CN101410513A

CN101410513A - 新型磷脂酶c

Info

Publication number: CN101410513A
Application number: CNA2006800537852A
Authority: CN
Inventors: 长崎咏子; 深泽彻也; 小野泰典
Original assignee: Mitsubishi Chemical Foods Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2009-04-15
Anticipated expiration: 2026-03-10
Also published as: EP1995313A1; EP1995313B1; EP2368978A1; WO2007105264A1; EP2368978B1; EP1995313A4; US20110293786A1; US20090053768A1; CN101410513B; US7993874B2

Abstract

本发明提供一种磷脂酶C，该磷脂酶C具有于酸性pH区域或中性pH区域附近有效水解各种磷脂的能力，在柠檬酸缓冲液中也具有活性，并且具有一定程度的热稳定性，还具有不会水解不含脂质部分的磷酸酯的性质。此磷脂酶C于酸性至中性的pH区域中表现出活性，且实质上不水解除磷脂以外的磷酸酯。

Description

新型磷脂酶C

技术领域

本发明涉及一种磷脂酶C、可制造该磷脂酶C的丝状菌、自丝状菌培养物中分离出该磷脂酶C的方法、编码该磷脂酶C的DNA，以及该磷脂酶C的制造方法等。具体而言，本发明涉及一种特别适用于食品工业及医药品工业的磷脂酶C，特别是由丝状菌中的米曲霉(Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)所制造的磷脂酶C、生产该磷脂酶C的丝状菌、自丝状菌培养物中分离精制出该磷脂酶C的方法、编码该磷脂酶C的DNA，以及该磷脂酶C的制造方法等。

背景技术

[1]磷脂酶C

先前已知有动物及微生物可制造磷脂酶C。源自动物的酶主要是具有磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol)选择性的磷脂酶C，而源自微生物中的细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的磷脂酶C也是已知的。细菌、放线菌及酵母菌所制造的磷脂酶C，几乎都对磷脂酰肌醇或磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)具有选择性。

已知源自细菌的磷脂酶C例如由下列细菌所制造：Psudomonusschuylkilliensis(例如见于专利文献1：日本特开昭50-1017183号)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Bulkholderia pseudomallei，例如见于非专利文献1：Korbsrisate S等.，Jounal of Clinical Microbiology，1999，Vol.37，3742-3745)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus，例如见于非专利文献2：Tan C.等，Protein Expression and Purification，1997，Vol.10，365-372)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，例如见于非专利文献3：Daugherty S.等，Infection and Immunity，1993，Vol.61，5078-5089)，以及产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridium perfringens，例如见于非专利文献4：Titball R.等，Infection and Immunity，1989，Vol.57，367-376)等等。

已知源自放线菌的磷脂酶C例如是八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijyoensis)(例如见于专利文献2：日本特开昭49-55893号)所制造的磷脂酶C。

源自酵母菌的磷脂酶C已知例如是下列酵母菌所制造的：白色念珠菌(Candida albicans，例如见于非专利文献5：Andaluz E.等，Yeast，2001，Vol.18，711-721)、酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，例如见于非专利文献6：Payne W.等，Molecular and Cellular Biology，1993，Vol.13，4351-4364)。

已知源自霉菌的磷脂酶C有两例。其一来自黑曲霉菌(Aspergillusniger，例如见于专利文献3：日本特开第2000-166543号)，另一来自佐氏曲霉菌(Aspergillus saitoi)(例如见于非专利文献7：MatsuokaS.等，Biotechnology and Applied Biochemistry，1987，Vol.9，401-409)。

[2]卵磷脂

卵磷脂是广泛分布于动物、植物、菌类中的代表性甘油磷脂。所谓的甘油磷脂是指磷酰碱以共价键与1，2-二酰基甘油的3-位结合的化合物，其中碱的部分包括胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇以及甘油等，其组成比例依来源而有所不同。卵磷脂在使用上是归属于甘油磷脂类。

