CN104837993A - 用于在丝状真菌中产生位点特异性突变的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在一种有待直接地转化进丝状真菌宿主中的编码感兴趣多肽的基因中产生定点突变的方法，其中不需要依靠中间宿主如大肠杆菌来产生充足的遗传材料以成功地转化该真菌宿主。

Description

用于在丝状真菌中产生位点特异性突变的方法
对序列表的引用
本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及用于提供一种位点特异性突变的感兴趣的变体多肽的方法。
相关技术说明
在感兴趣的多肽中产生定点突变的若干种方法，包括例如，重叠延伸拼接PCR(“SOE-PCR”)或方法(Stratagene公司)是已知的。后者在线性PCR反应中使用一组重叠诱变PCR引物来扩增甲基化的双链质粒模板，随后是片段自连，其中在执行PCR反应后且在将该连接混合物转化进大肠杆菌宿主中前，使用Dpn1核酸酶来去除甲基化的模板质粒。然而，持续需要改进转化和选择效率，尤其在丝状真菌宿主内。
发明概述
本发明提供了在一种有待直接地转化进丝状真菌宿主中的编码感兴趣多肽的基因中产生定点突变的方法，其中不需要依靠中间宿主如大肠杆菌来产生充足的遗传材料以成功地转化该真菌宿主。这些方法涉及使用被特异性甲基化的常染色体复制型质粒，该常染色体复制型质粒包括在PCR反应中作为模板的编码基因与一对非重叠端对端引物(其中至少一个引物是诱变的)，接着去除甲基化的模板DNA，自连以再环化这些PCR片段并指导将产生的再环化载体转化至选择的丝状真菌表达宿主中，其中将这些引物在PCR反应前磷酸化或者该产生的PCR片段在连接步骤前或期间磷酸化以便能够成功地连接。
相应地，在第一方面，本发明涉及一种提供位点特异性突变的变体多肽的方法，该方法包括下述步骤：
a)提供一种甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体，该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体包括一种编码亲本多肽的亲本多核苷酸；
b)提供一对针对该亲本多核苷酸的端对端非重叠PCR引物，一个5’正向引物和另一个3’反向引物，其中至少一个引物是诱变的；
c)用该PCR引物对进行该模板载体的PCR扩增以产生全长的载体突变的PCR片段；
d)用适合的甲基化特异性核酸酶去除该模板载体；
e)通过自连环化这些突变的PCR片段；并且
f)将这些环化的突变的PCR片段直接转化至丝状真菌宿主细胞中以表达这些变体多肽，
其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，或者将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
附图简要说明
图1示出了实例1中使用的模板质粒pENI4286的示意图。
图2示出了被用来验证实例1中产生的PCR片段大小的琼脂糖凝胶的图片。
图3示出了被用来验证通过所声称的定点诱变方法成功地去除糖基化位点的在实例1中使用的SDS-PAGE凝胶的图片。在实例的结尾中讨论该凝胶的细节。
定义
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
端对端非重叠PCR引物：该术语意指一对PCR引物，一个5’正向引物和一个3’反向引物，其靶向双链环状DNA载体模板上的一个连续的多核苷酸区域，在该模板中当每个引物都退火到其模板链时，这些引物端对端排成一行，在它们之间没有任何碱基对重叠。以此方式，这两个引物将各自代表完全扩增的双链载体PCR片段的末端，如果将这些引物在PCR扩增前磷酸化，或者将PCR片段在连接前或期间磷酸化，这些末端可以被连接在一起以再环化载体。当这些端对端非重叠PCR引物中的至少一个是诱变的，即，它包括至少一个核苷酸，其不同于所述诱变引物靶向的模板多核苷酸区域，则那个突变将被掺入进产生的扩增PCR片段中。
甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体：该术语意指一种常规的双链环状DNA载体，即，一种质粒，其是甲基化的、常染色体的并且在丝状真菌宿主细胞中能够独立复制，例如，凭借包含“自主复制序列”或ARS，诸如，众所周知的AMA1序列。
DNA甲基化：DNA甲基化是一个生化过程，其对于高等生物中的正常发育是重要的。它涉及将甲基添加至胞嘧啶嘧啶环的5位或腺嘌呤嘌呤环的6号氮(胞嘧啶和腺嘌呤是4种DNA碱基中的2种)。通过细胞分裂可以遗传这种修饰。腺嘌呤或胞嘧啶甲基化是许多细菌的限制修饰系统的一部分，其中特异性DNA序列在整个基因组中被周期性地甲基化。甲基化酶是识别特异序列并将该序列中或靠近该序列的碱基中的一种甲基化。被引入至该细胞中的外源DNA(其不是以这种方式被甲基化)被序列特异限制性内切酶降解并切割。细菌基因组DNA不被这些限制性内切酶识别。天然DNA甲基化作为一种原始的免疫系统起作用，从而允许该细菌自我保护以防止被噬菌体侵染。大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)是一种～32kDa的酶。大肠杆菌Dam的靶识别序列是GATC，因为甲基化出现在这个序列中的腺嘌呤的N6位(GmeATC)。
甲基化特异性核酸酶：如上所述，腺嘌呤或胞嘧啶甲基化是许多细菌的限制修饰系统的一部分，其中特异性DNA序列在整个基因组中被周期性地甲基化。另一方面，IIM类型限制性内切核酸酶能够识别并切割甲基化的DNA。DpnI是来自肺炎双球菌G41的甲基化特异性核酸酶，其识别由Dam甲基化酶在这个序列中的腺嘌呤的N6位甲基化的序列(G meATC)。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然发生的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性，该算法是如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open SoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼和翁施，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法是如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
发明详细说明
