlenowDNA聚合酶处理并用PacI消化。将消化的质粒在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，并将8.1kb片段切出，并使用GelExtractionKit从琼脂糖纯化。
将南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶编码序列(DNA序列为SEQIDNO:75而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:76)从pMT1229(WO94/01541)使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。
正向引物：
5'-GCATGCGAGTGTCCTTGCGC-3’(SEQIDNO:77)
反向引物：
5’-TTAATTAACTAAGGTGGTGTGATG-3’(SEQIDNO:78)
PCR反应物含有200μMdNTPs，1μM每种引物，20ngpMT1229，1XPwo缓冲液(Promega,Madison,WI,USA)，和1μlPwoHotStartPolymerase(Promega,Madison,WI,USA)。
将扩增反应物在中温育，其程序为在94℃进行1个循环2分钟；10个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行45秒，和72℃进行1分钟；17个循环，每个在94℃进行30秒，55℃进行45秒，和72℃进行1分钟，在每个后续循环中另行进行20秒的延伸；以及在72℃进行1个循环10分钟。
将PCR产物在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，并将1.4kb片段接触，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将PCR片段使用TACloningKit克隆入以验证不含PCR错误。
由于该基因编码序列中内部SphI位点的存在，将南极假丝酵母脂肪酶A编码序列从作为两个不同的片段通过分别消化来释放。为了释放第一片段(1kb)，将质粒用SphI消化并用T4DNA聚合酶处理。将该聚合酶在75℃热失活10分钟，并用NheI消化质粒。将第二片段(0.4kb)用NheI/PacI消化从质粒释放。对两个消化物进行TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳并将来自SphI/NheI消化的1kb片段和来自NheI/PacI消化的0.4kb片段切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖纯化。将两个片段使用T4DNA连接酶连接于消化的pEJG61。连接反应物含有1XLigationBuffer(NewEnglandBiolabsInc.,Ipswich,MA,USA)，100ng上述1kb片段，50ng0.4kb片段，50ng消化的pEJG61和10单位T4DNA连接酶。将反应物在室温温育16小时，并用其依照生产商的指示转化大肠杆菌XL10-Ultra-感受态细胞。通过序列分析筛选转化体，并鉴定了一个含有具有所需无错误编码序列的质粒的克隆，并命名为pEJG65(图22)。
实施例29：构建质粒pMStr19
通过将来自pA2Ph10(WO1998/26057)的尖镰孢磷脂酶基因克隆入镶片镰孢表达载体pDM181(WO2000/56900)来构建质粒pMStr19。使用PCR扩增来分离方便DNA片段上的磷脂酶基因。
尖镰孢磷脂酶基因具体是使用标准扩增条件用PwoDNA聚合酶(RocheMolecularBiochemicals,Basel,Switzerland)和45℃的退火温度用如下所示的引物从pA2Ph10扩增的。
PLMStr10：
5’-TCAGATTTAAATATGCTTCTTCTACCACTCC-3’(SEQIDNO:79)
SwaI
PLMStr11：
5’-AGTCTTAATTAAAGCTAGTGAATGAAAT-3’(SEQIDNO:80)
将所得的DNA片段凝胶纯化，并用SwaI消化。还用SwaI消化质粒pDM181，并将其脱磷酸。然后将DNA片段连接在一起以产生质粒pMStr18。
将在两个使用连接混合物生成的单独的大肠杆菌pMStr18转化体，#4和#17中的磷脂酶基因使用标准引物步移方法测序。两者都在基因中的不同位置获得了单一的点突变。突变由NarI位点分隔，所述NarI切割pMStr18两次。因此通过如下将不含错误的磷脂酶基因装配在镰孢属表达载体pDM181中：用NarI消化pMStr18#4和pMStr18#17，分离不含错误的片段，并将其连接在一起以产生pMStr19(图23)。使用标准方法确证了pMStr19中的磷脂酶序列。
实施例30：构建质粒pEJG49
镶片镰孢表达载体pEJG49是通过修饰pSheB1(WO2000/56900)生成的。所述修饰包括(a)通过定点诱变去除一个pSheB1序列内的BspLU11I位点；(b)去除850bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子；(c)通过接头连接引入BspLU11I位点以助于插入2kb镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子；和(d)引入尖镰孢磷脂酶基因。
pSheB1序列之内BspLU11I位点的去除是使用QUIKCHANGETMSite-DirectedMutagenesisKit依照生产商的指示用下述诱变引物对完成的。
5'-GCAGGAAAGAACAAGTGAGCAAAAGGC-3'(SEQIDNO:81)
5'-GCCTTTTGCTCACTTGTTCTTTCCTGC-3'(SEQIDNO:82)
这产生了pSheB1中间物1。
930bp的尖镰孢胰蛋白酶启动子的去除是通过如下完成的：用StuI和PacI消化pSheB1中间物1(6,971bp)，对消化物进行使用TBE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳，切出6,040bp的载体片段，并用GelExtractionKit纯化切出的片段。为了引入新的BspLU11I位点，使用下述引物产生了接头：
5'-dCCTACATGTTTAAT-3’(SEQIDNO:83)
BspLu11I
5'-dTAAACATGTAGG-3'(SEQIDNO:84)
将每个引物(每个2μg)在70℃加热10分钟，然后经过1小时冷却至室温。将该接头连接入经StuI-PacI-消化的pSheB1中间物1载体片段，产生pSheBI中间物2。然后将载体pSheBI中间物2用BspLu11I和PacI消化。将消化的载体在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
尖镰孢磷脂酶基因片段还通过PCR使用pMSTR19作为模板来生成。使用下述PCR引物在该基因的5’端引入SphI位点而在3’端引入PacI位点：
5'-GGGGGCATGCTTCTTCTACCACTCC-3'(SEQIDNO:85)
SphI
5'-GGGGTTAATTAAGAGCGGGCCTGGTTA-3'(SEQIDNO:86)
PacI
实施PCR和纯化的条件如上所述。将磷脂酶基因片段依照生产商的指示克隆入然后将磷脂酶克隆用SphI消化并用T4DNA聚合酶处理以去除突出的3'端。使用NucleotideRemovalKit纯化片段，并用PacI消化。将消化物在TBE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将1kb条带从凝胶切出并使用GelExtractionKit纯化。
将质粒pSheb1中间物2(见上)用StuI和BspLu11I消化，并使用NucleotideRemovalKit纯化。然后将片段连接于2kbStuI-BspLu11I镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子片段(WO2000/056900)。该载体，称作pSheb1中间物3，用BspLu11I消化，用Klenow片段处理以填充5'悬突(overhang)，用PacI消化，并使用NucleotideRemovalKit纯化。然后将该片段连接于SphI，平端PacI尖镰孢磷脂酶片段(如上所述)。所得的质粒，命名为pEJG49(图24)，携带在镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子的转录调控之下的磷脂酶报道基因。
实施例31：构建质粒pEmY15
使用定点诱变从表达质粒pEJG49去除EcoRI和NotI限制位点各一个，并使得这些在双丙氨膦(bialaphos)抗性标记(bar基因)侧翼的限制位点唯一。诱变是使用如下所示的正向和反向引物和Site-DirectedMutagenesisKit来完成的。
正向引物：
5'-cctgcatggccgcCgccgcCaattcttacaaaccttcaacagtgg-3'(SEQIDNO:87)
反向引物：
5'-ccactgttgaaggtttgtaagaattGgcggcGgcggccatgcagg-3'(SEQIDNO:88)
大写字母表示所需的变化，而所得的质粒命名为pEmY15(图25)。
实施例32：构建质粒pEmY24
为了用镶片镰孢pyrG基因替代表达质粒pEmY15中的bar基因，进行了下述实验方案。将质粒pEmY15用EcoRI和NotI消化，并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化。将7.1kb片段切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
将pyrG基因的2.3kb片段从pDM156.2使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。
正向引物：
5’-ATAAGAATgcggccgcTCCAAGGAATAGAATCACT-3’(SEQIDNO:89)
反向引物：
5’-CGgaattcTGTCGTCGAATACTAAC-3’(SEQIDNO:90)
粗体序列对应于引入分别用于正向和反向引物的NotI位点和EcoRI位点。
扩增反应物由在50μl的终体积中的1XThermoPolBuffer，200μMdNTPs，31ngpDM156.2，1μM每种引物和1单位DNA聚合酶组成。
将反应物在中温育，其程序为在95℃进行1个循环3分钟；30个循环，每个在95℃进行30秒，55℃进行1分钟；和72℃进行3分钟；并在72℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，并将2.3kb片段切出并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。然后将该片段用EcoRI和NotI消化，并将消化反应物使用ReactionCleanupKit纯化。将片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接于经NotI/EcoRI消化的pEmY15。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XL1-Blue亚克隆级感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。对转化体进行测序以确保不含PCR错误，并鉴定了含有无错误pyrG片段的质粒。所得的质粒命名为pEmY24(图26)。
实施例33：构建质粒pDM257
将质粒pEmY24(实施例32)用AflII和SnaBI消化。将6.5kb片段在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将质粒pEJG65用AflII和SnaBI消化。将3.3kb片段在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XL1-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体，并鉴定了含有具有所需片段的质粒的克隆。将所得的质粒命名为pDM257(图27)。
实施例34：构建质粒pDM258
将质粒pDM257用ScaIandAflII消化并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将4.1kb片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。还将质粒pEJG69用ScaI和AflII消化，并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将5.8kb片段从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。
将两个片段使用T4DNA连接酶依照生产商的指示连接在一起。将连接混合物依照生产商的指示转化入大肠杆菌XL1-Blue亚克隆级感受态细胞。通过序列分析筛选转化体，并鉴定了所需的质粒，并命名为pDM258(图28)。
实施例35：在镶片镰孢株JfyS1643-95-04中表达乳糖氧化酶。
镶片镰孢JfyS1643-95-04(Δtri5ΔpyrGΔamyA)的原生质体如实施例5中所述生成。然后将该原生质体依照实施例20中所述的方法用携带Microdochiumnivale乳糖氧化酶表达载体的pDM258转化，以评价镶片镰孢JfyS1643-95-04株的表达潜力。将转化体如实施例21中所述在摇瓶中生长，只是所述烧瓶在28℃以200rpm振荡温育5日。
