CN105492604A - 受调节的pepc表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组真菌宿主细胞,该宿主细胞包含编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸;和编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸,其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子,连同用于产生感兴趣的多肽的方法,该方法包括培养所述真菌宿主细胞。
Description
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及重组真菌宿主细胞,该宿主细胞包含编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸;和编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸,其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子,连同用于产生感兴趣的多肽的方法,该方法包括培养所述真菌宿主细胞。
发明背景
在工业多肽制造领域中,对发现用来改进产率和/或储存稳定性的新方式具有持续的兴趣。已经显示,在真菌和细菌两种重组宿主细胞中,通常通过缺失一个或多个编码基因而灭活一种或多种蛋白水解酶可导致改进的产率和/或储存稳定性。
然而,还存在这样的实例,其中对于宿主细胞表型而言,灭活宿主细胞中的蛋白水解酶具有不令人希望的结果。一个这样的实例是灭活烟曲霉宿主中的PepC蛋白酶,其中显示PepC灭活显著降低孢子形成和生长速率,如由赖卡德(Reichard)U.等人(2000,国际医学微生物学杂志(IntJMedMicrobiol.)290,549-558)所报道的。
在生物技术产业中,真菌重组生产宿主细胞保留其形成孢子的能力,以便能够制备细胞库制剂是非常重要的,这对于一致的多肽制造而言是决定性要求。
发明概述
本申请的诸位发明人已经证明,灭活米曲霉或黑曲霉中的PepC蛋白酶导致至少3种不同的多肽,即脂肪酶、角质酶和天冬酰胺酶的产率和/或稳定性大大改进。不幸的是,灭活PepC蛋白酶也严重妨碍了细胞的孢子形成能力(参见以下实例),在赖卡德(Reichard)U.等人(见上)看来,这不是完全出乎意料的。
尽管存在这一负面结果,诸位发明人还是继续向前,并且他们成功地将编码PepC的多核苷酸可操作地连接至若干种不同的调节型启动子之一,在适于工业制造多肽的典型培养条件期间,这些启动子是被抑制的或非诱导的,但是可以通过存在导致PepC表达并且因此导致正常孢子形成表型的具体化合物来诱导这些启动子或使它们去抑制。
换言之,诸位发明人已经成功地构建了用于工业制造多肽的高度令人希望的真菌宿主细胞,取决于条件,该细胞具有拨动开关控制的高产率(PepC灭活)对孢子形成(PepC表达)。如以下实例中所示,与野生型相比,这些真菌宿主细胞示出高达五倍的更高生产产率,同时与ΔPepC菌株相比,在斜面试管中,它们产生的孢子数要高约一个数量级。
因此,在第一方面中,本发明涉及重组真菌宿主细胞,该宿主细胞包含:
a)编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸;和
b)编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸,其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子。
在第二方面中,本发明涉及产生感兴趣的多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在适于产生该感兴趣的多肽的条件下,培养如以上权利要求的任一项中限定的宿主细胞;并且,可任选地
b)回收该感兴趣的多肽。
附图简要说明
图1示出了菌株MLxn69和MLxN70的脂肪酶发酵液样品的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片。泳道1是“完美蛋白标记(PerfectProteinMarker)TM”,大小为10-225kDa(诺瓦根公司(Novagen))。泳道2-5是在第2-5天取的MLxN69样品。泳道6-9是在第2-5天取的MLxN70样品。粗箭头指示全长脂肪酶蛋白;小箭头指示脂肪酶的降解产物。
图2示出了菌株MLxN69和MLxN70的在两个不同温度下孵育的脂肪酶发酵液样品的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片。泳道1是“完美蛋白标记TM”,大小为10-225kDa(诺瓦根公司)。泳道2和3是菌株MLxn69和MLxN70的在-18℃下孵育的样品。泳道4和5是菌株MLxn69和MLxN70的在34℃下孵育的样品。
图3示出了在96、144和190hr,来自实例5和6的发酵液样品的考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片,示出了表达于由sorA-或sorB启动子调节pepC的菌株中的天冬酰胺酶。泳道1:分子标记(伯乐(Biorad)#161-0318);泳道2-4:菌株50-C2948-9(ΔPepC);泳道5-7:菌株50-4C-9(天然PepC);泳道8-10:菌株91-50-C2948-18(PsorA-pepC);泳道11-13:菌株92-50-C2948-13(PsorB-pepC);泳道14:分子标记。
图4示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片,其中在第5天来自两个转化体的产物形成被可视化。图4中最左侧泳道是“SeeBluePlus2TM”(英杰公司(Invitrogen)),大小为4-250kDa。泳道2和3分别示出了菌株DAu712(从天然PepC启动子表达的pepC)和Dau729(从PniaD启动子表达的pepC)在第5天的产物形成。图中的粗箭头指示全长特异腐质霉角质酶蛋白。小箭头指示脂肪酶的降解产物。通过质谱分析确认蛋白带是全长特异腐质霉角质酶蛋白(大箭头)抑或其蛋白片段。该图显示在DAu729中PepC-表达的基于氨的抑制(经由其从调节型PniaD启动子的表达)显著降低了角质酶的降解,因为在泳道3中不可见角质酶降解产物。
图5示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片,其中分析来自实例7中黑曲霉菌株的发酵样品,以看到天冬酰胺酶产物的降解并且比较其程度。正如所料,来自菌株50-4C-9(天然PepC表达)的样品在PepC存在下严重降解(图5,泳道5-7),而在菌株50-C2948-9(ΔPepC)中表达的天冬酰胺酶要稳定地多得多(图5,泳道8-10)。来自菌株107-C2948-20(niaD-启动子PepC表达)的样品中的降解也示出天冬酰胺酶的显著更少的降解(图5,泳道2-4),表明在罐发酵条件下,通过niaD启动子进行的PepC表达被强烈抑制。
定义
cDNA:术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体,其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工,包括剪接。
编码序列:术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定,该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列:术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即,来自相同基因)或外源的(即,来自不同基因),或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少,控制序列包括启动子,以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的,这些控制序列可以提供有多个接头。
表达:术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体:术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子,该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
片段:术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如,若干个)氨基酸的多肽;其中该片段已经保留其活性,例如酶片段是保留其酶活性的酶片段。
非常高严格条件:术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在70℃下洗涤三次,每次15分钟。
高严格条件:术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在65℃下洗涤三次,每次15分钟。
中-高严格条件:术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在60℃下洗涤三次,每次15分钟。
中严格条件:术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在55℃下洗涤三次,每次15分钟。
低严格条件:术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在50℃下洗涤三次,每次15分钟。
非常低严格条件:术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言,遵循标准DNA印迹程序,在42℃下在5XSSPE、0.3%SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2%SDS,在45℃下洗涤三次,每次15分钟。
宿主细胞:术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的:术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质,(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质,该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除;(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质;或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如,宿主细胞中的重组体产生;编码该物质的基因的多个拷贝;以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。
成熟多肽:术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域已知,宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即,具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知,不同的宿主细胞不同地加工多肽,并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如,具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列:术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。
核酸构建体:术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子,该核酸分子是从天然存在的基因中分离的,或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段,或是合成的,该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接:术语“可操作地连接”意指如下的构造,其中,控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置,从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite),赖斯(Rice)等人,2000,遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch),1970,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且计算如下:
(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的,使用如在EMBOSS包(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,赖斯(Rice)等人,2000,见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch),1970,见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5,以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性,并且计算如下:
(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
子序列:术语“子序列”意指使一个或多个(例如,若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸;其中该子序列编码保留其活性的片段。
变体:术语“变体”意指在一个或多个(例如,若干个)位置包括改变(即,取代、插入和/或缺失)的多肽,例如酶。取代意指用不同的氨基酸置换占用一个位置的氨基酸;缺失意指去除占据一个位置的氨基酸;并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
发明详细说明
宿主细胞
本发明涉及重组真菌宿主细胞,这些宿主细胞包含编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸,该至少一种第一多核苷酸可操作地连接至指导多肽产生的一个或多个控制序列,并且包含编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸,其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子。
将包含至少第一和/或一种或多种第二多核苷酸的DNA构建体或表达载体引入宿主细胞中,从而将该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体保持,如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi),第8版,1995,国际应用生物科学中心(CABInternational),大学出版社(UniversityPress),英国剑桥(Cambridge,UK)中进行定义的)。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人,1995,见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸,而碳分解代谢是专性需氧的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如,丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长绒毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP238023,约尔顿(Yelton)等人,1984,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人,1988,生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人,1989,基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。
本发明的一个优选实施例涉及第一方面的宿主细胞,其中在宿主细胞的染色体中存在至少一种第一多核苷酸;优选地,该至少一种第一多核苷酸以两个或更多个拷贝存在于宿主细胞的染色体中。
在一个优选实施例中,感兴趣的多肽是选自下组的酶,该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶以及转移酶;优选地,感兴趣的多肽是选自下组的酶,该组由以下各项组成:α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
PepC蛋白酶
在一个优选实施例中,PepC蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的多肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置1至380或SEQIDNO:4的位置1至418所示的成熟序列至少80%相同;优选与SEQIDNO:2的位置1至380或SEQIDNO:4的位置1至418所示的成熟序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在中严格条件下,优选在中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件(如在此所定义)下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列;或(ii)(i)的全长互补体杂交;
c)一种由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列至少80%相同;优选与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同;
d)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的一种变体,该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入;以及
e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段,该片段具有蛋白酶活性。
本发明的PepC蛋白酶优选地包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成;或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一个方面中,该多肽包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中,该多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸1至380或SEQIDNO:4的氨基酸1至418或由其组成。
在另一个实施例中,本发明涉及分离的PepC蛋白酶,该蛋白酶由以下多核苷酸编码,该多核苷酸在中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,分子克隆,实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual),第二版,冷泉港(ColdSpringHarbor),纽约)。
可以使用SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的多核苷酸或其子序列、连同SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽或其片段来设计核酸探针,以根据本领域熟知的方法来鉴定并克隆对来自不同属或种的菌株的PepC蛋白酶多肽进行编码的DNA。具体而言,可以遵循标准DNA印迹程序,使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交,以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列,但是长度应为至少15,例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地,核酸探针的长度为至少100个核苷酸,例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针二者均可使用。典型地将探针进行标记(例如,用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白),以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码PepC蛋白酶多肽的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3或其子序列杂交的克隆或DNA,将载体材料用于DNA印迹中。
出于本发明的目的,杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交:(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3;(ii)SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列;(iii)其全长互补体;或(iv)其子序列;杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面中,该核酸探针是SEQIDNO:2的核苷酸1至1485、核苷酸49至1485或核苷酸346至1485。在另一个方面中,该核酸探针是SEQIDNO:3的核苷酸1至1599、核苷酸49至1599或核苷酸346至1599。在又另一个方面中,该核酸探针是编码以下项的多核苷酸:SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的多肽;其成熟多肽;或其片段。在另一个方面中,该核酸探针是SEQIDNO:1或SEQIDNO:3。
在另一个实施例中,本发明涉及一种由以下多核苷酸编码的PepC多肽,该多核苷酸与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
在另一个实施例中,本发明涉及SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的变体,这些变体在一个或多个(例如,若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一个实施例中,引入SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质,即,不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入;小缺失,典型地为1-30个氨基酸;小的氨基末端的或羧基末端的延伸,例如氨基末端甲硫氨酸残基;高达20-25个残基的小连接肽;或通过改变净电荷或另一功能有利于纯化的小的延伸,例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域。
保守取代的实例是在下组的范围内:碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill),1979在蛋白质(TheProteins),学术出版社(AcademicPress),纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。
可替代地,氨基酸改变具有这样的性质:改变多肽的物理化学特性。例如,氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH,等等。
可以根据本领域中已知的程序,如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells),1989,科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中,在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变,并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人,1996,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变,如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定,对结构进行物理学分析,从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见,例如德沃斯(deVos)等人,1992,科学(Science)255:306-312;史密斯(Smith)等人,1992,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904;乌乐达维尔(Wlodaver)等人,1992,欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试,随后进行相关筛选程序,如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer),1988,科学(Science)241:53-57;博维(Bowie)和萨奥尔,1989,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如,洛曼(Lowman)等人,1991,生物化学(Biochemistry)30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人,1986,基因(Gene)46:145;内尔(Ner)等人,1988,DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人,1999,自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞,并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽,其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽,其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合至本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的,并且包括连接编码多肽的编码序列,这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建,其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人,1993,欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583;道森(Dawson)等人,1994,科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括切割位点。