CN103261420B - 用于在真菌细胞中表达基因的启动子 - Google Patents
用于在真菌细胞中表达基因的启动子 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分离的启动子,以及包含这种与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子的构建体、载体和真菌宿主细胞。本发明还涉及生产这种多肽的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年12月16日提交的美国临时申请序列号第61/423,909号的权益,该申请并入本文以作参考。
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式并入本文以作参考。
技术领域
本发明涉及生产多肽的方法。本发明还涉及分离的启动子以及包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接(operablylinked)的启动子的核酸构建体(construct)、载体和宿主细胞。
背景技术
多肽在真菌宿主细胞例如丝状真菌细胞中的重组生产,可以提供更合乎需要的载体用于以商业相关的量生产多肽。
通过构建表达盒而完成多肽的重组生产,在表达盒中,编码多肽的DNA处于从基因上分离的适用于宿主细胞的启动子的表达控制下。通常通过质粒介导的转化将表达盒引入宿主细胞中。之后通过在对于表达盒中所包含的启动子的适当运作有必要的诱导条件下,培养被转化的宿主细胞,从而实现多肽的生产。
真菌宿主细胞在重组生产多肽中的使用,通常需要适合于在宿主细胞中控制多肽表达的启动子的可用性。因此,领域内需要新的启动子来控制基因的重组表达。
本发明提供改善的用于在真菌宿主细胞中生产多肽的方法。
发明内容
本发明涉及用于生产多肽的方法,包括:(a),在有益于生产多肽的介质中培养真菌宿主细胞,其中真菌宿主细胞包括与选自以下的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸,所述启动子选自(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子,(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子,(iii)包括SEQIDNO:1的启动子,(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子,以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b),从培养介质中分离多肽。
本发明还涉及选自以下的分离的启动子:(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子;(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子;(iii)包括SEQIDNO:1的启动子;(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子;以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子。
本发明还涉及构建体、载体和真菌宿主细胞,其包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的本发明启动子。
附图说明
图1示出pSMai226的限制性图谱。
图2示出pSaMe-CatP的限制性图谱。
图3示出里氏木霉(Trichodermareesei)过氧化氢酶启动子的DNA序列(SEQIDNO:1)。
具体实施方式
定义
等位变体(allelicvariant):术语“等位变体”是指占据相同染色体基因座的两种或多种(例如,数种)可替换基因形式中的任一种。等位变体自然地通过突变而产生,且可以引起群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化),或者可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。
cDNA:术语“cDNA”是指能够通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制得的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录子是mRNA的前体,其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤加工,包括剪接。
编码序列:术语“编码序列”是指多核苷酸,其直接明确多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框决定,其以起始密码子例如ATG、GTG或TTG开始,并以终止密码子例如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列:术语“控制序列”是指对于编码多肽的多核苷酸的表达为必要的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是原生的(native)(即,来自相同基因)或外源的(即,来自不同基因)。这样的控制序列包括但不限于,前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入特定限制性酶切位点的目的,控制序列可具有接头,其促进控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区域的连接。
表达:术语“表达”包括涉及到多肽生产中的任何步骤,包括但不限于:转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”是指包括编码多肽的多核苷酸并且可操作地与用于其表达的控制序列相连接的线性或环状DNA分子。
高等严格条件:术语“高等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在65℃下清洗三次,每次15分钟。
宿主细胞:术语“宿主细胞”是指对转化、转染、转导等敏感的任何细胞类型,其具有包含感兴趣的多核苷酸的核酸构建体或表达载体。术语“宿主细胞”包括因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任意后代。
杂合启动子:术语“杂合启动子”是指两个或更多个(例如,数个)启动子的部分,这些部分连接在一起以生成该两个或更多个启动子部分的融合的序列,当杂合启动子与编码序列可操作地连接时,其介导编码序列转录为mRNA。
分离的:术语“分离的”是指处于非天然出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括:(1)任何非天然出现的物质;(2)包括但不限于任何酶、变体、多核苷酸、蛋白、肽或辅助因子的任何物质,其至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然出现的成分中移出;(3)相对于天然出现的物质有人工修饰的任何物质;或者(4)通过增加物质相对于其天然相关的其他组分(例如,多个拷贝的物质编码基因;使用比与编码物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)的含量而修饰的任意物质。感兴趣多肽可以以发酵液产物的形式用于工业应用中,即,多肽是用作工业应用(例如,乙醇生产)中产物的发酵液的组分。除感兴趣多肽外,发酵液产物还包括用于发酵过程中的其他成分,例如,细胞(包括,含有用来生产多肽的编码感兴趣多肽的基因的宿主细胞)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。发酵液可以任选地进行一个或多个纯化(包括过滤)步骤,以除去或降低发酵过程中的一种以上的组分。因此,分离的物质可以存在于这样的发酵液产物中。
低等严格条件:术语“低等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在50℃下清洗三次,每次15分钟。
成熟多肽:术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N端加工、C端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。领域内公知,宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同成熟多肽(即,具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有生物学活性的成熟多肽的多核苷酸。
中等严格条件:术语“中等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在55℃下清洗三次,每次15分钟。
中-高等严格条件:术语“中-高等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在60℃下清洗三次,每次15分钟。
核酸构建体:术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离的、或以自然中不会另外出现的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。
可操作地连接:术语“可操作地连接”是指如下的构造,其中,控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在合适位置处,从而控制序列指导编码序列的表达。
多肽片段:术语“多肽片段”是指在成熟多肽的氨基和/或羧基端缺少一个或多个(例如,数个)氨基酸的多肽;其中,片段具有生物学活性。在一个方面,片段具有成熟多肽的至少85%,例如至少90%或至少95%的氨基酸数量。
多肽突体:术语“多肽突体”是指包括在一个或多个(例如数个)位置上的改变(即替换、插入和/或缺失)且具有生物学活性的多肽。替换是指用不同的氨基酸替换占据某位置的氨基酸;缺失是指去除某占据位置的氨基酸;并且插入是指增加与占据某位置的氨基酸相邻以及紧接其后的氨基酸。