使用与3000(BeckmanCoulter,Inc,Fullerton,CA,USA)一同的活性测定法对摇瓶培养液测定乳糖氧化酶活性。该乳糖氧化酶测定法是GlucoseOxidaseAssayProcedure(K-Glox)(Megazyme,Wicklow,Ireland)的修饰版本。将培养上清适当地在0.1MMOPS缓冲液pH7.0(样品缓冲液)中稀释，然后对稀释样品进行从0倍至1/3倍至1/9倍的系列稀释。将乳糖氧化酶标样(NovozymesA/S,Bagsvaerd,Denmark)使用两倍逐步稀释，在样品缓冲液中的浓度以0.056mg/ml开始以0.007mg/ml结束。将包括标样的总共20μl的每个稀释物转移至96孔平底板。将一百微升POD溶液(Peroxidase,4AA，在磷酸钾缓冲液pH7加对羟基苯甲酸和叠氮化钠中的稳定剂)添加至每孔然后添加100μl葡萄糖底物(样品缓冲液中0.5M葡萄糖)。反应速率在环境温度(大约26℃)在510nm测量总共10分钟。样品浓度通过从使用乳糖氧化酶作为标样生成的标准曲线外推来确定。选择产量最高的乳糖氧化酶转化体在2升发酵罐中进行生长和分析。
发酵培养基(pH6)由每升20g大豆粉，20g蔗糖，2.0gMgSO4·7H2O，2.0g无水KH2PO4，2.0gK2SO4，5.0g(NH4)2SO4，1.0g柠檬酸，0.5ml的200XAMG痕量金属溶液(不含镍)和0.5ml的pluronicacid及20％麦芽糖补料(feed)组成。发酵在29.0+/-1.0℃，1200rpm和1.0vvm通气下进行，其中％DO维持在30％以上。
对发酵液使用Alpha-AmylaseAssayKit(MegazymeInternationalIrelandLtd.,Wicklow,Ireland)连同3000和NX(BeckmanCoulter,Inc,FullertonCA,USA)进行α-淀粉酶活性的测定。如上所述对发酵液测定乳糖氧化酶活性。
所得的转化体镶片镰孢JfyS1643-95-04，在2升发酵罐中具有与无缺失的其它镶片镰孢转化体等同的乳糖氧化酶产生水平(图29)，表明amyA基因的缺失并不对异源蛋白质产生具有不利作用。然而该缺失确实消除了该株和该种系所有后续株在培养液中的α-淀粉酶活性(图30)。由于该转化体与现有的生产株具有等同的外源蛋白质产生能力，并在发酵过程中减少了α-淀粉酶水平，选取镶片镰孢JfyS1643-95-04宿主株用于缺失碱性蛋白酶A基因(alpA)。
实施例36：镶片镰孢碱性蛋白酶A(alpA)缺失载体pJfyS1698-72-10的生成
用于完全去除镶片镰孢A3/5碱性蛋白酶A(alpA)基因的上游侧翼序列(DNA序列为SEQIDNO:91而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:92)使用GENOMEWALKERTMUniversalKit获得。将每个用该试剂盒生成的文库使用如下所示的5’基因特异性引物和5’嵌套引物进行针对5’侧翼序列的两轮PCR。
5’基因特异性引物：
5’-GAGGAATTGGATTTGGATGTGTGTGGAATA-3’(SEQIDNO:93)
5’嵌套引物
5’-GGAGTCTTTGTTCCAATGTGCTCGTTGA-3’(SEQIDNO:94)
序列信息是从从PCR产物使用BDGENOMEWALKERTMUniversalKit中提供的NestedAdaptorPrimer和上述5’嵌套引物获得的。将获得的序列用于设计引物以扩增5’alpA侧翼序列的1kb区域以供插入空的缺失载体pJfyS1579-41-11。
将alpA5’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行PCR扩增。下划线字母代表用于之后去除载体的部分的NotI位点，而斜体字母代表用于载体克隆的AscI位点。
正向引物：
5’-aaaaaaggcgcgccgcggccgcGTTACGGTGTTCAAGTACATCTTACA-3’(SEQIDNO:95)
反向引物：
5’-aaaaaaggcgcgccATTGCTATCATCAACTGCCTTTCTT-3’(SEQIDNO:96)
扩增反应物含有1XReactionBuffer，120ng基因组DNA，400nm引物，200μMdNTPs和2.5单位DNA聚合酶。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；20个循环，每个在94℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分10秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
将扩增反应物的5μl部分通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳显影以确保该反应产生了所需的1kb条带。然后将该插入物从所述扩增反应物依照生产商的指示使用TACloningKit直接克隆入通过用EcoRI的限制性分析筛选转化体以确保插入物的存在，并合并了5个正确的制备物。通过用AscI消化将该插入物从释放，并如上所述通过琼脂糖凝胶电泳纯化片段。将该插入物使用QUICKLIGATIONTMKit克隆入经AscI-线性化的pJfyS1579-41-11，并使用连接混合物依照生产商的实验方案转化大肠杆菌化学感受态细胞。通过序列分析筛选转化体以确保不含PCR错误。一个含有侧翼序列而无错误的质粒命名为pJfyS1698-65-15(图31)并用于插入3’侧翼序列。
将alpA基因的3’侧翼序列从镶片镰孢A3/5基因组DNA使用如下所示的区域特异性正向和反向引物进行扩增。下划线字母代表供之后去除β内酰胺酶的NotI位点，而斜体字母代表用于载体克隆的SbfI位点。
正向引物：
5’-aaaaacctgcaggGGATGTGTGTGGAATAGGATATG-3’(SEQIDNO:97)
反向引物：
5’-aaaaacctgcagggcggccgcCCTCAAGGTGGAGAAATAATCTGT-3’(SEQIDNO:98)
PCR反应物含有1XReactionBuffer，120ng基因组DNA模板，400nm引物，200μMdNTPs和2.5单位DNA聚合酶。
将扩增反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；20个循环，每个在94℃进行30秒，56℃进行30秒，和72℃进行1分10秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
将扩增反应物的5μl部分通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳显影以确保该反应产生了所需的1kb条带。然后将该直接来自PCR反应的插入从所述扩增反应物使用TACloningKit克隆入对所得的质粒进行测序以鉴定含有正确序列的菌落。然后通过SbfI消化将该片段从该质粒释放，并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳纯化。将1kb条带切出并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
然后将该片段使用QUICKLIGATIONTMKit连接于经SbfI线性化的pJfyS1698-65-15(经小牛小肠磷酸酶处理)，并使用该连接混合物依照生产商的指示转化大肠杆菌化学感受态细胞。通过用NotI的限制性分析筛选转化体以确保片段以正确的取向插入，并进行测序以确保没有偏离预计的序列。将所得的质粒pJfyS1698-72-10(图32)用于缺失alpA基因。
实施例37：Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpA镶片镰孢株JfyS1763-11-01的生成
将依照实施例20中所述方法用经NotI-消化和凝胶纯化的pJfyS1698-72-10转化的镶片镰孢JfyS1643-95-04(Δtri5ΔpyrGΔamyA)(实施例26)的三个转化体用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml125μg潮霉素B和10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在室温温育7日。对于Southern分析，将来自3个转化体每一个的2μg镶片镰孢基因组DNA用34单位SphI消化。根据实施例21中所述方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对aplA基因5’侧翼序列的DIG探针。
正向引物：
5'-GCACGTTAGGCTCAAGCCAGCAAGG-3'(SEQIDNO:99)
反向引物：
5'-GAGGCTCATGGATGTGGCGTTAATG-3'(SEQIDNO:100)
如实施例21中所述实施的Southern分析表明三个转化体之一含有缺失盒在alpA基因位点的单一拷贝，并将该转化体命名为JfyS1698-83-2。
将镶片镰孢JfyS1698-83-2如实施例5所述进行孢子形成，并将105个孢子铺板于含有补充了50μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了10μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例21中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒的孢子分离物。该分离物命名为镶片镰孢JfyS1698-94-04。将镶片镰孢JfyS1698-94-04如实施例21中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢JfyS1763-11-01(Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpA)。
如实施例5和20中所述生成并用pDM258转化镶片镰孢JfyS1763-11-01的原生质体。将转化体如实施例35中所述进行分析，并测定发酵液的碱性蛋白酶活性。将AK片(Megazyme,Wicklow,Ireland)通过轻柔地搅拌悬于2.0ml0.01％X-100中。将五百微升该悬液和500μl补充了AK片的测定缓冲液在管中混合并置于冰上。添加了二十微克的蛋白酶样品(稀释于0.01％X-100)。该测定通过将该管转移至设定为测定温度热混合器而起始。将管在热混合器上以1300rpm温育15分钟。该温育通过将管转移回冰浴而停止。然后将管在冰冷的离心机中以16,000xg离心几分钟，并将200μl上清转移至微滴定板。读取在650nm的吸光度作为蛋白酶活性的量度。
如amyA缺失，alpA基因的缺失不对乳糖氧化酶表达具有有利影响。然而，在发酵上清中碱性蛋白酶的副活性减少了10倍(图33)。
实施例38：dps1缺失载体pJfyS111的生成
将镶片镰孢缩酚酸肽(depsipeptide)合酶(dpsI)基因的3’侧翼序列(DNA序列为SEQIDNO:101而推导的氨基酸序列为SEQIDNO:102)从镶片镰孢JfyS1763-11-01基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的SbfI位点，而斜体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的NotI位点。使用PlantMaxiKit提取基因组DNA。
正向引物：
5'-GACTAAGCCCTGCAGGTTGGTCTCAATCGTCGCGACAG-3'(SEQIDNO:103)
反向引物：
5'-AGTCTACCCCTGCAGGCGGCCGCTGGCATCGGTGGACGTAACACGC-3'(SEQIDNO:104)
扩增反应物以50μl的终体积含有1XReactionBuffer，400nM每种引物，200μMdNTP，100ng基因组DNA和1.5单位DNA聚合酶。将扩增反应物在 中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95℃进行30秒，57℃进行30秒，和72℃进行1分20秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
扩增反应物使用PCRPurificationKit纯化。然后用SbfI消化纯化的反应物并对其进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。将1kb条带从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。然后将消化的载体依照生产商建议的实验方案使用QUICKLIGATIONTMKit连接于经SbfI-消化的pJfyS1579-41-11(实施例22)(其经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。通过用EcoRI的限制分析(以检查插入的存在和取向)和序列分析(以确保不含PCR错误)分析所得的克隆，并将所得质粒命名为pJfyS1879-32-2(图34)。
为了获得dps1基因5’端的侧翼序列，如实施例36中所述使用GENOMEWALKERTMUniversalKit及如下所示的基因特异性引物和基因特异性嵌套引物。
基因特异性引物：
5'-GCTATTGAGGGGACTATCTCCATGACTACA-3'(SEQIDNO:105)
基因特异性嵌套引物：
5'-GCCTACCATCGACAGCAGTAAGATATTCC-3'(SEQIDNO:106)
将5’dps1侧翼序列从镶片镰孢JfyS1763-11-1基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行扩增。正向引物中的下划线部分代表引入用于克隆的AscI位点而斜体部分对应于引入用于之后β-内酰胺酶去除的NotI位点。扩增反应和循环参数与上述的那些相同，只是使用的引物是下述那些，所用的退火温度是53℃，而延伸时间为1分15秒。
正向引物：
