CN104271737A - 角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及角质酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

角质酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及角质酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。

相关技术说明

角质酶是能够水解底物角质的脂肪分解酶。已知角质酶来自各种真菌(P.E.科拉图库蒂(Kolattukudy)于“脂酶(Lipases)”，编辑B.柏格斯卓姆和H.L.布罗克曼(Brockman)，爱思唯尔(Elsevier)1984,471-504)，例如来自豌豆根腐镰孢(Fusarium solani pisi)(S.隆吉(Longhi)等人，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)，268(4),779-799(1997))和特异腐质霉(US 5827719)的角质酶。来自特异腐质霉的角质酶的变体从例如WO 00/34450中已知。

角质酶可被用于丙烯酸酯的聚合中。丙烯酸酯是工业上重要的具有广泛商业应用的化合物。在这些分子中存在的α-双键可被用于聚合以产生终产品，如油漆、塑料和粘合剂。传统上，丙烯酸和甲基丙烯酸的酯类是在高温下用聚合抑制剂和用硫酸作为催化剂来化学地制备的。丙烯酸酯的酶转酰基作用是传统化学的一个“绿色”选择并且可以提供从葡萄糖和乳酸等可再生能源起始到丙烯酸酯的可持续路线。

本发明提供了与其亲本相比具有改进的特性的一种亲本角质酶的变体，特别是具有增加的转酰基活性的变体。

发明概述

本发明涉及一种亲本角质酶的分离的变体，该变体包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相对应的一个或多个位置处的取代，该取代选自下组，该组由以下各项组成：P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，并且该变体具有角质酶活性。

本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及修饰表面、将植物生物质中的胶质转化为化学原料以及再循环聚酯的方法。

定义

角质酶：术语“角质酶”意指具有角质酶活性(EC3.1.1.74)的一种脂肪分解酶，该酶催化以下反应：根据http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme处可获得的酶命名法，能够水解底物角质的脂肪分解酶被归类为EC3.1.1.74。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序确定角质酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的角质酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子的反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指一种多核苷酸，该多核苷酸直接规定了一种变体的氨基酸序列。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指为编码本发明的一种变体的一种多核苷酸的表达所需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生(native)的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及一种变体的产生的任何步骤，包括(但不限于)转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指一种直链或环状DNA分子，该分子包括编码一种变体的一种多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指在一种成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在一个或多个(例如若干个)氨基酸的一种多肽；其中该片段具有角质酶活性。在一个方面，该片段的氨基酸数目是该成熟多肽的氨基酸数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、或至少95％。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包括本发明的一种多核苷酸的一种核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

改进的特性：术语“改进的特性”意指与变体相关的与亲本相比得到改进的特征。这类改进的特性包括但不限于催化效率、催化速率、比活性、底物结合、底物裂解、底物特异性。

分离的：术语“分离的”意指在自然界中不存在的一种形式或环境中的一种物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关联的一种或多种或全部天然存在的组分中除去的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或者(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。一种分离的物质可以存在于发酵液样品中。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-端加工、C-端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至194。本领域中已知的是，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有角质酶活性的一种成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸109至690。

突变体：术语“突变体”意指编码一种变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的基因，或其被修饰成以本来在自然界中不存在的方式含有核酸的区段，或其为合成的，其包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。

亲本或亲本角质酶：术语“亲本”或“亲本角质酶”意指一种角质酶，对该角质酶进行一个改变以产生本发明的酶变体。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来测定两个氨基酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基X 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，同上)来测定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有角质酶活性的一个片段。在一个方面，一个子序列含有编码成熟多肽的核苷酸的数目的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少85％、至少90％、或至少95％。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如若干个)位置处包括一个取代的具有角质酶活性的一种多肽。一个取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的角质酶活性的至少20％、例如至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。