在第一方面，本发明涉及提供位点特异性突变的变体多肽的方法，该方法包括下述步骤：
a)提供一种甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体，该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体包括一种编码亲本多肽的亲本多核苷酸；
b)提供一对针对该亲本多核苷酸的端对端非重叠PCR引物，其中至少一个引物是诱变的；
c)用该PCR引物对进行该模板载体的PCR扩增以产生全长的载体突变的PCR片段；
d)用适合的甲基化特异性核酸酶去除该模板载体；
e)通过自连环化这些突变的PCR片段；并且
f)将这些环化的突变的PCR片段直接转化至丝状真菌宿主细胞中以表达这些变体多肽，
其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，或者将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
在第一方面的一个优选实施例中，该模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体是一种包含AMA1真菌复制起始序列的质粒。
在另一个优选的实施例中，该至少一个诱变引物与其针对的亲本多核苷酸是完全互补的，除了被设计为在产生的编码这些变体多肽的一个或多个PCR片段中编码一个或多个氨基酸插入、取代或缺失的一种或多种位点特异性点突变之外；优选地，这些变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或插入。在一个实施例中，引入变体中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域已知的程序来鉴定多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁安(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见例如，德福斯(de Vos)等人，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；沃勒达尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴定必需氨基酸。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由瑞德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；鲍依(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所描述的那些。可以使用的其他方法包括：易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比希尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该亲本多肽可以是天然发生的多肽或杂合多肽，其中一个多肽的区域融合在另一多肽的区域的N-末端或C-末端。
该亲本多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一多肽融合在本发明的多肽的N-末端或C-末端。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不限于以下各项中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物学与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯韦蒂纳(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森(Rasmussen)-威尔逊(Wilson)等人，1997，应用环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；华德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯(Collins)-莱斯(Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能和遗传学(Proteins:Structure，Function，and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
优选地，这些端对端非重叠PCR引物的长度为至少20个核苷酸，优选地长度为至少25、30、35、40、45，或最优选地至少50个核苷酸。优选的是这些PCR引物是在PCR扩增前被磷酸化的，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变PCR片段，或可替代地，这些PCR片段在自连步骤前或期间被磷酸化，以便允许这些引物端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
在一个优选的实施例中，该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体由识别GATC的甲基化酶在体内或体外甲基化；优选地，该甲基化酶是来自大肠杆菌的Dam甲基化酶；更优选地，被用于去除模板载体的甲基化特异性核酸酶识别Dam甲基化；最优选地，该甲基化特异性核酸酶是Dpn1。
当然，在第一方面的方法中，可以设想另外的步骤，如一个或多个筛选、选择、产生和/或分离感兴趣的一种或多种变体多肽的步骤。优选地，第一方面的方法包括至少一个另外的筛选或选择这些表达的变体多肽的步骤，以鉴定具有一种或多种感兴趣的改变特征的一种或多种变体，所述改变特征是如改变的热稳定性、改变的比活性、改变的底物特异性、改变的溶解性、改变的储存稳定性、改变的辅因子依赖性。优选地，与亲本多肽比较，这种改变是一种更高或更低的特征，例如，更高的热稳定性。
多肽来源
多肽可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，获得自给定来源的多肽被分泌到细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性菌多肽，例如具有[酶]活性的芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、或链霉菌属多肽，或革兰氏阴性菌多肽，例如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、或脲原体属(Ureaplasma)多肽。