卵磷脂具有表面活性功能、抗氧化功能及生理活性功能等，可应用于食品、饲料、医药品等中。在食品工业中，以蛋黄卵磷脂及大豆卵磷脂等为代表的天然卵磷脂可作为食品添加物使用，其主要是作为乳化剂等以改变食品性质，所以供给量甚多。

[3]卵磷脂的酶处理

现也正在进行使用酶将卵磷脂部分水解，以赋予其新性质的研究。现今所用的酶为磷脂酶类的酶，已知有磷脂酶A、B、C、D等，其中磷脂酶A可选择性水解甘油磷脂的1-或2-位的脂肪酸，磷脂酶B可进行非选择性水解，磷脂酶C可水解出二酰基甘油及磷酰碱，磷脂酶D可分解出磷脂酸及碱。

于食品工业领域中，现在最常使用的是磷脂酶A。虽然卵磷脂难溶于水，但若使用磷脂酶A处理卵磷脂，则其酰基可部分水解而生成水溶性的溶血卵磷脂(lysolecithin)。将溶血卵磷脂用作食品添加物时，所得食品的物性与习知使用卵磷脂所得食品的物性可能不同。

[4]神经鞘氨醇磷脂(sphingophospholipid)

神经鞘氨醇磷脂是由甘油磷脂与磷脂所构成的，代表为神经鞘磷脂(sphingomyelin)，其是胆碱磷酸与神经酰胺(ceramide)的伯醇经磷酸二酯结合的化合物，广泛存在于动物脏器中。母乳中也含有，因此有时也将其添加入婴儿用奶粉中。

若使用磷脂酶C处理神经鞘磷脂，则可使胆碱磷酸脱落而生成神经酰胺。神经酰胺现正广泛应用于化妆品中作为保湿成分，又有报导称异位性皮肤炎是由于神经酰胺不足所造成的。

[5]磷脂酶C在食品中的应用

于水存在下使用磷脂酶C，即可自卵磷脂制造二酰基甘油，如下图所示：

卵磷脂二酰基甘油

上式中R₁及R₂各自表示烷基，R₃表示胆碱、乙醇胺、甘油、肌醇等基团。

于食品原料中引起如上反应，即可提供一种附加有与磷脂酶A本质上不同的特性的商品。

此处所使用的磷脂酶C必须能够水解各种甘油磷脂。例如，大豆卵磷脂中是以磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺为主，其中也含有磷脂酰甘油或磷脂酰肌醇等。另外，源自蛋黄的卵磷脂中主要含有磷脂酰胆碱及磷脂酰乙醇胺。因此，所使用的磷脂酶C较佳可以无区别地水解上述物质。

但，食品中除磷脂以外尚含有大量磷酸酯，如其被水解而使磷酸游离，则会进一步改变该食品的性质，故此作法仍不够好。因此，较佳的选择是不会水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C，例如是对甘油磷酰胆碱等类似于磷脂但不含脂质部分的磷酸酯不具酶活性的磷脂酶C。

就此观点而言，所使用的磷脂酶C较佳是不具有磷酸酶活性的蛋白质，也即对作为磷酸酶基质的对硝基苯基磷酸不具分解活性的磷脂酶C。

另外，于食品工业中为防止食品变质，较佳作法是于中性至弱酸性pH区域进行各种处理，因此，含有磷脂酶等的酶剂以于该pH区域内具有较高活性者为佳。

[6]磷脂酶C在食品工业中的应用

磷脂酶C的用途例如有：改善于面包的冷冻保存生面团烤制时在面包表面产生的老化、缓和梨皮状表皮及改进食用油的纯化步骤等。

于由大豆/菜籽等制造食用油时，由于卵磷脂是造成色泽或口味变差的原因，故必须除去卵磷脂。为达该目的，人们一直在研究如何使用习知的磷脂酶A将卵磷脂部分水解成溶血卵磷脂，而使其变为水溶性后加以除去的方法。