在融合蛋白分泌之时,该位点被切割,从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点:马丁(Martin)等人,2003,工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576;斯维特娜(Svetina)等人,2000,生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251;拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人,1997,应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493;沃德(Ward)等人,1995,生物技术(Biotechnology)13:498-503;以及孔特雷拉斯(Contreras)等人,1991,生物技术9:378-381;伊顿(Eaton)等人,1986,生物化学(Biochemistry)25:505-512;柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人,1995,生物技术13:982-987;卡特(Carter)等人,1989,蛋白质:结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,andGenetics)6:240-248;以及史蒂文斯(Stevens),2003,药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。
本发明的PepC蛋白酶多肽可以获得自任何属的微生物。出于本发明的目的,如在此结合一种给定的来源使用的术语“从…中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中,从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。
该PepC蛋白酶多肽可以是一种真菌多肽。例如,该PepC多肽可以是酵母多肽,例如假丝酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属多肽;或丝状真菌多肽,例如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属、赤霉属、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属、柱顶孢霉属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属多肽。
在另一个方面中,该PepC蛋白酶多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在另一个方面中,该PepC多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、灰腐质霉、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌、产紫青霉、黄孢平革菌、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉多肽。
将理解的是,对于以上提到的物种而言,本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物,例如无性型,而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得,如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源,包括从自然界(例如,土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如,土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸,就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如,萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,见上文)。
多核苷酸
本发明还涉及编码PepC的多核苷酸,如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA,或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段,实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如,伊尼斯(Innis)等人,1990,PCR:方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication),学术出版社(AcademicPress),纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由曲霉属菌株或相关有机体克隆,并且因此,例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指该多肽的非天然发生的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽,例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸,和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列,但对应于预期用于产生该酶的宿主有机体的密码子用法的核苷酸取代,或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述,参见例如福德(Ford)等人,1991,蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体,这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸,在与控制序列相容的条件下,这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按多种方式操纵,以提供该多肽的表达。取决于表达载体,在多核苷酸序列插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必要的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子,即,被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。该启动子包含转录控制序列,这些序列介导该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸,包括突变型、截短型及杂合型启动子,并且可以由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的至少第一多核苷酸在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子:构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子,以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子,其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因,其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代;非限制性实例包括修饰的启动子,其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因,其中未翻译的前导子由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代);及其突变型、截短型和杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
用于指导编码本发明的真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是调节型异源性启动子;优选地,在具体化合物存在下,该调节型异源性启动子被诱导或抑制;更优选地,该调节型异源性启动子在硝酸盐存在下被诱导,并且在铵存在下被抑制;优选地,该调节型异源性启动子是丝状真菌硝酸还原酶启动子;更优选地,该调节型异源性启动子是来自曲霉属或木霉属细胞的硝酸还原酶启动子;甚至更优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的硝酸还原酶启动子;最优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的niaD硝酸还原酶启动子;最优选地,该调节型异源性启动子包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:41至少80%相同;优选地,与SEQIDNO:41至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%%相同。
在另一个优选实施例中,该调节型异源性启动子在山梨醇存在下被诱导并且在不存在山梨醇时被抑制;优选地,该调节型异源性启动子是来自曲霉属或木霉属细胞的丝状真菌山梨醇转运体启动子或山梨醇脱氢酶启动子;甚至更优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的山梨醇转运体启动子或山梨醇脱氢酶启动子;最优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的sorA或sorB启动子;最优选地,该调节型异源性启动子包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:42或SEQIDNO:43至少80%相同;优选地,与SEQIDNO:42或SEQIDNO:43至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得:构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域,它增加该基因的表达。
该控制序列还可以是一个前导子,一种对宿主细胞翻译重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中起作用的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列,可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得:构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地,编码序列的5’-端可以包含对于该编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下,可能需要外源信号肽编码序列。可替代地,外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而,可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下各项的基因的信号肽编码序列:黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切右旋糖酐酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下,该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