启动子:术语“启动子”是指与RNA聚合酶结合并将聚合酶引导至编码多肽的多核苷酸的正确下游转录起始位点以起始转录的DNA序列。RNA聚合酶有效地催化与编码区域的合适DNA链互补的信使RNA的组装。术语“启动子”也将被理解为包括用于在转录成mRNA之后的翻译的5′非编码区(在启动子和翻译起始之间)、顺式作用转录调控元件例如增强子,以及能够与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。
启动子变体:术语“启动子变体”是指在一个或多个(例如,数个)位置上包括改变(即替换、插入和/或缺失)的启动子。替换是指用不同的核苷酸替换占据某位置的核苷酸;缺失是指去除占据位置的核苷酸;并且插入是指增加与占据某位置的核苷酸相邻以及紧接其后的核苷酸。术语“启动子变体”也将包括天然变体以及使用领域内已知的方法例如经典诱变、定点突变和DNA改组而得到的体外生成的变体。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个多核苷酸序列之间的关联性通过参数“序列一致性”来说明。
出于本发明的目的,使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice等人,2000,TrendsGenet.16:276-277)(优选3.0.0、5.0.0版本或更新)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(NeedlemanandWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所用的参数:空位开放罚分为10,空位扩展罚分为0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。Needle标记的“最长一致度”的输出(使用-nobrief选项得到的)被用作百分比一致度并如下计算:
(相同残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的,使用在EMBOSS软件包(EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(欧洲分子生物学开放软件包),Rice等人,2000,同上)(优选3.0.0、5.0.0版本或更新)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(NeedlemanandWunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所用的参数:空位开放罚分为10,空位扩展罚分为0.5,以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。Needle标记的“最长一致度”的输出(使用-nobrief选项得到的)被用作百分比一致度并如下计算:
(相同脱氧核糖核酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列:术语“子序列”是指缺少成熟多肽编码序列的5’和/或3’端的一个或多个(例如,数个)核苷酸的多肽,且其中子序列编码具有生物学活性的片段;或者指缺少启动子序列的5’和/或3’端的一个或多个(例如,数个)核苷酸的多核苷酸,且其中启动子序列具有启动子活性。在一个方面,子序列具有成熟多肽编码序列的至少85%,例如至少90%或至少95%的核苷酸数量。在另一个方面,启动子序列具有启动子序列的至少85%,例如至少90%或至少95%的核苷酸数量。
串联启动子:术语“串联启动子”是指串联连接的两个或多个(例如,数个)启动子,其中各个与编码序列可操作地连接并介导编码序列转录成mRNA。
很高等严格条件:术语“很高等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在70℃下清洗三次,每次15分钟。
很低等严格条件:术语“很低等严格条件”是指长度为至少100个核苷酸的探针,在42℃下在5×SSPE、0.3%SDS、200mg/ml、剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交并杂交,之后进行12~24个小时的标准Southern印迹过程。载体材料最终使用2×SSC、0.2%SDS,在45℃下清洗三次,每次15分钟。
本发明涉及用于生产多肽的方法,包括:(a),在有益于生产多肽的介质中培养真菌宿主细胞,其中真菌宿主细胞包括与选自以下的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸,所述启动子选自(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子,(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子,(iii)包括SEQIDNO:1的启动子,(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子,以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b),从培养介质中分离多肽。
在本发明的生产方法中,使用领域内已知的方法在适合生产多肽的营养介质中培养细胞。例如,可以通过在合适的介质中并在允许多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、或进行在实验发酵罐或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批补料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用领域内已知的步骤,在合适的包含碳和氮源以及无机盐的合适营养介质中进行培养。合适的培养基可以从商业供应方处得到或可以根据已公开的组成(例如,在美国模式培养物集存库的目录中)进行制备。如果多肽被分泌到营养介质中,可以直接从介质中回收多肽。如果多肽未被分泌出去,可以从细胞裂解物中进行回收。
可以使用领域内已知的特定用于多肽的方法来检测多肽。这些检测方法可以包括特定抗体、高效液相色谱、毛细管色谱、酶产物形成、酶底物消失或SDS-PAGE的使用。例如,可以使用酶检定来确定酶的活性。对于很多酶而言,确定酶活性的方法在领域内是已知的(参见,例如,D.SchomburgandM.Salzmann(eds.),EnzymeHandbook,Springer-Verlag,NewYork,1990)。
可以使用领域内已知的方法来回收多肽。例如,可以通过传统方法(包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀)从营养介质中回收多肽。在一个方面,回收整个发酵液。
之后,分离的多肽还可以通过多种领域内已知的方法来进一步纯化以得到基本纯的多肽,这些方法包括但不限于色谱(例如,离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳法(例如制备式等电聚焦)、差别溶解(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见,例如ProteinPurification,JansonandRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。
启动子
本发明还涉及选自以下的分离的启动子:(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子;(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子;(iii)包括SEQIDNO:1的启动子;(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子;以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子,本发明还涉及包括与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子的构建体、载体和真菌宿主细胞。
在一个方面,分离的启动子与SEQIDNO:1具有至少60%,例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性,且具有启动子活性。
在一个实施方式中,本发明的启动子包括SEQIDNO:1或其等位变体的核苷酸序列,或由SEQIDNO:1或其等位变体的核苷酸序列构成;或是其具有启动子活性的子序列。在另一个方面,启动子包括SEQIDNO:1的核苷酸序列,或由SEQIDNO:1的核苷酸序列构成。
SEQIDNO:1的子序列(即,截短的启动子)包括在5’端的截短,从而保留3’端最邻近于ATG密码子的序列。子序列可以是至少600个核苷酸,例如,至少700个核苷酸、至少750个核苷酸、至少800个核苷酸、至少850个核苷酸、或至少900个核苷酸,其具有启动子活性。
在一个方面,分离的启动子包括在很低等严格条件、低等严格条件、中等严格条件、中-高等严格条件、高等严格条件或很高等严格条件下与SEQIDNO:1或其子序列杂交的核苷酸序列;或上述序列的全长互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatis,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。
SEQIDNO:1的多核苷酸或其子序列可以用来设计核酸探针,从而根据领域内已知的方法,从不同属或种的菌株中识别并克隆启动子DNA。具体而言,根据标准Southern印迹法,这样的探针可以用于与感兴趣属或种的基因组DNA或cDNA杂交,以识别并分离其中的相应启动子DNA。这样的启动子可以大大短于整个序列,但是长度应该至少为15个核苷酸,例如至少25个、至少35个、或至少70个。优选地,核酸探针的长度为至少100个核苷酸,例如至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针均可使用。探针通常被标记以检测相应的启动子DNA(例如,用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白)。这样的探针包括在本发明中。