在一个方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌多肽。
在另一个方面，该多肽是马链球菌、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种多肽。
在另一个方面，该多肽是不产色链霉菌、阿维链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链丝菌、或变铅青链霉菌多肽。
该多肽可以是一种真菌多肽。例如，该多肽可以是酵母多肽，如假丝酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母、或耶氏酵母属多肽；或丝状真菌多肽，如枝顶孢霉属、伞菌属、链格孢属、曲霉属、短梗霉属、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属、毛喙壳属、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、乳白蚁属、棒囊壳属、隐丛赤壳菌属、隐球菌属、色二孢属、黑耳属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、赤霉属、全鞭毛虫属、腐质霉属、耙齿菌属、蘑燕属、小腔球菌属、梨孢菌属、黑果菌属(Melanocarpus)、多孔菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、瘤胃壶菌属、Poitrasia、假黑盘菌属、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属、裂褶菌属、柱顶孢属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、嗜热真菌属(Thermomyce)、梭孢壳属、弯颈霉属、木霉属、长毛盘菌属、轮枝孢属、小包脚菇属、或炭角菌属多肽。
在另一个方面，该多肽是卡氏酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉斯酵母、克鲁费酵母、诺地酶母、或卵形酵母多肽。
在另一方面，该多肽是解纤维枝顶孢霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉、柔毛腐质霉、白耙齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉多肽。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译重要的非翻译mRNA区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
控制序列还可以是编码连接至多肽的N-末端的信号肽并指导该多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区域。该多核苷酸的编码序列的5’端可以固有地包含在翻译读码框内与编码该多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’端可以包含对编码序列而言是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因中获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
当信号肽和前肽序列同时存在时，前肽序列的位置紧邻于多肽的N-末端，且信号肽序列的位置紧邻于前肽序列的N-末端。
还可能希望的是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调控系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制型载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
用于整合到宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码多肽的多核苷酸的序列或该载体中通过同源或非同源重组而整合到该基因组中的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO 00/24883披露的方法完成。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序对于本领域普通技术人员而言是熟知的(参见，例如萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是在本发明的多肽重组生产中有用的任何丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞菌属、革盖菌属、隐球菌属、线黑粉酵母属、镰刀菌属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉菌属、平革菌属、白腐菌属、瘤胃壶菌属、侧耳属、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属、或木霉属的细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉菌、黄孢原毛平革菌、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。
可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉和木霉宿主细胞的合适程序描述于EP 238023，约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。马拉迪耶(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787描述了用于转化镰刀菌物种的合适方法。
产生方法
