CN104694394A - 一种枝孢霉表达的磷脂酶c及其产生菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的枝孢霉菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7508。利用本发明所提供菌株和制备方法制备所得的磷脂酶C可以用于油脂精炼，脱胶效果良好，可以广泛应用于油脂精炼、添加剂、医药等领域。

Description

一种枝孢霉表达的磷脂酶C及其产生菌株
技术领域
本发明属于酶脱胶领域，具体说是一种枝孢霉表达的磷脂酶C及其产生菌株。
背景技术
磷脂酶（Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，水解产物为各种磷脂酸和氨基醇，如胆胺、胆碱、丝氨酸、乙醇胺等。根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A(Phospholipase A，PLA)、磷脂酶B(Phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)和磷脂酶D（PhospholipaseD，PLD)，如图1所示。
磷脂酶可广泛应用于油脂精练、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药等方面。脱胶是植物油精炼过程中的一个重要环节，对提高油的品质至关重要，脱胶主要是脱除磷脂，脱胶若不彻底，会影响油品的深加工和油品的稳定性，减低油品货架期。酶法脱胶可以克服传统脱胶方法脱胶脱除率低，同时中性油损失高等的问题。而在酶法脱胶工艺中，现有文献多报道磷脂酶PLA用于植物油脱胶。磷脂酶PLA(包括PLA1和PLA2)，脱胶后可产生极性溶血磷脂和极性脂肪酸，PLA脱胶工艺仅仅损失油中总的磷脂分子，来减少精炼损耗。而磷脂酶PLC酶通过选择性水解磷酸酯官能团与磷脂反应，生成甘油二酯（DAG）和磷脂酸基团，甘油二酯不需要被除去，所以PLC脱胶工艺通过保留原始的磷脂分子而仅去除磷酸酯官能团来减少精炼损耗，不存在PLA脱胶工艺中产生的能提高脱胶油酸价的极性脂肪酸的问题，PLC用于脱胶优势明显好于PLA。
磷脂酶C（PLC）可来源于动物和微生物。文献报道磷脂酶C细菌来源的有：粘质沙雷氏菌武汉株(Serratia marcescens wuhan strain)、假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridum perfringens)、诺氏梭状芽孢杆菌(Closrtidium novyi)、双酶梭状芽孢杆菌(clostridium bifermantans)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、类鼻疽伯克氏菌（burkholderia pseudomallei）。磷脂酶C霉菌来源的有：烟曲霉(Aspergillusfumigates)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、自佐氏曲霉菌(Aspergillus saitoi)。磷脂酶C酵母来源的有白色念珠菌(canidia Albicans)。JP50-1017183报道斯谷假单胞菌（Pseudomonas schuylkilliensis）可以产磷脂酶C。JP49-55893报道来源于streptomyces hachijyoensis的磷脂酶C。
在以上所报道的磷脂酶C产生菌株中，除了鼠李糖乳杆菌、米曲霉和黑曲霉等少部分菌株外大都均存在一定的致病性，因而制约了其的工业化开发。另外，虽然以上文献公开了这些菌能够产生胞外磷脂酶C，但是除了蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）等少数几个细菌来源的PLC外，大部分并没有进一步公开这些磷脂酶的性质，更少有PLC产量、制备方法和酶学性质的报道。其中，真核微生物特别是丝状真菌来源的胞外磷脂酶C的报道则更少，报道的内容也更简单。在以上这些关于胞外磷脂酶C的报道中，大部分的胞外PLC都只能作用于相对单一的底物，如有的作用于磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺，有的仅能作用于磷脂酰肌醇等。鲜见有能够同时高效地作用于多种底物特别是大豆来源含有多种磷脂的复杂体系的胞外分泌型的PLC。众所周知，植物油毛油中的磷脂成分非常复杂，以大豆油的毛油为例，其中的磷脂成分有磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酰胆碱（LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）、溶血磷脂酸（LPA）、磷脂酰丝氨酸（PS）、甘油磷脂酰胆碱（PG）、双磷脂酰甘油（DPG）以及鞘磷脂（SM）等（Glonek T.JAOCS.1998,75(5):569-573）。因此在PLC的酶法脱胶时，如果加入的PLC酶能够同时对多种磷脂成分有作用，必然能够大大提高其脱胶效率。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种分离的表达磷脂酶C的菌株。