从这样的其他菌株中制备的基因组DNA或cDNA文库可以用来筛选与本文中描述的探针杂交并具有启动子活性的DNA。来自这些其他菌株的基因组或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术而进行分离。来自文库的DNA或分离的DNA可以被转移到并固定在硝化纤维素或其他合适的载体材料上。为识别与SEQIDNO:1或其子序列同源的克隆或DNA,在Southern印迹法中优选使用载体材料。
对于本发明的目的,杂交是指,在很低等到很高等的严格条件下,多核苷酸杂交到与SEQIDNO:1或其全长互补链、或其子序列对应的标记核酸探针上。在这些条件下核酸探针所杂交的分子可以使用例如X射线胶片而进行检测。
在一个实施方式中,核酸探针是SEQIDNO:1或其子序列。在另一个实施方式中,核酸探针是SEQIDNO:1。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针,严格条件被定义为,在使用根据Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:1390)的计算法而算出的Tm以下约5℃至约10℃,根据标准Southern印迹法,在(每毫升)0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1×Denhardt′s溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP、和0.2mg酵母RNA中,任选地进行12~24小时的预杂交和杂交。载体材料最终在6×SCC加0.1%SDS中洗涤一次,15分钟,并使用6×SSC在所计算的Tm以下的5℃~10℃下洗涤两次,各15分钟。
在另一个方面,分离的启动子可以是包含SEQIDNO:1或其具有启动子活性的子序列的多核苷酸序列的启动子突变体。突变启动子包括SEQIDNO:1或其具有启动子活性的子序列中的一个或多个(例如,数个)突变。各个突变是独立的核苷酸替换、缺失和/或插入。将核苷酸替换、缺失、和/或插入引入到启动子中可以使用领域内已知的任意方法来完成,例如经典诱变、定点突变或DNA改组。特别有用的是使用具有感兴趣插入的超螺旋双链DNA载体以及包含所需突变的两个合成引物的方法。各自与载体的两条链互补的寡核苷酸引物借助PfuDNA聚合酶在温度循环过程中延伸。在引物的掺入下,产生包含有错配缺口的突变质粒。在温度循环之后,用对于甲基化和半甲基化DNA特定的DpnI来处理产物,以消化母本DNA模板并选择包含突变的合成DNA。也可以使用其他领域内已知的方法。
在另一个方面,分离的启动子可以是杂合启动子,其包括本发明启动子的一部分以及其他启动子的一部分(例如,一个启动子的前导序列以及另一启动子的转录起始位点);或者本发明一种或多种(例如,数种)启动子的一部分以及一种或多种(例如,数种)其他启动子的一部分。其他启动子可以是在真菌宿主细胞选择中显示出转录活性的包括突变的、截短的和杂合启动子的任何启动子序列,且可以从与宿主细胞同源或异源的编码胞外或胞内多肽的基因获得。其他启动子序列也可以是本发明的启动子的一部分。其他启动子序列对于编码多肽的多核苷酸也可以是原生的或外源的,并且对于细胞也可以是原生的或外源的。
在另一个方面,分离的启动子可以是包含一种或多种(例如,数种)本发明启动子以及一种或多种(例如,数种)其他启动子的串联启动子。一种或多种(例如,数种)其他启动子可以是本发明的启动子。一种或多种(例如,数种)其他启动子可以是例如以下示例的那些启动子。串联启动子的两种或更多种(例如,数种)启动子序列可以同时促进多核苷酸的转录。或者,串联启动子的一种或多种(例如,数种)启动子序列可以在细胞生长的不同阶段促进多核苷酸的转录。在一个实施方式中,串联启动子包括两种启动子。在另一个实施方式中,串联启动子包括三种启动子。在另一个实施方式中,串联启动子包括四种启动子。在另一个实施方式中,串联启动子包括五种启动子。
可用于与本发明的启动子一起构建串联启动子或杂合启动子的其他启动子的例子包括从构巢曲霉(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillusniger)中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰酶样蛋白酶(WO96/00787)、Fusariumvenenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、FusariumvenenatumDaria(WO00/56900)、FusariumvenenatumQuinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(Trichodermareesei)β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子、NA2-tpi启动子(曲霉中性α淀粉酶基因的修饰启动子,其中不翻译的前导被曲霉磷酸丙糖异构酶基因的不翻译前导替代;非限制性实例包括来自黑曲霉中性α淀粉酶基因的修饰启动子,其中不翻译前导被构巢曲霉或米曲霉的磷酸丙糖异构酶基因的不翻译前导替代);酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得的启动子;及其突变的、截短的和杂合的启动子。其他启动子在美国专利第6,011,147号以及Romanos等,1992,Yeast8:423-488中描述。
在本发明的方法中,本发明的杂合或串联启动子将被理解为对于编码多肽的多核苷酸为外源的,即使野生型启动子对于多核苷酸是原生的。例如,在由至少两种启动子构成的串联启动子中,一种启动子可以是编码多肽的多核苷酸的野生型启动子。
多肽
术语“多肽”在本文中被定义为由对于本发明启动子为外源的编码序列所编码的多肽。
多肽可以是具有感兴趣生物学活性的任意多肽。术语“多肽”在本文中不是指特定长度的所编码产物,因此,包括肽、寡肽和蛋白。术语“多肽”也包括多个多肽,其包括得自至少两种不同多肽的部分和/或完整多肽序列的组合,其中一种或多种(例如,数种)对于真菌细胞为异源的。多肽还包括多肽的天然出现的等位变体和工程化变体。
在一个方面,多肽是抗体、抗原、抗菌肽、酶、生长因子、激素、immunodilator、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白以及转录因子。
在一个实施方式中,酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在另一个实施方式中,酶是乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、香豆酸酯酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、具有水解纤维素增强活性的GH61多肽、葡糖脑苷脂酶、葡糖苷酸酶、半纤维素酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
在另一个方面,多肽是白蛋白、胶原、弹性蛋白原、弹性蛋白或明胶。
在另一个方面,多肽是棒曲霉素或swollenin。
在另一个方面,多肽是杂合多肽,其中一个多肽区域融合在另一多肽区域的N端或C端。
在另一个方面,多肽是嵌合多肽,其中一个多肽的一个或多个(例如,数个)区域被一种或多种(例如,数种)其他多肽的一个或多个(例如,多种)区域替代。
在另一个方面,多肽是融合多肽或可切割的融合多肽,其中一个多肽融合在另一个多肽的N端或C端。通过将编码一种多肽的多核苷酸融合到编码另一多肽的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在领域内是已知的,并包括连接编码多肽的编码序列,从而使它们在框内且融合多肽的表达处于相同启动子和终止子的控制下。融合多肽也可以使用内含肽(intein)技术进行构建,其中融合多肽在翻译后生成(Cooper等,1993,EMBOJ.12:2575-2583;Dawson等,1994,Science266:776-779)。
融合多肽还可以包括在两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌时,该位点被切割,释出两个多肽。切割位点的例子,包括但不限于,在Martin等,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576;Svetina等,2000,J.Biotechnol.76:245-251;Rasmussen-Wilson等,1997,Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493;Ward等,1995,Biotechnology13:498-503;以及Contreras等,1991,Biotechnology9:378-381;Eaton等,1986,Biochemistry25:505-512;Collins-Racie等,1995,Biotechnology13:982-987;Carter等,1989,Proteins:Structure,Function,andGenetics6:240-248;andStevens,2003,DrugDiscoveryWorld4:35-48中公开的位点。
编码多肽的多核苷酸可以从任何原核生物、真核生物或其他来源获得。出于本发明的目的,本文中与给定来源相关使用的术语“获自”是指,多肽由该来源或由已插入有该来源的基因的细胞而产生。
用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在领域内是已知的,并包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或它们的组合。从这些基因组DNA克隆多核苷酸可以例如通过使用聚合酶链式反应(PCR)来实现。参见,例如,Innis等,1990,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。克隆步骤可包括:切割和分离含有编码多肽的多核苷酸的期望核酸片段,将该片段插入到载体分子中,并将重组载体掺入到可复制出多个拷贝或克隆的多核苷酸的真菌细胞中。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,其含有与本发明的启动子和一个或多个(例如,数个)控制序列可操作地连接的编码多肽的多核苷酸,其中控制序列在与该控制序列相容的条件下在合适的宿主细胞中指导编码序列的表达。表达将被理解为包括在多肽产生中所涉及到的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