5’-ATGTGCTACAGGCGCGCCGCGGCCGCGAGTTCCAACATGTCTTATTATCC-3’(SEQIDNO:107)
反向引物：
5’-TACTGTACCGGCGCGCCATCTGAGCCAAGAGACTCATTCAT-3’(SEQIDNO:108)
PCR反应物使用PCRPurificationKit纯化。用AscI消化纯化的反应物，并对其进行使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳。将0.7kb条带从凝胶切出，并如上所述进行琼脂糖提取。将0.7kb条带使用QUICKLIGATIONTMKit连接于pJfyS1879-32-2(经AscI消化而经小牛小肠磷酸酶脱磷酸)。对所得的克隆通过序列分析加以分析以确保不含PCR错误，并将所得的质粒命名为pJfyS111(图35)并用于缺失镶片镰孢dps1基因。
实施例39：Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpAΔdps1镶片镰孢株JfyS1879-57-01的生成
当依照实施例20中所述的方法用经NotI消化的和凝胶纯化的pJfyS111转化镶片镰孢JfyS1763-11-01原生质体时，获得了77个转化体。将其中48个用灭菌牙签从转化板转移至含有补充了每ml125μg潮霉素B和10mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板，并在室温温育7日。
真菌生物质是通过用如实施例21中所述获得的来自7日转化体的四个琼脂栓接种25ml补充了10mM尿苷的M400培养基来产生的。将培养物在28℃以150rpm振荡温育3日。去除琼脂栓，并将培养物经过MIRACLOTHTM过滤。将收获的生物质用液氮冻结，并使用研钵和杵磨碎菌丝体。
使用PlantMaxiKit依照生产商的指示分离基因组DNA，只是在65℃的裂解温育期从10分钟延伸至1.5小时。
将两μg基因组DNA用NcoI和SpeI各28单位在50μl反应体积中在37℃消化22小时。在TAE缓冲液中对消化物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。在凝胶中将DNA通过用0.25MHCl处理进行片段化，用1.5MNaCl-0.5MNaOH变性，用1.5MNaCl-1MTrispH8中和，然后在20XSSC中使用TURBOBLOTTERTMKit转移至Supercharge尼龙膜。将DNA使用UVSTRATALINKERTMUV交联至膜，并在42℃在20mlDIGEasyHyb中预杂交1小时。
依照实施例21中所述的方法使用如下所示的正向和反向引物生成针对dps1基因3’侧翼序列的DIG探针。
正向引物：
5'-CTTGACTATTATCTCACGTTGTCAG-3'(SEQIDNO:109)
反向引物：
5'-TCAAGTGTTGTGTAATGTTGGAACA-3'(SEQIDNO:110)
如实施例21中所述实施的Southern分析表明获得的8个转化体中的三个在dps1位点含有单一拷贝的缺失片段。将一个命名为镶片镰孢JfyS1879-43-05。
将镶片镰孢JfyS1879-43-05如实施例5所述进行孢子形成，并将105个孢子铺板于含有补充了50μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的150mm直径板。将所得的孢子分离物亚培养至含有补充了50μMFdU和0.1mM尿苷的VNO3RLMT培养基的新板。将所得的孢子分离物如实施例21中所述通过Southern分析进行分析，并鉴定了一个正确地切出盒的孢子分离物。该分离物命名为镶片镰孢JfyS1879-52-3。将镶片镰孢JfyS1879-52-03如实施例21中所述进行一次孢子纯化，并挑取一个孢子分离物，并命名为镶片镰孢JfyS1879-57-01(Δtri5ΔpyrGΔamyAΔalpAΔdps1)。
实施例40：构建里氏木霉hemA缺失载体pJfyS120
为了缺失里氏木霉氨基-γ-酮戊酸合酶基因，将3’hemA侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的SbfI位点而粗体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的NotI位点。正向引物(#064877)
5'-TATAGCGTACCTGCAGGTGTCATGCCCGCGGCTTTGCCTTGA-3'(SEQIDNO:111)
反向引物(#064878)
5'-ATGCTGTACCTGCAGGCGGCCGCCGCTCCCGATCATCATCCCTCCGAG-3'(SEQIDNO:112)
扩增反应物由1XReactionBuffer，400nM每种引物，200μMdNTP，125ng基因组DNA和1.5单位DNA聚合酶组成。将反应物在中温育，程序为在95℃进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95℃进行30秒，57℃进行30秒，和72℃进行1分45秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1.5kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
将1.5kb片段使用-TACloningKit依照生产商的指示克隆入并测序以确保不含PCR错误。将片段从pCR2.1通过SbfI消化来释放，并在TAE缓冲液中通过1％琼脂糖凝胶电泳来纯化。将1.5kb条带切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将消化的片段使用QUICKLIGATIONTMKit依照生产商的指示连接于通用缺失载体pJfyS1579-41-11(实施例22)，其之前经SbfI消化和小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将所得的克隆通过序列分析来进行分析以检查插入物的存在和取向以确保不含PCR错误。将所得的质粒命名为pJfyS2010-13-5(图36)。
将5’hemA侧翼序列从里氏木霉RutC30基因组DNA使用如下所示的正向和反向引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分代表引入用于克隆的AscI位点而粗体部分对应于引入用于之后去除β-内酰胺酶的NotI位点。
正向引物(#065245)：
5’-CATGGTTTAAACGGCGGCGCGCCGCGGCCGCAATTCAGAGCATCACGGTTGAGGGA-3’(SEQIDNO:113)
反向引物(#065246)：
5’-CTTGTTTTGTCGGGCGCGCCACATGGCCTTGGATTGACGCAGGAC-3’(SEQIDNO:114)
对扩增反应物实施与上述3’侧翼序列进行的相同方法。将反应物在中温育，其程序为在95℃进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95℃进行30秒，53℃进行30秒，和72℃进行1分15秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
将PCR产物通过使用TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶电泳分离。将大约1kb的片段从凝胶切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。
随后将1kb片段用AscI消化，并如上所述凝胶纯化。将消化的片段使用QUICKLIGATIONTMKit依照生产商连接于pJfyS2010-13-5，其之前经SbfI消化，并经小牛小肠磷酸酶脱磷酸。将所得的克隆通过序列分析加以分析以确保不含PCR错误，并将所得的质粒命名为pJfyS120(图37)。将质粒pJfyS120用于缺失里氏木霉hemA基因。
实施例41：里氏木霉株RutC30的原生质体的生成
为了生成里氏木霉株RutC30的新鲜培养物，将栓从含有浸于10％甘油的菌株栓的储备物转移至新鲜的PDA板，并在28℃温育7日。将孢子在4ml0.01％20中使用灭菌的涂布器收集，并将350μl孢子用于接种带挡板的摇瓶中的25mlYPG2％，并在28℃以90rpm振荡温育16小时。通过如下收集菌丝体：将培养物经过250ml0.2μm过滤器单元过滤并收集在过滤器上的种系(gremlin)。将菌丝体用大约100ml1.2M山梨醇洗涤。将菌丝体重悬于20ml由1MMgSO4中的5mg/mlGLUCANEXTM(Novozymes,Bagsvaerd,DK)和0.36单位/ml甲壳酶(SigmaAldrich,StLouis,MO,USA)组成的原生质体化溶液。将原生质体化溶液在125ml摇瓶中在34℃以90rpm振荡温育25分钟。通过在冰上温育烧瓶来停止反应。将原生质体转移至50ml锥底管(conicalbottomedtube)，并添加30ml冰冷的1.2M山梨醇。将管在室温(大约24-28℃)以377xg在SorvallRT6000B浮筒式离心机(Thermo-FischerScientific,Waltham,MA,USA)中离心10分钟。弃去上清并用30ml1.2M山梨醇洗涤原生质体。重复管离心，并弃去上清。将沉淀重悬于1.2M山梨醇并移出10μl样品以使用血细胞计数器(VWR,WestChester,PA)确定原生质体的浓度。将含有原生质体的管以377xg离心，并将原生质体重悬于TrSTC至终浓度为2x108个原生质体/ml。
实施例42:里氏木霉氨基-γ-酮戊酸合酶(hemA)基因的缺失
将里氏木霉RutC30原生质体如实施例20中所述用经NotI消化和凝胶纯化的缺失载体pJfyS120转化，但具有下述指出的不同之处。将一百μl原生质体转移至添加了2μg凝胶纯化的pJfyS120的14ml聚丙烯管。添加两百五十微升聚乙二醇4000并将管通过颠倒6次轻柔地混合。将管在34℃温育30分钟，之后添加3mlTrSTC。将管内含物铺板于两个含有1M蔗糖和5mM氨基-γ-酮戊酸(ALA)的150mmPDA板，将其在28℃温育16小时。将冷却至50℃，含有PDA、100μg/ml潮霉素B和5mMALA的覆层(overlay)倾至板顶部，并使其在室温冷却30分钟。然后将板在28℃温育5日。
该转化产生134个转化体。将每个转化体转移至含有5ml具有5mMALA和25μg/ml潮霉素B的6孔细胞培养板的一个孔，并在28℃温育5日。通过将少量来自转化体的孢子刮至含有未补充ALA的TrMM培养基的不同的6孔板来测试转化体的ALA营养缺陷型。然后将三个呈现营养缺陷型的转化体亚培养至含有5mMALA的PDA板，并在28℃温育5日。为了生成用于Southern分析的基因组DNA，将5日转化体的四个1cm2栓接种至125ml烧瓶中25ml含有5mMALA的YPG2％培养基，并在28℃以150rpm生长48小时。使用实施例8中所述的相同方法从培养物分离基因组DNA。
对于Southern分析，将2μg基因组DNA用33单位NcoI在50μl反应体积中进行消化，并对其在TAE缓冲液中进行1％琼脂糖电泳。将凝胶中的DNA脱嘌呤、变性并中和，然后如实施例8中所述转移至Supercharge膜。将DNA使用UVSTRATALINKERTMUV交联至膜，并在42℃在20mlDIGEasyHyb中预杂交1小时。
使用PCRDigProbeSynthesisKit依照生产商的指示用如下所示正向和反向引物生成针对hemA基因3’侧翼的探针。
正向(#065764)
5'-GACGCATACAATACAAGCATATGCTGTTGGTGTCT-3'(SEQIDNO:115)
反向(#065765)
5'-AAGGCGTCTGGAAACAGAAGCTGCT-3'(SEQIDNO:116)
扩增反应物由组成1XReactionBuffer，400nM每种引物，200μMDIG-标记的含dUTP-的dNTPs，125ng里氏木霉RutC30基因组DNA和1.5单位DNA聚合酶。将反应物在 中温育，其程序为在95℃进行1个循环2分钟；25个循环，每个在95℃进行30秒，58℃进行30秒，和72℃进行45秒；和在72℃进行1个循环7分钟。
将探针通过TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并将对应于探针的条带切出，并使用GelExtractionKit进行琼脂糖提取。将探针煮沸5分钟，并添加至10mlDIGEasyHyb以产生杂交溶液。杂交在42℃实施15-17小时。然后将膜在高严格条件下在室温在2XSSC加0.1％SDS中洗涤5分钟，然后在0.1XSSC加0.1％SDS中洗涤两次，每次在65℃洗涤15分钟。通过化学发光测定法(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)依照生产商的指示检测探针-靶杂交体。
三个转化体的Southern分析表明所有三个ALA营养缺陷型转化体在hemA位点含有单一拷贝的缺失盒。将一个转化体JfyS2010-52-65用于消除hpt和tk标记。一个新鲜板的孢子通过将7日培养物的栓转移至含有5mMALA板的PDA板并在28℃温育7日来生成。将孢子在10ml0.01％20中使用灭菌的涂布器来收集。孢子浓度使用血细胞计数器确定，并将106个孢子铺板至含有TrMM-G培养基的150mm板，所述培养基含有1mMALA和1μMFdU。
获得了十六个FdU抗性孢子分离物，并如上所述从10个这样的孢子分离物提取DNA。将分离物如上所述通过Southern分析进行分析，而结果显示所有10个孢子分离物在缺失盒的重复之间切出了htp/tk区。挑取一个镶片镰孢菌株JfyS2010-52-65-02(ΔhemA,hpt-,tk-)并将其归档(archived)。
本发明进一步由下述编号的段落描述：
