CN103314091A - 具有磷脂酶c活性的多肽及其编码多核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法。

Description

具有磷脂酶C活性的多肽及其编码多核苷酸

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过提述并入本文。

技术领域

本发明涉及具有磷脂酶C活性的酶，编码具有磷脂酶C活性的酶的克隆的DNA序列，产生所述酶的方法，和所述酶在多种工业应用中的用途。

此外，本发明涉及通过使用具有磷脂酶C活性的酶而减少包含高量不可水合的磷的可食用油中含磷组分的含量的方法。

发明背景

已知数种类型的磷脂酶，其根据在磷脂分子中攻击的键的位置而在其特异性方面有所不同。磷脂酶A1(PLA1)去除1位脂肪酸以产生游离脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂(1-lyso-2-acylphospholipid)。磷脂酶A2(PLA2)去除2位脂肪酸以产生游离脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂(1-acyl-2-lysophospholipid)。术语磷脂酶B(PLB)用于具有A1和A2活性两者的磷脂酶。磷脂酶C(PLC)去除磷酸模块以产生1,2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)产生1,2-二酰基甘油磷酸和碱性基团。

具有磷脂酶活性的多肽可应用于工业工艺，例如用于精制植物油。在使用之前，将植物油脱胶以提供精制的储藏稳定性植物油，其具有中性味道和浅颜色。脱胶工艺包括从富含甘油三酯的油级分去除磷脂组分(胶)。

传统上，脱胶工艺基于水提取、酸或碱处理，继以分离工艺。由于磷脂组分的乳化性质，脱胶步骤导致油，即甘油三酯的损失。

由于对磷脂的有效水解(这减少了乳化性质)，酶脱胶减少了油损失。然而，现行磷脂酶A溶液受限于对繁琐的pH调整步骤的需要，以及游离脂肪酸的产生，而目前仅有的商业上可获得的磷脂酶C(Purifine of Verenium,参见Dijkstra,101^st AOCS Annual Meeting10。2010年5月)，依赖于油中的磷脂物种，因为其无法水解磷脂磷脂酸和磷脂酰肌醇。因此在酶法脱胶之后，磷脂酸和磷酯酰肌醇会遗留在油中，且必须用苛性物质进一步处理经磷脂酶C处理的油以去除剩余的胶。

存在对于具有磷脂酶活性并适于应用于可食用油的酶法脱胶的其它酶的需要。

发明内容

本发明人从在中国于1997年发现的Kinochaeta属菌种的菌株分离了新型磷脂酶C酶。相应地，本发明提供了具有磷脂酶C活性的新颖多肽，和编码所述多肽的多核苷酸。所述多肽对主要的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷酯酰肌醇具有活性。本发明的多肽具有相对较低的最佳pH和在低至pH4具有良好的活性。该较低的最佳pH在低pH条件下植物油的酶脱胶而言是优点。

本发明涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的多肽的片段，其具有磷脂酶C活性。

本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并涉及产生多核苷酸的方法。

本发明亦涉及对植物油进行脱胶的方法。

定义

磷脂酶C活性：术语“磷脂酶C活性”意指催化反应：磷脂酰胆碱+H2O=1,2-sn-二酰基甘油+胆碱磷酸的活性。就本发明而言，磷脂酶C活性根据“材料和方法”中所述的步骤确定。具有“磷脂酶C活性”的酶可属于EC3.1.4.3。

本发明的多肽具有SEQ ID NO:2的成熟多肽的磷脂酶C活性的至少20%，例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，和至少100%。

分离的多肽：术语“分离的多肽”意指相对于如见于自然界的多肽经人力修饰的多肽。在一个方面，多肽如通过SDS-PAGE测定的，为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，并且最优选至少90%纯。

分离的多肽的非限定性实例包括：(1)任何非天然存在的多肽，(2)任何多肽，其包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子，它们至少部分地从与其在自然界结合的一种或多种或所有天然存在的组分移出；(3)任何多肽，其相对于见于自然界的多肽经人工修饰；或(4)任何多肽，其通过相对于与其天然结合的其它组分增加所述多肽的量而受修饰。分离的多肽可存在于发酵液样品。

基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10%，至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，和至多0.5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。优选地，所述多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，例如至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%纯，至少99.5%纯，和100%纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，例如，这能够通过以下实现：通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。

成熟多肽：术语“成熟多肽意指以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在的多肽，所述修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等。在一个方面，所述成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至625。SEQ IDNO:的氨基酸-1至-18为信号肽。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有磷脂酶C活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，所述成熟多肽编码序列是SEQ IDNO:1的核苷酸55至1929。SEQ ID NO:1的核苷酸1至54编码信号肽。