野生型角质酶：术语“野生型”角质酶意指由见于自然界中的一种天然存在的微生物(如一种细菌、酵母或丝状真菌)表达的一种角质酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种角质酶中的对应的氨基酸残基。将另一种角质酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯等人，2000，遗传学趋势16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼和翁施，1970，分子生物学杂志48:443-453)来确定与SEQ ID NO:2中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序、使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种角质酶中的相应氨基酸残基的鉴别，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多种序列比较；版本3.5或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(Nucleic Acids Research)32:1792-1797)、MAFFT(版本6.857或更新版本；加藤(Katoh)和库马(Kuma)，2002，核酸研究30:3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33:511-518；加藤和都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23:372-374；加藤等人，2009，分子生 物学方法(Methods in Molecular Biology)537:39-64；加藤和都，2010，生 物信息学26:1899-1900)、以及采用ClustalW(1.83或更新版本；汤姆斯(Thompson)等人，1994，核酸研究22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。

当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志)295：613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，核酸研究25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定这类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或者组合延伸(Shindyalov和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。使用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。

取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或者“T226A”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表分别在位置205和位置411处甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代，并且丝氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。

多个取代。包含多个取代的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同的取代。在可以在一个位置处引入不同取代的情况下，这些不同取代由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”以及“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

发明详细说明

本发明涉及分离的角质酶变体，这些变体包含在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基36、45、52、70、120、174相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代，其中该变体具有角质酶活性。

变体

本发明涉及一种亲本角质酶的分离的变体，其包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相对应的一个或多个位置处的取代，该取代选自下组，该组由以下各项组成：P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，并且该变体具有角质酶活性。

在一个实施例中，该变体与该亲本角质酶的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。

在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或者至少99％、但小于100％的序列一致性。

在一个方面，本发明的变体中的取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个取代。

在另一方面，变体包含在与位置P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q相对应的一个或多个(例如若干个)位置处的取代。优选地，该变体包括在与位置P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q中任一个相对应的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、或九个位置处的取代。

在另一个方面，变体包括在对应于位置31的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置31的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置36的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置36的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置45的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置45的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置52的位置处的取代或由其组成。在另一方面，与位置52相对应的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Glu取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代N52E或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置70的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置70的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置120的位置处的取代或由其组成。在另一方面，在对应于位置120的位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val，优选被Ser取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G120S或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置143的位置处的取代或由其组成。在另一个方面，对应于位置143的一个位置处的氨基酸被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置167的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置167的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Ala取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L167A或由其组成。

在另一个方面，变体包括在对应于位置174的位置处的取代或由其组成。在另一方面，对应于位置174的位置处的氨基酸是被Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、或Val取代，优选被Asn或Gln取代。在另一个方面中，该变体包括SEQ ID NO:2的成熟多肽的取代L174N,Q或由其组成。

在一些实施例中，本发明涉及包括选自以下的突变/突变的组合中的至少一种或由其组成的变体：(a)E30Q；(b)P31V；(c)I36N；(d)I36Q；(e)I36S；(f)G45N；(g)R51P；(h)N52E；(i)F70A；(j)F70S；(k)G120S；(l)G143R；(m)L167A；(n)L174N；(o)L174Q；(p)A14P/I169A；(q)A14P+N52E+I169A；或(r)G8D+A14P+R51P+E179Q。

变体可以进一步包括在一个或多个(例如若干个)其他位置处的一个或多个另外的取代。

这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的较小缺失；较小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的较小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的较小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(The Proteins),学术出版社(Academic Press),纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质:改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

该变体还可包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置：G8D、A14P、E30Q、E47R、E47K、R51P、I169A、i169V、或E179Q相对应的一个位置处的取代。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的角质酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(de Vos)等人，1992，科学255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断鉴别必需氨基酸。

这些变体可以由100至194个、150至194个、100至150个、或150至194个氨基酸组成。

在一些实施例中，本发明涉及一种变体，其中相对于亲本的角质酶活性，该变体的角质酶活性更高。

在一些实施例中，本发明涉及一种变体，其中角质酶活性是在短链烷基酯底物上测量的，优选地其中该底物选自下组，该组由以下各项组成：异丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化效率。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的催化速率。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的比活性。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物结合。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物裂解。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改进的底物特异性。

亲本角质酶

该亲本角质酶可以是(a)一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；(b)一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性。