本发明提供的分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD00050，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7508。
本发明还有一个目的在于，提供一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
在本发明的一个优选实施例中，所述培养为在15-35℃、100-300rpm，培养48-144h。
在本发明的一个优选实施例中，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C。
本发明提供的磷脂酶C为用前述方法制得。
本发明提供的磷脂酶C能催化水解大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂成分。
本发明还有一个目的在于，提供一种磷脂酶C酶液。
本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。
本发明还有一个目的在于，提供一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
本发明的产磷脂酶C的真菌——枝孢霉（Cladosporium sp.），WBRD00050及使用该菌株获得的酶液和磷脂酶C可以用于油脂精炼，该菌株能够生产出能够水解去除大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂成分的磷脂酶C，该磷脂酶C作用范围广，脱胶效果良好。由于枝孢霉（Cladosporium sp.）WBRD00050是传统食品中分离的微生物，因而较绝大部分可产胞外磷脂酶C的微生物更具安全性，因此，可以直接用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样枝孢霉来源的磷脂酶C可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。
附图说明
图1是磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D的酶切作用示意图。
图2是枝孢霉磷脂酶C处理磷脂酰胆碱后的TLC检测结果图，其中，泳道1为1,2二油酸甘油酯；泳道2为1,3二油酸甘油酯；泳道3为三油酸甘油酯；泳道4为磷脂酰胆碱(PC)，泳道5为枝孢霉PLC水解磷脂酰胆碱的样品。
图3是大豆混合磷脂的31P-NMR分析图。
图4是枝孢霉磷脂酶C催化水解大豆混合磷脂的31P-NMR分析图。
图5是枝孢霉磷脂酶C的最适作用温度曲线示意图。
图6是枝孢霉磷脂酶C最适作用pH值曲线示意图。
图7是枝孢霉磷脂酶C的温度稳定性曲线示意图。
图8是枝孢霉磷脂酶C的pH稳定性曲线示意图。
图9显示不同金属离子、EDTA等对枝孢霉磷脂酶C活性的影响结果。
本发明的菌株WBRD00050已于2013年4月22日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）”(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号是CGMCC No.7508，分类命名为：枝孢霉（Cladosporium sp.）。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
在本发明中，如果没有特别的说明，百分数（％）或者份都指相对于组合物的重量百分数或者重量份。
在本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的含量之和为100％。
在本发明中，如果没有相反的说明，组合物中各组分的份数之和可以为100重量份。
在本发明中，除非有其他说明，数值范围“a-b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“0-5”表示本文中已经全部列出了“0-5”之间的全部实数，“0-5”只是这些数值组合的缩略表示。
在本发明中，除非有其他说明，整数数值范围“a-b”表示a到b之间的任意整数组合的缩略表示，其中a和b都是整数。例如整数数值范围“1-N”表示1、2……N，其中N是整数。
在本发明中，除非有其他说明，“其组合”表示所述各元件的多组分混合物，例如两种、三种、四种以及直到最大可能的多组分混合物。
如果没有特别指出，本说明书所用的术语“一种”指“至少一种”。
如果没有特别指出，本发明所述的百分数（包括重量百分数）的基准都是所述组合物的总重量。
本文所公开的“范围”以下限和上限的形式。可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。给定范围是通过选定一个下限和一个上限进行限定的。选定的下限和上限限定了特别范围的边界。所有可以这种方式进行限定的范围是包含和可组合的，即任何下限可以与任何上限组合形成一个范围。例如，针对特定参数列出了60－120和80－110的范围，理解为60－110和80－120的范围也是预料到的。此外，如果列出的最小范围值1和2，和如果列出了最大范围值3，4和5，则下面的范围可全部预料到：1－3、1－4、1－5、2－3、2－4、和2－5。