[1]一种用于在丝状真菌细胞基因组中缺失基因或其部分的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和
(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组，以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；
(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第一和第二多核苷酸。
[2]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
[3]段落1的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
[4]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。
[5]段落4的方法，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。
[6]段落1的方法，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[7]段落6的方法，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。
[8]段落1的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[9]段落1-8任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞选自下组：枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、梨孢属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
[10]段落1-8任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞是pyrG营养缺陷型。
[11]段落1-10任一项的方法，还包括(d)将编码目标多肽的多核苷酸引入步骤(c)的分离细胞。
[12]段落1-11任一项的方法，其中所述核酸构建体包含于线性化的重组载体中。
[13]段落1-12任一项的方法，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。
[14]段落1-12任一项的方法，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。
[15]段落1-12任一项的方法，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。
[16]段落1-15任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
[17]段落1的方法，其中整个基因完全缺失，不留下外源DNA。
[18]一种用于缺失丝状真菌细胞基因组中一个基因或其部分的核酸构建体，包含：
(i)第一多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(ii)第二多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iii)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列；和
(iv)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)和(iii)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)和(iii)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同，其中(1)所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而所述第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’，(2)所述第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞基因之内，或(3)所述第一和第二区域中的一个位于丝状真菌细胞基因之内而所述第一和第二区域中的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞的第一和第二区域发生分子间同源重组以缺失基因或其部分并用核酸构建体替代基因或其部分；且所述第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失所述第一和第二多核苷酸。
[19]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
[20]段落18的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
[21]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。
[22]段落21的核酸构建体，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。
[23]段落18的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[24]段落23的核酸构建体，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。
[25]段落18的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[26]段落18-25任一项的核酸构建体，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。
[27]段落18-25任一项的核酸构建体，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。
[28]段落18-25任一项的核酸构建体，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。
[29]段落18-28任一项的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
[30]一种重组载体，包含段落18-29任一项的核酸构建体。
[31]一种重组丝状真菌细胞，包含段落18-29任一项的核酸构建体。
[32]一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组的方法，包括：
(a)将核酸构建体引入丝状真菌细胞，所述核酸构建体包含：
(i)目标第一多核苷酸；
(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iv)第一重复序列，位于第二和第三多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第二和第三多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而目标第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和
(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组，以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；
(b)通过施以阳性选择来选择具有来自步骤(a)的显性阳性选择性表型的细胞；和
(c)通过施以阴性选择来从具有步骤(b)的显性阳性选择性表型的所选细胞选择并分离具有阴性选择性表型的细胞以迫使第一和第二重复序列发生分子内同源重组以缺失第二和第三多核苷酸。
[33]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
[34]段落32的方法，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
[35]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。
[36]段落35的方法，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。
[37]段落32的方法，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[38]段落37的方法，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。
[39]段落32的方法，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[40]段落32-39任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞选自下组：枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属或木霉属细胞。
[41]段落32-39任一项的方法，其中所述丝状真菌细胞是pyrG营养缺陷型。
[42]段落32-41任一项的方法，其中所述核酸构建体包含于线性化的重组载体中。
[43]段落32-42任一项的方法，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。
[44]段落32-42任一项的方法，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。
[45]段落32-42任一项的方法，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。
[46]段落32-45任一项的方法，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
[47]一种用于将多核苷酸引入丝状真菌细胞基因组中的核酸构建体，其包含：
(i)目标第一多核苷酸；
(ii)第二多核苷酸，包含显性阳性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞显性阳性选择性表型；
(iii)第三多核苷酸，包含阴性选择性标记编码序列，当其表达时，赋予所述丝状真菌细胞阴性选择性表型；
(iv)第一重复序列，位于第一和第二多核苷酸的5’，以及第二重复序列，位于第一和第二多核苷酸的3’，其中所述第一和第二重复序列包含相同序列，而编码目标多肽的第一多核苷酸位于第一重复的5’或第二重复的3’；和
(v)第一侧翼序列，其位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的5’，以及第二侧翼序列，位于组分(i)、(ii)、(iii)和(iv)的3’，其中第一侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第一区域相同而第二侧翼序列与所述丝状真菌细胞基因组的第二区域相同；
其中所述第一和第二侧翼序列分别与所述丝状真菌细胞基因组的第一和第二区域发生分子间同源重组以将所述核酸构建体引入所述丝状真菌细胞的基因组；且所述第一和第二重复序列可发生分子内同源重组以缺失所述第二和第三多核苷酸。
[48]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)、草胺膦乙酰转移酶基因(pat)、博来霉素、zeocin和腐草霉素(phleomycin)抗性基因(ble)、乙酰胺酶基因(amdS)、吡啶硫胺抗性基因(ptrA)、嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因(pac)、新霉素-卡那霉素磷酸转移酶基因(neo)、乙酰CoA合酶基因(acuA)、D-丝氨酸脱水酶基因(dsdA)、ATP硫酰酶基因(sC)、线粒体ATP合酶亚基9基因(oliC)、氨基糖苷磷酸转移酶3′(I)(aph(3′)I)基因，和氨基糖苷磷酸转移酶3′(II)(aph(3′)II)基因。
[49]段落47的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记由选自下组的基因的编码序列所编码：胸苷激酶基因(tk)、乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)和胞嘧啶脱氨酶基因(codA)。
[50]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的。
[51]段落47的核酸构建体，其中所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[52]段落47的核酸构建体，其中所述显性阳性选择性标记是由潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)的编码序列所编码的而所述阴性选择性标记是由胸苷激酶基因(tk)的编码序列所编码的。
[53]段落47的核酸构建体，其中所述hpt编码序列是从大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因获得的。
[54]段落47的核酸构建体，其中所述tk编码序列是从单纯疱疹病毒1型基因获得的。
[55]段落47-54任一项的核酸构建体，其中所述第一区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的5’而第二区域位于丝状真菌细胞基因或其部分的3’。
[56]段落47-54任一项的核酸构建体，其中第一和第二区域两者均位于丝状真菌细胞的基因内。
