CN104630175A

CN104630175A - 一种磷脂酶c

Info

Publication number: CN104630175A
Application number: CN201310567107.XA
Authority: CN
Inventors: 丛芳; 李芳�; 许骏
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-11-14
Also published as: CN104630175B

Abstract

本发明提供了一种磷脂酶C、其编码序列、及其生产和应用。本发明提供的磷脂酶C可水解磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，具有于酸性pH区域或中性pH区域或碱性pH区域附近有效水解磷脂的能力，具有广泛的pH区域的耐受性，并且具有一定程度的热稳定性，对锌离子敏感，不依赖锌发挥水解能力。对于酶的发酵生产以及工业化应用都有很重要的意义。

Description

一种磷脂酶C

技术领域

本发明涉及酶脱胶领域，具体的，涉及一种磷脂酶C。

背景技术

催化水解磷脂的酶都可以称为磷脂酶，它们广泛分布与自然界中，发挥了多种多样的功能，从蛇毒的毒性(Janssen et al.1999)到信号传导(Singer et al.1997)到人类消化，都是磷脂酶参与的生物学特性和过程(De Maria et al.2007)。虽然磷脂酶的底物都是磷脂，但是它们可以作用于磷脂分子上的不同位点，根据水解位点不同，磷脂酶被分为五种：phospholipase A1(PLA1)，phospholipaseA2(PLA2)，phospholipase B(PLB)，phospholipase C(PLC)和phospholipase D(PLD)。比如，PLA1和PLA2可分别水解甘油基sn-1，sn-2位置上的脂肪酸酰基酯键。PLA1和PLA2可以相应的催化产生游离脂肪酸和2-acyllysophospholipid或者1-acyl lysophospholipid。溶血磷脂上的脂肪酸再继续被phospholipase B(PLB)水解而游离出来。PLC被定义为一种磷酸二酯酶，可以水解甘油磷酸键，产生甘二酯。PLD可作用于磷脂产生磷脂酸(Ramrakhiani andChand2011)。磷脂酶是一类很重要的可水解磷脂的酶，因为水解位置不同，可释放出多种不同的底物，比如溶血磷脂(lysophospholipids)，游离脂肪酸(freefatty acids，FFAs)，甘二酯(diacylglycerols，DGs)，磷酸胆碱(cholinephosphate)和磷脂酸盐(phosphatidates)。现今，磷脂酶已经被应用于面包制造，蛋黄工业和植物油脱胶(Clausen2001)。

磷脂广泛存在于所有的生物体内，它们和糖脂、胆固醇一起，是生物膜结构的重要组成部分(De Maria et al.2007)。磷脂主要在三个方面发挥了重要的作用：保持了生物膜结构的完整性(White et al.2001)，参与了许多代谢有关和神经系统的疾病(Lee1998)，以及作为信号物质调控了许多生物过程(Hannun et al.2001)。磷脂分子通常由非极性的二酰基部分和极性的含磷部分组成，酰基部分的特性和含磷部分的构成决定了这个磷脂的分类，特点以及生物学功能。植物油中的磷脂主要包括phosphatidylcholine(lecithin，PC，磷脂酰胆碱)，phosphatidylethanolamine(PE，磷脂酰乙醇胺)，phosphatidylinositol(PI，磷脂酰肌醇)，phosphatidic acid(PA，磷脂酸)，phosphatidylserine(PS，磷脂酰丝氨酸)，phosphatidylglycerol(PG，磷脂酰甘油)，diphosphatidylglycerol(DPG，二磷脂酰甘油)及N-acyl phosphatidylethanolamine(NAPE，乙酰基磷脂酰乙醇胺)等。植物油中的磷脂包括水化磷脂和非水化磷脂。水化磷脂和非水化磷脂的不同主要在于和磷脂酸的羟基相连的官能团不同。水化磷脂包括PC、PE、PI，都含有极性较强的基团，例如胆碱、乙醇胺、肌醇等，因此具有比较强的亲水性。非水化磷脂包括具有非脂类性质的含磷物质，以酸的形式存在的磷脂酸和聚磷脂酸，还包括溶血磷脂(Padley et al.1994)。

植物油，比如豆油，菜籽油，葵花籽油和玉米油，是一种重要的营养来源。从油料种子中提取的毛油需要进一步提纯，以去除会影响油品稳定性，颜色和风味的杂质。磷脂是一类主要的杂质，在传统精炼工艺中，需要以很高的成本进行脱胶来去除。油中的磷脂会导致油品在后续脱色、氢化和脱臭的过程中颜色变深。此外，磷脂会降低精炼油的氧化稳定性并抑制脱氢催化剂的表现。磷脂的总量和种类与油料种子的生长，储藏，处理条件和萃取方式有关，一般来说，不超过毛油重量的3%。在传统精炼过程中，通过加水来脱除磷脂。磷脂由DAG和一个极性磷酸酯组成，加水可引起磷酸酯的水化，将磷脂吸附于油水界面。水化的磷脂可吸附中性油，因此形成了含有磷脂和中性油的乳状液或者胶。这种粘性的胶可通过离心从油中分离，这个过程称为水化脱胶。但是这一步精炼的步骤会导致与杂质正比例相关的TAG和DAG得率损失。磷脂的强乳化性质，会导致吸附油品，从而造成得率损失。另一部分的得率损失来自于，离心后油胶界面上，油的不完全回收。残留在油中的磷脂，还会在接下来的精炼步骤中导致进一步的得率损失。比如脱酸时，又产生乳状液。因此，传统的油脂精炼中，主要的得率损失都是源于磷脂产生的乳状液，而这种损失是和磷脂的存在总量成正比的。