在本文中，除非另有说明，各组分的比例或者重量都指干重。
在本文中，除非另有说明，各反应都在常温常压下进行。
在本文中，除非另有说明，各个反应步骤可以顺序进行，也可以不按顺序进行。例如，各个反应步骤之间可以包含其他步骤，而且反应步骤之间也可以调换顺序。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
本发明的发明人从藏酥油样品中筛选获得了一株枝孢霉（Cladosporium sp.），WBRD00050。经检测，该菌株能够表达并胞外分泌能够水解去除大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂成分的磷脂酶C，该磷脂酶C作用范围广，脱胶效果良好。由于枝孢霉WBRD00050菌株是传统食品中分离的微生物，因而较绝大部分可产胞外磷脂酶C的微生物更具安全性，也更具开发潜力，因此，可以用于食品工业，安全可靠，例如可以安全方便的用于油脂精炼。同样，本发明提供的枝孢霉来源的磷脂酶C，还可以安全的用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业等方面。例如，制备磷脂酶改性磷脂，使磷脂在营养价值、乳化性能以及色、味等方面大为改进和提高，从而大大拓展了磷脂在食品、保健品工业中的应用范围和使用价值；在食品添加剂方面，本发明的磷脂酶C可以用于烘焙，可使面团形成胶状复合体，可以减少淀粉回生，调节和改善面团的稳定性，因此在烘焙行业应用也非常广泛；在医药研究方面，将本发明提供的磷脂酶C作为疫苗，可用于防治各种病原菌的感染，用本发明提供的磷脂酶C开发抗血小板聚集类药物，可治疗或预防心脑血管疾病等，本发明提供的磷脂酶C还可被应用于抗肿瘤药物的研制等。
本发明提供了一种分离的表达磷脂酶C的菌株，命名为WBRD00050，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7508。
本发明提供了一种生产磷脂酶C的方法。
本发明提供的生产磷脂酶C的方法包括：培养前述的菌株CGMCC No.7508以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
菌株CGMCC No.7508的培养方法可采用枝孢霉的常规培养方法，例如使用PDA培养基进行培养。
菌株CGMCC No.7508的培养可以在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述菌株CGMCC No.7508的培养为在适宜所述菌株胞外分泌磷脂酶C的条件下培养所述菌株，。
菌株CGMCC No.7508的培养条件可以但不限于为：于5-40℃、100-400rpm，培养时间为48-144h，优选的，培养温度为15-35℃、摇床转速为100-300rpm，培养周期为48-144h。
菌株CGMCC No.7508可将生产的磷脂酶C分泌到胞外的培养基中。在本发明的一个优选实施例中，所述收获磷脂酶C包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液。
实施方式之一中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。本发明的酶液可以直接使用。可以采用酶工程领域已知的各种方法从本发明的酶液中进一步分离和纯化磷脂酶C，由此获得本发明的磷脂酶C。
本发明还提供了一种磷脂酶C，本发明提供的磷脂酶C为采用前述方法制得。
本发明提供了一种磷脂酶C，本发明提供的磷脂酶C能够水解去除大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂成分，该磷脂酶C作用范围广。
本发明还提供了一种磷脂酶C酶液，本发明提供的磷脂酶C酶液为用前述方法制得。在本发明的一个优选实施例中，该酶液为含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液。在本发明的另一个优选实施例中，对本发明的磷脂酶C酶液进行了浓缩，这样可以提高磷脂酶C酶液的磷脂酶C活性。
本发明还提供了一种脱胶的方法。
本发明提供的脱胶的方法为使用前述的磷脂酶C或磷脂酶C酶液进行脱胶，枝孢霉WBRD00050菌株是传统食品中分离的微生物，因而较绝大部分可产胞外磷脂酶C的微生物更具安全性，因此，本发明的磷脂酶C或磷脂酶C酶液可用于油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还提供了前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂，特别是可食用油脂的脱胶。
本发明还有一个目的在于，提供前述的菌株或磷脂酶C或磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
在本发明的下述实施例中，菌株鉴定方法如下：
18S rDNA鉴定：参考张海涛等.几丁质酶产生菌筛选鉴定及产酶性能研究.中国生物工程杂志.2010,30(8):82-87.