然而，此处也可使用磷脂酶C使卵磷脂成为二酰基甘油，而与三酰基甘油共同成为油的一个成分。将此方法应用于食用油的制造步骤中，即可有效提高产率。

此处所使用的磷脂酶C必须能够水解各种磷脂，例如上述大豆油中所含的各种磷脂，或是棉籽油或菜籽油中所含的各种磷脂。所使用的磷脂酶C较佳可以无区别地水解这些磷脂。

另外，由于制油工业中是于酸性加温条件下除去油以外的杂质，故较佳使用于酸性区域活性较高且具有一定的热稳定性的酶剂。为了使被处理的粗制油成为酸性，有时会使用柠檬酸，故所使用的磷脂酶C较佳是于柠檬酸存在下具有活性及一定的热稳定性。

[7]已知的磷脂酶C的问题

动物、细菌、放线菌或酵母菌所制造的磷脂酶C主要是对磷脂酰肌醇或磷脂酰胆碱具选择性，故不适用于需要分解各种基质的食品工业。另外，有些国家及地区因宗教原因而不能接受动物来源的酶剂，故其于通用性上也有问题。再者，会制造磷脂酶C的细菌几乎都具病原性，故安全上也有问题。

习知源自丝状菌的磷脂酶C能够水解各种磷脂，而先前用于制造磷脂酶C的任何丝状菌于食用酶制造上已有实用效果。源自黑曲霉菌(Aspergillus niger)与佐氏曲霉菌(Aspergillus saitoi)两菌的酶的温度或pH值相关特性极相似，且分子量也相同。两者于酸性侧中均具有较强活性，但于中性附近却完全没有活性。因此，这些酶可以使用于可能在酸性侧使用酶的制油工业中。但是，关于磷脂酶C在柠檬酸中的性质却未有记载，其实际上是否可用于制油工业尚不明确(请见专利文献3及非专利文献7)。另外，磷脂酶C于pH6时活性几乎为0，故一般认为大多在中性附近进行酶反应的食品工业中难以使用上述酶(请见专利文献3)。

再者，有报导指出黑曲霉菌所制造的磷脂酶C对作为磷酸酶的基质的磷脂酸的分解活性很高(专利文献3)。因此，该酶具有水解磷酸单酯的能力，故可推断其为同时具有磷酸酶活性的蛋白质。此外，也有报导指出佐氏曲霉菌所制造的磷脂酶C对2-十六酰基氨基-4-硝基苯酚磷酰基胆碱的分解活性很高(非专利文献7)。因此，可推断该酶是一种同时能够水解除磷脂外的磷酸二酯的蛋白质。因此，使用以上各种酶进行加工的食品，可能会遭受不必要的改性。

如此可列举出以下磷脂酶C的问题：习知的磷脂酶C其作为酶的功效不足，或于安全方面有问题等等，因此可于市场流通的含磷脂酶C的酶剂至今尚不存在。至于所期望的酶剂的性质可列举如下：其是源自于食品用酶剂制造中已有实用效果的微生物，于酸性侧或中性附近能够有效水解各种磷脂，于柠檬酸缓冲液中也具有活性并具有一定程度的热稳定性，以便用于制油工业。再者，也希望能举出一种磷脂酶C，其不会水解以甘油磷酰胆碱为代表的除磷脂外的磷酸酯。

发明内容

如上所述，所期望的磷脂酶C的性质列举如下：可于酸性侧或中性附近有效水解各种磷脂、于柠檬酸缓冲液中也具有活性及一定程度的热稳定性，以便用于制油工业。再者，也希望能举出一种磷脂酶C，其不会水解以甘油磷酰基胆碱为代表的除磷脂外的磷酸酯，且较佳是源自在食品用酶剂制造上已具实用效果的微生物。

因此，如何提供这样的磷脂酶C，在该技术领域中是非常令人关注的。

本发明人为发现一种安全性良好、可于酸性侧或中性附近有效水解各种磷脂、于柠檬酸缓冲液中也具有活性及一定程度的热稳定性，同时又不会水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C而进行了不懈研究，从而纯化出源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的磷脂酶C，并筛选源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的磷脂酶C的基因，以完成本发明。