[57]段落47-54任一项的核酸构建体，所述第一和第二区域的一个位于丝状真菌细胞基因之内，而所述第一和第二区域的另一个位于丝状真菌细胞基因的5’或3’。
[58]段落47-57任一项的核酸构建体，其中所述第一和第二重复序列与第一侧翼序列或第二侧翼序列相同。
[59]一种重组载体，包含段落47-58任一项的核酸构建体。
[60]一种重组丝状真菌细胞，包含段落47-58任一项的核酸构建体。
[61]一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照段落1-17任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回收所述多肽。
[62]段落61的方法，其中所述多肽对于丝状真菌细胞是内源的。
[63]段落61的方法，其中所述多肽是由引入所述丝状真菌细胞的多核苷酸编码的外源(异源)多肽。
[64]一种产生多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下，培养依照段落32-46任一项获得的丝状真菌细胞；和(b)回所述收多肽。
[65]段落65的方法，其中所述多肽对于所述丝状真菌细胞是内源的。
[66]段落65的方法，其中所述多肽是由引入所述丝状真菌细胞的多核苷酸编码的外源(异源)多肽。
[67]一种分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，选自下组：(a)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由在优选至少中等严格条件下，更优选至少中高严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交的多核苷酸编码；和(c)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸具有与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选地，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列。
[68]段落67的分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段，或由SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段组成。
[69]一种分离的多核苷酸，其编码段落67或68的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶。
[70]段落69的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列，或由SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列组成。
[71]一种核酸构建体，其包含段落69或70的多核苷酸。
[72]一种重组表达载体，其包含段落69或70的多核苷酸。
[73]一种重组丝状真菌细胞，其包含段落69或70的多核苷酸。
[74]一种产生段落67或68的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的方法，包括：在有助于产生乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述构建体包含编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核苷酸序列。
本文中描述和要求保护的本发明并不受限于本文中公开的具体方面的范围，因为这些方面意欲说明本发明的几个方面。任何等同的方面意欲在本发明的保护范围之内。事实上，除了本文中显示和描述的之外，本发明的多种修饰对于本领域技术人员从前述描述而言是显而易见的。此类修饰也意欲落入所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下，应以包括定义的本公开为准。

Claims (9)

1.一种分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其选自下组：(a)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含与SEQIDNO:52的成熟多肽具有优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选至少95％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少中等严格条件下，更优选至少中等严格条件下，甚至更优选至少高严格条件下且最优选非常高严格条件下与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列或其全长互补链杂交；和(c)乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸包含与SEQIDNO:51的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性，且最优选地，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列。
2.权利要求1的分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其包含SEQIDNO:52。
3.权利要求1的分离的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶，其由SEQIDNO:52或其具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段组成。
4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1-3中任一项的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶。
5.权利要求4的分离的多核苷酸，其包含SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列。
6.权利要求4的分离的多核苷酸，其由SEQIDNO:51或其编码具有乳清苷-5’-磷酸脱羧酶活性的片段的亚序列组成。
7.一种核酸构建体，其包含权利要求4-6中任一项的多核苷酸。
8.一种重组丝状真菌细胞，其包含权利要求4-6中任一项的多核苷酸。
9.一种产生权利要求1-3中任一项的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的方法，其包括：在有助于产生所述乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述构建体包含编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶的核苷酸序列。
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Families Citing this family (202)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012030845A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US9267126B2 (en) 2010-08-30 2016-02-23 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030858A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having hemicellulolytic activity and polynucleotides encoding same
US8624082B2 (en) 2010-08-30 2014-01-07 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2735611B1 (en) 2010-08-30 2018-11-21 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US9187742B2 (en) 2010-08-30 2015-11-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2622070T3 (en) 2010-09-30 2016-11-21 Novozymes Inc Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
WO2012044835A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Novozymes, Inc. Variants of polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2622069B1 (en) 2010-10-01 2015-11-25 Novozymes, Inc. Beta-glucosidase variants and polynucleotides encoding same
BR112013009817B1 (pt) 2010-10-26 2020-02-04 Novozymes As métodos de degradar ou converter refugo de cana de açúcar, de produzir um produto de fermentação, e, de fermentar refugo de cana de açúcar
ES2541492T3 (es) 2010-11-02 2015-07-21 Novozymes, Inc. Métodos para pretratar material celulósico con polipéptido GH61
DK2635594T3 (en) 2010-11-04 2017-04-03 Novozymes Inc Polypeptides with cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding them
EP2638153B1 (en) 2010-11-12 2017-07-12 Novozymes Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
DK2640833T3 (en) 2010-11-18 2016-11-28 Novozymes Inc Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing ACTIVITY AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THEM
CN105420267A (zh) 2010-11-30 2016-03-23 诺维信股份有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
WO2012078712A2 (en) 2010-12-07 2012-06-14 Vnomics Corp. System and method for measuring and reducing vehicle fuel waste
DK2652138T3 (en) 2010-12-16 2018-01-22 Novozymes Inc Promoters for expression of genes in a fungal cell
EP2668265B1 (en) 2011-01-26 2017-07-26 Novozymes A/S Novel glycoside hydrolases from thermophilic fungi
WO2012103350A1 (en) 2011-01-26 2012-08-02 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
DK2678352T3 (en) 2011-02-23 2018-03-05 Novozymes Inc Polypeptides with cellulolysis enhancing activity and polynucleotides encoding them
US9150842B2 (en) 2011-03-09 2015-10-06 Novozymes A/S Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
WO2012122477A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US20140080182A1 (en) 2011-03-31 2014-03-20 Novozymes, Inc. Cellulose Binding Domain Variants and Polynucleotides Encoding Same
CN103649308A (zh) 2011-04-28 2014-03-19 诺维信股份有限公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US9624518B2 (en) 2011-04-29 2017-04-18 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US20140141471A1 (en) 2011-05-19 2014-05-22 Novozymes, Inc. Methods for Enhancing the Degradation of Cellulosic Material with Chitin Binding Proteins