本发明还涉及产生一种通过本发明的方法而产生的变体多肽的方法。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批补料、或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，则可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不分泌，则其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。
可以通过本领域已知的多种程序来纯化该多肽，以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如蛋白纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
本发明还涉及产生蛋白质的方法，包括(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；并且(b)回收该蛋白质。
该蛋白质对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白质”在此不意图是指一种特定长度的编码产物，并且因此涵盖肽、寡肽及多肽。术语“蛋白质”还涵盖组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白质还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白质是一种激素、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。例如，该多肽可以是一种水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。该编码基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
实例
实例1.在曲霉属中直接产生定点变体。
通常，首先在标准的中间宿主(如大肠杆菌)中在DNA水平上构建具有位点特异性突变的酶变体。这些变体在大肠杆菌中被产生和验证后，包含编码基因的质粒然后被转化至丝状真菌宿主(如曲霉属细胞)中，在该丝状真菌宿主中这些编码基因得以表达。
在以下实例中概括的方法使得可以跳过大肠杆菌中的早期步骤并且直接进入丝状真菌宿主中。该方法是可自动化的并且例如不需要对曲霉属再划痕，因为它是基于一种常染色体复制型质粒的，该质粒并未整合进曲霉属染色体中。
突变：
使用所声称的方法通过引入定点突变(N33Q)从脂肪酶中去除N-糖基化位点。在这种情况下，在产生的表达的变体多肽中不存在糖基化使得在SDS-page凝胶上验证突变的变体中已经发生取代变得容易。
寡核苷酸的磷酸化：
在制造商(新英格兰生物实验室(New England biolab))推荐的条件下，使用T4多核苷酸激酶，在T4连接酶缓冲液中将以下两种寡核苷酸磷酸化2小时。将50微升磷酸化混合物中的每种的5微升用于后续的100微升PCR反应中。
引物24885：CCAGCTGGTACACAGATTACTTGCACGGGAAATGC(SEQ ID NO:1)
引物130411jvi8：GGCATCATTGTTTTTTCCGCAG(SEQ ID NO:2)
PCR设计：
使用PHUSIONTM聚合酶和下表1中提到的模板过夜运行多个PCR。
PCR程序：
98℃ 20秒
25X(98℃ 20秒，55℃ 20秒，72℃ 5分钟)
72℃ 7分钟
模板和甲基化：
两种模板质粒(pENI4286和pENI1849(图1))都包含AMA复制起始区域，因此保证它可以在曲霉属(参见WO 2003070956)以及来自嗜热棉毛菌的脂肪酶基因中复制。两种质粒之间仅存在较小的序列差异。
在这个过程中，为了在稍后阶段用Dpnl剪切该模板，这些质粒不得不在序列GATC的A处被甲基化。通过甲基化酶(如识别GATC的Dam甲基化酶)这既能够在体内完成又能够在体外完成。在这个实例中使用的模板是在GATC处在体内被甲基化的。
只要存在相应的限制性内切酶(例如，McrBC内切核酸酶)，可以在甲基化的模板中剪切该识别位点，任何甲基化酶都可以被用于甲基化DNA。
表1.每个管中的PCR组分。注意在管7和8中，这些寡核苷酸在PCR前没有被磷酸化。
管 模板 寡核苷酸 寡核苷酸 注释
5 pENI1849 130411jvi8 24885 被预磷酸化
6 pENI4286 130411jvi8 24885 被预磷酸化
7 pENI1849 130411jvi8 24885 连接期间被磷酸化
8 pENI4286 130411jvi8 24885 连接期间被磷酸化
PCR和磷酸化：
产生PCR片段，其中为了产生具有所希望的突变的质粒，仅需连接5’端和3’端。然而，为了能够连接这些末端，它们首先需要被磷酸化。可替代地，PCR片段的这些末端可以在PCR后，但是在连接步骤前或期间被磷酸化。
在琼脂糖凝胶上验证PCR片段的大小(图2)。
去除模板：
为了去除初始的甲基化模板，将25微升具有Dpnl的5*NEB 4缓冲液(新英格兰生物实验室，美国)加入每个PCT反应并且在37℃下孵育3小时。
PCR片段的纯化：
为了交换缓冲液，在BioradTM柱(伯乐公司(Bio-Rad)，美国)上纯化50微升Dpnl处理过的样品。为了去除所有模板，该Dpnl步骤可以被优化，例如通过使用较少的模板、Dpnl处理前改变缓冲液和/或通过延长孵育。
连接和磷酸化：
将10微升5*T4连接缓冲液、T4连接酶和T4多核苷酸激酶(都来自新格兰生物实验室)加入40微升伯乐(biorad)纯化样品中。加入该多核苷酸激酶，以磷酸化管7和8中产生的PCR片段。这产生磷酸化的PCR片段，通过T4连接酶将其连接；所有都在同一溶液中。将这些样品置于37℃下持续1小时以便磷酸化5’末端，并且然后将这些样品移至室温持续1小时以便连接这些末端。
将5微升连接混合物转化至米曲霉Toc1512(如在WO 98/01470和WO2003070956中所描述)中并且铺板。将这些板置于37℃下，超过一周。
曲霉属转化体：
将来自每板的4个转化体接种在96孔微量滴定板中的200微升2％YPM中，并且不经摇动，在34℃下孵育4天。
将10毫升培养液加载至SDS PAGE凝胶上(10％伯乐凝胶，目录号345-0113)，如图3所示，并且对曲霉属样品还进行正戊酸对硝基苯酚酯测定(如在WO 200024883中所披露)。下表2中提供了对图3中的SDS凝胶的注释和所测量的连接酶活性。
所有的变体显出是去糖基化的，从而表明诱变起作用。SDS-PAGE条带的大小与活性的量相关。当这些寡核苷酸在连接混合物期间被磷酸化(管7和8)，该方法也起作用。
表2.对图3中的SDS凝胶连同在正戊酸对硝基苯酚酯测定中测量的脂肪酶活性的综述和注释。