也即，本发明关于(1)一种磷脂酶C，其于酸性至中性pH下显示活性，且实质上不水解除磷脂外的磷酸酯。

(2)如(1)所述的磷脂酶C，其不具有对磷脂酰肌醇的特异性。

(3)如(1)或(2)所述的磷脂酶C，其最适pH值是在pH3至pH6的范围内。

(4)如(1)至(3)中任一项所述的磷脂酶C，其于pH7时的相对活性为20％以上。

(5)如(1)至(4)中任一项所述的磷脂酶C，其由丝状菌产生。

(6)如(5)所述的磷脂酶C，其中丝状菌为曲霉属。

(7)如(6)所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)产生。

(8)如(7)所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株，或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM 13907株产生。

(9)如(1)至(8)中任一项所述的磷脂酶C，其表现出以下性质：

1)以SDS-PAGE电泳法测得的分子量约为87000；

2)水解磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油；

3)实质上不水解甘油磷酰胆碱及对硝基苯基磷酸；

4)在pH3至pH9范围内，水解源自蛋黄的卵磷脂；

5)于0℃至80℃范围内具有如4)所述的水解活性；

6)在温度稳定性方面，当pH4.5时，于小于等于45℃的温度下是稳定的；

7)在pH稳定性方面，于pH3至pH10范围内是稳定的。

(10)一种磷脂酶C，其是以下a)～d)中任一项所述的蛋白质：

a)具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质；

b)具有由序列号4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质；

c)具有a)或b)所述的氨基酸序列中减少、取代或附加一或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白质；

d)包含a)或b)所述的氨基酸序列而得的蛋白质。

(11)一种被分离出的丝状菌，其具有制造如(1)～(4)、(9)、(10)中任一项所述的磷脂酶C的能力，且属于米曲霉或溜曲霉，但溜曲霉的IAM 13907株除外。

(12)如(11)所述的丝状菌，其是米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株。

(13)一种DNA，是以下a)～d)中任一所述的DNA：

a)具有序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA；

b)包含与a)所述的DNA具有70％以上的核苷酸序列相同性的核苷酸序列，且编码具有磷脂酶C活性的蛋白质的DNA；

c)编码具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质的DNA；

d)包含序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA。

(14)一种磷脂酶C，其是由(11)所述的DNA所编码的蛋白质。

(15)一种磷脂酶C的制造方法，包括：

1)培养(9)所述的米曲霉或溜曲霉的工序；以及

2)自1)的培养产物中将磷脂酶C分离/纯化的工序。

(16)如(15)所述的方法，其中米曲霉是FERM ABP-10200株或NBRC 4190株，溜曲霉是IAM 13907株。

附图说明

图1显示源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的纯化磷脂酶C的活性与pH值的关系。

图2显示源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的纯化磷脂酶C的活性与温度的关系。

图3显示源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的纯化磷脂酶C的热稳定性。

图4显示源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的纯化磷脂酶C的pH稳定性。

图5显示源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的纯化磷脂酶C的活性与pH值的关系。

图6显示源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的纯化磷脂酶C的活性与温度的关系。

图7显示源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的纯化磷脂酶C的热稳定性。

图8显示源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的纯化磷脂酶C的pH稳定性。

图9显示源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的纯化磷脂酶C的活性与pH值的关系。

具体实施方式

以下详细说明本发明，其中只要没有特别指定，则以下所述各特性的测定方法皆是基于后述实施例或试验例中所记载的测定方法。

本发明涉及一种于酸性至中性pH区域具有活性，且实质上不会水解除磷脂外的磷酸酯的磷脂酶C；或可说是一种于酸性至中性pH区域具有活性，但不具有磷酸酶活性的磷脂酶C。

所谓“于酸性至中性pH区域具有活性”，是指于pH值约3～7的范围内的相对活性大于等于20％。(酶活性的测定法是“试验例1-1：pH活性”中所记载的方法)