EP2710133A1 (en) 2011-05-19 2014-03-26 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
EP2527432A1 (en) * 2011-05-23 2012-11-28 Novozymes A/S Bi-directional cytosine deaminase-encoding selection marker
EP2527448A1 (en) 2011-05-23 2012-11-28 Novozymes A/S Simultaneous site-specific integrations of multiple gene-copies in filamentous fungi
WO2013028915A2 (en) 2011-08-24 2013-02-28 Novozymes, Inc. Methods for obtaining positive transformants of a filamentous fungal host cell
EP2748314B1 (en) 2011-08-24 2016-12-28 Novozymes, Inc. Aspergillus fumigatus cellulolytic enzyme compositions and uses thereof
IN2014CN02136A (zh) 2011-08-24 2015-05-29 Novozymes Inc
BR112014004186B1 (pt) 2011-08-24 2020-12-15 Novozymes, Inc. Composição enzimática, célula hospedeira de fungo filamentoso recombinante, método para produzir uma composição enzimática, processos para degradar um material celulósico, para sintetizar um produto de fermentação, e, para fermentar um material celulósico
WO2013043910A1 (en) 2011-09-20 2013-03-28 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2013089889A2 (en) 2011-09-30 2013-06-20 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2013044867A1 (en) 2011-09-30 2013-04-04 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
DK2773656T3 (da) 2011-10-31 2019-09-09 Novozymes Inc Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
US9562222B2 (en) 2011-11-18 2017-02-07 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
CN109112118A (zh) 2011-11-21 2019-01-01 诺维信股份有限公司 Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸
EP2782998B1 (en) 2011-11-22 2018-01-10 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
BR112014012417A2 (pt) 2011-12-01 2017-06-06 Novozymes Inc polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para a produção de um polipeptídeo, de um mutante de uma célula de origem, e de uma proteína, e para a inibição da expressão de um polipeptídeo, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, molécula de rna, processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
WO2013087027A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Novozymes, Inc. Polypeptides having laccase activity and polynucleotides encoding same
BR112014014697A2 (pt) 2011-12-19 2020-10-27 Novozymes, Inc. polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, para gerar oxigênio molecular, e para remover peróxido de hidrogênio do tecido, processos para degradar ou converter um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
WO2013096603A2 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Novozymes, Inc. Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
DK2841567T3 (en) 2012-04-27 2017-10-16 Novozymes Inc GH61 polypeptide variants and polynucleotides encoding them
WO2014028833A1 (en) 2012-08-17 2014-02-20 Novozymes A/S Methods for co-silencing expression of genes in filamentous fungal strains and uses thereof
US20150210991A1 (en) 2012-09-19 2015-07-30 Novozymes, Inc. Methods For Enhancing The Degradation Or Conversion Of Cellulosic Material
DK2903412T3 (da) 2012-10-08 2019-12-16 Novozymes As Polypeptider med cellulolyseforbedrende aktivitet og polynukleotider, som koder for dem
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
US9765373B2 (en) 2012-12-14 2017-09-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2014099798A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancinc activity and polynucleotides encoding same
BR112015014624A2 (pt) 2012-12-24 2017-10-10 Novozymes As polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, método para tratamento de têxtil
EP2964760B1 (en) 2013-03-08 2021-05-12 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN105378050A (zh) 2013-04-18 2016-03-02 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
EP2994529B1 (en) 2013-05-10 2018-11-21 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2997143A1 (en) 2013-05-17 2016-03-23 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
CN105339494B (zh) 2013-07-17 2020-04-17 诺维信公司 普鲁兰酶嵌合体以及编码它们的多核苷酸
US10010094B2 (en) 2013-08-15 2018-07-03 Novozymes A/S Polypeptides having beta-1,3-galactanase activity and polynucleotides encoding same
CN105518142B (zh) 2013-10-25 2020-07-28 诺维信公司 具有内切葡聚糖酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸
US20170166939A1 (en) 2013-11-26 2017-06-15 Novozymes A/S Enzyme Compositions and Uses Thereof
US10030237B2 (en) 2014-01-22 2018-07-24 Novozymes A/S Pullulanase variants and polynucleotides encoding same
US10123535B2 (en) 2014-03-05 2018-11-13 Novozymes A/S Compositions and methods for improving post-harvest properties of agricultural crops
EP3114272A1 (en) 2014-03-05 2017-01-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
EP3114276B1 (en) 2014-03-05 2019-01-16 Novozymes A/S Compositions and methods for functionalizing and linking materials
US20160348035A1 (en) 2014-03-05 2016-12-01 Novozymes A/S Compositions and Methods for Improving Properties of Non-Cellulosic Textile Materials with Xyloglucan Endotransglycosylase
BR112016020374A2 (pt) 2014-03-05 2018-01-23 Novozymes As formulação, e, métodos para potenciar o crescimento de plantas e para formular um ou mais agentes agricolamente benéficos
CN106103704A (zh) 2014-03-19 2016-11-09 诺维信公司 具有磷脂酶c活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸
EP3126479A1 (en) 2014-04-01 2017-02-08 Novozymes A/S Polypeptides having alpha amylase activity
EP3722406A1 (en) 2014-04-11 2020-10-14 Novozymes A/S Detergent composition
WO2015187935A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
EP3155097A1 (en) 2014-06-12 2017-04-19 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CN106795504A (zh) 2014-08-20 2017-05-31 诺维信公司 木葡聚糖内糖基转移酶变体以及编码其的多核苷酸
US11390898B2 (en) 2014-09-05 2022-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2016090059A1 (en) 2014-12-02 2016-06-09 Novozymes A/S Laccase variants and polynucleotides encoding same
CN107002049A (zh) 2014-12-16 2017-08-01 诺维信公司 具有n‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽
CN114717217A (zh) 2014-12-19 2022-07-08 诺维信公司 包括具有木聚糖酶活性的多肽和具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的组合物