还可能希望地是添加调节序列,这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。在丝状真菌中,可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中,这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中,编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体,该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地,该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时,该编码序列位于该载体中,这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如,质粒或病毒),其能够方便地进行重组DNA程序,并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是自主复制载体,即,作为染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体复制,例如,质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地,该载体可以是这样一种载体,当它被引入该宿主细胞中时,被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外,可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因,该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于,adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶),连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是如在WO2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一个方面中,双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中,该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地,该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性,这些整合的元件应包含足够数量的核酸,例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对,这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外,这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面,该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制,该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”意指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人,1991,基因(Gene)98:61-67;卡伦(Cullen)等人,1987,核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可以根据披露于WO00/24883中的方法来完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目,其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见,例如,萨姆布鲁克(Sambrook)等人,1989,见上文)。
在本发明的一个优选实施例中,PepC蛋白酶是与选自下组的前肽一起表达的,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的前肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置-99至-1或SEQIDNO:4的位置-99至-1所示的序列至少80%相同;优选与SEQIDNO:2的位置-99至-1或SEQIDNO:4的位置-99至-1所示的成熟序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的前肽,该多核苷酸在中严格条件下,优选在中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件(如在此所定义)下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的前肽编码序列,或(ii)(i)的全长互补体杂交;或
c)一种由以下多核苷酸编码的前肽,该多核苷酸具有以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的前肽编码序列至少80%相同,优选与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的前肽编码序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同。
在本发明的另一个优选实施例中,PepC蛋白酶是与选自下组的信号肽一起表达的,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的信号肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置-115至-100或SEQIDNO:4的位置-115至-100所示的序列至少80%相同,优选与SEQIDNO:2的位置-115至-100或SEQIDNO:4的位置-115至-100所示的序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的信号肽,该多核苷酸在中严格条件下,优选在中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件(如在此所定义)下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的信号肽编码序列,或(ii)(i)的全长互补体杂交;或
c)一种由以下多核苷酸编码的信号肽,该多核苷酸与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的信号肽编码序列具有至少80%序列一致性,优选与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的信号肽编码序列至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同。
产生方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法,这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞;并且可任选地,(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如,可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下,进行摇瓶培养,或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续,分批,分批补料,或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序,在一种适合营养培养基中发生,该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如,在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中,那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌,那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于,特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如,可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如,该多肽可以通过常规程序,包括但不限于,收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀,从该营养培养基回收。在一个方面中,回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽,这些程序包括但不限于:色谱法(例如,离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如,制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如,硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如,蛋白质纯化(ProteinPurification),詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑,VCH出版社(VCHPublishers),纽约,1989)。
在一个替代性方面中,没有回收该多肽,而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
实例
材料与方法
PCR、克隆、连接核苷酸等的一般方法是本领域普通技术人员熟知的并且可以例如发现于“分子克隆:实验室手册(Molecularcloning:Alaboratorymanual)”,萨拉布鲁克(Sambrook)等人(1989),冷泉港实验室(ColdSpringHarborlab.),冷泉港,纽约;奥苏贝尔(Ausubel),F·M等人(编辑);“分子生物学实验指南(CurrentprotocolsinMolecularBiology)”,约翰威立父子公司(JohnWileyandSons),(1995);哈伍德(Harwood),C·R和卡廷(Cutting),S·M(编辑);“DNA克隆:实用方法(DNACloning:APracticalApproach),I和II卷”,D.N.格洛弗(Glover)编辑(1985);“寡核苷酸合成”(OligonucleotideSynthesis),M.J.盖特(Gait)编辑(1984);“核酸杂交(NucleicAcidHybridization)”,B.D.黑姆斯(Hames)&S.J.希金斯(Higgins)编辑(1985);“分子克隆实用指南(APracticalGuideToMolecularCloning)”,B.帕柏尔(Perbal)(1984)。
培养基和试剂
用于缓冲液和底物的化学品是分析等级的商品:
-Cove:342.3g/L蔗糖、20ml/LCOVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L诺布尔(noble)琼脂。
-Cove顶层琼脂:342.3g/L蔗糖、20ml/LCOVE盐溶液、10mM乙酰胺、10g/L低熔点琼脂糖
-Cove-2:30g/L蔗糖、20ml/LCOVE盐溶液、10mM乙酰胺、30g/L诺布尔琼脂。
-COVE盐溶液由以下构成:26gKCl、26gMgSO4·7H2O、76gKH2PO4和50mlCove痕量金属,水补足至1升。
-用于COVE的痕量金属溶液由以下构成:0.04gNaB4O7·10H2O、0.4g的CuSO4·5H2O、1.2g的FeSO4·7H2O、1.0g的MnSO4·H2O、0.8g的中性淀粉酶IIMoO2·2H2O、和10.0g的ZnSO4·7H2O,水补足至1升。
-COVE-N顶层琼脂糖由以下构成:342.3g的蔗糖、20ml的COVE盐溶液、3g的NaNO3、和10g的低熔点琼脂糖,水补足至1升。
-淀粉糖苷酶痕量金属溶液由以下构成:6.8gZnCl2·7H2O、2.5gCuSO4·5H2O、0.24gNiCl2·6H2O、13.9gFeSO4·7H2O、13.5gMnSO4·H2O和3g柠檬酸,水补足至1升。
-YPG由以下构成:4g的酵母提取物、1g的KH2PO4、0.5g的MgSO4·7H2O和15g的葡萄糖(pH6.0),水补足至1升。
-STC缓冲液由以下构成:0.8M的山梨醇、25mM的Tris(pH8)、和25mM的CaCl2,水补足至1升。
-STPC缓冲液由以下构成:在STC缓冲液中的40%PEG4000。
-MSS由以下构成:70g蔗糖、100g大豆粉(pH6.0),水补足至1升。
-MU-1由以下构成:260g的麦芽糊精、3g的MgSO4·7H2O、5g的KH2PO4、6g的K2SO4、淀粉糖苷酶痕量金属溶液0.5ml和尿素2g(pH4.5),水补足至1升。
-MU-1glu由以下构成:260g的葡萄糖、3g的MgSO4·7H2O、5g的KH2PO4、6g的K2SO4、淀粉糖苷酶痕量金属溶液0.5ml和尿素2g(pH4.5),水补足至1升。
实例1-4中的PCR扩增:
在包含以下项的100微升体积中进行所有PCR扩增:2.5单位Taq聚合酶、100ng的pSO2、250nM的每种dNTP、和10pmol的于50mMKCl、10mMTris-HCl(pH8.0)、1.5mMMgCl2的反应缓冲液中的上述两种引物中的每一种。在珀金-埃尔默(Perkin-Elmer)CetusDNATermal480中进行扩增,并且扩增由以下组成:在94℃下的一个3分钟的循环,随后是25个以下循环:在94℃下1分钟,在55℃下30秒,和在72℃下1分钟。