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,2000,Trends in Genetics 16:276-277)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap openpenalty)为10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)为0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个核苷酸序列之间的序列同一性程度通过使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open SoftwareSuite,Rice等,见上文)(优选3.0.0版或更高版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分为10，缺口延伸罚分为0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：

(同样的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

片段：术语“片段”意指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有磷脂酶C活性。在一个方面，片段含有至少550个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸19至569)，至少575个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸19至594)，和至少600个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2的氨基酸19至619)。

亚序列：术语“亚序列(subsequence)”意指从成熟多肽编码序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的多核苷酸；其中所述亚序列编码具有磷脂酶C活性的片段。在一个方面，亚序列含有至少1800个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸55至1855)，例如至少1825个核苷酸(例如SEQ ID NO:1的核苷酸55至1880)，和至少1850个核苷酸((例如SEQ ID NO:1的核苷酸55至1905)。

等位变体(allelic variant)：术语“等位变体”意指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指相对于见于自然界的多核苷酸经人力修饰的多核苷酸。在一个方面，分离的多核苷酸如通过琼脂糖电泳测定的，为至少1%纯，例如至少5%纯，至少10%纯，至少20%纯，至少40%纯，至少60%纯，至少80%纯，至少90%纯，和至少95%纯。所述多核苷酸可为基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源，或其任意组合。

基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，至多8%，至多6%，至多5%，至多4%，至多3%，至多2%，至多1%，和至多0.5%的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选地，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，例如至少92%纯，至少94%纯，至少95%纯，至少96%纯，至少97%纯，至少98%纯，至少99%纯，和至少99.5%纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成的或重组的多核苷酸。

cDNA：术语“cDNA”意指能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤(包括剪接)加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因，或将其以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或其为合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。

调控序列(control sequence)：术语“调控序列”意指对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最低限度，调控序列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点目的的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得调控序列指导编码序列的表达。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的(susceptible)。术语“宿主细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。

变体：术语“变体”意指具有磷脂酶C活性的多肽，其在一个或多个(几个)位置包含改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。取代意指用不同的氨基酸替代占据某位置的氨基酸；缺失意指移出占据某位置的氨基酸；和插入意指紧邻占据某位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。

发明详述

具有磷脂酶C活性的多肽

本发明涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；和

(e)(a)，(b)，(c)，(d)或(e)的多肽的片段，其具有磷脂酶C活性。

本发明涉及分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性；其具有磷脂酶C活性。在一个方面，所述多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差不多于十个氨基酸，例如五个氨基酸，四个氨基酸，三个氨基酸，两个氨基酸，和一个氨基酸。

本发明的多肽优选包含或组成为SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其等位变体，或是其具有磷脂酶C活性的片段。在另一个方面，所述多肽包含或组成为SEQ ID NO:2的成熟多肽。

本发明亦涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，New York)。

本发明的多肽源自Kinochaeta属菌种的菌株。所述多肽具有磷脂酶C活性，并对主要的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸和磷酯酰肌醇具有活性。

SEQ ID NO:1的多核苷酸或其亚序列，以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有磷脂酶C活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，例如至少25，至少35，和至少70个核苷酸。优选地，所述核酸探针是至少100个核苷酸长度，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸，至少500个核苷酸，至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸，或至少900个氨基酸的核酸探针。DNA和RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。这些探针涵盖于本发明中。

可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有磷脂酶C活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至并且固定于硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料。为了鉴定与SEQ ID NO:1，或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用于Sounthern印迹中。

就本发明而言，杂交表示多核苷酸在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。

在一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码SEQ ID NO:2的多肽或其片段的多核苷酸。在另一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO:1。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严格条件定义为在42℃，在5X SSPE、0.3%SDS、200μg/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，以及对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺，对于中等和中-高严格性为35%的甲酰胺，或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。使用2X SSC、0.2%SDS在45℃(非常低严格性)，在50℃(低严格性)，在55℃(中等严格性)，在60℃(中等-高严格性)，在65℃(高严格性)，和在70℃(非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比使用根据Bolton和McCarthy的计算法(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:1390)计算的T_m低大约5℃至大约10℃，在0.9M NaCl，0.09MTris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5%NP-40，1×Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交和杂交最佳12至24小时。将所述载体材料最终在6×SSC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在比计算的T_m低5℃至10℃的温度洗涤两次，每次15分钟。