酶法脱胶，已经发展到工业化规模，对传统的水法脱胶是一种补充和替代。与化学催化不同的是，酶是高度专一并且只作用于目标分子，而那些与目标分子相似的分子却不会受到影响。许多商业化的用于酶法脱胶的酶，已经在市场上推出，大部分都是属于PLA。PLA将磷脂杂质上的脂肪酸脱除，形成在少水环境中乳化效果差的溶血磷脂，来起到脱胶的目的，但是这个过程中，产生的游离脂肪酸会残留在油中，需要在后期通过皂化来脱除，而这一步又会产生乳化剂带来油损。

而PLC只与油中的磷脂杂质反应，而并不攻击油体本身。PLC可将磷脂水解为水溶性的磷酸基，以及油溶性的甘二酯，因此减少了磷脂杂质的乳化能力，也就降低了后续的油损。与PLA不同的是，PLC不会产生额外的游离脂肪酸。值得指出的是，用PC-PLC脱胶，又可以产生DAG，这对得率又是一个提高。而提高的DAG含量没有超出油品中DAG天然含量的范围(10%)(Yasukawa andKatsuragi，2004)，并且不会影响油品质量的指标，例如烟点。

现在已知的PC-PLC，主要来源于Bacillus sp.和Pseudomonas sp.。

根据对底物分子的特异性，PLC可分为phosphatidylinositol-specificphospholipase C(PI-PLC，EC number3.1.4.11)和phosphatidylcholine-specificphospholipase C(PC-PLC，EC number3.1.4.3)。PI-PLC可特异性水解磷脂酰肌醇(PI)，而PC-PLC可水解磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。毛油中各个磷脂的含量并不是恒定的，会因为物种来源、压榨或浸出工艺不同，而发生变化。以大豆油为例，PC含量为47%，PI含量为24%，PE含量为20%，PA含量为9%。但现已成功商品化开发的Purifine(DSM公司)的工作pH范围为6-7，是一种中性PC-PLC，可水解PE和PC，但不能水解PI，因此无法实现磷脂的完全去除。此外，在深度酶法脱胶中，要共同添加PC-PLC和PLA1来实现对磷的完全脱除，PLA1的工作pH为4-5，因此当Purifine和PLA1混合使用时，无法找到一个合适的pH范围，使两种酶同时以较高酶活工作。

发明内容

本发明提供了一种磷脂酶C，该磷脂酶C可水解磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，具有于酸性pH区域或中性pH区域或碱性pH区域附近有效水解磷脂的能力，具有广泛的pH区域的耐受性(pH4-11)，并且具有一定程度的热稳定性可大量节省在生产中对pH和温度调节和调控花费的成本，在与PLA1联合使用是，这2种酶能同时以较高酶活工作。具有广泛pH区域的耐受性，对于酶的发酵生产以及工业化应用都有很重要的意义。另外，该磷脂酶C对锌离子敏感，不依赖锌发挥水解能力。本发明还提供了该磷脂酶C的融合蛋白，该融合蛋白不仅能同时水解磷脂底物中的主要磷脂：磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰胆碱(PC)，具有更广泛的水解底物特性，且其酶活比亲本酶混合液酶活高出20%。

因此，本发明的一个目的在于，提供一种磷脂酶C。

本发明提供的所述磷脂酶C选自：(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示的多肽，或(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示的多肽的保守性变体。

在本发明的一个优选实施例中，所述的保守性变体是：将SEQ ID NO:1或7氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO:1或7所示的氨基酸序列相同功能的多肽变体。

在本发明的一个优选实施例中，所述磷脂酶C由SEQ ID NO:2或6所示多核苷酸编码。

本发明还有一个目的在于，提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述的磷脂酶C。较佳地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2或6所示。

本发明还提供了一种包含前述多核苷酸的重组表达载体。

本发明还提供了一种包含前述多核苷酸或重组表达载体的重组菌株。

本发明还提供了一种生产磷脂酶C的方法。

本发明提供的方法包括：培养本发明提供的重组菌株以表达所述磷脂酶C，收获磷脂酶C。在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括破碎细胞来收集含有表达在胞内的磷脂酶C上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩或纯化。

本发明还提供了一种生产磷脂酶C酶液的方法。本发明提供的方法包括：培养本发明提供的重组菌株以表达所述磷脂酶C，分离和收集含有表达在胞内的磷脂酶C的上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。

在本发明的一个优选实施例中，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行纯化或浓缩。

本发明还提供了一种磷脂酶C酶液。较佳地，本发明提供的所述磷脂酶C酶液通过前述生产磷脂酶C的酶液的方法制备。

本发明还提供了一种组合物，它含有所述的磷脂酶C或所述的酶液，以及食品学或工业上可接受的载体。

本发明还提供了所述的磷脂酶C或所述的酶液的用途，用于将磷脂底物水解为水溶性的磷酸基以及油溶性的甘二酯；较佳地所述的磷脂底物包括：磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)；较佳地所述的磷酸基包括：磷酸乙醇胺和磷酸胆碱；或