实例5-8中的PCR扩增:
3步循环:
预变性:94℃,2min。
米曲霉转化
如克里斯滕森(Christensen)等人;生物技术(Biotechnology)198861419-1422所述,完成曲霉属转化。简言之,使米曲霉菌丝体在富营养肉汤中生长。通过过滤,从肉汤中分离出菌丝体。将酶制剂(诺维信公司(Novozymes))添加至渗透压稳定的缓冲液(例如用磷酸钠缓冲至pH5.0的1.2MMgSO4)中的菌丝体中。将悬浮液在37℃下伴随搅拌孵育60分钟。通过mira-cloth过滤原生质体,以去除菌丝体碎片。收获原生质体,并且用STC(1.2M山梨醇、10mMCaCl2、10mMTris-HCl(pH7.5))洗涤两次。最后在200-1000微升STC中重悬原生质体。
用于转化,将5微克DNA添加至100微升原生质体悬浮液中,并且然后添加200微升PEG溶液(60%PEG4000、10mMCaCl2、10mMTris-HCl(pH7.5)),并且在室温下孵育该混合物20分钟。收获原生质体并且用1.2M山梨醇洗涤两次。最后,在200微升1.2M山梨醇中重悬原生质体。在包含1.0M蔗糖作为碳源、10mM乙酰胺作为氮源的最低板(科夫(Cove.)D.J.1966.生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)113:51-56)上,针对其使用乙酰胺作为唯一氮源的能力来选择包含amdS基因的转化体。在37℃下生长5-7天后,稳定的转化体看起来强力地生长并且使菌落形成孢子。通过分生孢子纯化转化体两次。
黑曲霉转化
如克里斯滕森(Christensen)等人;生物技术(Biotechnology)198861419-1422所述,完成曲霉属转化。以下描述了优选程序。
将黑曲霉宿主菌株接种至100ml的补充有10mM尿苷的YPG培养基上,并且在32℃下在80rpm下孵育16hr。将球粒进行收集并且用0.6MKCl洗涤,并且将其重悬于含有商业β-葡聚糖酶产品(GLUCANEXTM,诺维信公司(NovozymesA/S),鲍斯韦(Bagsvaerd),丹麦)的20ml0.6MKCl(终浓度为20mg/ml)中。将悬浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生质体,并且然后用STC缓冲液洗涤两次。将这些原生质体用血红蛋白计计数,并且在8:2:0.1的STC:STPC:DMSO溶液中重悬并调整至终浓度为2.0x107个原生质体/ml。将大约4μg的质粒DNA添加至100μl的原生质体悬浮液中,轻轻混合,并且在冰上孵育30分钟。添加1ml的SPTC,并且将原生质体悬浮液在37℃下孵育20分钟。在添加10ml的50℃Cove或Cove-N顶层琼脂糖之后,将反应液倾例于Cove琼脂板上,并且将板于32℃下孵育5天。
摇瓶发酵
用来自转化体菌株的孢子接种包含10mlYPM培养基(2g/l酵母提取物、2g/l蛋白胨和2%麦芽糖)的摇瓶,并且在30℃,200rpm下孵育4天。
米曲霉发酵方案
种子培养:将来自固体最低培养基(科夫(Cove)(1966)生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta),113:51-56)斜面的孢子转移至摇瓶(甘油20g/L、酵母提取物18g/L)中,并且在30℃和250rpm下孵育1天。
分批补料发酵:
将罐培养基(蔗糖24g/L、酵母提取物10g/L、(NH4)2SO45g/L、MgSO4·7H2O2g/L、K2SO42g/L、柠檬酸1g/L、KH2PO42g/L、痕量金属溶液0,5ml/L)调节至34℃。通气为1vvm,并且使用10%NH4OH将pH控制在6,0。从种子培养接种主培养基。当pH>6,4时,按3,33g/L/h的速率开始给料(400g/L麦芽糖浆、1g/L柠檬酸)。控制搅拌器速度,以避免氧张力过低(<20%)。
用于天冬酰胺酶产生的实验室规模罐培养
按分批补料发酵来完成发酵(H.佩德森(Pedersen)2000,应用微生物学与生物技术(ApplMicrobiolBiotechnol),53:272-277)。将所选择菌株在液体培养基中预培养,然后将生长的菌丝体转移到罐中用于酶产生的进一步培养。在pH4.75下在34℃下培养7天,用葡萄糖和铵进行给料而不过度给予(其阻止酶产生)。使用离心后的培养物上清液用于酶测定。
SDS-page
脂肪酶/角质酶:使用的SDS凝胶为CriterionTMXT预制凝胶,10%Bis-Tris,来自伯乐公司,并且如制造商推荐的跑胶并且用考马斯蓝染色。
天冬酰胺酶:使培养物上清液经历SDS-PAGE分析。通过使用具有miniPAGE(pageRun)系统(#AE-6531,ATTO)的e.Pagel12.5%E-R12.5L(#2331720,ATTO)来进行SDS-PAGE。在凝胶上,上样二十ul的样品(十μl的每种样品与10ul的上样缓冲液混合)。还施加十ul的MW标记:(预染色的SDS-PAGE标准品,伯乐#161-0318)。在1xSDS缓冲液(伯乐公司)中,在20mA的恒电流下使凝胶电泳80min。通过CBBStainOne(那卡赖公司(Nakarai))将蛋白带染色。
基因
pyrG:这一基因编码乳清苷-5’-磷酸脱羧酶,该脱羧酶是尿苷的生物合成中涉及的一种酶。
amdS:这一基因编码乙酰胺酶,乙酰胺酶是乙酰胺的代谢中涉及的一种酶。
质粒
pCOls1124描述于2013年5月29日提交的专利申请PCT/EP2013/061052中。
pCOls1126描述于2013年5月29日提交的专利申请PCT/EP2013/061052中。
pCOls1130描述于2013年5月29日提交的专利申请PCT/EP2013/061052中。
pCOls1148描述于2013年5月29日提交的专利申请PCT/EP2013/061052中。
pCOls1150描述于实例2中
pCOls1151描述于实例2中
pCOls1152描述于实例2中
pCOls1175描述于实例2中
pCOls1197描述于实例2中
pCOls1198描述于实例2中
pCOls1202描述于实例2中
pCOls1360描述于实例2中
pCOls1386描述于实例2中
pCOls1387描述于实例2中
pCR-4Blunt-TOPO来自英杰公司。
pDAu689描述于实例4中
pHUda797描述于专利US2013095525,实例1中
pJaL554描述于专利WO07045248,实例9中
pJaL617描述于实例1中
pJaL619描述于实例1中
pJaL620描述于实例1中
pMLxN31描述于实例3中
pMT1335描述于专利WO98/12300,实例2中
pMT3536描述于实例1中
将TOPO质粒克隆试剂盒(英杰公司)和pBluescriptIISK-(Stratagene#212206)用于克隆PCR片段。
pJN001描述于WO2008110513中。
由构巢曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Pgpd)和构巢曲霉色氨酸合酶终止子(TtrpC)驱动的含有构巢曲霉pyrG基因和单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶基因(TK)的pHUda801描述于WO2012/160093中的实例4中。
pRika147酶表达载体描述于WO2012/160093,实例9中。
pHUda1306描述于_WO2012/160093,实例14中
菌株
使用大肠杆菌DH5-α(东洋公司(Toyobo))用于质粒构建和扩增。
米曲霉NBRC4177:可获得自发酵研究所(Instituteforfermentation),大阪;17-25JusoHammachi2-ChomeYodogawa-Ku,大阪,日本。
米曲霉COls454描述于专利WO2012160093,实例16中
米曲霉DAu712描述于实例4中
米曲霉DAu729描述于实例4中
米曲霉MLxN56描述于实例1中
米曲霉MLxN69描述于实例3中
米曲霉MLxN70描述于实例3中
米曲霉RUNG237描述于实例1中
将米曲霉RIB40/ATCC42149用作启动子序列的基因来源;其亲本宿主(NN059280)描述于WO2012/160093,实例13中。
黑曲霉菌株C2948是NN059280的pepC基因缺陷衍生物。进行C2948的pyrG基因解救,以产生C2948-6,如在WO2012/160093中所述。
序列
SEQIDNO:1:米曲霉PepC编码DNA序列
SEQIDNO:2:米曲霉PepC蛋白酶
SEQIDNO:3:黑曲霉PepC编码DNA序列
SEQIDNO:4:黑曲霉PepC蛋白酶
SEQIDNO:5:引物oJaL1135’-gagctgctggatttggctg
SEQIDNO:6:引物oJaL1145’-ccaacagccgactcaggag
SEQIDNO:7:引物oJaL2285’-accagcagcaacggcgaag
SEQIDNO:8:引物oJaL2295’-ggccttccctgccggtaacatgagaggcatcctcggcc
SEQIDNO:9:引物oJaL2305’-ggccgaggatgcctctcatgttaccggcagggaaggcc
SEQIDNO:10:引物oJaL2315’-cgtccacgcggggattatgcggatgtggacgggttatcgg
SEQIDNO:11:引物oJaL2325’-ccgataacccgtccacatccgcataatccccgcgtggacg
SEQIDNO:12:引物oJaL2335’-taatcactccgaaaggtcccccccgtcaaggagcttatcg
SEQIDNO:13:引物oJaL2345’-cgataagctccttgacgggggggacctttcggagtgatta
SEQIDNO:14:引物oJaL2355’-gcacagccgtagtgggag
SEQIDNO:15:引物B2103F035’-actagttagaatgctggaccagccccg
SEQIDNO:16:引物B2103F045’-aagcttatttgtctctgacacac
SEQIDNO:17:引物P8015’-gaaacctgtcgtgccagttaattaagagagagttgaacctggacgc
SEQIDNO:18:引物P8025’-gcggccgcttttttttgcgatcgcggtgactgacacctggcggtag
SEQIDNO:19:引物P8035’-gcgatcgcaaaaaaaagcggccgcccccagttgtgtatatagagg
SEQIDNO:20:引物P8045’-gccgattcattaatgcagggcgcgcctgaatgtataagctagcttccg
SEQIDNO:21:引物P8055’-tagcttatacattcaggcgcgccttcggtaaatacactatcacacac
SEQIDNO:22:引物P8065’-gattcattaatgcagggcgcggtttaaacattagtgataccccactctaag
SEQIDNO:23:引物P8305’-aaaaaaggccttcttggccccacacaacatacgagccgg
SEQIDNO:24:引物P8315’-aaaaaagcttttatacattcaaatatgtatccgctc
SEQIDNO:25:柔毛腐质霉脂肪酶变体编码序列
SEQIDNO:26:引物P8755’-cagttgtcgcttggtgcatc
SEQIDNO:27:引物P8825’-cttagagtggggtatcactaataagcttgtttctgcattaatgaatcggcc
SEQIDNO:28:引物P8815’-aagcttattagtgataccccactctaag
SEQIDNO:29:引物P8645’-aggacttcccctacggctccg
SEQIDNO:30:引物P2005’-ccaactccgccgttgcatatc
SEQIDNO:31:引物P9205’-ttttttttaattaattggcggtgatattgatggcac
SEQIDNO:32:引物P9215’-aaaaaagcttgcatgcactagtttatacattcaaatatgtatccgctc
SEQIDNO:33:引物P9225’-tagtgcatgccctagggtcgacttaagcaaggattttcttaac
SEQIDNO:34:引物P9235’-cgaccctagggcatgcactagtctgtcagaccaagtttactcatatatac
SEQIDNO:35:引物P9245’-aaaaaagcttactagtgcatgcgtttctgcattaatgaatcggcc
SEQIDNO:36:引物MLxnoli205’-caactgggggcggccgcaccatgaagctactctctctgaccg
SEQIDNO:37:引物MLxnoli215’-gtcagtcaccgcgatcgctcagggggtgacgatg
SEQIDNO:38:特异腐质霉角质酶编码序列
SEQIDNO:39:引物DAuP8105’-caactgggggcggccgcaccatgaagttcttcaccacgatcctctcg