本发明亦涉及具有磷脂酶C活性的分离的多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%的序列同一性。

本发明还涉及SEQ ID NO:2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/或活性；小缺失，通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列(poly histidinetract)、抗原表位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)。

保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins,Academic Press,New York中描述。最普遍发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

或者，氨基酸变化可为这样的性质，其使得所述多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸变化可改善多肽的热稳定性，改善其底物特异性，改变最适pH等。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的磷脂酶C活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来确定。参见例如de Vos等,1992,Science 255:306-312；Smith等,1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等,1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份(identity)也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与亲本多肽相关。

能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如那些由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-2156；WO 95/17413；或WO95/22625公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等,1991,Biochemistry 30:10832-10837；美国专利No.5,223,409；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire等,1986,Gene46:145；Ner等,1988,DNA7:127)。

诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等,1999,Nature Biotechnology17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速确定肽中单个氨基酸残基的重要性。

SEQ ID NO:2的成熟多肽的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数为不多于10，例如1，2，3，4，5，6，7，8或9。

所述多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的一部分融合于在另一个多肽的一部分的N端或C端。

所述多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到本发明的多肽的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们符合读框(in frame)，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合蛋白亦可使用内蛋白(intein)技术构建，其中融合在翻译后构建。(Cooper等，1993，EMBO J.12:2575-2583；Dawson等，1994，Science266:776-779)。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。一旦分泌了融合蛋白，就切割所述位点，释放所述两个多肽。切割位点的实例包括但不限于，公开于Martin等，2003，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.3:568-576；Svetina等，2000，J.Biotechnol.76:245-251；Rasmussen-Wilson等，1997，Appl.Environ.Microbiol.63:3488-3493；Ward等，1995，Biotechnology 13:498-503；和Contreras等，1991，Biotechnology 9:378-381；Eaton等，1986，Biochemistry 25:505-512；Collins-Racie等，1995，Biotechnology 13:982-987；Carter等，1989，Proteins:Structure，Function，和Genetics 6:240-248；和Stevens，2003，Drug DiscoveryWorld4:35-48中的那些。

具有磷脂酶C活性的多肽的来源

本发明的具有磷脂酶C活性的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思应为多核苷酸编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的多核苷酸的菌株产生。在一个方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。

所述多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有磷脂酶C活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多肽。

在一个方面，所述多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。

在另一个方面，所述多肽是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)多肽。

在另一个方面，所述多肽是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多肽。

所述多肽还可以是真菌多肽。例如，所述多肽可为酵母多肽如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia)多肽；或丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、Botryospaeria、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、Kinochaeta、蘑菇属(Lentinula)、Leptospaeria、梨孢菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属(Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。

在另一个方面，所述多肽是卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多肽。

在另一个优选的方面，所述多肽是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporiummerdarium、毡金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、Chrysosporiumqueenslandicum、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporiumzonatum、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusarium crookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霉(Humicola insolens)、疏棉状腐质霉(Humicola lanuginosa)、白耙齿菌(Irpex lacteus)、Kinochaeta sp.、Kinochaeta pughii、Kinochaeta ramifera、Kinochaeta spissa、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、无色梭孢壳(Thielavia achromatica)、Thielavia albomyces、Thielavia albopilosa、澳洲梭孢壳(Thielavia australeinsis)、Thielavia fimeti、小孢梭孢壳(Thielavia microspora)、卵孢梭孢壳(Thielavia ovispora)、Thielavia peruviana、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielavia spededonium)、Thielavia subthermophila、土生梭孢霉(Thielavia terrestris)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)多肽。

在一个优选实施方案中，所述多肽来源于Kinochaeta属菌种。

可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域技术人员将容易地识别适合的等同物的身份。

这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures)(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regional Research Center)(NRRL)。

可使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定和获得所述多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码所述多肽的多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

多核苷酸

本发明亦涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸。

用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域中是已知的，并包括包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆多核苷酸。参见，例如，Innis等,1990,PCR:A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivated transcription；LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从Kinochaeta属菌种的菌株，或其它或相关生物体克隆所述多核苷酸，可为例如所述多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。

本发明亦涉及分离的多核苷酸，其包含或组成为多核苷酸，所述多核苷酸与序列SEQ ID NO:1的成熟多肽编码具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%的序列同一性，其编码具有磷脂酶C活性的多肽。

修饰编码本发明多肽的多核苷酸对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。可以在作为SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列呈现的多核苷酸，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代：所述取代不导致多肽氨基酸序列的改变，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者通过导入可产生不同的氨基酸序列的核苷酸取代来构建变体。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford等,1991,ProteinExpression and Purification 2:95-107。