另外，所谓“实质上不会水解除磷脂以外的磷酸酯”，是指：以对磷脂酰胆碱(源自蛋黄)的水解活性为100％时，对磷脂酸的水解活性小于等于30％，较佳小于等于25％，以及/或是对甘油磷酰胆碱的水解活性小于等于15％，较佳小于等于10％，以及/或是对对硝基苯基磷酸的水解活性小于等于10％，较佳小于等于5％。“实质上不水解甘油磷酰胆碱及对硝基苯基磷酸”也表示类似意思。

此处磷脂酸被认为是中性脂肪及甘油磷脂的合成中间体，因此于本案的中是不包含于甘油磷脂(磷脂)中的。

所谓“不具有磷酸酶活性”，是指对磷脂酸或硝基苯酚磷酸的分解活性小于等于对磷脂酰胆碱的分解活性的50％；对磷脂酸的分解活性较佳小于等于对磷脂酰胆碱的40％，更佳是小于等于30％，再佳是小于等于25％。另外，对硝基苯基磷酸的分解活性较佳小于等于对磷脂酰胆碱的30％，更佳是小于等于20％，再佳是小于等于10％。

本发明的磷脂酶C也具有对神经鞘磷脂的分解活性，较佳的是此分解活性等于或高于对磷脂酰胆碱的分解活性。具体而言，以对磷脂酰胆碱(源自蛋黄)的分解活性为100％时，对神经鞘磷脂的分解活性较佳是大于等于90％，更佳是大于等于105％，再佳是大于等于115％。

另外，本发明的磷脂酶C也具有对磷脂酰乙醇胺的分解活性，其较佳与对磷脂酰胆碱的分解活性相近。具体而言，以对磷脂酰胆碱(源自蛋黄)的分解活性为100％时，对磷脂酰乙醇胺的分解活性较佳大于等于80％，更佳是大于等于85％，再佳是大于等于90％且小于等于150％。

磷脂酶C的所谓“不具有磷脂酰肌醇专一性”，是指与对磷脂酰肌醇的分解活性(相对活性)相比，对除磷脂酰肌醇以外的基质的分解活性较高。此处除磷脂酰肌醇以外的基质较佳是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰甘油。

本发明的磷脂酶C作用时的pH值较佳在酸性至中性范围内，尤其是在pH3至pH6的范围内，更佳是在pH3至pH5的范围内，再佳则是在pH4至pH5的范围内。

另外，所谓“于pH7时的相对活性”，是以活性最高的pH值时的水解活性为100％时，以百分率(％)表示pH7时的酶水解活性的相对值。本发明的磷脂酶C于pH7时的相对活性较佳大于等于20％，更佳是大于等于40％，再佳则是大于等于50％。

关于温度活性，本发明的磷脂酶C的作用温度较佳在45～70℃范围内，更佳是在55～70℃范围内，再佳是在60～70℃范围内。另外，本发明的磷脂酶C较佳是在55～70℃范围内有大于等于50％的相对活性，更佳是在45～70℃范围内有大于等于50％的相对活性；再佳是在35～70℃范围内有50％的相对活性。另外，更佳的是其在55～65℃范围内的相对活性大于等于80％。

另外，关于温度稳定性的所谓的“稳定”，是指具有大于等于40％的残存水解活性；本发明的磷脂酶C于45℃或以上处理温度下的残存活性较佳大于等于50％，更佳是大于等于70％，再佳是大于等于80％。另外，本发明的磷脂酶C较佳是在45℃、更佳50℃、再佳60℃的处理温度下，具有大于等于40％的残存水解活性。

另外，关于pH稳定性，其所谓“稳定”是指经过保存处理后仍具有大于等于5％的残存水解活性；本发明的磷脂酶C的处理pH值在5～9的范围内时，其残存水解活性较佳是大于等于40％，更佳是大于等于50％，再佳是大于等于60％。另外，处理pH值在6～8的范围内时，其残存水解活性较佳是大于等于60％，更佳是大于等于70％，再佳是大于等于80％。