用于植物油(包括但不限于大豆油)的脱胶处理。

本发明还提供了一种植物油的脱胶方法，其使用本发明提供的磷脂酶C、或其酶液进行脱胶。较佳地，脱胶过程在40℃-70℃(较佳地55-65℃)、pH4-10(较佳地pH5-8.5；更佳地pH4-7)条件下进行。

附图说明

图1为PFSMC底物偏好性的NMR检测结果。图1-1为未添加酶的磷脂氯仿相NMR检测结果；图1-2为添加PFSMC的磷脂氯仿相NMR检测结果；图1-3为未添加酶的磷脂水相NMR检测结果；图1-4为添加PFSMC的磷脂水相NMR检测结果；其中，PA代表磷脂酸，PE代表磷脂酰乙醇胺，PI代表磷脂酰肌醇，PC代表磷脂酰胆碱，E代表磷酸乙醇胺，C代表磷酸胆碱。

图2显示温度对PFSMC磷脂酶酶活的影响。

图3显示pH对PFSMC磷脂酶酶活的影响。

图4显示温度对PFSMC磷脂酶酶活稳定性的影响。

图5显示pH对PFSMC磷脂酶酶活稳定性的影响。

图6显示不同金属离子对PFSMC磷脂酶酶活稳定性的影响。

图7为实施例1中洗脱液的凝胶电泳检测结果，其中泳道1为Marker，泳道2为洗脱液。

图8为实施例4中洗脱液的凝胶电泳检测结果，其中泳道1为Marker，泳道2为洗脱液。

图9显示PF-PI融合蛋白底物偏好性的NMR检测结果，其中，图9-1为未添加酶的磷脂氯仿相NMR检测结果，图9-2为添加PF-PI融合蛋白的磷脂氯仿相NMR检测结果。

图10显示温度对酶活的影响，其中，PF-PI表示的是融合蛋白，PF+PI表示的是PFSMC和PI-PLC混合液。

图11显示pH对酶活的影响，其中，PF-PI表示的是融合蛋白，PF+PI表示的是PFSMC和PI-PLC混合液。

图12显示最适条件下的酶活，其中，PF-PI表示的是融合蛋白，PF+PI表示的是PFSMC和PI-PLC混合液。

图13显示pH对Purifine磷脂酶酶活的影响。

图14显示pH对Purifine磷脂酶酶活稳定性的影响。

具体实施方式

本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60-120和80-110的范围，理解为60-110和80-120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、和2-5。

如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。

如果没有特别指出，本发明所述的百分数(包括重量百分数)的基准都是所述组合物的总重量。

在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，但是优选是顺序进行的。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的“包括”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述“包括”可以表示还可以包含没有列出的其他元件，也可以仅包括列出的元件。

在本发明中，如果没有特别的说明，本文实施例中的具体数值以及具体物质可与本文描述部分的其他特征结合。例如，本文描述部分提到反应的温度为10-100℃，而实施例提到的反应温度为20℃，那么可以认为本文已经具体公开了10-20℃的范围，或者20-100℃的范围，且该范围可以描述部分的其他特征结合起来形成新的技术方案。

本发明提供的磷脂酶C的氨基酸序列选自：

1)SEQ ID NO:1或7所示氨基酸序列，或

2)SEQ ID NO:1或7所示氨基酸序列的保守性变体。

在本发明中，“SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的保守性变体”指的是：该变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列存在差异，但其依然具有或基本具有本发明的磷脂酶C的性能。SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的变体是否为“保守性变体”可由本领域的技术人员经有限试验确定。

在本发明中，“SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的保守性变体”指的是：该变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:7所示氨基酸序列存在差异，但其依然具有或基本具有本发明的磷脂酶C的性能。SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的变体是否为“保守性变体”可由本领域的技术人员经有限试验确定。

本发明还包括磷脂酶C的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然磷脂酶C相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，所述磷脂酶C SEQ ID NO:1或7序列编码多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。因此该术语还包括磷脂酶C的活性片段和活性衍生物。

在本发明的一个优选实施例中，所述磷脂酶C由SEQ ID NO:2或6所示核苷酸序列编码。

本发明提供的多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示的多肽或其保守性变体。在本发明的一个优选实施例中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:2或6所示。

本发明还提供了一种包含前述核苷酸序列的重组表达载体。

在本发明中可供选择使用的表达载体为本领域的技术人员所熟知，例如，可以是现有常用的表达载体，例如包括但不限于：pET系列表达载体，pCold系列表达载体，pGEX系列表达载体，pCMVp-NEO-BAN等真核表达载体。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本发明还提供了一种包含前述核苷酸序列或重组表达载体的重组菌株。

在本发明中可供选择使用的菌株为本领域的技术人员所熟知，例如，可以是现有常用的表达载体，在重组技术中的常用的宿主，例如包括但不限于大肠杆菌，酵母，米曲霉，黑曲霉，里氏木霉等，例如，毕赤酵母(Pichia pastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