WO2016124239A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Aurealis Oy Recombinant probiotic bacteria for use in the treatment of a skin dysfunction
EP3739045A3 (en) 2015-02-24 2021-03-10 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
US10385352B2 (en) 2015-03-09 2019-08-20 Novozymes A/S Methods of introducing multiple expression constructs into a eukaryotic cell
WO2016188459A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2016196202A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CA2981342A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 Novozymes A/S Polypeptides having trehalase activity and the use thereof in process of producing fermentation products
WO2016207373A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Novozymes A/S Polypeptides having peroxygenase activity
EP3313193B1 (en) 2015-06-26 2021-03-24 Novozymes A/S Method for producing a coffee extract
EP3313990A4 (en) 2015-06-26 2019-01-23 Novozymes A/S BIOLOGICAL FINISHING TREATMENT SYSTEM
EP3317293A4 (en) 2015-07-02 2019-03-20 Novozymes A/S ANIMAL FOOD COMPOSITIONS AND USES THEREOF
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN108138153A (zh) 2015-07-24 2018-06-08 诺维信股份有限公司 具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
US20180171315A1 (en) 2015-09-17 2018-06-21 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
EP3353195B1 (en) 2015-09-22 2021-11-10 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
EP3708660A3 (en) 2015-10-07 2020-12-30 Novozymes A/S Polypeptides
EP4324919A2 (en) 2015-10-14 2024-02-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
US20190078097A1 (en) 2015-10-30 2019-03-14 Novozymes A/S Polynucleotide Constructs For In Vitro and In Vivo Expression
JP6821598B2 (ja) 2015-12-07 2021-01-27 ザイマージェン インコーポレイテッド Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のプロモーター
US9988624B2 (en) 2015-12-07 2018-06-05 Zymergen Inc. Microbial strain improvement by a HTP genomic engineering platform
US11208649B2 (en) 2015-12-07 2021-12-28 Zymergen Inc. HTP genomic engineering platform
EP3408386A1 (en) 2016-01-29 2018-12-05 Novozymes A/S Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
US20190048413A1 (en) 2016-02-23 2019-02-14 Novozymes A/S Improved next-generation sequencing
WO2017151957A1 (en) 2016-03-02 2017-09-08 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
EP3433358B1 (en) 2016-03-24 2022-07-06 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
CN108779155A (zh) 2016-04-19 2018-11-09 诺维信公司 RlmA灭活的丝状真菌宿主细胞
BR112018072282A2 (pt) 2016-04-29 2019-02-12 Novozymes A/S composições detergentes e usos das mesmas
US10927359B2 (en) 2016-05-24 2021-02-23 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having galactanase activity and polypeptides having beta-galactosidase activity
US11058129B2 (en) 2016-05-24 2021-07-13 Novozymes A/S Animal feed additives
US10947520B2 (en) 2016-05-24 2021-03-16 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having galactanase activity and polypeptides having beta-galactosidase activity
WO2017202966A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-galactosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2017211803A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 Novozymes A/S Co-expression of heterologous polypeptides to increase yield
KR102345899B1 (ko) 2016-06-30 2021-12-31 지머젠 인코포레이티드 박테리아 헤모글로빈 라이브러리를 생성하는 방법 및 이의 용도
US10544411B2 (en) 2016-06-30 2020-01-28 Zymergen Inc. Methods for generating a glucose permease library and uses thereof
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
EP3481959A1 (en) 2016-07-06 2019-05-15 Novozymes A/S Improving a microorganism by crispr-inhibition
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
BR112019000125A2 (pt) 2016-07-08 2019-07-09 Novozymes As grânulo, polipeptídeo isolado, composição, aditivo de ração animal, ração animal peletizada, métodos de aprimoramento de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, de preparação de uma ração animal, para aprimorar o valor nutricional de uma ração animal, de solubilização de xilana a partir do material à base de planta e de produção do polipeptídeo, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, e, uso do grânulo
EP3485010A1 (en) 2016-07-13 2019-05-22 The Procter and Gamble Company Bacillus cibi dnase variants and uses thereof
CN109790525A (zh) 2016-07-18 2019-05-21 诺维信公司 脂肪酶变体、编码其的多核苷酸及其用途
EP3487997B1 (en) 2016-07-20 2021-03-24 Novozymes A/S Heat-stable metagenomic carbonic anhydrases and their use
US11046736B2 (en) 2016-07-22 2021-06-29 Novozymes A/S Filamentous fungal host
WO2018015444A1 (en) 2016-07-22 2018-01-25 Novozymes A/S Crispr-cas9 genome editing with multiple guide rnas in filamentous fungi
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
CN109563522A (zh) 2016-09-15 2019-04-02 诺维信公司 真菌宿主细胞中dna片段的基因组整合
WO2018077938A1 (en) 2016-10-25 2018-05-03 Novozymes A/S Detergent compositions
US20210284991A1 (en) 2016-11-21 2021-09-16 Novozymes A/S Yeast Cell Extract Assisted Construction of DNA Molecules
CA3039809A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
CN110268063A (zh) * 2016-12-30 2019-09-20 齐默尔根公司 利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的方法
WO2018167153A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cell
WO2018172155A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 Novozymes A/S Improved filamentous fungal host cells
EP3601551A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having rnase activity
US11053483B2 (en) 2017-03-31 2021-07-06 Novozymes A/S Polypeptides having DNase activity
WO2018177938A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
WO2018185181A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Glycosyl hydrolases
WO2018185152A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
US20200109354A1 (en) 2017-04-04 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides
CN110719956A (zh) 2017-06-06 2020-01-21 齐默尔根公司 用于改良真菌菌株的高通量基因组工程改造平台
MX2019014889A (es) 2017-06-28 2020-02-13 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad trehalasa y polinucleotidos que los codifican.