在一方面，该亲本与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的序列一致性，这一成熟多肽具有角质酶活性。在一个方面，该亲本的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不超过20个，例如1-10个，1-5个，或例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个氨基酸。

在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包括SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个方面中，该亲本包括SEQ ID NO:2的氨基酸1至194或由其组成。

在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的、包含至少194个氨基酸残基、例如至少150个氨基酸残基以及至少100个氨基酸残基的一个片段。

在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个等位变体。

在另一方面，该亲本由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严谨度条件下、低严谨度条件下、中严谨度条件下、中-高严谨度条件下、高严谨度条件下或非常高严谨度条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约)。

可以使用SEQ ID NO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴别和分离其中的对应基因。这类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA，来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴别与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在非常低到非常高严谨度条件下与一种被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQ ID NO:1；(ii)SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下该核酸探针所杂交的分子。

在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核酸探针是对SEQ ID NO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段进行编码的多核苷酸。在另一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:1。

在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％的序列一致性。

该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内蛋白技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两个多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工程微生物和生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯瓦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术(Biotechnology)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。

该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是一种细菌角质酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)角质酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)角质酶。

在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)角质酶。

在另一个方面，该亲本是一种类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)角质酶。

在另一方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)角质酶。

该亲本可以是一种细菌角质酶。例如，该亲本可以是一种酵母角质酶，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母属(Yarrowia)角质酶；或一种丝状真菌角质酶，如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、蘑燕属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)角质酶。

在另一方面，该亲本是卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)角质酶。

在另一方面，该亲本是解纤维枝顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、莫达瑞姆金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳霉(Thielavia achromatica)、阿波梭孢壳菌(Thielavia albomyces)、白毛梭孢壳霉(Thielavia albopilosa)、澳洲梭孢壳霉(Thielavia australeinsis)、菲美蒂梭孢壳菌(Thielavia fimeti)、小孢梭孢壳霉(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳霉(Thielavia ovispora)、秘鲁梭孢壳霉(Thielavia peruviana)、毛梭孢壳霉(Thielavia setosa)、瘤孢梭孢壳霉(Thielavia spededonium)、耐热梭孢壳(Thielavia subthermophila)、土生梭孢壳霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、或绿色木霉(Trichoderma viride)角质酶。

在另一方面，该亲本是一种特异腐质霉角质酶，例如SEQ ID NO:2的角质酶或其成熟多肽。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfect and imperfect states)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的株系可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得一种具有角质酶活性的多肽的方法，该方法包括：(a)向亲本角质酶中与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q相对应的一个或多个(例如若干个)位置处引入取代，其中该变体具有角质酶活性；并且(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制性内切酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见，例如，US2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(Fungal Genet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种所感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学30:10832-10837；US 5223409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA 7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯等人，1999，自然生物技术17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因69:301-315)、天蓝色链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteins fromrecombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克等人，1989(见上文)中。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马努斯等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适用的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导子，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

该控制序列还可以是一种多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的一个信号的一种序列。在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列都可以使用。

用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

有用于酵母宿主细胞的多腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中有过描述。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。上文的罗马诺斯等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或者在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节序列包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列是位于该载体中，以使得该编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体、或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型、等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包含但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包含使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、以及ARS4与CEN6的组合。

有用于丝状真菌细胞的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。根据WO00/24883中披露的方法可以实现AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸的可扩增的选择性标记基因可以获得增加的多核苷酸拷贝数目，其中通过在适当选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，同上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌、梭菌、肠球菌、土芽孢杆菌、乳杆菌、乳球菌、海洋芽孢杆菌、葡萄球菌、链球菌、以及链霉菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌、大肠杆、黄杆菌、梭杆菌、螺杆菌、泥杆菌、奈瑟氏菌、假单胞菌、沙门菌、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