SEQIDNO:40:引物DAuP8115’-gtcagtcaccgcgatcgtcacgccctaattcggtcgacgag
SEQIDNO:41:米曲霉niaD启动子,PniaD。
SEQIDNO:42:米曲霉sorA启动子,PsorA。
SEQIDNO:43:米曲霉sorB启动子,PsorB。
实例1.米曲霉PniaD-pepC菌株MLxN56的构建
amdS缺失的米曲霉菌株MT3625的构建
用于米曲霉amdS基因的缺失,按以下方式构建表示为pMT3536的质粒:通过用引物B2103F03和B2103F04对米曲霉基因组DNA进行PCR,扩增了2654bpDNA片段,该片段包含完整amdS编码区,包括352bp上游序列和348bp下游序列。同时,在经扩增的DNA的末端添加限制酶切位点(SpeI位于amdS基因的5’,并且HindIII位于amdS基因的3’)。根据制造商的说明书,将2654片段克隆进pCR-4Blunt-TOPO载体,由此产生质粒pJaL617。
将amdS基因分离为来自pJaL617的2648bpSpeI-HindII片段,并且将其克隆进质粒pJaL575中的对应限制酶切位点,由此产生包含米曲霉amdS基因和单纯性疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVTK)的质粒pJaL619。
接下来,将编码米曲霉pyrG基因的来自质粒pJaL554的2132bpXbaI-SalI与pJaL619的8786bpXhoI-XbaI片段连接在一起,以产生质粒pJaL620,从而用编码米曲霉pyrG基因的2132bp片段替换amdS的267bp片段。
然后通过将以下片段连接在一起而用构巢曲霉pyrG基因替换米曲霉pyrG基因,以产生米曲霉amdS缺失质粒pMT3536:
1.来自pJaL620的5947bpBssHI-XbaIDNA片段;
2.来自pHUda797的2124bpSpeI-NsiIDNA片段;和
3.来自pJaL620的2798bpNsiI-BssHIDNA片段。
用SpeI将质粒pMT3536线性化,并且用于转化米曲霉COls454,并且在包含0.6mM5-氟-2’-脱氧尿苷(FdU)的最低培养基上选择转化体,如在WO0168864中所述。将多个转化体重新分离两次,并且制备染色体DNA。用EcoRI消化来自每个转化体的染色体DNA,并且通过DNA印迹使用来自包含米曲霉amdS基因的5’侧翼的pMT3536的705bp32P-标记的DNASpeI-NheI片段作为探针进行分析。通过7353bpEcoRI带的消失和9168bpEcoRI带的出现,从DNA印迹鉴定感兴趣的菌株。将一个这样的转化体命名为MT3625。
pyrG缺失的米曲霉菌株RUNG237的构建
为了去除米曲霉菌株MT3625中存在于amdS基因中的pyrG基因,完成以下工作:
针对对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性来筛选米曲霉菌株MT3625,用来在补充有1.0M蔗糖作为碳源、10mM硝酸钠作为氮源和0.5mg/mlFOA的最低板(科夫(Cove)D.J.1966.生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)113:51-56)上鉴定自发pyrG突变体。一个菌株RUNG237被鉴定为是pyrG负型的。RUNG237是尿苷依赖性的,因此可以用野生型pyrG基因来转化它,并且通过在不存在尿苷时生长的能力来选择转化体。
pepC-启动子交换的米曲霉菌株MLxN56的构建
在米曲霉菌株MLxN56中,用米曲霉硝酸还原酶启动子PniaD替换其天然pepC启动子,PniaD通过不同氮源进行调节–存在硝酸盐将诱导表达,而铵将抑制表达。按以下方式进行启动子交换:
通过SOEPCR(重叠延伸拼接PCR)如下产生包含夹在3’pepC区域(pepC的编码区的一部分)和5’部分pyrG基因之间的niaD启动子的第一3529bpDNA片段:
a)用引物oJaL228和oJaL229,基于作为模板的米曲霉BECh2的染色体DNA制备1019bpPCR片段;
b)用引物oJaL230和oJaL231,基于作为模板的米曲霉BECh2的染色体DNA制备1149bpPCR片段;并且
c)用引物oJaL232和oJaL114,使用质粒pJaL554作为模板制备1149bpPCR片段。
纯化这三个片段a)-c),混合在一起,并且使用引物oJaL228和oJaL114进行PCR反应,以产生3529bpPCR片段。
产生包含通过PCR扩增的以下两个片段的3’部分pyrG基因和5’pepC区域的第二2497bpPCR片段:
d)用引物oJaL113和oJaL233,使用质粒pJaL554作为模板制备1465bpPCR片段;并且
e)用引物oJaL234和oJaL235,基于BECh2的染色体DNA制备1072bpPCR片段。
纯化这两个片段d)和e),并且混合在一起,并且使用引物oJaL113和oJaL235进行PCR反应,以产生2497bpPCR片段。
根据克里斯滕森(Christensen)等人,1988,生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422的方法,将第一3529bp和第二2497bpPCR片段混合在一起,并且转化进米曲霉RUNG237。RUNG237缺失了pyrG基因,因此它只能在补充有尿苷的最低培养基上生长。
针对它们在最低培养基上生长的能力选择转化体,意指在5’部分pyrG基因和3’部分pyrG基因上,在这两个PRC片段之间至少已经发生了同源重组,以产生完整的pyrG基因。将转化体重新分离两次。为了制备基因组DNA,在液体培养基(2g/l酵母提取物、2g/l蛋白胨和2%葡萄糖)中培养转化体。如先前在WO0168864所述的制备染色体DNA。
进行pepC座位的DNA印迹分析,目的是鉴定其中在PCR片段的染色体pepC与3’和5’pepC区域之间已经发生了完全的双交换(cleandoublecross-over)的转化体。用限制性内切酶SpeI和StuI消化染色体DNA。用以上经扩增的1019bpPCR片段探测DNA印迹。如果天然pepC启动子已经成功地与niaD启动子和pyrG基因进行了交换,则将预期带大小从3340bp移至6326bp。按以下方式分离并且加工具有这种带移的菌株,用来进一步去除在pepC座位处插入的pyrG基因:
针对对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性来筛选被选择的米曲霉菌株,用来在补充有1.0M蔗糖作为碳源、10mM硝酸钠作为氮源和0.5mg/mlFOA的最低板(科夫(Cove)D.J.1966.生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)113:51-56)上鉴定自发pyrG突变体。
一个这样的菌株MLxN56被鉴定为是pyrG负型的。MLxN56具有与pepC基因可操作地连接的niaD启动子,并且它是尿苷依赖性的,因此它适合用野生型pyrG基因进行的后续转化以及通过在不存在尿苷时生长的能力进行的选择。
实例2.曲霉属表达质粒的构建。
用AfeI和AatII切割质粒pCOls1126。纯化5615bp片段,并且然后将其用克列诺(Klenow)聚合酶平端化。然后连接片段,并且将所得质粒命名为pCOls1150。
首先,使用pCOls1124作为模板并且使用引物对P801和P802扩增PCR片段。其次,使用pCOls1124作为模板并且使用引物对P803和P804扩增另一个PCR片段。使用SOE-PCR和引物对P801和P804融合这两个PCR片段。根据制造厂的说明书,使用In-Fusion试剂盒将SOE-PCR片段插入用PvuII线性化的pCOls1150中。将所得质粒命名为pCOls1151。
使用pCOls1124作为模板并且使用引物对P805和P806扩增PCR片段。将经扩增的PCR片段融合克隆进用AscI线性化的pCOls1151。将所得质粒命名为pCOls1152。
使用pCOls1130作为模板和引物对P830和P831扩增PCR片段。将来自pCOls1152的7532bpHindIII-PmeI片段连接至用HindIII和StuI切割的PCR片段。将所得质粒命名为pCOls1197。
将来自pCOls1130的9406bpHindIII-SacII片段连接至来自pCOls1148的1286bpHindIII-SacII片段。将所得质粒命名为pCOls1175。
将来自pCOls1175的1456bpTth111I-AfeI片段连接至来自pCOls1197的8241bpTth111I-AfeI片段。将所得载体命名为pCOls1198。
用NotI和AsiSI切割编码柔毛腐质霉脂肪酶变体的DNA序列。将所得947bp片段连接至来自pCOls1198的9678bpAsiSI-NotI片段。将所得质粒命名为pCOls1202。
首先,使用pCOls1202作为模板和引物对P875和P882扩增一个PCR片段。其次,使用pCOls1202作为模板和引物对P881和P864扩增另一个PCR片段。
使用SOE-PCR和引物对P875和P864融合以上两个PCR片段。用XhoI-BsiWI切割SOE-PCR片段并且将其连接至来自pCOls1202的8275bpXhoI-BsiWI片段。将所得质粒命名为pCOls1360。
使用pCOls1360作为模板和引物对P920和P200扩增PCR片段。用PacI-BsrGI切割所得PCR片段,并且纯化933bp片段,并且将其连接至来自pCOls1360的9512bpPacI-BsrGI片段。将所得质粒命名为pCOls1386。
首先,使用pCOls1386作为模板和引物对P921和P922扩增PCR片段。其次,使用pCOls1386作为模板和引物对P923和P924扩增另一个PCR。使用SOE-PCR和引物对P921和P924融合这两个PCR片段。用HindIII切割SOE-PCR片段,并且按以下取向将其连接至来自pCOls1386的8268bpHindIII片段,即如果用XhoI和ApaLI切割所得质粒,这些片段给出524bp和9969bp的片段。将所得质粒命名为pCOls1387。
实例3.具有天然对niaDpepC启动子的米曲霉中的脂肪酶表达
南极假丝酵母脂肪酶B表达质粒pMLxN31的构建。
用引物MLxn20和MLxn21通过PCR从质粒pMT1335扩增南极假丝酵母脂肪酶B编码区,由此提供1067bpDNA片段。在此扩增中,向脂肪酶编码区的5’添加了20bp,并且向脂肪酶编码区的3’添加了18bp,以制备它,用于In-克隆(克隆技术公司(ClontechInc.),美国)。用NotI和AsiAI消化质粒pCOls1198,并且从1%琼脂糖凝胶带纯化所得9684bp片段。混合9684bp和1067bp的两个片段,并且用In-PCF剪接在一起。这产生了南极假丝酵母脂肪酶B的曲霉属表达质粒pMLxN31。
米曲霉菌株中的南极假丝酵母脂肪酶B表达
如以下方法所述,用表达质粒pMLxN31转化米曲霉菌株RUNG237和MLxN56。
用来自产生的转化体和宿主BECh2的孢子接种包含10mlYPM培养基(2g/l酵母提取物、2g/l蛋白胨和2%麦芽糖)的摇瓶,并且在30℃下伴随振荡(200rpm)孵育4天。在SDS-page上分析上清液(10μl)。从亲本宿主RUNG237和PniaDPepC调节的菌株MLxN56中的每一个分离产生南极假丝酵母脂肪酶B蛋白的一个转化体,并且将其分别命名为MLxN69和MLxN70。
如以下方法所述,在1l罐中发酵MLxN69和MLxN70菌株。图1示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片,其中在5天的发酵期间,用在第2-5天每天所取的样品,将来自这两个转化体的产物形成可视化。图1中最左侧泳道是“完美蛋白标记TM”(诺瓦根公司),大小为10-225kDa。泳道2-5示出了菌株MLxN69(在第2-5天)的产物形成(从天然PepC启动子表达的pepC)。泳道6-9示出了菌株MLxN70(在第2-5天)的产物形成(从PniaD启动子表达的pepC)。图中的粗箭头指示全长南极假丝酵母脂肪酶B蛋白。小箭头指示脂肪酶的降解产物。通过质谱分析确认蛋白带是全长南极假丝酵母脂肪酶B蛋白(大箭头)抑或其蛋白片段。
图1显示在MLxN70中PepC-表达的基于氨的抑制(经由其从调节型PniaD启动子的表达)显著降低了脂肪酶的降解,因为在泳道6-9中不可见脂肪酶降解产物。
南极假丝酵母脂肪酶B在发酵液中的稳定性
通过在-18℃和34℃的温度下将来自第5天的发酵液样品孵育7天,测试南极假丝酵母脂肪酶B蛋白在来自菌株MLxn69和Mlxn70的发酵液中的稳定性。图2示出了在SDS-PAGE凝胶上跑胶的样品。泳道2和3分别是储存在-18℃下的MLxN69和MLxN70的样品。泳道4和5分别是储存在34℃下的MLxN69和MLxN70的样品。
图2显示当在-18℃下孵育时,脂肪酶蛋白在两个菌株的发酵液中都是稳定的。然而,在34℃下孵育使得脂肪酶蛋白在MLxN69中不稳定,其中脂肪酶蛋白已经几乎完全消失(泳道4)。相反,脂肪酶在菌株MLxN70中是稳定的,其中经由niaD启动子抑制PepC蛋白酶的表达(泳道5)。
实例4.具有天然对PniaD调节的PepC的米曲霉菌株中的角质酶
特异腐质霉角质酶表达质粒pDAu689的构建。