KR20200035060A (ko) 2017-07-24 2020-04-01 노보자임스 에이/에스 습식 제분에서의 gh5 및 gh30
AR112955A1 (es) 2017-09-01 2020-01-08 Novozymes As Aditivos de alimento animal que comprenden polipéptidos que tienen actividad proteasa y usos de los mismos
BR112020001577B1 (pt) 2017-09-01 2023-12-26 Novozymes A/S Aditivo de ração animal, formulação líquida, ração animal, métodos para melhoria de um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, para preparação de uma ração animal, para o tratamento de proteínas, para aumento da digestibilidade e/ou solubilidade da proteína, para melhoria do valor nutricional de uma ração animal e para produção de um polipeptídeo, e, uso do aditivo de ração animal
WO2019046703A1 (en) 2017-09-01 2019-03-07 Novozymes A/S METHODS OF ENHANCING GENOME EDITION IN FUNGI
CN111417725A (zh) 2017-10-02 2020-07-14 诺维信公司 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
EP3692148A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
CN111148830A (zh) 2017-10-04 2020-05-12 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽和编码其的多核苷酸
PL3476935T3 (pl) 2017-10-27 2022-03-28 The Procter & Gamble Company Kompozycje detergentowe zawierające odmiany polipeptydowe
WO2019081721A1 (en) 2017-10-27 2019-05-02 Novozymes A/S VARIANTS OF DNASE
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
EP3707252A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Novozymes A/S Temperature-sensitive cas9 protein
WO2019096903A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Novozymes A/S New galactanases (ec 3.2.1.89) for use in soy processing
US20210017544A1 (en) 2017-12-22 2021-01-21 Novozymes A/S Counter-Selection by Inhibition of Conditionally Essential Genes
WO2019185535A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Novozymes A/S Fungal chaperone proteins
BR112020020744A2 (pt) 2018-04-09 2021-02-02 Novozymes A/S polipeptídeos tendo atividade de alfa-amilase e polinucleotídeos codificando os mesmos
US11028401B2 (en) 2018-06-06 2021-06-08 Zymergen Inc. Manipulation of genes involved in signal transduction to control fungal morphology during fermentation and production
WO2020002575A1 (en) 2018-06-28 2020-01-02 Novozymes A/S Polypeptides having pectin lyase activity and polynucleotides encoding same
CN112585267A (zh) 2018-08-02 2021-03-30 诺维信公司 使用内含子制备dna构建体的组合文库
US11473076B2 (en) 2018-08-31 2022-10-18 Novozymes A/S Animal feed additives and compositions comprising an S8 serine protease
CN113056476A (zh) 2018-10-03 2021-06-29 诺维信公司 具有α-甘露聚糖降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN113056552A (zh) 2018-10-09 2021-06-29 诺维信公司 经修饰的丝状真菌宿主细胞
WO2020092608A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Novozymes A/S Genome editing by guided endonuclease and single-stranded oligonucleotide
US20220025423A1 (en) 2018-11-28 2022-01-27 Novozymes A/S Modified Filamentous Fungal Host Cells
CN113166211A (zh) 2018-11-28 2021-07-23 诺维信公司 改善的丝状真菌宿主细胞
CN113302293A (zh) 2018-12-12 2021-08-24 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸
CN113302305A (zh) 2018-12-12 2021-08-24 诺维信公司 提高丝状真菌细胞在多肽的产生方面的生产力的方法
CN113366103A (zh) 2018-12-21 2021-09-07 诺维信公司 具有肽聚糖降解活性的多肽以及编码其的多核苷酸
WO2020127198A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Tandem protein expression
WO2020160126A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and use thereof for improving the nutritional quality of animal feed
WO2020173817A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Novozymes A/S Calcite binding proteins
WO2020201403A1 (en) 2019-04-03 2020-10-08 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
CN113874499A (zh) 2019-04-10 2021-12-31 诺维信公司 多肽变体
CN113939588A (zh) 2019-05-15 2022-01-14 诺维信公司 温度敏感性的rna指导的内切核酸酶
US20220298517A1 (en) 2019-06-25 2022-09-22 Novozymes A/S Counter-selection by inhibition of conditionally essential genes
EP4004211A1 (en) 2019-07-25 2022-06-01 Novozymes A/S Filamentous fungal expression system
EP4004187A1 (en) 2019-07-26 2022-06-01 Novozymes A/S Modified filamentous fungal host cell
US20230012672A1 (en) 2019-09-16 2023-01-19 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity and polynucleotides encoding same
US20220340843A1 (en) 2019-10-03 2022-10-27 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
CN114761551A (zh) 2019-12-19 2022-07-15 诺维信公司 木聚糖酶变体和编码其的多核苷酸
EP4077656A2 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
EP4093188A1 (en) 2020-01-24 2022-11-30 Novozymes A/S Mutants of a filamentous fungal cell having increased productivity in the production of a polypeptide
WO2021152120A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2021152123A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2021163030A2 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-amylase activity and polynucleotides encoding same
WO2021163015A1 (en) 2020-02-10 2021-08-19 Novozymes A/S Process for producing ethanol from raw starch using alpha-amylase variants
MX2022009515A (es) 2020-02-10 2022-09-02 Novozymes As Variantes de alfa-amilasa y polinucleotidos que las codifican.
EP4110909A1 (en) 2020-02-26 2023-01-04 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2021183622A1 (en) 2020-03-12 2021-09-16 Novozymes A/S Crispr-aid using catalytically inactive rna-guided endonuclease
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
CN115516071A (zh) 2020-04-21 2022-12-23 诺维信公司 包含具有果聚糖降解活性的多肽的清洁组合物
US11479779B2 (en) 2020-07-31 2022-10-25 Zymergen Inc. Systems and methods for high-throughput automated strain generation for non-sporulating fungi
CN116323932A (zh) 2020-08-28 2023-06-23 诺维信公司 具有改善的溶解度的蛋白酶变体
EP4229189A1 (en) 2020-10-13 2023-08-23 Novozymes A/S Glycosyltransferase variants for improved protein production
EP4237430A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 Novozymes A/S Leader peptides and polynucleotides encoding the same
EP4237555A1 (en) 2020-11-02 2023-09-06 Novozymes A/S Glucoamylase variants and polynucleotides encoding same
EP4263822A1 (en) 2020-12-15 2023-10-25 Novozymes A/S Mutated host cells with reduced cell motility
WO2022175440A1 (en) 2021-02-18 2022-08-25 Novozymes A/S Inactive heme polypeptides
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
US20240060061A1 (en) 2021-03-15 2024-02-22 Novozymes A/S Dnase variants
CN116615536A (zh) 2021-03-15 2023-08-18 宝洁公司 含有多肽变体的清洁组合物
WO2022251056A1 (en) 2021-05-27 2022-12-01 Novozymes A/S Transcriptional regulators and polynucleotides encoding the same
WO2022268885A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050181509A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 The Penn State Research Foundation Dual selection based, targeted gene disruption method for fungi and fungus-like organisms
EP1826273A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-29 Noda Institute For Scientific Research Method for the production of a strain having a deleted region in chromosome

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6555370B1 (en) * 1990-11-13 2003-04-29 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
GB9505663D0 (en) * 1995-03-21 1995-05-10 Stringer Bradley M J Genetically modified neural cells
US6207442B1 (en) * 1997-10-16 2001-03-27 Zymogenetics, Inc. Plasmid construction by homologous recombination
CA2664414C (en) * 2006-09-28 2016-07-12 Bayer Bioscience N.V. Methods and means for removal of a selected dna sequence
WO2009069986A2 (en) * 2007-11-30 2009-06-04 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Genetically-modified cell line for producing cloned miniature pigs for xenotransplantation and method for preparing the same.

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050181509A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 The Penn State Research Foundation Dual selection based, targeted gene disruption method for fungi and fungus-like organisms
EP1826273A1 (en) * 2006-02-22 2007-08-29 Noda Institute For Scientific Research Method for the production of a strain having a deleted region in chromosome

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAKAHASHI T. 等: "Efficient gene disruption in the koji-mold Aspergillus sojae using a novel variation of the positive-negative method", 《MOLECULAR GENETICS AND GENOMICS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2356242A2 (en) 2011-08-17
CN102224245A (zh) 2011-10-19
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WO2010039889A3 (en) 2010-08-12
JP2012504390A (ja) 2012-02-23

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