可以以多种方式操纵多核苷酸,从而为多肽表达做准备。取决于表达载体,在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可能是期望的或必需的。利用重组DNA法来修饰多核苷酸的技术是领域内熟知的。
控制序列也可以是转录终止子,其被宿主细胞识别以终止转录。终止子与编码多肽的多核苷酸的3’端可操作地连接。在宿主细胞中起作用的任何终止子均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获自构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰刀菌胰酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶和里氏木霉翻译延长因子的基因。
用于酵母宿主细胞的优选终止子获自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。可用于酵母宿主细胞的其他终止子在Romanos等,1992(同上)中有过描述。
控制序列也可以是前导区(leader),其是对宿主细胞的翻译很重要的mRNA非翻译区。前导区与编码多肽的多核苷酸的5’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导区。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导区获自米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因。
用于酵母宿主细胞的适合前导区获自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列,其是与多核苷酸的3’端可操作地连接并在转录时作为信号被宿主细胞识别从而向所转录的mRNA添加多聚腺苷酸残基的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰酶样蛋白酶的基因。
可用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在GuoandSherman,1995,Mol.CellularBiol.15:5983-5990中有过描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可包含在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列片段相连接的信号肽编码序列。或者,编码序列的5’端可含有对于该编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列并不天然包含信号肽编码序列的情况下可能需要外源的信号肽编码序列。或者,为增强多肽的分泌,可以简单地用外源信号肽编码序列替换天然信号肽编码序列。然而,可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质酶内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)脂肪酶以及米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶的基因的信号肽编码序列。
可用于酵母宿主细胞的信号肽获自酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因。其他可用的信号肽编码序列在Romanos等,1992(同上)中有过描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N端的前肽的前肽编码序列。得到的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下为酶原(zymogen))。多肽原通常为无活性的并能够通过前肽的催化切割或自身催化切割而从多肽原转化为活性多肽。前肽编码序列可以获自嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶以及酿酒酵母α因子的基因。
当信号肽和前肽序列同时存在时,前肽序列的位置紧邻于多肽的N端,且信号肽序列的位置紧邻于前肽序列的N端。
也可能期望加入相对于宿主细胞的生长对多肽表达进行调控的调控序列。调控序列的例子是使得基因表达响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)而打开或关闭的那些。在酵母中,可以使用ADH2体系或GAL1体系。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子、和里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调控序列的其他例子是允许基因扩增的那些。在真核体系中,这些调控序列包括,在甲氨蝶呤的存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因、以及在重金属下扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
本发明还涉及用于改变编码多肽的宿主细胞内源性基因的表达的核酸构建体。该构建体可以包括最小数量的改变内源基因表达所必需的组件。在一个实施方式中,核酸构建体优选包括(a)导向序列(targetingsequence)、(b)本发明的启动子、(c)外显子、以及(d)剪接供体位点。在将核酸构建体引入细胞后,构建体通过同源重组在内源基因位点上插入到细胞基因组中。导向序列指导元件(a)~(d)整合到内源基因中,从而元件(b)~(d)与内源基因可操作地连接。在另一个实施方式中,核酸构建体包括(a)导向序列、(b)本发明的启动子、(c)外显子、(d)剪接供体位点、(e)内含子、以及(f)剪接受体位点,其中导向序列指导元件(a)~(f)的整合,从而元件(b)~(f)与内源基因可操作地连接。然而,构建体可以包括其他组件,例如可选择的标记物。
在两个实施方式中,引入这些组件导致产生了内源基因表达发生改变的新转录单元。大体而言,新的转录单元是通过导向构建体引入的序列与内源基因的融合产物。在内源基因被改变的一个实施方式中,基因被活化。在该实施方式中,采用同源重组,通过插入使基因以比在相应亲本细胞中更高的水平表达的调控序列,来替代、破坏或失效通常与亲本细胞的内源基因相关的调控区域。可以使用本领域熟知的方法(参见,例如,美国专利第5,641,670号),通过在构建体中纳入可扩增的选择标记基因而进一步扩增活化的基因。在内源基因改变的另一个实施方式中,基因的表达被降低。
导向序列可以在内源基因内,紧邻该基因,在上游基因内,或在内源基因的上游内并相隔一段距离。可以使用一个或多个(例如,数个)导向序列。例如,环状质粒或DNA片段优选采用单个导向序列,而线性质粒或DNA片段优选采用两个导向序列。
构建体还包括内源基因的一个或多个(例如,数个)外显子。外显子被定义为被复制成RNA并在成熟mRNA分子中存在从而使外显子序列与内源基因的编码区域在阅读框上符合(in-frame)的DNA序列。外显子可以任选地包括编码一个或多个(例如,数个)氨基酸和/或部分编码氨基酸的DNA。或者,外显子含有与5’非编码区对应的DNA。在一个或多个外源外显子编码一个或多个(例如,数个)氨基酸和/或氨基酸的一部分的情况下,该核酸构建体被设计成在转录和剪接后,阅读框与内源基因的编码区域在阅读框上符合,从而使源自第二外显子的mRNA部分的适当阅读框没有变化。
构建体的剪接供体位点指导一个外显子向另一外显子的剪接。通常而言,第一外显子位于第二外显子的5’,位于第一外显子3’侧翼并与之重叠的剪接供体位点识别位于第二外显子5’侧翼的剪接受体位点。与剪接供体位点一样,剪接受体位点是指导一个外显子向另一个外显子剪接的序列。剪接装置联合剪接供体位点一起作用,使用剪接受体位点来实现内含子的移除。
本发明还涉及用于生产多肽的方法,包括(a)在有益于生产多肽的条件下,培养其中已掺入如下转录单元的同源重组细胞,其中该转录单元包含与编码多肽的内源多核苷酸的第二外显子可操作地连接的本发明的启动子、外显子和/或剪接供体位点,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b)回收多肽。该方法基于基因活化技术(例如在美国专利第5,641,670中描述的)的使用。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体,包括本发明的启动子、编码多肽的多核苷酸、以及转录和翻译终止信号。可将多种核苷酸和控制序列连接在一起,产生可包括一个或多个(例如,数个)方便的限制性位点的重组表达载体,从而可以在这些位点插入或替代编码多肽的多核苷酸。或者,可以通过将与本发明启动子可操作地连接的多核苷酸或其核酸构建体插入到合适的表达载体中来表达多核苷酸。在建立表达载体时,编码序列位于载体中,使得该编码序列与本发明的启动子可操作地连接。
重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA程序并能使多核苷酸表达的任何载体(例如,质粒或病毒)。载体的选择将通常取决于载体和载体将要被引入的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制型载体,即作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体,例如,质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包括确保自我复制的任何元件(means)。或者,载体可以是,在被引入宿主细胞后整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。此外,可以使用单个载体或质粒,或一起包含将要引入宿主细胞基因组中的总DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。