可以通过原生质体转化(参见，例如常(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学和基因组(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829、或者杜布(Dubnau)和大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或共轭(参见，例如，凯勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)实现DNA到芽孢杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化(参见，例如，哈那汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志166:557-580)或者电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究16:6127-6145)实现DNA到大肠杆菌细胞中的引入。可以通过原生质体转化、电穿孔(参见，例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(Folia Microbiol.(Praha))49:399-405)、共轭(例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志171:3583-3585)、或者转导(参见，例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊98:6289-6294)实现DNA到链霉菌细胞中的引入。可以通过电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)、或者共轭(例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学71:51-57)实现DNA到假单孢菌细胞中的引入。可以通过如下方式实现将DNA引入链球菌细胞中：天然感受态(例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，传染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(例如，卡特(Catt)和约里克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，布克莱(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)、或接合(参见，例如，克莱怀尔(Clewell)，1981，微生物学综述(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，大学出版社(University Press)，英国剑桥(Cambridge,UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用，“酵母”包括产子囊酵母(内孢霉目)、产担子酵母以及属于半知菌类(芽生菌)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)、或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟赌菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊81:1470-1474、以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156、以及WO 96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(Guide to Yeast Genetics andMolecular Biology,Methods in Enzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志153:163；以及伊嫩(Hinnen)等人，1978，美国科学院院刊75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生一种变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养本发明的一种宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对角质酶特异的方法来检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。在一些实施例中，本申请中所述的方法可适用于此目的。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，《蛋白质纯化(Protein Purification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCH Publishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物以及形式

在一些实施例中，本发明涉及包括这些变体的组合物。该组合物可以是液体、胶体、粉末、颗粒或其任意组合。

在另一个实施例中，本发明涉及以下变体，这些变体已在一个载体上通过截留在天然或合成基质如溶胶-凝胶、褐藻胶和角叉菜胶中，通过交联方法如在交联的酶晶体(CLEC)和交联的酶聚集体(CLEA)中，或通过在盐晶体如蛋白涂覆的微晶(PCMC)上沉淀而被固定化。适合的载体可以是一种选自下组的亲水载体，该组包含：由氧化铝、二氧化硅和硅酸盐构成的多孔无机粒子，如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨润土、蛭石、水滑石；以及由碳水化合物聚合物如琼脂糖或纤维素构成的多孔有机粒子。

方法和用途

由于在聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、尼龙6,6,聚乙酸乙烯酯、聚丙烯腈等上催化许多重要的聚合物生物转化，角质酶可被用于合成的聚合物修饰。因此，增加对所选择的聚酯底物的角质酶活性可在各种应用中利用，例如像：(a)对工业上重要的材料进行表面修饰来调整其物理化学特性，这对于增强生物相容性、耐化学性、疏水性、附着性和湿润度可以是理想的；(b)改进将植物生物质中角质转化为化学原料的效率；以及(c)开发再循环聚酯如聚(ω-羟基脂肪酸)或合成聚酯(如PET)的酶途径。

在一个方面，本发明涉及修饰表面的方法，该方法包括：(a)将该变体添加到表面；并且(b)检测至少一个物理化学特性上的变化，优选地其中该至少一个物理化学特性是生物相容性、耐化学性、增强疏水性、表面的附着性和/或湿润度。

在一个方面，本发明涉及一种将植物生物质中的角质转化为化学原料的方法，该方法包括：(a)在有益于转化的条件下，将该变体添加到含角质的植物生物质中用于转化。

在一个方面，本发明涉及再循环聚酯的方法，该方法包括：(a)将该变体添加到有待再循环的聚酯中，优选地其中该聚酯是一种聚(ω-羟基脂肪酸)或一种合成聚酯。

在另一个方面，本发明涉及该变体用于修饰表面的用途，从而至少一个物理化学特性被改变，优选地其中该至少一个物理化学特性是生物相容性、耐化学性、增强疏水性、表面的附着性和/或湿润度中的任一个。

在另一个方面，本发明涉及该变体用于改进将植物生物质中的角质转化为化学原料的效率的用途。

在另一个方面，本发明涉及该变体用于再循环聚酯的用途，优选地其中该聚酯是一种聚(ω-羟基脂肪酸)或一种合成聚酯。

在一些实施例中，本发明涉及用于获得一种角质酶变体的方法，该方法包括：(a)在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相对应的一个或多个位置处引入一个亲本角质酶取代，该变体选自下组，该组由以下各项组成：P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，其中该变体具有角质酶活性；并且(b)回收该变体。