本发明亦涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸在中等-高严格条件，高严格条件，或非常高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；或其等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文中定义。

在一个方面，所述多核苷酸包含或组成为SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，或编码SEQ ID NO:2具有磷脂酶C活性的片段的SEQID NO:1的亚序列。

核酸构建体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。

可以用许多方式操作所述多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

调控序列可为启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞所识别的多核苷酸。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等,1978,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75:3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:21-25)。另外的启动子在"Useful proteins from recombinantbacteria"于Gilbert等,1980,Scientific American,242:74-94中；和在Sambrook等,1989,见上文中描述。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO 00/56900)、曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其包含在曲霉属中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在曲霉属(Aspergilli)中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包含在黑曲霉中编码中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由在构巢曲霉或米曲霉中编码丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列所替代)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1,ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等,1992,Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，其由宿主细胞识别以终止转录。所述终止子序列与编码所述多肽的多核苷酸的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。

对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是合适的前导序列，当被转录时其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。

对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与多核苷酸的3’末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为将聚腺苷残基添加至转录的mRNA的信号。可使用在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。

对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。

对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990描述。

调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的N端相连的信号肽，并且指导所述多肽进入细胞分泌途径。多核苷酸的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码所述多肽的编码序列的区段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，可使用指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT,nprS,nprM)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews 57:109-137描述。

对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、疏棉状腐质霉脂肪酶和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等,1992,见上文描述。

调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽N端的前肽。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α因子的基因获得前肽编码序列。

当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的N端时，将前肽序列置于紧接着(next to)多肽N端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的N端。

同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调节序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的多核苷酸或核酸构建体来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。

所述载体优选地含有一个或多个(几个)选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。

细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)(orotidine-5’-phosphatedecarboxylase)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选含有元件，其允许载体整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。

为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，400至10,000碱基对，和800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(replicator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。

在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(Gems等,1991,Gene 98:61-67；Cullen等,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂(selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等,1989,见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入宿主细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。宿主细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于，弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属和脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。

可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.168:111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.81:823-829或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.56:209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques 6:742-751)或接合(参见，例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.169:5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等,1988,Nucleic Acids Res.16:6127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等,2004,Folia Microbiol.(Praha)49:399-405)，接合(参见，例如，Mazodier等,1989,J.Bacteriol.171:3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke等,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：例如电穿孔(参见，例如，Choi等,2006,J.Microbiol.Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.71:51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.32:1295-1297)，原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick,1991,Microbios.68:189-207)，电穿孔(参见，例如，Buckley等,1999,Appl.Environ.Microbiol.65:3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。

宿主细胞可为真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门：子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth等,于Ainsworth and Bisby’s Dictionary of TheFungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等,1995,见上,171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)(Hawksworth等,1995,见上文)。

真菌宿主细胞可为酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如Biology and Activities of Yeast(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.，和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980)中所述。

酵母宿主细胞可为假丝酵母属、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可为枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filibasidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可为泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea、Ceriporiopsis gilvescens、Ceriporiopsis pannocinta、Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、Chrysosporium inops、嗜角质金孢子菌、Chrysosporium lucknowense、Chrysosporium merdarium、毡金孢子菌、Chrysosporium queenslandicum、热带金孢子菌、Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉细胞。

可将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP 238023和Yelton等,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等,1989,Gene 78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母：Becker和Guarente,于Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology,Volume 194,pp 182-187,Academic Press,Inc.,New York；Ito等,1983,J.Bacteriol.153:163；和Hinnen等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1920。

产生方法

本发明亦涉及产生本发明的多肽的方法，其包括：(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养细胞，其以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是曲霉属的细胞。在一个更优选的方面，所述细胞是米曲霉。

本发明亦涉及产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养本发明的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。

使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(lysate)回收。

可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测所述多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，酶测定法(enzyme assay)可用于测定多肽的活性。

多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

所述多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,New York,1989)。

在可选的方面，不回收所述多肽，而将表达所述多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。

植物

本发明还涉及植物，例如，转基因植物、植物部分或植物细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有所述多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties)，或用于破坏抗营养因子。

转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis(翦股颖属)；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。

双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyme)、维管组织(vasculartissue)、分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。

同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。

表达多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞：将编码多肽的一个或多个(几个)表达构建体并入植物宿主基因组或叶绿体基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。

表达构建体便利地是包含编码多肽的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该多核苷酸所需的适当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可以包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。

调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如Tague等,1988,Plant Physiology 86:506所述。