载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、相对营养缺陷型的原养型等的基因。
用于酵母宿主细胞的选择标记的例子包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨咪唑琥珀酸甲酰胺合酶)、adeB(磷酸核糖氨基咪唑合成酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶,phosphinothricinacetyltransferase)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶,sulfateadenyltransferase)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。优选用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选用于木霉细胞中的是adeA、adeB、amdS、hph、和pyrG基因。
选择标记可以是在WO2010/039889中描述的双选择标记系统。在一个方面,双选择标记是hph-tk双选择标记系统。
载体优选包括使得载体整合到宿主细胞的基因组或允许载体在细胞中独立于基因组而自主复制中的元件。
为了整合入宿主细胞基因组中,载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组而整合入基因组的载体的任何其他元件。或者,载体可以含有用于通过同源重组而在染色体的准确位置指导向宿主细胞基因组中整合的额外多核苷酸。为增加在精确位置的整合可能性,整合元件应当包含足量的核酸,例如100~10,000个碱基对、400~10,000个碱基对、以及800~10,000个碱基对,其对相应的靶序列具有高度的序列一致性,以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外,整合元件也可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面,载体可以通过非同源重组而整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制,载体还可以包括使得载体能在被考虑的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使得质粒或载体能在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的例子是2微米的复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。
可用于丝状真菌细胞中的复制起点的例子是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene98:61-67;Cullen等,1987,NucleicAcidsRes.15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分离以及包括基因的质粒或载体的构建可以根据在WO00/24883中公开的方法而完成。
可以向宿主细胞中插入多于一个拷贝的多核苷酸,以增加多肽的产量。多核苷酸拷贝数的增加可以通过以下得到:将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中;或包括可扩增的选择标记基因以及多核苷酸,这样,可以通过在合适的选择剂的存在下培养细胞而选择含有扩增拷贝的选择标记基因的细胞,由此选择含有额外拷贝的多核苷酸的细胞。
用来连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序为本领域技术人员熟知的(参见,例如,Sambrook等,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及包括与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的本发明启动子的重组宿主细胞,其有利地用在多肽的重组生产中。将包含与编码多肽的多核苷酸可操作地连接的本发明启动子的载体被引入宿主细胞,从而使载体保持为染色体整合体或上述的自我复制染色体外载体。术语“宿主细胞”包括任意因复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞后代。对于宿主细胞的选择将很大程度取决于编码多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是任何在本发明的方法中有用的真菌细胞。本文中使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂的孢子真菌(如在Hawksworth等,In,AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi,8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中定义的)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。本文中使用的“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目(Endomycetales))、产担孢子(basidiosporogenous)酵母以及属于半知菌类(FungiImperfecti)芽孢纲(Blastomycetes)的酵母。因为酵母分类将来可能会变化,出于本发明的目的,酵母应按BiologyandActivitiesofYeast(Skinner,Passmore,andDavenport,editors,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中的描述来定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞,例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomycesdouglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、Saccharomycesnorbensis、Saccharomycesoviformis、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门亚门的所有丝状类型(如Hawksworth等,1995,同上,定义的)。丝状真菌的总体特征为,由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸进行的,且碳的分解代谢一般是专性需氧的。相反,酵母例如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽来进行的,且碳的分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、Piromyces、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
例如,丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、Ceriporiopsiscaregiea、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、Ceriporiopsispannocinta、Ceriporiopsisrivulosa、Ceriporiopsissubrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Chrysosporiuminops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、Chrysosporiumlucknowense、Chrysosporiummerdarium、Chrysosporiumpannicola、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、Chrysosporiumzonatum、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛云芝菌(Coriolushirsutus)、Fusariumbactridioides、Fusariumcerealis、Fusariumcrookwellense、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、Fusariumnegundi、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、Fusariumreticulatum、粉红色镰刀菌(Fusariumroseum)、接骨木镰刀菌(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusariumsulphureum)、Fusariumtorulosum、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、Fusariumvenenatum、特异腐质霉(Humicolainsolens)、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、Mucormiehei、嗜热毁丝菌(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、脉射侧菌(Phlebiaradiata)、白腐菌(Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉(Trichodermaviride)细胞。
在一个方面,宿主细胞是木霉宿主细胞(例如,里氏木霉宿主细胞)。