生理生化鉴定参考：
魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科学技术出版社,1979.
戴芳澜.真菌的形态和分类[M].科学出版社,1987.
中国真菌志:枝孢属黑星孢属梨孢属[M].科学出版社,2003.
在本发明的下述实施例中，枝孢霉磷脂酶C的酶活测定方法，采用pNPPC法，具体参考Michael Birch,et.al.Evidence of Multiple Extracellular PhospholipaseActivities of Aspergillus fumigates[J].INFECTION AND IMMUNITY,Mar.1996,p.751–755。
在本发明的下述实施例中，使用的毛油为大豆粗榨毛油，参考刘玉兰.油脂制取与加工工艺学[M].科学出版，2003，496-499.中的方法制备，所制备的毛油中：
磷含量检测方法：参考文献GB/T5537。
在本发明的下述实施例中，使用的培养基如下：
筛选平板：
甲成份：硫酸铵0.1％，酵母提取粉0.5%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.1％，KC10.5％，七水合硫酸镁0.05％，七水合硫酸锌0.05%，无水氯化钙0.05%，琼脂2.0%，pH6.5，115℃灭菌25min。
乙成份:6.7%的大豆混合磷脂水溶液，调节pH为6.5，115℃，25min灭菌。灭菌后，按照甲成份110ml和乙成份90ml的比例进行混合并制备平板。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基制备方法如下：
取新鲜马铃薯去皮后称取200g，切成小块，而后加入约1L的去离子水，煮烂后，过滤得到清液。加入20g的葡萄糖和15-20g的琼脂粉，补水至体积1000ml后，于121℃灭菌20min，即可制备得到PDA培养基。
察氏培养基：
硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
麦芽汁培养基：
麦芽汁粉20g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
查氏酵母膏琼脂培养基:
硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、酵母膏5g、七水合硫酸镁0.5g、氯化钾0.5g、七水合硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、琼脂20g、蒸馏水1000ml。
枝孢霉产磷脂酶C的发酵培养基组成（单位wt%）：
蔗糖1.0，蛋白胨0.5，酵母浸出粉0.5，玉米浆膏0.5，K2HPO40.15，Na2HPO40.25，MgSO4·7H2O0.1，CaCl20.1，ZnSO4·7H2O0.2，硫酸铵0.1，吐温800.2，磷脂0.5，玉米粉1.0，pH7.0；
实施例1：枝孢霉（Cladosporium sp.）WBRD00050的分离及鉴定
取新鲜藏酥油样品，去除约1cm厚度表层后，切取约10g左右的藏酥油样品置于100mL含1.0%混合磷脂(购自北京美亚斯磷脂技术有限公司)的无菌水溶液中。充分振荡30min后，将溶液分别稀释101、102、103、104倍，并将各个稀释度的样品涂布于筛选平板上，于28℃培养。
每24h观察筛选平板上是否有菌落出现。培养96h后，挑取浑浊圈较大较明显的微生物进行进一步的划线分离以获得纯种菌株。用筛选平板对这些纯种菌株进行胞外磷脂酶检测，结果发现有一株浑浊圈十分显著的菌株命名为WBRD00050。
将菌株WBRD00050分别在察氏培养基、麦芽汁培养基、查氏酵母膏琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基上划线接种，25℃培养96h后，观察检测菌株的生态学形态和形态学特征。
结果显示，WBRD00050在察氏培养基上25℃温度下生长速度极慢，培养7天时菌落直径为10mm，菌丝呈绒状、暗黄绿色、质地致密、背面呈黑绿色；该菌在麦芽汁培养基上25℃温度下生长7天时达菌落直径可达30mm，菌丝厚绒状，灰色、质地致密、背面墨黑色；在查氏酵母膏琼脂培养基上25℃温度下生长7天时的菌落直径约20mm，菌丝绒状，形成同心环纹，中间橄榄色，外围暗黄绿色，质地致密，背面黄绿至褐色；该菌在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上25℃温度下培养7天时的菌落直径约15mm，菌丝绒状或絮状，黄绿色，质地致密，背面绿黑色。