对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和稻肌动蛋白1启动子(Franck等,1980,Cell 21:285-294,Christensen等,1992,Plant Mo.Biol.18:675-689；Zhang等,1991,Plant Cell 3:1155-1165)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990,Ann.Rev.Genet.24:275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等,1994,Plant Mol.Biol.24:863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu等,1998,Plant Cell Physiol.39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等,1998,J.of Plant Physiol.152:708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen等,1998,Plant Cell Physiol.39:935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的rbcs启动子(Kyozuka等,1993,PlantPhysiology 102:991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins,1994,Plant Mol.Biol.26:85-93)，来自稻的aldP基因启动子(Kagaya等,1995,Mol.Gen.genet.248:668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu等,1993,Plant Mol.Biol.22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisicacid)和赤霉酸(gibberellic acid)，和重金属。

启动子增强子元件也可以用于实现多肽在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码多肽的多核苷酸之间。例如Xu等,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。

选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。

将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等,1990,Science 244:1293；Potrykus,1990,Bio/Technology 8:535；Shimamoto等,1989,Nature 338:274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(genetransfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和Schilperoort,1992,Plant Mol.Biol.19:15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是常用的。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚(developing embryos)(Christou,1992,Plant J.2:275-281；Shimamoto,1994,Current Opin.Biotech.5:158-162；Vasil等,1992,Bio/Technology 10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh等,1993,Plant Mol.Biol.21:415-428所描述的。其他用于依照本公开使用的转化方法包括那些描述于美国专利6,395,966和7,151,204的那些(两者均通过提述以其整体并入本文)。

转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。

除了用根据本发明制备的构建体直接转化具体植物基因型之外，还可通过将具有所述构建体的植物与缺乏该构建体的第二植物杂交来制备转基因植物。举例而言，可将编码多肽的构建体通过杂交而引入特定植物品种，而根本无需直接转化该给定品种的植物。因此，本发明不仅涵盖从依照本发明经转化的细胞直接再生的植物，还包括此类植物的后代(progeny)。如用于本文，后代可指依照本发明制备的亲本植物任何世代的后裔(offspring)。此种后代可包含依据本发明制备的DNA构建体，或依据本发明制备的DNA构建体的一部分。杂交导致转基因通过将起始种系与供体植物种系交叉授粉而引入植物种系。此类步骤的非限制性实例进一步阐述于美国专利7,151,204号。

植物可通过回交转化方法生成。举例而言，植物包括称作回交转化的基因型、种系、近交体(inbred)或杂交体(hybrid)的植物。

可使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景基因渗入(introgression)至另一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可用于避免由表型变异导致的错误。进一步，遗传标记可在特定杂交的个体后代中提供有关良种种质相对程度的数据。举例而言，当具有所需性状但除此之外(otherwise)具有非农艺学所需的遗传背景的植物与良种亲本杂交时，可使用遗传标记来选择不仅具有该目标性状，还具有相对较大比例所需种质的后代。以此方式，使一种或多种性状基因渗入特定遗传背景所需的世代数得到最小化。

本发明还涉及产生本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养包含编码所述多肽的多核苷酸的转基因植物或植物细胞；和(b)回收所述多肽。

组合物

本发明亦涉及包含本发明的多肽的组合物。所述组合物可包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。或者，所述组合物可包含其它酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶(chitinase)、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂质酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。其它酶亦可为具有磷脂酶A1、A2、B和/或D活性的多肽。其它酶可例如由属于下述属的微生物来产生：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、禾谷镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。

所述组合物可依照本领域已知方法制备，并可为液体或干组合物的形式。例如，所述组合物可为颗粒或微颗粒的形式。所述多肽可依照本领域中已知的方法来稳定化。

用途

本发明亦涉及使用具有磷脂酶C活性的多肽或其组合物的方法。

本发明的磷脂酶可应用于包括用磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂的工艺。一旦与磷脂酶C相接触，所述磷脂或溶血磷脂分别水解产生甘油二酯和磷酸酯，或甘油一酯和磷酸酯。

本发明的磷脂酶可应用于包括对植物油例如可食用的植物油脱胶的工艺，包括水解磷脂以获得改善的磷脂乳化剂的工艺，特别是其中所述磷脂是卵磷脂，包括水解来自水脱胶的胶级分中的磷脂以释放捕获的甘油三酯油的工艺，用于改善含有磷脂的、来源于糖的浆料或水性溶液的可过滤性的工艺，和/或用于制备烘烤产品的工艺，所述工艺包括将磷脂酶添加至生面团，并烘烤所述生面团以制备所述烘烤产品。