可以通过涉及原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法以本质上已知的方式来转化真菌细胞。用于曲霉和木霉宿主细胞的转化的合适过程在EP238023、Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470-1474、和Christensen等,1988,Bio/Technology6:1419-1422中有过描述。用于转化镰孢菌属的适当方法描述于Malardier等,1989,Gene78:147-156和WO96/00787中。酵母可以使用在BeckerandGuarente,InAbelson,J.N.andSimon,M.I.,editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163;andHinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1920中描述的方法进行转化。
通过以下实施例进一步描述本发明,实施例不应理解为是对本发明范围的限制。
实施例
菌株
里氏木霉RutC30(ATCC56765;MontenecourtandEveleigh,1979,Adv.Chem.Ser.181:289-301)从里氏木霉Qm6A(ATCC13631;MandelsandReese,1957,J.Bacteriol.73:269-278)获得。
里氏木霉RutC30-2是里氏木霉RutC30的突变菌株(ATCC56765;MontenecourtandEveleigh,1979,同上)。
培养基和溶液
YP培养基由10g酵母提取物、20g细菌用胰蛋白胨、以及加至1升的去离子水组成。
纤维素酶诱导培养基由20g纤维素、10g玉米浆固体、1.45g(NH4)2SO4、2.08gKH2PO4、0.28gCaCl2、0.42gMgSO4·7H2O、0.42ml微量金属溶液、以及加至1升的去离子水组成。
微量金属溶液由216gFeCl3·6H2O、58gZnSO4·7H2O、27gMnSO4·H2O、10gCuSO4·5H2O、2.4gH3BO3、336g柠檬酸、以及加至1升的去离子水组成。
STC缓冲液由1M山梨糖醇、10mMCaCl2、以及10mMTris-HCl,pH7.5组成。
COVE板由342g蔗糖、10mlCOVE盐溶液、10ml1M乙酰胺、10ml1.5MCsCl、25g诺布尔琼脂、以及加至1升的去离子水组成。
COVE盐溶液由26gKCl、26gMgSO4、76gKH2PO4、50mlCOVE微量金属溶液、以及加至1升的去离子水组成。
COVE微量金属溶液由0.04gNa2B4O7·10H2O、0.4gCuSO4·5H2O、1.2gFeSO4·7H2O、0.7gMnSO4·H2O、0.8gNa2MoO2·H2O、10gZnSO4·7H2O、以及加至1升的去离子水组成。
COVE2板由30g蔗糖、20mlCOVE盐溶液、25g诺布尔琼脂、10ml1M乙酰胺、以及加至1升的去离子水组成。
PDA板由39克马铃薯右旋糖琼脂和加至1升的去离子水组成。
2XYT-Amp板由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、15g细菌琼脂、100mg氨苄青霉素、和加至1升的去离子水组成。
LB培养基由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化钠、以及加至1升的去离子水组成。
SOC培养基由2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖于去离子水中而组成。
TAE缓冲液由4.84gTris碱、1.14ml冰醋酸、2ml0.5MEDTA(pH8.0)、以及加至1升的去离子水组成。
TE缓冲液由10mMTris碱和1mMEDTA,pH8.0组成。
实施例1:报告质粒pSMai226的构建
如下所述构建报告质粒pSMai226,以分析里氏木霉启动子的强度,使用烟曲霉的β-葡糖苷酶作为报告物。
使用以下所示的引物069448和069449,从pEJG107(WO2005/047499)中扩增烟曲霉β-葡糖苷酶编码区和里氏木霉纤维二糖水解酶I(cbh1/cel7a)的终止子。下划线部分表示所引入的SphI位点,斜体部分表示与IN-FUSIONTM克隆(ClontechLaboratoriesInc.,MountainView,CA,USA)的质粒pMJ09(WO2005/056772)中的插入位点具有同源性的区域。
069448:
5’-GAATTGTTTAAACGTCGACGCATGCATGAGATTCGGTTGGCTCGAGGTGGC-3’(SEQIDNO:2)
069449:
5’-CGAAATGGATTGATTGTCTACCGCCAGGTGTCAGT-3’(SEQIDNO:3)
扩增反应体系(50μl)由25ngpEJG107、dNTP各200μM、0.4μM引物069448、0.4μM引物069449、1×PHUSION缓冲液(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)以及1个单位的PHUSION热启动高保真DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA,USA)构成。反应液在EPPENDORFMASTERCYCLER(EppendorfAG,Hamburg,Germany)中孵育,程序为:98℃30秒,1个循环;98℃30秒、60℃30秒、以及72℃3分30秒,30个循环;72℃15分钟,1个循环。
使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳来分离反应产物,其中从凝胶中切取3610bp片段并根据制造商的说明书使用凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)进行纯化。
使用AccI消化质粒pMJ09,其中对包括构巢曲霉真菌乙酰胺酶基因(amdS)的5.6kb片段使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳进行纯化,从凝胶中切割出来,并根据制造商的说明书使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
之后,根据制造商的说明书使用IN-FUSIONTMADVANTAGETMPCR克隆试剂盒(ClontechLaboratoriesInc.,MountainView,CA,USA),将3610bp的PCR片段连接到经AccI消化的pMJ09的5.6kb片段中,以得到pSMai226(图1)。连接反应混合物(10μl)由1×IN-FUSIONTM缓冲液、1μlIN-FUSIONTM酶、100ng消化的pMJ09片段、和63.5ng纯化的3610bpPCR片段构成。反应混合物在37℃下孵育15分钟,之后在50℃下15分钟。根据制造商的方案(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA),在用50μl的TE缓冲液(pH8)稀释反应混合物之后,将2.5μl的反应液用来转化大肠杆菌ONESHOTTOP10感受态细胞。包含有pSMai226的大肠杆菌转化子通过SphI和SpeI的限制性消化进行检测,使用BIOROBOT9600(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)来制备质粒DNA。插入烟曲霉β-葡糖苷酶基因和里氏木霉纤维二糖水解酶I终止子的pSMai226通过DNA测序来证实。
实施例2:里氏木霉菌株RutC30基因组DNA提取
在带挡板的摇瓶中,在50ml的YEG培养基中于28℃培养里氏木霉菌株RutC302天,200rpm振荡。使用(Calbiochem,LaJolla,CA,USA),通过过滤收集菌丝体,在去离子水中洗涤两遍,并在液氮中冷冻。冷冻的菌丝体通过研钵及研杵磨成细微粉末,并使用DNEASYPlantMaxi试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)来分离总DNA。
实施例3:质粒pSaMe-CatP的构建
如下所述构建质粒pSaMe-CatP,以包括里氏木霉过氧化氢酶启动子、烟曲霉β-葡糖苷酶编码序列、和里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子。
使用以下示出的引物069728和069729从里氏木霉RutC30基因组DNA中扩增出872bp的里氏木霉过氧化氢酶启动子区域。斜体部分代表与用于IN-FUSIONTM克隆的质粒pSMai226的插入位点具有同源性的区域。
引物069728:
5’-AACGTCGACGCATGCTTGTGCACGGCTTTGGGTTAGCAAA-3’(SEQIDNO:4)
引物069729:
5’-CCAACCGAATCTCATTTTTGCTGTTCTCGTTGGTT-3’(SEQIDNO:5)
扩增反应体系(50μl)由Pfx扩增缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)、dNTP各200μM、50ng里氏木霉RutC30基因组DNA、0.4μM引物069728、0.4μM引物069729、25mMMgSO4、和2.5单位的PfxDNA聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)组成。反应体系在EPPENDORFMASTERCYCLER5333中孵育,程序为:95℃2分钟,1个循环;95℃15秒、55℃30秒、和68℃1分钟,30个循环;68℃7分钟,1个循环。
使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应产物,其中从凝胶切割872bp的过氧化氢酶启动子,并根据制造商的说明书使用MINELUTE凝胶提取试剂盒进行纯化。
质粒pSMai226用SphI消化,其中使用TAE缓冲液通过1%琼脂糖凝胶电泳来纯化9.2kb片段,从凝胶上切割,并根据制造商说明书使用MINELUTE凝胶提取试剂盒进行纯化。