本发明还提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养本发明提供的重组菌株以表达所述磷脂酶C，收获磷脂酶C。有些宿主菌株，例如酵母，可将生产的磷脂酶C分泌到胞外的培养基中。实施方式之一中，所述收获包括从培养物中分离出上清液，由此得到含有磷脂酶C具有磷脂酶C活性的酶液。在本发明的一个实施方案中，可以对生产菌株进行破胞处理，从而释放出更多的磷脂酶C。当所选宿主(例如大肠杆菌)不向胞外分泌产物时，细胞破碎则成为必需步骤。这些调整都是本领域技术人员所熟知的。

在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括对生产菌株进行破胞处理收集含有磷脂酶C的细胞破碎物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩或纯化。实施方式之一中，当使用磷脂酶C酶液即可满足目的时，可以直接使用酶液，例如细胞破碎物上清，而不需要将磷脂酶C纯化；为提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性，可将本发明的磷脂酶C酶液进行了纯化。浓缩和纯化磷脂酶C的方法，为本领域的技术人员所熟知，例如可以采用本领域的常规技术，例如包括但不限于：超滤法、透析法、冷冻干燥法进行浓缩，或凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析进行纯化。

本发明提供的生产磷脂酶C酶液的方法包括：培养本发明提供的重组菌株以表达所述磷脂酶C，分离和收集磷脂酶C的细胞破碎物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。优选的，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行纯化或浓缩。

本发明还提供了一种磷脂酶C酶液，该磷脂酶C酶液通过前述生产磷脂酶C的酶液的方法制备，优选的，磷脂酶C酶液为纯化或浓缩后的磷脂酶C酶液。

本发明还提供了一种脱胶的方法，其使用本发明提供的磷脂酶C、或其酶液进行脱胶。

PLC酶法脱胶是在油脂精炼中利用磷脂酶将毛油中的磷脂水解生成油溶性的甘二酯和水溶性的磷酸基，甘油二酯溶于油中成为食用油的一部分，可以提高脱胶油的得率。并且，由于水解破坏了磷脂分子的亲水亲油性，从而减少了脱胶过程中，结合大量油的胶体的形成，也从另一方面提高了油的得率。因此酶法脱胶具有降低生产成本，增加出油率等诸多优点。

实施例

在本发明的下述实施例中，使用的培养基配方如下：

LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L；

表达培养基：蛋白胨1.2%，酵母提取物2.4%，甘油0.4%，磷酸二氢钾17mM，磷酸氢二钾72mM。

在本发明的下述实施例中，使用的溶液配方如下：

裂解缓冲液：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH8。

洗脱缓冲液1：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，20mM咪唑，pH8。

洗脱缓冲液2：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，50mM咪唑，pH8。

洗脱缓冲液3：50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，250mM咪唑，pH8。

透析液：150mM氯化钠，20mM Tris-HCl,10mM硫酸锌,1mM二硫苏糖醇，pH8。

NMR分析缓冲液：氯仿-d:甲醇:0.2M EDTA-Cs(v/v/v)=1：1：1，pH8.5。

在本发明的下述实施例中，除特别说明外，磷脂酶活力的检测均采用钼蓝法。钼蓝法是通过检测水解反应释放出来的无机磷来检测磷脂酶酶活的方法，具体过程如下：

试剂：

10%(w/v)抗坏血酸：取2g溶于20mL水中，可稍微加热促进溶解，4℃保存(新鲜配制)。

30%(v/v)硫酸溶液；

2.5%(w/v)钼酸铵溶液：取2.5g钼酸铵溶于100mL的30%硫酸溶液，常温放置；

1%混合磷脂：0.5g大豆粉末磷脂溶于50mL去离子水，在烧杯中旋转均匀后再储存，4℃保存(新鲜配制)；

500mM Tris-Cl(pH7.5)：取100mL的1M Tris-Cl的母液，加水至150mL，调pH至7.5，定容至200mL，常温保存；

100mM CaCL2：称取0.555g CaCL2溶于50mL水，4℃保存；

1M Tris-Cl(pH9.0)：称取24.228g Tris溶于180mL水中，调pH至9.0，定容至200mL，常温保存；

500mM MgCl₂：称取9.521g MgCl₂溶于200mL水中，常温保存；

500U/mL碱性磷酸酶(AP，购自Takara)：10U/μL，稀释20倍后即为500U/mL，4℃保存。

磷钼蓝检测无机磷方法的标准曲线的制定

取烘干的磷酸氢二钾试剂粉末0.1431g，溶于去离子水，定容至100mL，即配制成1mg/mL PO₄ ^3-的磷酸氢二钾溶液。从1mg/mL PO4^3-的磷酸氢二钾溶液分别取出0，2，5，8，10，15，20，50μL，加入去离子水补足至940μL，再加入20μL的10%(w/v)抗坏血酸溶液，摇匀30s后加入40μL的2.5%(w/v)钼酸铵溶液(溶剂为30%硫酸溶液)，最后定容至1mL，最终的PO₄ ^3-浓度是0，2，5，8，10，15，20，50μg/mL。每个浓度点平行做3个重复样品。37℃水浴10min后，在吸光度700nm下进行吸光值检测，对得到的数据进行线性拟合，即得到磷钼蓝检测的标准曲线。