用引物DAuP810和DAuP811通过PCR扩增特异腐质霉角质酶编码区,以提供727bpDNA片段。在此扩增中,向角质酶编码区的5’添加了20bp,并且向角质酶编码区的3’添加了17bp,以制备它,用于In-克隆。用NotI-PvuII消化质粒pCOls1387,并且从1%琼脂糖凝胶带纯化9546bp片段。混合这两个9546bp和1067bpPCR片段,并且用In-克隆将其一起克隆。这产生了命名为pDAu689的特异腐质霉角质酶的曲霉属表达质粒。
米曲霉菌株中的特异腐质霉角质酶表达
如以下方法所述,用角质酶表达质粒pDAu689转化米曲霉菌株RUNG237和MLxN56。
用来自产生的转化体和宿主BECh2的孢子接种包含10mlYPM培养基(2g/l酵母提取物、2g/l蛋白胨和2%麦芽糖)的摇瓶,并且在30℃下伴随振荡(200rpm)孵育4天。通过SDS-PAGE分析上清液(10μl)。从RUNG237亲本和MLxN56菌株中的每一个分离一个产生特异腐质霉角质酶蛋白的转化体,并且将其分别命名为DAu712和DAu729。
如以下方法所述,在1l罐中发酵这两个菌株DAu712和DAu729。
图4示出了考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶的照片,其中在第5天来自两个转化体的产物形成被可视化。图4中最左侧泳道是“SeeBluePlus2TM”(英杰公司),大小为4-250kDa。泳道2和3分别示出了菌株DAu712(从天然PepC启动子表达的pepC)和Dau729(从PniaD启动子表达的pepC)在第5天的产物形成。图中的粗箭头指示全长特异腐质霉角质酶蛋白。小箭头指示脂肪酶的降解产物。通过质谱分析确认蛋白带是全长特异腐质霉角质酶蛋白(大箭头)抑或其蛋白片段。该图显示在DAu729中PepC-表达的基于氨的抑制(经由其从调节型PniaD启动子的表达)显著降低了角质酶的降解,因为在泳道3中不可见角质酶降解产物。
实例5.具有PepC对ΔPepC的黑曲霉菌株中的天冬酰胺酶
表达质粒pHiTe50的构建
基于WO2004/032648中的序列信息,用包含BamHI/PmlI限制酶切位点的引物对HTJP-2和HTJP-3通过PCR从pJN001扩增米曲霉天冬酰胺酶的1.1kb区域。
SEQIDNO:44:引物HTJP-2:5’ccgcacgtgtcaagcaaccccaatccgc
SEQIDNO:45:引物HTJP-3:5’cgcggatccaccatgggtgtcaatttcaaagttcttg
从琼脂糖凝胶回收获得的包含米曲霉天冬酰胺酶基因的1.1kbDNA片段,并且用BamHI和PmlI进行消化。将BamHI-PmlI1.1kb片段连接进来自pRika147的修饰质粒的BamHI-PmlI片段,在该修饰质粒中用在pCols1124中使用的Na2/tpi启动子取代其启动子。将所得质粒命名为pHiTe50。在大肠杆菌DH5α中进行质粒制备。此外,pHiTe50携带来自构巢曲霉的选择性标记amdS。
用pHiTe50进行的黑曲霉亲本菌株的转化
为了在黑曲霉亲本菌株NN059280中表达天冬酰胺酶,对靶向天冬酰胺酶表达盒的整合的以下四个座位进行修饰:amyA、amyB、asaA和payA。在这些座位处,将天冬酰胺酶编码基因与amdS选择性标记一起整合,如在WO2012/160093中所述。从补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的标准培养基中选择转化体。
将随机选择的转化体接种到补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的最低培养基板上。使分离的菌株经历DNA印迹分析,以确认4个拷贝的天冬酰胺酶编码基因是否已经正确引入。使用以下引物组制备非放射性探针:
SEQIDNO:46:引物HTJP-24:5’ccgcaacaacaggttacaaag
SEQIDNO:47:引物HTJP-25:5’ccaggttacccatttcgatg
从所选择的转化体中提取的染色体DNA被HindIII消化。通过正确的基因破坏事件,用探针确认了在amyA、amyB、asaA和payA座位处的大小为7.8、4.7、6.4和4.4kb的杂交信号。选择了一个表示为50-4C-9的4拷贝天冬酰胺酶菌株。
用pHiTe50进行的PepC缺陷型黑曲霉后代菌株的转化
为了在PepC缺陷型C2948菌株(亲本NN059280的衍生物)中表达天冬酰胺酶,对靶向天冬酰胺酶表达盒的整合的以下四个座位进行修饰:amyA、amyB、asaA和payA。在这些座位处,将天冬酰胺酶编码基因与amdS选择性标记一起整合,如在WO2012/160093中所述。从补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的标准培养基中选择转化体。
将随机选择的转化体接种到补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的最低培养基板上。使分离的菌株经历DNA印迹分析,以确认4个拷贝的天冬酰胺酶编码基因是否已经正确引入。
从所选择的转化体中提取的染色体DNA被HindIII消化。通过正确的基因破坏事件,用探针确认了在amyA、amyB、asaA和payA座位处的大小为7.8、4.7、6.4和4.4kb的杂交信号。选择了一个表示为50-C2948-9的4拷贝天冬酰胺酶菌株。
黑曲霉菌株50-4C-9(PepC+)对50-C2948-9(ΔPepC)中的天冬酰胺酶表达
确定菌株50-4C-9(天然PepC)对50-C2948-9(ΔPepC)的上清液的天冬酰胺酶活性。在pH4.75下,在标准黑曲霉发酵条件下,平行地罐发酵这两个菌株,其中通常由PepC活性降解天冬酰胺酶。天冬酰胺酶活性(rASNU)测量如下:
天冬酰胺酶测定方法利用天冬酰胺酶的羟氨解反应,其中在天冬酰胺和羟胺之间发生转酰胺基作用(邓禄普(Dunlop)等人(1980)酿酒酵母的天冬酰胺酶II的反应.水解和羟氨解的机理分析(ReactionsofasparaginaseIIofSaccharomycescerevisiae.Amechanisticanalysisofhydrolysisandhydroxylaminolysis).生物化学杂志(JournalofBiologicalChemistry),255(4),第1542-1546页)。
反应产物β-天冬氨酸异羟肟酸(β-aspartohydroxamate)与FeCl2一起形成红色异羟肟酸铁复合物,它可以在A490下读取。在0-8ASNU/ml的范围中观察到,标准曲线与KSF0083具有良好线性。
用于96孔板中的天冬酰胺酶测定(rASNU测定)的方案
试剂:
1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)
1MKH2PO4(136g/500ml)+1MK2HPO4(174g/500ml)
调节至pH6.0
100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)+0.1%tritonX-100(1L)
100ml1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)
1gTritonX-100
调节至1000ml
2M羟胺(HA)溶液(100ml)
13.9g羟胺
用100mM磷酸钾缓冲液(pH6)调节至100ml
终止溶液(500ml)
23.83ml乙酸盐
13.88gFeCl36H2O
84ml5NHCl
用H2O调节至500ml
底物溶液(100ml)
10ml1M磷酸钾缓冲液
0.5gL-天冬酰胺(132.12,终浓度0.0325M)
5ml2MHA溶液。
用H2O调节至100ml。
标准品(KSF0083:14280ASNU/g)100ASNU/ml溶液
0.7002g/100ml100mM磷酸钾缓冲液(pH6)+0,1%tritonX-100
(0.3501g/50ml,0,1751g/25ml、0.07g/10ml)
在下表1中示出了天冬酰胺酶测定结果,其中将来自菌株50-4C-9的rASNU活性归一化为1.00。
表1.来自w/oPepC活性的黑曲霉菌株的天冬酰胺酶活性。
使来自这两个黑曲霉菌株50-4C-9(天然PepC)和50-C2948-9(ΔPepC)的发酵样品也经历SDS-PAGE分析,以看到天冬酰胺酶的降解并且比较其程度。正如所预期,来自50-4C-9的样品在PepC存在下严重降解(图3,泳道5-7),而在50-C2948-9(ΔPepC)中表达的天冬酰胺酶要稳定地多得多(图3,泳道2-4)。
然而,虽然与PepC野生型菌株相比,在PepC灭活菌株中天冬酰胺酶的稳定性得到大大改进,但是存在缺点。已知PepC的灭活显著降低孢子形成和生长速率,如先前针对烟曲霉所述(赖卡德(Reichard)U等人2000,国际医学微生物学杂志(IntJMedMicrobiol).290,549-558)。重要的是保留工业蛋白生产宿主细胞在固体培养基上形成孢子的能力;工业细胞库制剂需要孢子,这样使得在工业规模蛋白生产中确保成功的未来罐接种。
实例6.具有天然对PsorA/sorB调节的PepC的黑曲霉菌株中的天冬酰胺酶
质粒pHiTe91和pHiTe92的构建
基于米曲霉RIB40(ATCC42149)中的基因组序列信息设计sorA和sorB基因的启动子序列的引物。使用米曲霉RIB40的基因组DNA作为模板用引物对HTJP-231和HTJP-233通过PCR来扩增sorA的1.4kb区域。使用黑曲霉NN059280(WO2012/160093)的基因组DNA作为模板用引物对HTJP-232和HTJP-234通过PCR来扩增pepC基因和终止子的2.3kb区域。
用引物对HTJP-231和HTJP-232通过PCR来扩增具有pepC及其终止子的sorA启动子的3.7kb区域。经由In-PCR克隆系统(克隆技术公司),将扩增的3.7kb片段在SpeI位点处插入pHUda801,以产生中间体质粒pHiTe82。在大肠杆菌DH5α中进行质粒制备。
pepC和sorA启动子的引物:
SEQIDNO:48:HTJP-231ctaactactaactaggttaattaactccccgaccaccaagttcc
SEQIDNO:49:HTJP-232aaaatactttactagtgcatgcatgaggtctttttg
SEQIDNO:50:HTJP-233gcccttcatggtggctagcttcggtgcactaatagtatgac
SEQIDNO:51:HTJP-234gtgcaccgaagctagccaccatgaagggcatcctcggcc
使用米曲霉RIB40的基因组DNA作为模板用引物对HTJP-235和HTJP-236通过PCR来扩增sorB启动子的0.6kb区域。从琼脂糖凝胶回收获得的包含sorB启动子的0.6kbDNA片段。用PacI和NheI消化经扩增的0.6kbDNA片段,连接进用PacI和NheI消化的pHiTe82,以产生中间体质粒pHiTe83。在大肠杆菌DH5α中进行质粒制备。
pepC和sorB启动子的引物:
SEQIDNO:52:HTJP-235ccttaattaagacgcagtgtccctgtatta
SEQIDNO:53:HTJP-236ctagctagctttgctccctaaactctaaac
使用质粒pHiTe82用引物对HTJP-280和HTJP-281通过PCR来扩增sorB启动子-pepC及其终止子的3.7kb片段。通过In-克隆在NheI位点处将经扩增的片段整合进pHUda1306。将所得质粒命名为pHiTe91。这一质粒还包括来自构巢曲霉的选择性标记pyrG。
启动子sorA-pepC的引物:
SEQIDNO:54:HTJP-280agttaattaagctagcctccccgaccaccaagttc
SEQIDNO:55:HTJP-281gtaagactgagctagcgcatgcatgaggtctttttg
使用质粒pHiTe83用引物对HTJP-281和HTJP-282通过PCR来扩增sorB启动子-pepC和pepC终止子的2.9kb片段。通过In-Fusion在NheI位点处将经扩增的片段整合进pHUda1306。将所得质粒称为pHiTe92。此外,这些质粒包括来自构巢曲霉的选择性标记pyrG。
启动子sorB-pepC的引物:
SEQIDNO:55:HTJP-281gtaagactgagctagcgcatgcatgaggtctttttg
SEQIDNO:56:HTJP-282agttaattaagctagcgacgcagtgtccctg
黑曲霉菌株(ΔPepC)C2948-6中的天冬酰胺酶
黑曲霉菌株C2948是NN059280的pepC基因缺陷衍生物。进行C2948的pyrG基因解救,以产生C2948-6(如在WO2012/160093中所述)。
如在WO2012/160093中所述的进行具有amdS选择性标记的天冬酰胺酶基因(pHiTe50)和具有pyrG标记的PsorA-或PsorB-调节的pepC基因(分别是pHiTe91或pHiTe92)至黑曲霉C2948-6中的染色体插入。
从补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的标准培养基中选择转化体。将随机选择的转化体接种到补充有10μg/ml5FC的最低培养基板上。纯化生长良好的菌株,并且使其经历DNA印迹分析,以选择具有相同拷贝数的每个基因的菌株。
从所选择的转化体中提取的基因组DNA被HindIII消化。在给出正确整合事件的菌株中,选择91-50-C2948-18(3拷贝天冬酰胺酶和1拷贝sorA-启动子-pepC)和92-50-C2948-13(3拷贝天冬酰胺酶和1拷贝sorB-启动子-pepC)。