Claims (11)

1.一种提供位点特异性突变的变体多肽的方法，该方法包括下述步骤：
a)提供一种甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体，该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体包括一种编码亲本多肽的亲本多核苷酸；
b)提供一对针对该亲本多核苷酸的端对端非重叠PCR引物，其中至少一个引物是诱变的；
c)用该PCR引物对进行该模板载体的PCR扩增以产生全长的载体突变的PCR片段；
d)用一种适合的甲基化特异性核酸酶去除该模板载体；
e)通过自连环化这些突变的PCR片段；并且
f)将这些环化的突变的PCR片段直接转化至丝状真菌宿主细胞中以表达这些变体多肽，
其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，或者将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
2.如权利要求1所述的方法，其中该亲本多肽是一种酶，优选水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；优选地，该酶是氨肽酶、淀粉酶、碳水化合物酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶或β-木糖苷酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中该模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体是一种包含AMA1真菌复制起始序列的质粒。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该至少一个诱变引物与其针对的亲本多核苷酸是完全互补的，除了被设计为在产生的编码这些变体多肽的一个或多个PCR片段中编码一个或多个氨基酸插入、取代或缺失的一种或多种位点特异性点突变之外。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中这些端对端非重叠PCR引物中的每个的长度为至少20个核苷酸，优选地长度为至少25、30、35、40、45，或最优选地至少50个核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体由一种识别GATC的甲基化酶在体内或体外甲基化；优选地，该甲基化酶是Dam。
7.如权利要求6所述的方法，其中这种用于去除该模板载体的甲基化特异性核酸酶识别Dam甲基化；优选地，该甲基化特异性核酸酶是Dpn1。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中将这些PCR片段在该自连步骤前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中该丝状真菌宿主细胞是一种曲霉属细胞；优选地，该曲霉属细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，该方法包括至少一个另外的筛选或选择这些表达的变体多肽的步骤，以鉴定具有一种或多种感兴趣的改变特征的一种或多种变体。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114561296A (zh) * 2021-12-09 2022-05-31 杨凌未来中科环保科技有限公司 一种棘孢曲霉菌及其应用
EP4086344A4 (en) * 2019-12-30 2024-01-10 Nanjing Genscript Biotech Co Ltd METHOD FOR CONSTRUCTING A LIBRARY OF GENE MUTATIONS

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201610894UA (en) 2014-08-08 2017-01-27 Xyleco Inc Aglycosylated enzyme and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059331A1 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Novozymes A/S In vivo mutation and recombination in filamentous fungi
WO2008138835A1 (en) * 2007-05-09 2008-11-20 Novozymes A/S Expression cloning method suitable for selecting library clones producing a polypeptide of interest

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
WO1995033836A1 (en) 1994-06-03 1995-12-14 Novo Nordisk Biotech, Inc. Phosphonyldipeptides useful in the treatment of cardiovascular diseases
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
AU3336597A (en) 1996-07-05 1998-02-02 Novo Nordisk A/S A transcription factor
JP5043254B2 (ja) 1998-10-26 2012-10-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 糸状面細胞内の問題のｄｎａライブラリーの作製及びスクリーニング
JP4620253B2 (ja) 1999-03-22 2011-01-26 ノボザイムス，インコーポレイティド 菌類細胞中で遺伝子を発現させるためのプロモーター
WO2003070956A1 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Novozymes A/S Expression cloning methods in filamentous fungi

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002059331A1 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 Novozymes A/S In vivo mutation and recombination in filamentous fungi
WO2008138835A1 (en) * 2007-05-09 2008-11-20 Novozymes A/S Expression cloning method suitable for selecting library clones producing a polypeptide of interest

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WILLIAMS MARNI ET AL,: "Deletion mutagenesis of targe areas in plasmodium falciparum genes:a comparative study", 《MALARIA JOURNAL》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4086344A4 (en) * 2019-12-30 2024-01-10 Nanjing Genscript Biotech Co Ltd METHOD FOR CONSTRUCTING A LIBRARY OF GENE MUTATIONS
CN114561296A (zh) * 2021-12-09 2022-05-31 杨凌未来中科环保科技有限公司 一种棘孢曲霉菌及其应用
CN114561296B (zh) * 2021-12-09 2023-09-22 杨凌未来中科环保科技有限公司 一种棘孢曲霉菌及其应用

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EP2929028A1 (en) 2015-10-14
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