植物

本发明还涉及植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，其包括本发明的多核苷酸，以便以可回收的量表达和产生该变体。该变体可以从植物或植物部分回收。可替代地，可以按原样将含有该变体的植物或植物部分用于改善食品或饲料的质量，例如，改善营养价值、可口性、以及流变性质，或用以破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆、马铃薯、糖甜菜(sugar beet)、豌豆、豆和大豆)、以及十字花科植物(十字花科(family Brassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。

植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。

同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。

表达变体的转基因植物或植物细胞可以根据本领域已知的方法来构建。简而言之，通过如下方法构建该植物或植物细胞：将编码变体的一个或多个表达构建体并入到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并且使所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体宜为包括编码变体的多核苷酸的核酸构建体，该多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。而且，表达构建体可包含用于鉴别整合了此表达构建体的植物细胞的选择性标记，和将此构建体引入所讨论的植物所必需的DNA序列(后者取决于所用的引入DNA的方法)。

例如，基于希望在何时、何处、以及如何表达该变体来确定对调控序列如启动子和终止子序列和任选的信号或转运序列的选择。例如，编码变体的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且可以使基因产物靶向特定组织或植物部分，如种子或叶。调控序列由例如塔格(Tague)等人，1988，植物生理学(Plant Physiology)86:506描述。

对于组成型表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1、或稻肌动蛋白1启动子(弗兰克(Franck)等人，1980，细胞(Cell)21:285-294；克里斯滕森等人，1992，植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)18:675-689；张(Zhang)等人，1991，植物细胞(Plant Cell)3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如：来自贮藏库组织(storage sink tissue)(如种子、马铃薯块茎、以及果实)(爱德华兹(Edwards)和科鲁兹(Coruzzi)，1990，遗传学年度综述(Ann.Rev.Genet.)24:275-303)、或代谢库组织(metabolic sink tissue)(如分生组织)的启动子(伊托(Ito)等人，1994，植物分子生物学24:863-878)；种子特异性启动子，如来自稻的谷蛋白、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)、或白蛋白启动子(吴(Wu)等人，1998，植物细胞生理学(PlantCell Physiol.)39:885-889)；来自豆球蛋白B4和来自蚕豆的未知种子蛋白基因的蚕豆启动子(康拉德(Conrad)等人，1998，植物生理学杂志(J.PlantPhysiol.)152:708-711)；来自种子油体蛋白的启动子(陈(Chen)等人，1998，植物细胞生理学39:935-941)；来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子、或本技术领域已知的任何其他种子特异性启动子，例如，如在WO 91/14772中所描述。此外，启动子可以是叶特异性启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(京冢(Kyozuka)等人，1993，植物生理学(Plant Physiol.)102:991-1000)、小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶基因启动子(麦卓(Mitra)和希金斯(Higgins)，1994，植物分子生物学26:85-93)、来自稻的aldP基因启动子(加贺屋(Kagaya)等人，1995，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)248:668-674)、或伤口诱导型启动子(如马铃薯pin2启动子)(许(Xu)等人，1993，植物分子生物学22:573-588)。同样地，该启动子可以通过非生物处理来诱导，如温度、干旱、或盐度变化，或通过外源施加的激活该启动子的物质来诱导，例如乙醇、雌激素、植物激素(如乙烯、脱落酸和赤霉酸)、以及重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现变体在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是置于启动子与编码变体的多核苷酸之间的内含子。例如，许等人，1993，见上文，披露了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

该选择性标记基因及该表达构建体的任何其他部分可以选自本领域中可用的那些。

可以根据本领域中已知的常规技术将核酸构建体结合到植物基因组中，这些常规技术包括农杆菌介导的转化、病毒介导的转化、微注射、粒子轰击、生物射弹转化、以及电穿孔(Gasser(加塞尔)等人，1990，Science(科学)244:1293；Potrykus(波特里库斯)，1990，Bio/Technology(生物/技术)8:535；Shimamoto(岛本)等人，1989，Nature(自然)338:274)。