在显微镜下观察，分生孢子梗单生、丛生、直立或曲屈状，偶有分枝，具隔膜；枝孢0-3个，隔膜，平；分生孢子椭圆形近球形，孢脐明显，褐色，顶生。
根据以上结果，筛选获得的WBRD00050与枝孢霉(Cladosporium)属菌最相似。
经过对该菌的18S rDNA测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示，进行比对后发现该菌与Cladosporium sp.CBS280.49（GENBANK号EU167574.1）,Cladosporiumcladosporioides（GENBANK号EU375523.1），Cladosporium bruhnei（GENBANK号AY251096.2），Cladosporium uredinicola（GENBANK号AY251097.2）以及Cladosporium cellare（GENBANK号NG016540.1）等的同源性均超过99%。
该菌株已于2013年4月22日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（CGMCC）保藏，保藏号是CGMCC No.7508，分类命名为枝孢霉（Cladosporiumsp.）。
实施例2：枝孢霉胞外磷脂酶C的制备和鉴定
（1）枝孢霉胞外磷脂酶C的发酵
将枝孢霉WBRD00050接种至PDA斜面培养基，于28℃培养120h，获得枝孢霉WBRD00050斜面。取2支枝孢霉WBRD00050斜面各加入10ml的无菌水，充分洗涤获得孢子悬浮液，合并所有的孢子悬浮液。以1ml/瓶的接种量将孢子悬浮液接种至枝孢霉发酵培养基，于28℃、200rpm，培养110h。
取枝孢霉WBRD00050发酵培养液于12000g离心10min，收集获得离心清液约400ml，检测离心清液的磷脂酶C酶活，结果显示离心清液的磷脂酶C的酶活约为0.042u/ml。
（2）枝孢霉磷脂酶C粗酶液的浓缩
按厂商提供的方法，采用10kDa的膜(Omega，美国PALL公司)对离心清液进行超滤浓缩，获得浓缩酶液约40ml。检测浓缩后的枝孢霉磷脂酶C酶活，结果显示，浓缩后的枝孢霉芽孢杆菌磷脂酶C酶活约为0.34u/ml。
（3）枝孢霉WBRD00050胞外磷脂酶C的鉴定
用枝孢霉WBRD00050所产的胞外磷脂酶水解磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC），酶液用量0.5ml，pH值8.0的Tris-HCL缓冲液2.0ml，2%磷脂酰胆碱2.5ml（购自阿拉丁试剂有限公司,纯度超过98%），150rpm、37℃水浴振荡反应24小时。反应结束后，取样1ml，等体积加入正己烷萃取，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取出上层有机相部分，加入至一新管中。此操作进行两次，收集两次的正己烷萃取液，开盖，置于通风橱中将有机相挥发完全。而后每管中加15ul异丙醇，充份溶解。取5ul点薄层板。TLC检测结果如图2所示，结果显示水解产物中出现大量甘油二酯，由此判定该酶为磷脂酶C。
实施例3：枝孢霉磷脂酶C催化水解大豆混合磷脂
配制2%的大豆混合磷脂（购自北京美亚斯磷脂技术有限公司，总磷脂含量不低于95%）的水溶液，分装两管，每管4.45ml并标记为甲管和乙管，其中甲管为对照样，乙管为酶作用样。
分别往甲乙两管中加入0.05ml的250mM的CoCl2水溶液，混合均匀。往甲管中加入0.5ml的蒸馏水，往乙管中加入0.5ml的实施例2所制备的磷脂酶C浓缩酶液。充分混匀后于40℃水浴反应24h。反应结束后，分别加入等体积的氯仿进行萃取，离心，取甲乙两管的下层有机相各约3ml置于通风橱中进行风干，而后用31P-NMR的方法（Glonek T.31P Nuclear Magnetic Resonance Phospholipid Analysis ofAnionic-Enriched Lecithins.JAOCS.1998,75(5):569-573）来检测其中的磷脂组成情况，混合磷脂对照样结果见图3，枝孢霉磷脂酶C的水解样品结果见图4。
结果显示，与对照样品相比，经过磷脂酶C催化后，大豆混合磷脂中几乎所有的磷脂均被水解去除。因此，本发明所提供的磷脂酶C是一种对多种磷脂底物都能起作用的磷脂酶C。