之后,根据制造商的说明书使用IN-FUSIONTMADVANTAGETMPCR克隆试剂盒,将872bp的PCR片段连接到经SphI消化的pSMai226片段的9.2kb片段中,以得到pSaMe-CatP(图2)。连接反应混合物(10μl)由1×IN-FUSIONTM缓冲液、1μlIN-FUSIONTM酶、200ng消化的pSMai226、和36ng纯化的872bpPCR片段构成。反应混合物在37℃下孵育15分钟,之后在50℃下15分钟。根据制造商的方案,在用50μl的TE缓冲液(pH8)稀释反应混合物之后,将2.5μl的反应液用来转化大肠杆菌SOLOPACKGold感受态细胞(AgilentTechnologies,PaloAlto,CA,USA)。包含有pSaMe-CatP的大肠杆菌转化子通过消化进行检测,使用BIOROBOT9600来制得质粒DNA。里氏木霉过氧化氢酶启动子插入pSaMe-CatP通过DNA测序来证实(SEQIDNO:1,参见图3)。
实施例4:利用里氏木霉过氧化氢酶启动子的烟曲霉β-葡糖苷酶的表达
编码与里氏木霉过氧化氢酶启动子可操作地连接的成熟烟曲霉β-葡糖苷酶的质粒pSaMe-CatP(实施例3)通过PEG介导的转化被导入里氏木霉RutC30-2(Penttila等,1987,Gene61:155-164)。包含构巢曲霉amdS基因的质粒使得转化子能以乙酰胺作为唯一氮源生长。
里氏木霉RutC30-2在补充有2%(w/v)葡萄糖和10mM尿苷的25mlYP培养基中在27℃和90rpm下培养17小时。使用真空驱动一次性过滤系统(Millopore,Bedford,MA,USA)通过过滤收集菌丝体,并用去离子水洗涤两次,并用1.2M山梨糖醇洗涤两次。通过在20ml包含15mg/mlGLUCANEXTM(NovozymesA/S,Denmark)和0.36单位/ml几丁质酶(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)的1.2M山梨糖醇中重悬洗涤过的菌丝体,并在34℃下在90rpm的温和摇动下孵育15~25分钟,从而产生原生质体。通过在400×g下离心7分钟来收集原生质体,并用冷的1.2M山梨糖醇洗涤两次。使用血球计数器来对原生质体进行计数,并在STC中重新悬浮至终浓度为每ml1×108个原生质体。过量的原生质体存储在-80℃的Cryo1℃冷冻容器(Nalgene,Rochester,NY,USA)中。
将约2μg的经PmeI消化的pSaMe-CatP添加到100μl的上述原生质体溶液中,并轻柔混合,之后添加200μl的PEG缓冲液,混合,并在30℃下孵育30分钟。之后边混合边加入STC(3ml),将转化溶液快速倒入利用构巢曲霉amdS选择的COVE板上。板在28℃下孵育5~7天。将转化子继代培养到COVE2板上并在28℃下生长。选择21个转化子并继代培养到含有乙酰胺的新鲜平板上,在28℃下形成孢子,持续7天。
所选的里氏木霉转化子在含有25ml纤维素酶诱导培养基(pH6.0)的125ml带挡板摇瓶中培养,并在28℃和200rpm下孵育5天。里氏木霉RutC30-2作为对照。在第5天移取培养液样品,将1ml的各个培养液在13,000×g下离心5分钟,将上清液转移到新管中并存储在4℃下,直至用于β-葡糖苷酶活性的检定。
在室温下使用以1:10稀释在50mM琥珀酸盐(pH5.0)中的25μl培养上清液等分样,使用溶于50mM琥珀酸盐(pH5.0)中的200μl的0.5mg/ml对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷作为底物,来确定以上上清液中的β-葡糖苷酶活性。在15分钟的孵育之后,通过添加100μl的1MTris-HCl(pH8.0)来停止反应,在405nm处以分光光度法读取吸光度。一个单位的β-葡糖苷酶活性对应于在pH5.0和室温下每分钟每升生成1μmol的对硝基苯基。将黑曲霉β-葡糖苷酶(Novozyme188,NovozymesA/S,Denmark)用作酶标准物。
结果显示,所有检定的转化子显示出高于对照或亲代菌株、里氏木霉RutC30-2的β-葡糖苷酶活性。转化子SaMe-CatP-19产出比对照菌株高10倍的最高的β-葡糖苷酶活性。
使用CRITERIONTris-HCl(8-16%溶解)凝胶(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)和CRITERION系统(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行SDS-PAGE。将第五天的5微升的各个上清液悬浮在2×浓度的Laemmli样品缓冲液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)中并在5%β-巯基乙醇的存在下煮沸3分钟。将上清液样品加样到聚丙烯酰胺胶中,并使用1×Tris/甘氨酸/SDS作为电泳缓冲液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行电泳。所得的凝胶用BIO-SAFE考马斯蓝G250蛋白染料(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行染色。
21个里氏木霉CatP转化子中有12个产生在里氏木霉RutC30-2对照中找不到的约为110kDa的蛋白。转化子里氏木霉SaMe-CatP-19产生最高水平的β-葡糖苷酶。
实施例5:在非纤维素培养基中分析上部转化子
为测试启动子在非纤维素酶诱导条件下的强度,将上部三个转化子一式两份地在125ml的包含25mlYP和2%葡萄糖培养基的带挡板摇瓶中培养,并在28℃和200rpm下孵育5天。里氏木霉RutC30-2作为对照。在第5天取培养液样品,并将1ml的各个培养液样品在13,000×g下离心5分钟,将各个上清液转移到新管,并在4℃下存储直至用于β-葡糖苷酶活性的检定。
按在上述实施例4中的描述确定β-葡糖苷酶的活性。结果表明,所有三个转化子表现出比对照菌株里氏木霉RutC30-2更高的β-葡糖苷酶活性。
按在实施例4中的描述进行SDS-PAGE。结果表明,通过约110kDa条带的存在,检定结果与SDS-PAGE结果相关。
实施例6:转化子SaMe-CatP-19的单孢分离
将里氏木霉转化子SaMe-CatP-19的孢子铺到PDA板上,并在34℃下孵育5天。用0.5ml的0.01%80洗涤汇合(confluent)孢子板上的小块区域,以重新悬浮孢子。用0.01%80将100μl的孢子悬浮液等分物稀释至5ml的终体积。孢子浓度用血球计数器确定,并稀释至每毫升0.1个孢子的终浓度。将200μl的孢子稀释液等分物铺在150mm的COVE2板上并在28℃孵育2~3天。将8个长出的菌落从板上切离出来并转移到PDA板。3天后,在28℃下,使孢子继代培养到新PDA板上并使其在28℃下再生长5天。使用5个汇合孢子板来接种到125ml含有25ml纤维素酶诱导培养基(pH6.0)的带挡板摇瓶,并在28℃和200rpm下孵育5天。里氏木霉RutC30-2作为对照。在第5天取培养液样品,将1ml的各个培养液在微型离心机中于13,000×g下离心5分钟,将上清液转移到新管。将5微升的各个上清液与等体积的2×加样缓冲液(10%β-巯基乙醇)混合,并加到1.5mm的8%~16%Tris甘氨酸SDS-PAGE胶中并用BIO-SAFE考马斯蓝G250蛋白染料进行染色。培养液的SDS-PAGE概况显示,5个转化子中有4个能表达β-葡糖苷酶。SaMe-CatP-19C这个转化子产生最高的收率。
实施例7:转化子SaMe-CatP-19C的发酵
将里氏木霉SaMe-CatP-19C和对照菌株里氏木霉RutC30-2一式两份在两升发酵体系中发酵,并测试β-葡糖苷酶活性。生长在PDA板上的里氏木霉SaMe-CatP-19C和里氏木霉RutC30-2的孢子被接种到含有100ml由标准碳源和氮源组成的摇瓶培养基的500ml摇瓶中。在28℃下摇瓶被置于定轨摇床中约48小时。将50ml的培养液加到含有1.8L由标准碳源和氮源组成的分批发酵培养基的玻璃外套的3L发酵罐(ApplikonBiotechnology,Inc.,FosterCity,CA,USA)中。由标准碳源和氮源组成的发酵补料培养基以0~4g/L/hr的速率供应185小时。发酵容器保持在28℃的温度,并使用Applikon1030控制系统(ApplikonBiotechnology,Inc.,FosterCity,CA,USA)将pH控制在4.5+/-0.1的设定点。以1vvm的速率将空气充到容器中,通过以1100~1300rpm旋转的Rushton叶轮来搅动发酵液。在发酵之后,从容器中回收全部发酵液,在3000×g离心以去除生物质。上清液无菌过滤并存储在5~10℃。
如以上实施例4所述的检定样品的β-葡糖苷酶活性。里氏木霉SaMe-CatP-19C表现出比对照菌株里氏木霉RutC30-2更高的β-葡糖苷酶活性。里氏木霉SaMe-CatP-19C和对照菌株里氏木霉RutC30-2的总蛋白水平是相当的。
通过以下编号的段落进一步描述本发明:
[1]一种生产多肽的方法,包括:(a),在有益于生产多肽的介质中培养真菌宿主细胞,其中真菌宿主细胞包括与选自以下的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸,所述启动子选自(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子,(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子,(iii)包括SEQIDNO:1的启动子,(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子,以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b),从培养介质中分离多肽。
[2]根据段落1的方法,其中启动子包括与SEQIDNO:1具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性的核苷酸序列。
[3]根据段落1的方法,其中启动子包括在中等严格条件、中-高等严格条件、高等严格条件、或很高等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列。