目前根癌农杆菌介导的基因转移是一种用于产生转基因双子叶植物(关于综述，请参见霍伊卡(Hooykas)和施尔伯鲁特(Schilperoort)，1992，植物分子生物学19:15-38)并且用于转化单子叶植物的方法，但对于这些植物还常常使用其他的转化方法。用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子(涂覆有转化DNA的微观金或钨粒子)轰击胚愈伤组织或发育中的胚(克里斯托(Christou)，1992，植物杂志(Plant J.)2:275-281；岛本，1994，生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)5:158-162；瓦西尔(Vasil)等人，1992，生物/技术10:667-674)。用于转化单子叶植物的替代方法是基于原生质体转化，如由奥米儒勒(Omirulleh)等人，1993，植物分子生物学21:415-428所描述。另外的转化方法包括US 6395966和US 7151204(两者都通过引用以其全文结合于此)中所描述的那些。

在转化后，根据本领域熟知的方法选出已并入了表达构建体的转化体，并使其再生成为完整植物。通常设计转化程序用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码变体的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于US 7151204中。

植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包含被称为回交转化的基因型、种系、近交体、或杂交体的植物。

可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。

本发明还涉及产生本发明的变体的方法，这些方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包括编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且(b)回收该变体。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

实例1：

固定：将这些酶在卢泰特(Lewatit)VP OC 1600基质上以20毫克酶/克基质的比率进行固定。通过用98％乙醇随后用水洗涤来制备该基质。将该酶溶液添加到该洗涤的基质中并在4℃伴随摇动孵育18小时。在孵育之后，在SDS-PAGE上解析上清液以查明固定程度。将固定前收集的酶等分试样用作对照。将固定的酶在真空下的干燥器中干燥以去除所有水分。将该干燥的固定的酶用于转酰基反应。在相同条件下不添加固定的酶进行对照反应。

转酰基反应：在微量离心管(2ml)中进行该反应。将固定的酶(20mg)添加到二异丙基醚中的酰基供体(100mM)和酰基受体(1-丙醇，100mM)中。将十二烷(5mM)用作内标。将该反应混合物在30℃下以750rpm孵育24小时。在完成孵育之后，将上清液转移到新鲜的微量离心管中并用二异丙基醚稀释10倍用于GC分析。

气相层析：在适配有DB-5柱和火焰电离检测器的安捷伦气相层析仪(型号7890)上进行气相层析。将样品(1ul，分流比1:10)用注射器注入，温度维持在250℃并且该检测器温度在280℃。在运行过程中，初始柱温度设置为50℃持续1分钟并且以5℃/min增加到150℃，并且以10℃/min增量从150℃增加到250℃，使用氢作为载气。

所有反应是以个体基质进行的并且转化百分比被计算为相对于内标归一化的起始(对照)和最终(反应)基质浓度的差异。

实例2：

如实例1中所述的用该亲本角质酶以及这些变体进行反应，使用了四种不同的基质(酰基供体)：异丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。

表1.变体对异丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯的活性显示为与该亲本角质酶(WT)的活性相比的相对数目。

在此描述并且要求的本发明不限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

Claims (25)

1.一种亲本角质酶的分离的变体，该变体包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相对应的一个或多个位置处的取代，该取代选自下组，该组由以下各项组成：

P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；

I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；

G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；

F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；

G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，并且该变体具有角质酶活性。

2.如权利要求1所述的变体，其中相对于该亲本的角质酶活性，该变体的角质酶活性更高。

3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，其中该角质酶活性是在短链烷基酯底物上测量的，优选地其中该底物选自下组，该组由以下各项组成：异丁酸甲酯、三甲基乙酸甲酯、丁烯酸甲酯、以及甲基丙烯酸甲酯。