磷钼蓝法检测梯度稀释的商品酶PLC的活力

选用DSM公司的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶(PC-PLC，以下简称PLC)作为检测对象，以大豆粉末磷脂作为PLC的反应底物。在200μL的反应体系中，含有100μL的混合磷脂试剂，10μL的Tris-Cl(pH7.5)试剂，10μL的CaCl₂试剂，60μL的去离子水。同时对PLC酶进行梯度稀释，稀释比例为1:500，1:800，1:1000,，1:1600，1:2000，1:3200，对照组采用沸水浴5min的PLC，稀释比例为1:500，最后在反应中各加入20μL的酶液(该反应试剂用量如下表1)。各反应在37℃水浴中进行30min。反应后加入200μL的氯仿混匀30s后,进行12,000rpm1min的离心，取上清液进行下一步反应。

吸取离心后的上清80μL于100μL的磷酸酶反应体系中，反应体系中，再加入5μL的Tris-Cl(pH9.0)试剂，2μL的MgCL₂试剂，11μL的去离子水，2μL的CIAP试剂(该反应试剂用量如下表2)。反应在37℃水浴中进行30min。

30min后，各加入的去离子水，再加入20μL的10%(w/v)的抗坏血酸，及40μL的2.5%(w/v)钼酸铵溶液。37℃显色10min。取显色后的溶液进行吸光度700nm检测。结合磷钼蓝检测的标准曲线，对数据进行分析回归，乘上稀释倍数后，即得活力值。

表1

	成分	试剂浓度	体积(ul)
				1	混合磷脂	1%(w/v)	100
2	Tris-HCl，pH7.5的缓冲液	500mM	10
				3	CaCl₂	100mM	10
4	PLC酶液	1:500稀释	20
				5	H₂O		60
	Total		200

表2

计算方法：

标准曲线：y=a×x(y:700nm的吸光值；x：PO4^3-的浓度μg/mL；a：回归系数)

每一个样品显色后得到一个吸光值A：

备注：

(A/a)：每一个样品测到的PO4^3-的浓度，　g/mL；

1：显色时总体积为1mL；

95：PO4^3-的摩尔质量是95μg/μmoL；

0.08：从PLC反应中取出的0.08mL去做的下一步反应，后面测得所有PO4^3-来自这个体积；

0.2：第一步PLC反应的总体积为0.2mL；

30：反应时间为30min；

0.00002：加入到第一步反应中的酶液体积为0.00002L；

[PLC]：加入到第一步反应中的酶液的浓度。

在本发明的下述实施例中，NMR参数如下：

Time19.32

INSTRUM spect

PROBHD5mm PABBO BB/

PULPROG zgig

TD32768

NS256

DS4

SWH14534.884Hz

FIDRES0.443569Hz

AQ1.1272192sec

RG197.41

DW34.400usec

DE6.50usec

TE298.1K

D15.00000000sec

D110.03000000sec

TD01

========CHANNEL f1========

SFO1242.9370770MHz

NUC131P

P112.00usec

PLW143.79999924W

========CHANNEL f2========

SFO2600.1324005MHz

NUC21H

CPDPRG[2waltz16

PCPD265.00usec

PLW223.00000000W

PLW120.60017997W

F2-Processing parameters

SI32768

SF242.9370770MHz

WDW EM

SSB0

LB3.00Hz

GB0

PC1.40

实施例1、PFSMC表达和纯化

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成SEQ ID NO:2所示序列(其编码序列如SEQ ID NO:1所示)，并克隆在表达载体pET24a(+)上。

将带有该核苷酸序列的pET24a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达(参考《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社2002，[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)。具体过程如下：

挑取阳性转化子在LB培养基中，于37℃进行过夜种子培养，按1%的接种量，将种子培养液接种到表达培养基中，于37℃，220rpm培养至OD600=0.6-0.8。

冷却至20℃后，加入IPTG至0.1mM进行诱导，20℃，190rpm过夜表达。诱导表达结束后，离心收集菌体。用裂解缓冲液重悬菌体(每克细胞加5毫升缓冲液)。

将重悬的菌体进行低温超声破碎细胞(50%电压输出，2秒超声破碎，9秒间隔，共超声20分钟)，操作时将样品冰浴冷却以保护蛋白。细胞破碎后，14000rpm离心20分钟并收集上清。

每100毫升上清中加入1毫升Ni-NTA树脂冰浴振荡30分钟。将细胞破碎上清和Ni树脂转移至层析柱中，待细胞破碎上清全部通过Ni树脂后，先用20个柱体积的洗脱缓冲液1清洗，再用20个柱体积的洗脱缓冲液2清洗，最后用5个柱体积的洗脱缓冲液3清洗，并收集洗脱液，将洗脱液于4℃透析过夜，凝胶电泳检测结果如图7所示，根据图7结果，所得溶液为纯化好的目的蛋白溶液，命名为PFSMC。

实施例2、PFSMC底物偏好性

向10ml混合磷脂底物(15.75g/L大豆粉末磷脂(为磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺磷脂酸等的混合物)，5mM CaCl₂)中加入0.5mlPFSMC(2.9mg/ml)，向另一管10ml磷脂混合底物加入0.5ml水作为对照，于35℃，200rpm反应18小时，加入10ml氯仿，震荡混匀，10,000g离心10分钟，溶液分为上下两层。