[4]根据段落1的方法,其中启动子包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其具有启动子活性的子序列,或者由SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其具有启动子活性的子序列构成。
[5]根据段落4的方法,其中启动子包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列,或由SEQIDNO:1的多核苷酸序列构成。
[6]根据段落1的方法,其中启动子是包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列的一个或多个(例如,数个)部分的杂合启动子。
[7]根据段落1的方法,其中启动子是包括SEQIDNO:1的一个或多个(例如,数个)多核苷酸序列或其保持启动子活性的子序列的串联启动子。
[8]根据段落7的方法,其中启动子是包括SEQIDNO:1的一个或多个(例如,数个)多核苷酸序列的串联启动子。
[9]根据段落7或8的方法,其中串联启动子包括两个或多个(例如,数个)启动子。
[10]根据段落9的方法,其中串联启动子的两个或多个(例如,数个)启动子同时促进多核苷酸的转录。
[11]根据段落10的方法,其中串联启动子的两个或多个(例如,数个)启动子中的一个或多个(例如,数个)在真菌宿主细胞生长的不同阶段促进编码多肽的多核苷酸的转录。
[12]根据段落1~11中任一段的方法,其中真菌宿主细胞包含一个或多个(例如,数个)拷贝的编码多肽的多核苷酸。
[13]根据段落1~11中任一段的方法,其中真菌宿主细胞包含一个拷贝的编码多肽的多核苷酸。
[14]根据段落1~13中任一段的方法,其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、immunodilator、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。
[15]根据段落1~14中任一段的方法,其中多肽对于真菌宿主细胞为原生的或外源的。
[16]根据段落1~15中任一段的方法,其中多核苷酸包含在真菌宿主细胞的染色体中。
[17]根据段落1的方法,其中多核苷酸包含在染色体外元件上。
[18]根据段落1~17中任一段的方法,其中真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。
[19]根据段落1~17中任一段的方法,其中真菌宿主细胞是酵母细胞。
[20]一种分离的启动子,选自(i)包括与SEQIDNO:1具有至少60%序列一致性的核苷酸序列的启动子,(ii)包括在至少中等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列的启动子,(iii)包括SEQIDNO:1的启动子,(iv)包括(i)、(ii)或(iii)的子序列并保持启动子活性的启动子,以及(v),(i)、(ii)、(iii)或(iv)的突变、杂合或串联启动子。
[21]根据段落20的启动子,其包括与SEQIDNO:1具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性的核苷酸序列。
[22]根据段落20的启动子,其包括在中等严格条件、中-高等严格条件、高等严格条件、或很高等严格条件下与SEQIDNO:1或其全长互补链杂交的核苷酸序列。
[23]根据段落20的启动子,其包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其具有启动子活性的子序列,或者由SEQIDNO:1的多核苷酸序列或其具有启动子活性的子序列构成。
[24]根据段落23的启动子,其包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列,或由SEQIDNO:1的多核苷酸序列构成。
[25]根据段落20的启动子,其是包括SEQIDNO:1的多核苷酸序列的一个或多个(例如,数个)部分的杂合启动子。
[26]根据段落20的启动子,其是包括SEQIDNO:1的一个或多个(例如,数个)多核苷酸序列或其保持启动子活性的子序列的串联启动子。
[27]根据段落26的启动子,其是包括SEQIDNO:1的一个或多个(例如,数个)多核苷酸序列的串联启动子。
[28]根据段落26或27的启动子,其中串联启动子包括两个或多个(例如,数个)启动子。
[29]根据段落28的启动子,其中串联启动子的两个或多个(例如,数个)启动子同时促进编码多肽的多核苷酸的转录。
[30]根据段落28的启动子,其中串联启动子的两个或多个(例如,数个)启动子中的一个或多个(例如,数个)在真菌宿主细胞生长的不同阶段促进编码多肽的多核苷酸的转录。
[31]一种核酸构建体,包括与段落20~30中任一段的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸。
[32]一种重组表达载体,包括段落31的核酸构建体。
[33]一种重组宿主细胞,包括段落31的核酸构建体。
[34]根据段落33的重组宿主细胞,其为丝状真菌细胞。
[35]根据段落33的重组宿主细胞,其为酵母细胞。
[36]一种核酸构建体,包括(a)导向序列、(b)段落20~30中任一段的启动子、(c)外显子、以及(d)剪接供体位点。
[37]一种核酸构建体,包括(a)导向序列、(b)段落20~30中任一段的启动子、(c)外显子、(d)剪接供体位点、(e)内含子、以及(f)剪接受体位点,其中导向序列指导元件(a)~(f)的整合,从而使元件(b)~(f)与内源基因可操作地连接。
[38]一种生产多肽的方法,包括(a)在有益于生产多肽的条件下,培养其中已掺入如下转录单元的同源重组细胞,其中该转录单元包含与编码多肽的内源多核苷酸的第二外显子可操作地连接的段落20~30中任一段的启动子、外显子和/或剪接供体位点,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b)回收多肽。
在本文中描述且主张权利的本发明的范围不被文中公开的具体实施方式所限制,因为这些实施方式意在说明本发明的多个方面。任何等同的实施方式都在本发明的范围之内。实际上,从前面的描述来看,除了本文中示出并描述的那些,本发明的多种修改对本领域技术人员也将是明晰的。这样的修改也意在落于所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下,包括定义的本公开将优先。
在本文中引用了多个文献,其公开整体地并入本文以作参考。
Claims (22)
1.一种生产多肽的方法,包括:(a),在有益于生产多肽的介质中培养真菌宿主细胞,其中真菌宿主细胞包括与选自以下的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸,所述启动子是SEQIDNO:1的启动子,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b),从培养介质中分离多肽。
2.根据权利要求1的方法,其中启动子由SEQIDNO:1的多核苷酸序列构成。
3.根据权利要求1或2的方法,其中真菌宿主细胞包含一个或多个拷贝的编码多肽的多核苷酸。
4.根据权利要求1或2的方法,其中真菌宿主细胞包含一个拷贝的编码多肽的多核苷酸。
5.根据权利要求1或2的方法,其中多肽选自抗原、酶、生长因子、激素、immunodilator、神经递质、受体、报告蛋白、结构蛋白和转录因子。
6.根据权利要求5的方法,其中酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶或连接酶。
7.根据权利要求6的方法,其中酶是乙酰基甘露聚糖酯酶、乙酰基木聚糖酯酶、α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、α-葡糖苷酸酶、氨基肽酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、阿拉伯聚糖酶(arabinanase)、阿拉伯呋喃糖酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、香豆酸酯酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、阿魏酸酯酶、具有水解纤维素增强活性的GH61多肽、葡糖脑苷脂酶、葡糖苷酸酶、半纤维素酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶、或木聚糖酶。
8.根据权利要求1或2的方法,其中多肽对于真菌宿主细胞为原生的或外源的。
9.根据权利要求1或2的方法,其中多核苷酸包含在真菌宿主细胞的染色体中。
10.根据权利要求1的方法,其中多核苷酸包含在染色体外元件上。
11.根据权利要求1或2的方法,其中真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。
12.根据权利要求1或2的方法,其中真菌宿主细胞是酵母细胞。
13.一种分离的启动子,是SEQIDNO:1的启动子。
14.根据权利要求13的启动子,其由SEQIDNO:1的多核苷酸序列构成。
15.一种核酸构建体,包括与权利要求13或14的启动子可操作地连接的编码多肽的多核苷酸。
16.一种重组表达载体,包括权利要求15的核酸构建体。
17.一种重组宿主细胞,包括权利要求15的核酸构建体。
18.根据权利要求17的重组宿主细胞,其为丝状真菌细胞。
19.根据权利要求17的重组宿主细胞,其为酵母细胞。
20.一种核酸构建体,包括(a)导向序列、(b)权利要求13或14的启动子、(c)外显子、以及(d)剪接供体位点。
21.一种核酸构建体,包括(a)导向序列、(b)权利要求13或14的启动子、(c)外显子、(d)剪接供体位点、(e)内含子、以及(f)剪接受体位点,其中导向序列指导元件(a)~(f)的整合,从而使元件(b)~(f)与内源基因可操作地连接。
22.一种生产多肽的方法,包括(a)在有益于生产多肽的条件下,培养其中已掺入如下转录单元的同源重组细胞,其中该转录单元包含与编码多肽的内源多核苷酸的第二外显子可操作地连接的权利要求13或14的启动子、外显子和/或剪接供体位点,其中编码多肽的多核苷酸对于启动子是外源的;以及(b)回收多肽。
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