另外，本发明的磷脂酶C的其它示例可例举如：含有序列号1、2及3的氨基酸序列中的任一个，较佳是含有任意两个，再佳是含有全部三个，并且具有磷脂酶C活性的蛋白质。当该蛋白质含有这三个氨基酸序列中的二个以上时，各氨基酸序列的排列顺序也可为任意顺序。

另外，本发明也包括：具有于序列号5的氨基酸序列中减去、取代或附加一或多个氨基酸而得的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白质。已知氨基酸序列经置换的蛋白质仍具有与天然蛋白质相同的活性的示例已知有：将相当于白介素2(IL-2)基因中对应半胱氨酸的核苷酸序列置换为对应丝氨酸的核苷酸序列而获得的蛋白质，其仍保持原来IL-2的活性(Wang，A.等，(1984)Science，224，1431-1433)。

另外，本发明的磷脂酶C的他例可例举如：具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质。再者，对包含序列号5的氨基酸序列的蛋白质而言，只要其具有磷脂酶C活性，则仍包含于本发明的范围中。

本发明的磷脂酶C的其它示例又包括：具序列号5的氨基酸序列且经糖链修饰的蛋白质。另外，对包含该种氨基酸序列的蛋白质而言，其只其要具有磷脂酶C的活性，则也包含于本发明中。

本发明的磷脂酶C其较佳的示例包括：源自米曲霉(Aspergillusoryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的磷脂酶C、具有序列号5的氨基酸序列的蛋白质，以及具有序列号5的氨基酸序列且经糖链修饰的蛋白质；更佳者是源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的FERMABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的磷脂酶C，以及具有序列号5的氨基酸序列且经糖链修饰的蛋白质。

本文中所谓“本发明的DNA”，是指编码本发明的磷脂酶C的DNA，包括：cDNA、基因组DNA、经人工修饰的DNA、化学合成的DNA等等，只要是现在已知的DNA，则任意形态均可。

本发明的DNA的示例之一，是具有序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列，且编码具有磷脂酶C活性的蛋白质的DNA。

本发明的DNA的其它示例包括与序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列间的核苷酸序列相同性大于等于70％的DNA。此种DNA包括自然界发现的变异型DNA、人工造成的变异型DNA及源自异种生物的相同DNA等。

另外，本发明的DNA的其它示例也包括编码具有序列号4的氨基酸序列的蛋白质的DNA。再者，对应于所需氨基酸的密码子也可任意选择，其例如可考虑所利用宿主的密码子的使用频率，而根据常用方法来决定(Grantham，R.等(1981)Nucleic Acids Res.，9，143-174)。再者，这些核苷酸序列的密码子的部分改变可依常用方法，利用包含编码所期望的改变的合成寡核苷酸序列的引物，而以“部位特异性变异导入法”(Site Specific Mutagenesis/Mark，D.F.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，5662-5666)等方法进行。

本发明的DNA的其它实也包括具有序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA。另外，也包括序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA，只要其编码具有磷脂酶C活性的蛋白质，则也包含于本发明中。

另外，本发明的磷脂酶C的例子包括：具有由本发明的DNA所编码的氨基酸序列的蛋白质。另外，为了自本发明的磷脂酶C制做有任意一个、二个或更多个氨基酸缺失的改变体，可使用以核酸外切酶Ba131等自末端切断DNA的方法(岸本利光等所著的“续生物化学实验讲座1·基因研究法II”，335-354)及盒式(cassette)突变法(岸本利光所著的“新生物化学实验讲座2·核酸III重组DNA技术”，242-251)等。如此般，即便是由利用习知基因工程方法所得的基于本发明DNA的蛋白质，只要其具有磷脂酶C的活性，则也包含于本发明中。如此的磷脂酶C不必含有序列号5的完整氨基酸序列；举例来说，即便是含有其部分序列的蛋白质，只要该蛋白质表现出磷脂酶C的活性，则也包含于本发明的磷脂酶C中。另外，编码该种磷脂酶C的DNA也包含于本发明中。