通过山梨醇诱导型启动子进行的COVE-N-gly上的孢子形成
还通过它们在COVE-N-gly(山梨醇)琼脂培养基上的孢子形成能力来评估分离的菌株。如以上提及的,PepC基因的破坏引起规则孢子形成和生长速率的显著降低,如先前针对烟曲霉所述(赖卡德(Reichard)U等人2000,国际医学微生物学杂志(IntJMedMicrobiol.)290,549-558)。重要的是保留pepC活性,直到细胞在固体培养基上完全形成孢子,因为在工业规模蛋白生产时,接种需要足够数量的孢子。因此,通过它们在COVE-N-gly(山梨醇)斜面上的孢子形成能力来评估分离的菌株。如表2中所示,与pepC缺陷型菌株相比,其中pepC基因被PsorA或PsorB调节的菌株的孢子产率显著更高,表明可以通过用sorA/B启动子条件性表达PepC来实现孢子形成诱导。
表2PepC缺陷型和PepC条件型表达菌株中的孢子产率。
由sorA和sorB启动子调节PepC表达
为了确认在不存在山梨醇时PepC表达是否可以下调,通过实验室规模罐来评估菌株91-50-C2948-18(sorA-启动子-pepC)和92-50-C2948-13(sorB-启动子-pepC)的天冬酰胺酶活性。确定各个转化体的上清液的天冬酰胺酶活性。作为参照,在pH4.75下,在标准黑曲霉发酵条件下,平行地发酵50-4C-9和50-C2948-9(参见上文),其中由PepC降解天冬酰胺酶。遵循上述方法测量天冬酰胺酶活性(rASNU活性);在下表3中示出结果,其中将来自菌株50-4C-9的天冬酰胺酶(rASNU)活性归一化为1.00。
表3.来自具有天然的和经调节的PepC表达的黑曲霉菌株的天冬酰胺酶活性。
使来自实例5和6中的黑曲霉菌株的发酵样品经历SDS-PAGE分析,以看到天冬酰胺酶的降解并且比较其程度。正如所预期,来自50-4C-9(天然PepC)的样品在PepC存在下严重降解(图3,泳道5-7),而在50-C2948-9(ΔPepC)中表达的天冬酰胺酶要稳定地多得多(图3,泳道2-4)。来自菌株91-50-C2948-18和92-50-C2948-13的样品中的降解也示出天冬酰胺酶的显著更少的降解(图3,泳道8-13),表明在罐发酵条件下,PepC表达被sorA-和sorB启动子强烈抑制。
实例7.具有天然对PniaD调节的PepC的黑曲霉菌株中的天冬酰胺酶
质粒pHiTe106和pHiTe107的构建
使用米曲霉Bech2的基因组DNA作为模板用引物对HTJP-341和HTJP-342通过PCR来扩增niaD启动子的1.4kb区域。从琼脂糖凝胶回收获得的包含niaD启动子的1.4kbDNA片段。用PacI和NheI消化经扩增的1.4kbDNA片段,连接进用PacI和NheI消化的pHiTe82,以产生中间体质粒pHiTe106。在大肠杆菌DH5α中进行质粒制备。
niaD启动子的引物:
SEQIDNO:57:HTJP-341ccttaattaaggatgtggacgggttatcg
SEQIDNO:58:HTJP-342ctagctagcgttaccggcagggaagg
将来自pHiTe106的3.7kbPacI-SpeI消化片段(niaD启动子-pepC和pepC终止子)与来自pHiTe91的7.6kbPacI-NheI片段连接,以产生质粒pHiTe107。此外,这些质粒包括来自构巢曲霉的选择性标记pyrG。
黑曲霉菌株(ΔPepC)C2948-6中的天冬酰胺酶
黑曲霉菌株C2948是NN059280的pepC基因缺陷衍生物。进行C2948的pyrG基因解救,以产生C2948-6(如在WO2012/160093中所述)。
如在WO2012/160093中所述的进行具有amdS选择性标记的天冬酰胺酶基因(pHiTe50)和具有pyrG标记的PniaD-调节的pepC基因(pHiTe107)至黑曲霉C2948-6中的染色体插入。
从补充有10μg/ml5-氟胞嘧啶(5FC)的标准培养基中选择转化体。将随机选择的转化体接种到补充有10μg/ml5FC的最低培养基板上。纯化生长良好的菌株,并且使其经历DNA印迹分析,以选择具有相同拷贝数的每个基因的菌株。
从所选择的转化体中提取的基因组DNA被HindIII消化。在给出正确整合事件的菌株中,选择107-C2948-20(3拷贝天冬酰胺酶和1拷贝niaD-启动子-pepC)。
通过它们在COVE-N-gly斜面上的孢子形成能力来评估分离的菌株。如表4中所示,与pepC缺陷型菌株相比,其中pepC基因被PniaD调节的菌株的孢子产率显著更高,显示可以通过用niaD启动子条件性表达pepC来实现孢子形成诱导。
表4pepC缺陷型和pepC基因条件型表达菌株中的孢子产率。
由niaD启动子调节PepC表达
为了确认在存在铵时PepC表达是否可以下调,通过实验室规模罐来评估菌株107-C2948-20(PniaD-pepC)的天冬酰胺酶活性。确定转化体的上清液的天冬酰胺酶活性。作为参照,在pH4.75下,在标准黑曲霉发酵条件下,平行地发酵50-4C-9和50-C2948-9(参见上文),其中由PepC降解天冬酰胺酶。遵循上述方法测量天冬酰胺酶活性(rASNU活性);在下表5中示出结果,其中将来自菌株50-4C-9的天冬酰胺酶(rASNU)活性归一化为1.00。
表5.来自具有天然的和经调节的PepC表达的黑曲霉菌株的天冬酰胺酶活性。
使来自实例7中的黑曲霉菌株的发酵样品经历SDS-PAGE分析,以看到天冬酰胺酶的降解并且比较其程度。正如所预期,来自50-4C-9(天然PepC)的样品在PepC存在下严重降解(图5,泳道5-7),而在50-C2948-9(ΔPepC)中表达的天冬酰胺酶要稳定地多得多(图5,泳道8-4)。来自菌株107-C2948-20的样品中的降解也示出天冬酰胺酶的显著更少的降解(图5,泳道2-4),表明在罐发酵条件下,PepC表达被niaD启动子强烈抑制。
Claims (16)
1.一种重组真菌宿主细胞,包括:
a)编码感兴趣的多肽的至少一种第一多核苷酸;和
b)编码真菌PepC蛋白酶的一种或多种第二多核苷酸,其中该一种或多种第二多核苷酸可操作地连接至调节型异源性启动子。
2.如权利要求1所述的真菌宿主细胞,该真菌宿主细胞是丝状真菌宿主细胞,优选地,该丝状真菌宿主细胞是以下属的:枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉菌科、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属。
3.如权利要求2所述的丝状真菌宿主细胞,该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌、干拟蜡菌、卡内基拟蜡菌、浅黄拟蜡菌、潘诺希塔拟蜡菌、环带拟蜡菌、微红拟蜡菌、虫拟蜡菌、狭边金孢子菌、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌、粪状金孢子菌、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌、灰盖鬼伞、毛革盖菌、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌、射脉菌、刺芹侧耳、土生梭孢壳霉、长绒毛栓菌、变色栓菌、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
4.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中该至少一种第一多核苷酸存在于该宿主细胞的染色体中。
5.根据权利要求4所述的宿主细胞,其中该至少一种第一多核苷酸以两个或更多个拷贝存在于该宿主细胞的染色体中。
6.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中该感兴趣的多肽是选自下组的酶,该组由以下各项组成:水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶以及转移酶。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞,其中该感兴趣的多肽是选自下组的酶,该组由以下各项组成:α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
8.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中该PepC蛋白酶选自下组,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的多肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置1至380或SEQIDNO:4的位置1至418所示的成熟序列至少80%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的成熟多肽编码序列,或(ii)(i)的全长互补体杂交;
c)一种由以下多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的成熟多肽编码序列至少80%相同;
d)SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的成熟多肽的一种变体,该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入;以及
e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段,该片段具有蛋白酶活性。
9.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中该PepC蛋白酶是与选自下组的前肽一起表达的,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的前肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置-99至-1或SEQIDNO:4的位置-99至-1所示的序列至少80%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的前肽,该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的前肽编码序列,或(ii)(i)的全长互补体杂交;或
c)一种由以下多核苷酸编码的前肽,该多核苷酸包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的前肽编码序列至少80%相同。
10.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中该PepC蛋白酶是与选自下组的信号肽一起表达的,该组由以下各项组成:
a)一种包括以下氨基酸序列的信号肽,该氨基酸序列与SEQIDNO:2的位置-115至-100或SEQIDNO:4的位置-115至-100所示的序列至少80%相同;
b)一种由以下多核苷酸编码的信号肽,该多核苷酸在中严格条件下与(i)SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的信号肽编码序列,或(ii)(i)的全长互补体杂交;或
c)一种由以下多核苷酸编码的信号肽,该多核苷酸包括以下核苷酸序列,该核苷酸序列与SEQIDNO:1或SEQIDNO:3的信号肽编码序列至少80%相同。
11.根据任何以上权利要求所述的宿主细胞,其中在具体化合物存在下,该调节型异源性启动子被诱导或抑制。
12.如权利要求11所述的宿主细胞,其中该调节型异源性启动子在硝酸盐存在下被诱导,并且在铵存在下被抑制;优选地,该调节型异源性启动子是丝状真菌硝酸还原酶启动子;更优选地,该调节型异源性启动子是来自曲霉属或木霉属细胞的硝酸还原酶启动子;甚至更优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的硝酸还原酶启动子;最优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的niaD硝酸还原酶启动子。
13.如权利要求12所述的宿主细胞,其中该调节型异源性启动子包括与SEQIDNO:41至少80%相同的核苷酸序列。
14.如权利要求11所述的宿主细胞,其中该调节型异源性启动子在山梨醇存在下被诱导并且在不存在山梨醇时被抑制;优选地,该调节型异源性启动子是来自曲霉属或木霉属细胞的丝状真菌山梨醇转运体启动子或山梨醇脱氢酶启动子;甚至更优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的山梨醇转运体启动子或山梨醇脱氢酶启动子;最优选地,该调节型异源性启动子是来自黑曲霉、米曲霉或里氏木霉的sorA或sorB启动子。
15.如权利要求14所述的宿主细胞,其中该调节型异源性启动子包括与SEQIDNO:42或SEQIDNO:43至少80%相同的核苷酸序列。
16.一种产生感兴趣的多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a)在适于产生该感兴趣的多肽的条件下,培养如以上权利要求的任一项中限定的宿主细胞;并且,可任选地
b)回收该感兴趣的多肽。
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