实施例4：枝孢霉WBRD00050所产胞外磷脂酶C的部分酶学性质
（1）枝孢霉胞外磷脂酶C的最适作用温度
分别在0℃、10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃水浴温度下测定实施例2浓缩制备所得的枝孢霉磷脂酶C的酶活。以最高PLC酶活的温度点的PLC酶活作为100%酶活，其它温度点的PLC酶活除以该最高酶活，从而得到该温度点的相对酶活，以相对酶活为纵坐标，温度点为横坐标，以平滑曲线依次连接各温度点的相对酶活，结果见图5。
图5结果显示，WBRD00050发酵粗酶液PLC酶活的最适反应温度为45℃。在40℃和50℃的相对酶活都高于80%。
（2）枝孢霉胞外磷脂酶C的最适pH值
配制0.1M的pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的乙酸-乙酸钠缓冲体系；配制0.1M的pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的Tris-HCl缓冲体系；配制0.1M浓度的pH值为9.5和10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲体系；配制0.1M的pH11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲体系。
分别在pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和11.0的300ul缓冲体系中，加入5ul的实施例2制备的浓缩酶液，于40℃水浴条件下进行PLC酶活的检测。
以最高PLC酶活的pH点的PLC酶活作为100%，其它pH的PLC酶活除以该最高酶活，从而得到该pH的相对酶活，以相对酶活为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对酶活，结果见图6。
图6结果显示，WBRD00050磷脂酶C在pH6.5反应时酶活最高。
（3）枝孢霉磷脂酶C的温度稳定性
将酶液取500ul分装成小份，测定起始酶活，分别放置于4℃、25℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃的水浴锅中保温，于第70min和第140min时取样，检测酶活，以起始的PLC活力为100%，其它温度点的PLC酶活除以该酶活从而得到其相对酶活值，以相对酶活为纵坐标，温度为横坐标，以平滑曲线连接各温度点的相对酶活，结果见图7。
图7结果显示WBRD0005001160的酶液PLC活性在4-40℃水浴中静置140min后，PLC酶活均比较稳定，几乎没有变化。枝孢霉磷脂酶C的酶液5℃水浴中静置140min后仍能保留近70%的活力，而酶液在50℃水浴中静置140min后，酶活力则迅速下降，仅能保留不到20%的活力，在60℃的环境下70min后则几乎失去所有的活力。
（4）枝孢霉磷脂酶C在不同pH值环境中的稳定性
配制0.1M的pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的乙酸-乙酸钠缓冲液；配制0.1M的pH值为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的Tris-HCl缓冲液；配制0.1M浓度的pH值为9.5和10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液；配制0.1M的pH11.0的磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液。
将实施例2中所制备的磷脂酶C浓缩酶液与3倍体积的0.1M浓度的上述不同pH值的缓冲液进行混合后，置于4℃的环境中放置2h后，测定酶活。以实施例2的酶活的四分之一值为100%，计算各个pH值时的酶活相对值，以相对酶活值为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对酶活，结果见图8。
图8的结果显示，本发明制备所得的PLC在pH4.0-10.0的范围内均比较稳定，其在pH11.0的环境下放置两个小时后酶活仍高于80%。
（5）多种金属离子、柠檬酸盐及EDTA对枝孢霉磷脂酶C活性的影响