4.如权利要求1至3中任一项所述的变体，该变体是选自下组的一种亲本角质酶的一种变体，该组由以下各项组成：

a.一种与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；

b.一种由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％一致性；以及

c.SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有角质酶活性。

5.如权利要求1-4中任一项所述的变体，其中该亲本角质酶包括SEQ IDNO:2的成熟多肽或由其组成。

6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，其中该亲本角质酶是SEQ ID NO:2的成熟多肽的一个片段，其中该片段具有角质酶活性。

7.如权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体与该亲本角质酶的氨基酸序列具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％一致性，至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列一致性。

8.如权利要求1-6中任一项所述的变体，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列一致性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，其中该变体由100至194个、150至194个、100至150个、或150至194个氨基酸组成。

10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中取代的数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、或20个取代。

11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，该变体包括在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸残基31、36、45、52、70、120、143、167、以及174中的任一个相对应的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个位置处的取代，该取代选自下组，该组由以下各项组成：

P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；

I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；

G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；

F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；

G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q。

12.如权利要求1-11中任一项所述的变体，该变体包括选自以下的突变/突变的组合中的至少一个或由其组成：

a.E30Q；

b.P31V；

c.I36N；

d.I36Q；

e.I36S；

f.G45N；

g.R51P；

h.N52E；

i.F70A；

j.F70S；

k.G120S；

l.G143R；

m.L167A；

n.L174N；

o.L174Q；

p.A14P/I169A；

q.A14P+N52E+I169A；或

r.G8D+A14P+R51P+E179Q。

13.如权利要求1-12中任一项所述的变体，该变体进一步包括在与SEQ IDNO:2的成熟多肽的位置：G8D、A14P、E30Q、E47R、E47K、R51P、I169A、i169V、或E179Q相对应的一个位置处的至少一个取代。

14.如权利要求1-13中任一项所述的变体，该变体相对于该亲本具有改进的特性，其中该改进的特性选自下组，该组由以下各项组成：催化效率、催化速率、比活性、底物结合、底物裂解、底物特异性。

15.一种对如权利要求1-14中任一项所述的变体进行编码的分离的多核苷酸。

16.一种包括如权利要求15所述的多核苷酸的核酸构建体。

17.一种包括如权利要求15所述的多核苷酸的表达载体。

18.一种包括如权利要求15所述的多核苷酸的宿主细胞。

19.一种产生角质酶变体的方法，该方法包括：(a)在适合于该变体的表达的条件下培养如权利要求18所述的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

20.用如权利要求15所述的多核苷酸转化的一种转基因植物、植物部分或植物细胞。

21.一种产生如权利要求1-14中任一项所述的变体的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该变体的条件下培养包括编码该变体的多核苷酸的一种转基因植物或一种植物细胞；并且(b)回收该变体。

22.一种用于获得角质酶变体的方法，该方法包括：(a)在与SEQ ID NO:2的成熟多肽的位置31、36、45、52、70、120、143、167、以及174相对应的一个或多个位置处引入一个亲本角质酶取代，该取代选自下组，该组由以下各项组成：P31A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,S,T,W,Y,V；

I36A,R,N,D,C,Q,E,G,H,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；

G45A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；N52E；

F70A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,P,S,T,W,Y,V；G120S；

G143A,R,N,D,C,Q,E,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V；L167A；以及L174N,Q，其中该变体具有角质酶活性；并且(b)回收该变体。

23.一种修饰表面的方法，该方法包括：(a)将如权利要求1-14中任一项所述的变体添加到一个表面；并且(b)检测至少一个物理化学特性上的变化，优选地其中该至少一个物理化学特性是生物相容性、耐化学性、增强疏水性、表面的附着性和/或湿润度。

24.一种将植物生物质中的角质转化为化学原料的方法，该方法包括：(a)在有益于转化的条件下，将如权利要求1-14中任一项所述的变体添加到含角质的植物生物质中。

25.一种再循环聚酯的方法，该方法包括：(a)将如权利要求1-14中任一项所述的变体添加到有待再循环的聚酯中，优选地其中该聚酯是一种聚(ω-羟基脂肪酸)或一种合成聚酯。