取1ml上层的水相，冻干，重悬于1ml重水中。取1ml下层氯仿相，超净台中吹干，重悬于3ml NMR分析缓冲液中，将两相分别进行31P-NMR分析。

添加水的磷脂底物氯仿相NMR结果见图1-1，可见，磷脂底物主要含有三种磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰胆碱(PC)。添加PFSMC的磷脂底物氯仿相NMR结果见图1-2，可见经过PFSMC的水解作用，PE和PC基本全部被水解，而PI并未发生改变。添加水的磷脂底物水相NMR结果见图1-3，可见，磷脂底物并无含磷的水溶性物质。添加PFSMC的磷脂底物的水相NMR结果见图1-4，可见，经过PFSMC的水解作用，产生了水溶性的磷酸胆碱和磷酸乙醇胺。

根据上述结果，PFSMC以磷脂酶C的作用形式有选择性的作用于磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)，起到有效的酶解效果。在实际生产中，大豆的胶体中含有约70%的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，因此在大豆油脱胶中，PFSMC可通过有效的水解这两种磷脂，生成甘二酯和水溶性的磷酸乙醇胺和磷酸胆碱来实现脱胶。

实施例3、PFSMC的部分酶学性质

在200μL的反应体系中，含有大豆粉末磷脂0.5%(w/v)，缓冲体系(25mMTris-Cl，pH7.5)，5mM CaCl₂，加入磷脂酶PFSMC20μl(0.097mg/ml)，反应进行30min，加入200μL的氯仿振荡混匀30s，进行12,000rpm离心1min，取80μL上清加入到磷脂酶反应体系中，终体积为200μL，该体系还含有50mMTris-Cl(pH9.0)，10mM MgCl₂，CIAP10U/μL。反应在37℃水浴中进行30min。各加入740μL的去离子水，再加入20μL的10%(w/v)的抗坏血酸，及40μL的2.5%(w/v)钼酸铵溶液。37℃显色10min。取显色后的溶液进行吸光度700nm检测。结合磷钼蓝检测的标准曲线，对数据进行分析回归，乘上稀释倍数后，即得活力值。

3.1、最适温度

分别在40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃下反应，以测定磷脂酶PFSMC活力。

以最高酶活为相对酶活，计算其他温度下纯酶的相对活力，以反应温度为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图2所示。

根据图2结果，60℃为该酶的最适温度，在40℃-70℃区域内，该酶都表现出大于50%的酶活。

3.2、最适pH

分别在pH为4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0，11.0的缓冲体系反应，以测定磷脂酶PFSMC活力。

以最高酶活为相对酶活，计算其他pH下纯酶的相对活力。以pH为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图3所示。

所用不同pH的缓冲液配方如下：

①pH4.0-pH6.0的缓冲液：使用500mM的醋酸钠及浓盐酸和NaOH调配。

②pH7.0-pH8.5的缓冲液：使用500mM的Tris-HCl及浓盐酸和NaOH调配。

③pH9.0-pH10.0的缓冲液：使用500mM的甘氨酸及浓盐酸和NaOH调配。

④pH11.0的缓冲液：使用500mM的磷酸氢二钠及浓盐酸和NaOH调配。

根据图3结果，pH5为该酶的最适pH，在pH5-8.5的区域内，该酶都表现出大于80%的酶活。

3.3、温度稳定性

将磷脂酶PFSMC溶液分装于不同的反应管中，分别于4℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃保温1小时，4小时，18小时，测定磷脂酶PFSMC活力，以不经保温处理所测的磷脂酶PFSMC的酶活为100%，计算经上述处理后的PFSMC的相对酶活。

以反应温度为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图4所示。

根据图4结果，该酶的热稳定性较好，60℃孵育1小时以及50℃孵育18小时，都还保留了50%以上的酶活。

3.4、pH稳定性

将20μl(0.097mg/ml)酶液分别加入20μl pH4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0，11.0的缓冲液体系，其中，pH4.0-6.0的缓冲液为500mM醋酸钠缓冲液，pH7.0-8.5的缓冲液为500mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0-11.0的缓冲液为500mM甘氨酸缓冲液。

于4℃保温18h后测定磷脂酶PFSMC活力，以不经保温处理所测的磷脂酶PFSMC酶活为相对酶活100%，计算经上述处理后的PFSMC的相对酶活，以pH为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图5所示。

根据图5结果，该酶在很广的pH区域都具有较强的稳定性，在pH4-10的区域都保留了80%以上的酶活。

3.5、金属离子对酶活影响

将20μl(0.097mg/ml)PFSMC溶液与不同的金属离子溶液(NaCl、CuSO₄、NiSO₄、ZnSO₄、CaCl₂、MnCl₂、KCl、CoCl₂溶液，50mM)按1：1比例(体积比)混合，4℃保温1小时后，测定磷脂酶PFSMC活力，以未添加任何金属离子的反应体系作为对照(100%酶活)，计算添加金属离子的PFSMC的相对酶活，结果如图6所示。

根据图6结果，该酶对锌离子敏感，在25mM锌离子中孵育1小时，酶活几乎检测不到，钾离子、钠离子、镁离子和钙离子对酶活几乎没有影响，锰离子、镍离子和铜离子对酶活有较大的抑制作用，而钴离子也对酶活表现出一定的抑制作用。