本发明的多肽可用于对水性溶液或浆料特别是淀粉水解物，尤其是小麦淀粉水解物(其难以过滤并产生浑浊的滤过物)进行脱胶以改善其可滤过性。所述处理使用本领域公知的方法进行。参见，例如EP 219,269，EP 808,903。

本发明的多肽可用于减少可食用油中磷脂含量的工艺。参见，例如WO2007/103005和US 2008/0182322。此种工艺适用于纯化任何含有磷脂的可食用油，例如植物油如大豆油、菜籽油和向日葵油。

所述磷脂酶处理可直接在粗油中进行，或在通过例如湿法精制去除粘质(slime/mucilage)之后进行。在湿法精制之后，所述油在用磷脂酶处理开始时通常会含有50-250ppm的作为磷脂的磷，且所述处理可减少磷值，优选至低于11ppm，如至低于5-10ppm。

所述磷脂酶处理通过将磷脂酶的水性溶液优选作为平均直径低于10微米(microM)的小滴分散来进行。水的量优选为按相对于油的重量计0.5-5%。可任选地添加乳化剂。可施加机械搅拌以维持乳液。磷脂酶处理可在约1.5至约7.0，优选3.5至约6范围的pH进行。合适的温度一般为30-70℃(特别是40-60℃，例如55-55℃)。

反应时间通常为1-12个小时(例如1-6个小时或1-3个小时)。合适的酶剂量通常会是0.1-10mg每升(例如0.5-5mg每升)。磷脂酶处理可分批进行，例如在釜中搅拌进行，或其可为连续的，例如一系列搅拌釜反应器。所述磷脂酶处理可继以水相和油相的分离。所述分离可通过常规手段例如离心进行。当使用液体脂质酶时，水相会含有磷脂酶，且可重新使用该酶以改善工艺经济性。

本发明的多肽和其它此类对四种主要的磷脂：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷酯酰肌醇(PI)具有活性的多肽可用于对油组合物进行脱胶。相应地，本发明提供了用于将油组合物脱胶的方法，所述方法包括(a)提供含有一定量磷脂的油组合物，(b)将所述油组合物与磷脂酶C酶在足以使得酶与磷脂反应以形成甘油二酯和磷酸酯的条件下相接触，和(c)从油组合物分离磷酸酯，由此获得经脱胶的油植物，其中所述磷脂酶C酶对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷酯酰肌醇(PI)具有活性。

除了本发明的磷脂酶C之外，可在上文概述的脱胶工艺中施用其它酶。在一个优选实施方案中，所述其它酶是具有磷脂酶A1、A2、B和/或D活性的多肽。合适的具有磷脂酶A1活性的多肽可为可从Novozymes A/S获得的Lecitase Ultra。合适的具有磷脂酶D活性的多肽可为例如来源于酿酒酵母并具有序列UniProt:P36126的酶，或来源于盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)并具有序列UniProt:Q54Z25的酶。

此外，本发明提供了对油组合物进行脱胶的方法，所述方法包括(a)提供含有一定量的PC、PE和/或PI的油组合物，(b)用磷脂酶D酶处理所述油组合物以将PC、PE和/或PI转化为PA，(c)用磷脂酶C酶处理所述油组合物以将PA转化为甘油二酯和磷酸。磷脂酶D和磷脂酶C可一起施用从而使得步骤(b)和(c)基本上同时进行。

将磷脂酶固定在合适的载体上亦可使用本领域任何已知方法进行，所述方法包括捕获于天然或合成基质如疏水性聚合物，离子交换树脂，溶胶，海藻酸，和角叉藻聚糖(carrageenan)；通过交联方法如交联的酶晶体(CLEC)和交联的酶聚集物(CLEA)；或通过沉淀于盐晶体上，如蛋白包被的微晶体(PCMC)。

在某些实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸酯产物的方法，其中所述载体是选自下组的亲水载体：由氧化铝，二氧化硅和硅酸盐构成的有孔无机颗粒如有孔玻璃，沸石，硅藻土，膨润土，蛭石，铝碳酸镁；和由糖聚合物如琼脂糖或纤维素构成的有孔有机颗粒。在其他实施方案中，本发明涉及产生脂肪酸酯产物的方法，其中所述载体是疏水聚合物载体，例如聚丙烯，聚乙烯，丙烯酸酯。合适的商业性载体为例如LEWATIT^TM，ACCUREL^TM，PUROLITE^TM和AMBERLITE^TM。