分别配制250mM的各金属离子（钴离子、锰离子、锌离子、镁离子、钙离子、铜离子、镍离子、铁离子、铵离子、钠离子、钾离子）母液，配制250mM的柠檬酸钠、EDTA母液。将上述母液分别按照5.0mM和10.0mM的量加入至反应体系中，测定酶活，以不添加任何离子及EDTA的样品（作为对照）所测的酶活值为100%，计算其它添加物的样品相对酶活力值，结果见图9。
图9的结果显示5.0mM和10.0mM的锰离子、钴离子、钙离子以及5.0mM的镁离子可以明显增加该酶的活性。但是5.0mM和10.0mM两个浓度的锌离子、铜离子、镍离子、铁离子、柠檬酸钠、EDTA等均会明显抑制该酶的活性。
实施例5：超纯水脱胶
毛油中的含磷量321ppm。
将200g大豆毛油在搅拌下加热至70-80℃，添加6g超纯水，将油水混合物剪切1分钟，在70-75℃温度下，在磁力搅拌器上160rpm搅拌30分钟，然后于1200rpm离心10分钟该水处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为110.1ppm。
实施例6：商品PLC（来源于DSM）酶法脱胶
将200g大豆毛油在搅拌下加热至70-80℃，添加0.16g的45%柠檬酸溶液，将混合物剪切1分钟，在70-75℃温度下，用磁力搅拌器搅拌30分钟，冷却该油，直至油温为55-65℃，然后添加0.5g8%氢氧化钠溶液，将混合物剪切混合30秒，
将温度维持在50-55℃，添加超纯水5.30g和19个单位酶活的PLC酶液，然后混合剪切1分钟，在温度为50-55℃下，搅拌反应5小时，然后离心该PLC处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为11.5ppm。
实施例7：枝孢霉WBRD00050磷脂酶C的酶法脱胶
用实施例2浓缩制备所得的枝孢霉磷脂酶C进行酶法脱胶，将200g大豆毛油在搅拌下加热至油温为45-50℃，将温度维持在45-50℃，添加3.2个单位酶活的浓缩磷脂酶C酶液，然后混合剪切1分钟，在温度为45-50℃，下，搅拌反应5小时，然后离心该酶处理的油，收集分离的油和湿胶，脱胶油中的残留磷为18.4ppm。
实施例5-7的结果显示，200g植物油中添加3.2个单位的枝孢霉WBRD00050磷脂酶C，最后脱胶植物油中的无机磷含量为18.4ppm，说明枝孢霉来源的粗酶PLC具有脱胶效果，而商品PLC(DSM-PLC)在200g植物油中添加19个单位的酶，最后植物油中的无机磷含量为11.5ppm，两者相当，但均明显强于水的脱胶效果（无机磷含量为110.1ppm）。

Claims (10)

1.一种分离的表达磷脂酶C的菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.7508。
2.一种生产磷脂酶C的方法，包括：培养权利要求1所述的菌株以使所述菌株或细胞生产磷脂酶C，收获磷脂酶C。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在适宜所述菌株生长和/或适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，优选的，所述培养为在适宜所述菌株生长的条件下培养所述菌株，以增加所述菌株数量，然后再于适宜所述菌株表达磷脂酶C的条件下培养所述菌株，以表达所述磷脂酶C。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养为在15-35℃、100-350rpm培养所述菌株48-144h。
5.如权利要求2-4中任一项所述的方法，所述收获包括分离和收集含有分泌或释放到胞外的磷脂酶C的培养物上清液，由此获得含有磷脂酶C的磷脂酶C酶液；优选地，所述方法还包括对所述磷脂酶C酶液进行浓缩。
6.一种磷脂酶C，用权利要求2-5中任一项所述方法制得。
7.一种磷脂酶C酶液，用权利要求5所述方法制得。
8.一种脱胶的方法，使用权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液进行脱胶，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
9.权利要求1所述的菌株或权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液用于脱胶的用途，优选的，所述脱胶为油脂脱胶。
10.权利要求1所述的菌株或权利要求6的磷脂酶C或权利要求7的磷脂酶C酶液用于磷脂改性、食品添加剂、饲料改良剂和医药工业的用途。
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