通过以上结果可看出，PFSMC在较为广泛的温度和pH区域都显示出较大的酶活和稳定性。

本发明提供的PFSMC，可有效水解大豆胶体中的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺，从而在工业生产上实现脱胶的目的。与现有用于脱胶的磷脂酶C相比，本发明提供的PFSMC，在更广泛的pH区域具有较高的酶活，且有更广泛的pH耐受区域。另外本发明提供的磷脂酶PFSMC，对锌离子敏感，而现有磷脂酶C需要添加锌离子才能发挥酶活，因此PFSMC可以与其他不需要锌离子的磷脂酶共同脱胶，填补了商品酶在这一功能上的空白。

实施例4、融合磷脂酶C(PF-PI-PLC)的构建和表达

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成编码PI-PLC(如SEQ ID NO:3所示)(特异性水解磷脂酰肌醇(PI)的磷脂酶C)的序列(如SEQ ID NO:4所示)，使用连接序列(如SEQ ID NO:5所示)将编码PI-PLC的序列与编码PFSMC的序列连接，获得PF-PI序列(如SEQ ID NO:6所示，其编码如SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的多肽)。

将获得的PF-PI序列克隆到表达载体pET24a(+)上(参考分子克隆实验指南第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)。

将带有融合蛋白核苷酸序列的pET24a(+)转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达(参考分子克隆实验指南第三版，科学出版社2002[美]J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著，黄培堂等译)。具体过程如下：

挑取阳性转化子到LB培养基中，于37℃进行过夜种子培养，按1%的接种量，将种子培养液接种到表达培养基中，于37℃，220rpm培养至OD600=0.6-0.8。

每100毫升上清中加入1毫升Ni-NTA树脂冰浴振荡30分钟。将细胞破碎上清和Ni树脂转移至层析柱中，待细胞破碎上清全部通过Ni树脂后，先用20个柱体积的洗脱缓冲液1清洗，再用20个柱体积的洗脱缓冲液2清洗，最后用5个柱体积的洗脱缓冲液3清洗，并收集洗脱液，将洗脱液于4℃透析过夜，凝胶电泳检测，结果如图8所示，根据图8结果，所得溶液为纯化好的目的蛋白溶液，命名为PF-PI-PLC。

采用与上述相同的方法，将PI-PLC序列克隆到表达载体pET24a(+)上，并诱导表达，纯化，制备获得PI-PLC蛋白溶液。

实施例5、PF-PI-PLC底物偏好性

向10ml混合磷脂底物(15.75g/L大豆粉末磷脂(为磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺磷脂酸等的混合物)，5mM CaCl₂)中加入0.5mlPF-PI-PLC(1.4mg/ml)，向另一管10ml磷脂混合底物加入0.5ml水作为对照，于35℃，200rpm反应18小时，加入10ml氯仿，震荡混匀，10,000g离心10分钟，溶液分为上下两层。

取1ml下层氯仿相，超净台中吹干，重悬于3ml NMR分析缓冲液中，进行31P-NMR分析。

添加水的磷脂底物氯仿相NMR结果见图9-1，可见，磷脂底物主要含有三种磷脂磷脂酰乙醇胺(PE)，磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰胆碱(PC)。添加PF-PI-PLC的磷脂底物氯仿相NMR结果见图9-2，可见经过PF-PI-PLC的水解作用，PE，PI和PC基本全部被水解。

根据上述结果，PF-PI-PLC可作用于磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺，起到有效的酶解效果。在实际生产中，只使用PF-PI-PLC便可以有效的水解三种主要磷脂，生成甘二酯和水溶性的磷酸乙醇胺、磷酸肌醇和磷酸胆碱，从而实现脱胶。

实施例6、PF-PI-PLC的部分酶学性质

在200μL的反应体系中，含有大豆粉末磷脂0.5%(w/v)，缓冲体系(通常为25mM Tris-Cl，pH7.5)，5mM CaCl₂，加入磷脂酶PF-PI-PLC20μl(2.17μM)或两亲本酶的混合液20μl(PFSMC：2.17μM；PI-PLC:2.17μM)，反应进行30min，加入200μL的氯仿振荡混匀30s，进行12,000rpm离心1min，取80μL上清加入到磷脂酶反应体系中，终体积为200μL，该体系还含有50mM Tris-Cl(pH9.0)，10mM MgCl₂，CIAP10U/μL。反应在37℃水浴中进行30min。各加入740μL的去离子水，再加入20μL的10%(w/v)的抗坏血酸，及40μL的2.5%(w/v)钼酸铵溶液。37℃显色10min。取显色后的溶液进行吸光度700nm检测。结合磷钼蓝检测的标准曲线，对数据进行分析回归，乘上稀释倍数后，即得活力值。

将PFSMC和PI-PLC溶液混合，并调节PFSMC和PI-PLC的浓度分别为2.17μM，获得亲本酶混合液，记为PF+PI。

6.1最适温度

分别在10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃，75℃，80℃下测定(2.17μM)PF-PI-PLC的活力以及PF+PI混合液(PFSMC:2.17μM;PI-PLC:2.17μM)的活力。

以反应温度为横轴，不同温度下的酶活为纵轴，将各点使用光滑曲线依次连接，分别获得PF-PI-PLC和PF+PI混合液的反应温度-酶活曲线，结果如图10所示。

根据图10结果，PF-PI-PLC和两亲本酶混合液(PF+PI混合液)呈现出不同的温度偏好性，60℃为PF-PI-PLC的最适温度，且酶活远高于PF+PI混合液的酶活。