本发明通过下述实施例进一步描述，其不应视作对本发明范围的限制。

材料和方法

磷脂酶C测定：将包含10微升的100mM对硝基苯基磷酰胆碱(p-nitrophenyl phosphoryl choline，p-NPPC)在100mM Borax-HCl缓冲液pH7.5中的溶液和90微升的酶溶液反应混合物在微滴定板孔中在环境温度下混合。然后将微滴定板置于微滴定板读板器中，并通过测量在410nm的吸光度对释放的对硝基苯酚定量。在30分钟过程中以1分钟间隔记录测量。在0.01至1微升/ml对硝基苯酚范围的校正曲线通过将来自Sigma的10微摩尔/ml对硝基苯酚储液稀释于Borax-HCl缓冲液来制备。一个单位在环境温度下会释放1.0微摩尔/分钟的p-NPPC。

实施例

实施例1：分子量

为了确定SEQ ID NO:2中所示的磷脂酶C的分子量，将30微升的纯化的酶样品施于12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将凝胶在100V运行1.5小时，并用考马斯蓝染色。酶的分子量确定为大约65KDa。

实施例2：磷脂酶C活性

将包含SEQ ID NO:2中所示的磷脂酶C的浓缩的无细胞发酵液在Borax-HCl缓冲液中稀释，并使用p-NPPC测定测量磷脂酶C活性。酶浓缩物对p-NPPC的活性确定为0.316单位/ml未稀释的样品。

实施例3：pH概貌的确定

磷脂酶C(PLC)活性使用WO2005040410中所述的测定法测量，所述方法经下述修改：当亚油酸氢过氧化物(linoleic acid hydroperoxide)形成时，通过在234nm的动力学测量直接检测。将作为底物的DLPC(1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)以含0.25mM甘油三油酸酯(triolein)的1mM在60℃在40mM含2mM β-环糊精和0.8mM CaCl₂的缓冲液中匀浆1分钟，然后冷却至25℃，并与均过量添加的纯化的脂肪氧合酶(来自Magnaporthe salvinii (WO2002086114))以及纯化的酰基甘油脂肪酶(细毛嗜热霉(Thermomyces lanuginosus)，来自Novozymes A/S的Lipolase^TM)混合(A280=0.04)。DLPC的最终浓度是0.6 mM。Magnaporthe脂肪氧合酶和嗜热霉属酰基甘油脂肪酶均不对DLPC具有显著活性，然而一旦添加具有PLC活性的酶，则DLPC水解为磷酸胆碱和1,2-亚油酰基甘油(1,2-dilinoylglycerol)，后者在过量酰基甘油脂肪酶的存在下迅速水解为亚油酸，而亚油酸是脂肪氧合酶的底物。简言之，PLC活性的存在导致过氧化氢的产生，其在234 nm检测。在反应最初10分钟过程中PLC活性由4分钟的最大平均斜率(dA234/dt)来确定。

结果示于表1。

表1：pH概貌；最佳pH为100%。

^*柠檬酸缓冲液，^**Hepes缓冲液

SEQ ID NO:2中所示的磷脂酶C在pH 4-6与Purifine相比具有较低的最适pH和对DLPC较高的相对活性。

实施例4：底物特异性的确定

具有PLC活性的酶对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷酯酰肌醇(PI)的底物特异性使用具有下述变化的实施例3中所示的测定来评估：

缓冲液：          MES，pH5.5。

PLC酶的剂量：    A280=0.0004

底物：            0.6mM DLPX(DLPC，DLPA，DLPE和DLPI)，与0.15三亚麻酸甘油酯(Trilinolein)混合。

结果示于表2。

表2：SEQ ID NO:2的PLC和Purifine的底物特异性

两种酶均具有DLPC作为其优选底物，然而SEQ ID NO:2的PLC具有更广泛的特异性，和对所有测试的磷脂类型的显著活性。该广泛的特异性在脱胶中是优点，因为该酶对于植物油中所有的主要磷脂均具有活性。

实施例5：通过差示扫描量热法确定热稳定性

SEQ ID NO:2的PLC的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)使用VP-Capillary Differential Scanning Calorimeter(MicroCal Inc.，Piscataway，NJ，USA)确定。将以200K/hr的恒定程序加热速率在缓冲液(添加或不添加5mMEDTA的50mM乙酸钠pH5.0)中加热酶溶液而获得的热分析图(Cp对T)中的变性峰(主要的吸热峰)顶部取为热变性温度Td(℃)。

将样品和参照溶液(大约0.2ml)从10℃的储藏条件加载至量热仪(参照：不含酶的缓冲液)，并在20℃热预平衡20分钟，然后从20℃至110℃进行DSC扫描。变性温度以大约+/-1℃的准确度确定。结果示于下表3。

表3：通过差示扫描量热法确定的热稳定性

热稳定性在存在或不存在5mM EDTA下对于Purifine和SEQ ID NO:2的PLC在pH 5通过DSC评估。不存在EDTA时，Purifine与SEQ ID NO:2的PLC相比更具热稳定性。然而，虽然5mM EDTA的存在并未不利地影响SEQ ID NO:2的PLC的热稳定性，在EDTA存在下，Purifine不稳定得超过了40℃(destabilized by more than 40℃)，表明Purifine中催化/结构上重要的二价金属离子的相对松散的结合。SEQ ID NO:2的PLC在EDTA存在下的高稳定性表明在工业条件下的高稳定性。

实施例6：大豆油的脱胶

从用磷脂PC、PI、PE和PA掺入的大豆油产生了测试底物。所述底物包含50mg磷脂每1mL油。将1mL油的样品与1mg纯化的酶蛋白在热振荡器(thermoshaker)中在45℃温育。除了酶反应之外，还温育了空白反应，其中将酶溶液用水的添加来替代。

样品通过³¹P NMR进行分析。该基于NMR的测定的原理是在PLC对磷脂起作用之后，磷酸(酯/盐)会离开油相。因此，油相的NMR积分(integral)在酶作用之后会变小。包括了空白以补偿非酶促的水脱胶。

结果：

45℃，pH6.0

样品：对照

积分尺度(integral size)

样品：SEQ ID NO:2的PLC

积分尺度

%剩余的磷脂

积分比例

45℃，pH4.0

样品：对照

积分尺度

样品：SEQ ID NO:2的PLC

积分尺度

%剩余的磷脂

积分比例

SEQ ID NO:2中所示的PLC在pH6.0以及在pH4.0对所有四种磷脂具有活性。

Claims (15)

1.一种具有磷脂酶C活性的分离的多肽，其选自下组：

(a)多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性；

(b)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等-高严格条件下与以下杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；

(c)多肽，其由多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，和至少99%序列同一性；

(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽包含一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入的变体；

(e)任何a、b或c的多肽，其包含SEQ ID NO:2或由SEQ ID NO:2组成，和

(f)(a)，(b)，(c)，(d)，或(e)的多肽的片段，其具有磷脂酶C活性。

2.权利要求1的分离的多肽，其与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60%，例如至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性。

3.权利要求1或2任一项的分离的多肽，其包含SEQ ID NO:2或由SEQID NO:2组成。

4.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至3任一项的多肽。

5.一种核酸构建体或表达载体，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个(几个)调控序列，所述调控序列指导所述多肽在表达载体中的产生。

6.一种重组宿主细胞，其包含权利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所述多肽的产生。

7.一种产生权利要求1至3任一项的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养细胞，其以其野生型形式产生所述多肽；和

(b)回收所述多肽。

8.一种产生权利要求1至3任一项的多肽的方法，其包括：

(a)在有助于所述多肽的产生的条件下培养权利要求6的宿主细胞；和

(b)回收所述多肽。

9.一种组合物，其包含权利要求1至3任一项的多肽和其它酶。

10.权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9的组合物在用于水解磷脂的工艺中的用途。

11.权利要求1至3任一项的多肽或权利要求9的组合物在减少可食用油中磷脂含量的工艺中的用途。

12.一种用于减少可食用油中含磷组分的含量的方法，其包括将所述油与权利要求1至3任一项的多肽的水性溶液相接触，所述水性溶液在油中乳化直至减少了油的磷含量，然后将水相与经处理的油分离。

13.一种对油组合物进行脱胶的方法，所述方法包括：

(a)提供含有一定量磷脂的油组合物，

(b)将所述油组合物与磷脂酶C酶在足以使得所述酶与磷脂反应以形成甘油二酯和磷酸酯的条件下相接触，和

(c)从油组合物分离磷酸酯，由此获得经脱胶的油组合物，

其中所述磷脂酶C酶对磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷酯酰肌醇(PI)具有活性。

14.一种对油组合物进行脱胶的方法，所述方法包括：

(a)提供含有一定量的PC、PE和/或PI的油组合物，

(b)用磷脂酶D酶处理所述油组合物以将PC、PE和/或PI转化为PA，

(c)用磷脂酶C酶处理所述油组合物以将PA转化为甘油二酯和磷酸。

15.权利要求13至14任一项的方法，其中所述磷脂酶C酶是权利要求1至3任一项的多肽。