6.2、最适pH

分别在pH为4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0，11.0的缓冲液中测定PF-PI-PLC及PF+PI混合液的酶活，其中，所用不同pH的缓冲液配方如下：

②pH7.0-pH8.5的缓冲液：使用500mM的Tris-HCl及浓盐酸和NaOH调配。

以pH为横轴，不同pH下的酶活为纵轴，将各点使用光滑曲线依次连接，分别获得PF-PI-PLC和PF+PI混合液的pH-酶活曲线，结果如图11所示。

根据图11结果，在中性pH范围内(pH6-pH8)，PF-PI-PLC表现出比PF+PI混合液更高的酶活。PF-PI-PLC和PF+PI混合液的最适pH均为pH6。

6.3、最适温度和pH条件下的酶活测定

将PF-PI-PLC在其最适温度和pH条件下进行酶活测定(60℃，pH6)，将PF+PI混合液在其最适温度和pH条件下进行酶活测定(50℃，pH6)，结果如图12所示。

根据图12的结果，PF-PI-PLC的酶活比PF+PI混合液的酶活高出20%。

在工业生产中，利用磷脂酶C进行酶法脱胶的应用以较广泛。但以往的研究和应用中仅仅都是将两种PLC单独表达纯化后使用，本发明中将PFSMC和PI-PLC成功的在大肠杆菌中融合表达，使得发酵生产两种磷脂酶C的成本大大缩减。同时本发明中的融合蛋白和两亲本酶的混合液在各自的最适温度和pH条件下，进行酶活的比较，融合蛋白酶活提高20%，从而为实际脱胶生产中融合磷脂酶C的应用打下良好的基础。

实施例7、Purifine的部分酶学性质

在200μL的反应体系中，含有大豆粉末磷脂0.5%(w/v)，缓冲体系(25mMTris-Cl，pH7.5)，5mM CaCl₂，加入磷脂酶Purifine20μl(3μg/ml)，反应进行30min，加入200μL的氯仿振荡混匀30s，进行12,000rpm离心1min，取80μL上清加入到磷脂酶反应体系中，终体积为200μL，该体系还含有50mM Tris-Cl(pH9.0)，10mM MgCl₂，CIAP10U/μL。反应在37℃水浴中进行30min。各加入740μL的去离子水，再加入20μL的10%(w/v)的抗坏血酸，及40μL的2.5%(w/v)钼酸铵溶液。37℃显色10min。取显色后的溶液进行吸光度700nm检测。结合磷钼蓝检测的标准曲线，对数据进行分析回归，乘上稀释倍数后，即得活力值。

7.1、最适pH

分别在pH为4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0，11.0的缓冲体系反应，以测定磷脂酶Purifine活力。

以最高酶活为相对酶活，计算其他pH下纯酶的相对活力。以pH为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图13所示。

所用不同pH的缓冲液配方如下：

②pH7.0-pH8.5的缓冲液：使用500mM的Tris-HCl及浓盐酸和NaOH调配。

根据图13结果，pH6为该酶的最适pH，只在pH5-6的区域内，该酶表现出大于80%的酶活。

7.2、pH稳定性

将20μl(3μg/ml)酶液分别加入20μl pH4.0，5.0，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，10.0，11.0的缓冲液体系，其中，pH4.0-6.0的缓冲液为500mM醋酸钠缓冲液，pH7.0-8.5的缓冲液为500mM Tris-HCl缓冲液，pH9.0-11.0的缓冲液为500mM甘氨酸缓冲液。

于4℃保温18h后测定磷脂酶Purifine活力，以不经保温处理所测的磷脂酶PFSMC酶活为相对酶活100%，计算经上述处理后的Purifine的相对酶活，以pH为横轴，相对酶活为纵轴，并将各点使用光滑曲线依次连接，结果如图14所示。

根据图14结果，该酶不具有在很广的pH区域较强的稳定性，只在pH7-8.5的区域都保留了80%以上的酶活。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims

1.一种磷脂酶C，其特征在于，所述磷脂酶C是选自：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示的多肽，或

(2)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或7所示的多肽的保守性变体。

2.如权利要求1所述的磷脂酶C，其特征在于，(2)中，所述的保守性变体是：将SEQ ID NO:1或7氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO:1或7所示的氨基酸序列相同功能的多肽变体。

3.如权利要求1所述的磷脂酶C，其特征在于，所述磷脂酶C由核苷酸序列如SEQ ID NO:2或6所示的多核苷酸编码。

4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的磷脂酶C；优选的，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一种包含权利要求4所述的多核苷酸的重组表达载体。

6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的重组表达载体。

7.一种生产权利要求1-3任一所述磷脂酶C的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求6所述的重组菌株以表达所述磷脂酶C，收获磷脂酶C；优选的，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩或纯化。

8.一种生产包含权利要求1-3任一所述的磷脂酶C的酶液的方法，其特征在于，所述方法包括：培养权利要求6所述的重组菌株以表达所述磷脂酶C，分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。

9.一种磷脂酶C酶液，其特征在于，所述磷脂酶C酶液通过权利要求8所述方法制备。

10.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1-3任一所述的磷脂酶C或权利要求9所述的酶液，以及食品学或工业上可接受的载体。