本发明所使用的磷脂酶C也可为自磷脂酶C制造菌中纯化而得的、经粗纯化而得的、除菌体的破碎液以外直接使用菌体的培养上清液而得的。于培养磷脂酶C制造菌时，较佳是除碳源、氮源以外还在培养基中添加表面活性剂。或者，较佳是在添加有鱼粉、芝麻酱(日文；スリゴマ)、棉籽粕等天然材料的培养基中进行培养。表面活性剂的例子包括：Triton^TM、吐温、蔗糖脂肪酸酯、胆酸钠、脱氧胆酸钠、以及皂素等。

磷脂酶C制造菌的培养可使用通常的培养装置、培养基来进行，并可适当选择液体培养、固体培养等方式。液体培养可使用烧瓶或发酵槽，且可使用培养开始后不追加培养基的分批培养法，或是在培养过程中添加适量培养基的流加料培养法。培养基中添加有碳源、氮源，并可依需要添加维他命、微量金属等。碳源例如是葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖类，麦芽糖、纤维二糖、异麦芽糖、乳糖、蔗糖等二糖类，淀粉等多醣类，以及麦芽提取物等。氮源可使用胺、硫酸铵、硝酸铵等无机氮源，酵母提取物、麦芽提取物、有机性液肥、蛋白胨(peptone)等有机氮源。这些培养基中的组合物量可适当选择，且培养温度、pH值、通气搅拌量等可因应磷脂酶C的制造方式作适当选择。

于磷脂酶C制造菌的培养结束后，进行离心分离，而可直接使用除去菌体的培养上清液作为粗酶液。另外，也可使用以离子交换层析法等进行粗纯化所得的纯化酶液。

本发明中所谓米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株也包含其所有变异菌株，只要其可产生本发明的磷脂酶C即可。另外，这些变异株中也含有以遗传学方法，如重组、转导(transduction)、转化(transformation)等而获得的。即，可制造本发明的磷脂酶C的米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株、其变异株以及与其无明确区别的菌株皆全部包含于米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM 13907株的范围中。

另外，本发明的磷脂酶C可以是在载体中插入本发明DNA的重组质体来转化宿主细胞，并自该转化细胞的培养产物中获得而得的。此种于适当载体中插入本发明DNA的重组质体的操作也包含于本发明中。用于上述目的的载体可以是一般已知的各种载体，其较佳者例如是：原核细胞用载体、真核细胞用载体、源自哺乳动物的细胞用载体等，但并非限定于此。通过如此的重组质体，即可转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞。进而，使用具有适当启动子序列及/或与特性表达相关的序列的载体，或是将该种序列导入而制成表达载体，即可使基因于各宿主中表现出来。如此的表达载体为本发明的重组质体的较佳型态。

可通过将本发明的重组质体导入各种细胞中，而获得宿主细胞。如此的细胞可为原核细胞，也可为真核细胞，只要其为可导入质体的细胞即可。

原核细胞的宿主例如是大肠杆菌(Escherichia coli)及枯草杆菌(Bacillus subtilis)等。为了于这些宿主细胞内使目的基因转化，可以利用含有源自适于宿主的菌种的复制子(Replicon，即复制起点)及调节序列的质体载体来转化宿主细胞。另外，此载体较佳具有可使转化细胞具备基因表达选择性的序列。

例如，大肠菌中经常使用K12株等；载体通常可使用pBR322及pUC系属的质体，但并非仅限于此，而可使用周知的各种菌株及载体。

用于大肠菌的启动子例如是：色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸/乳糖(tac)启动子、脂蛋白(lpp)启动子、多肽链伸展因子Tu(tufB)启动子等，其中任一启动子均可用于制造本发明的磷脂酶C。

枯草菌中较佳者例如是207-25株，可配合其使用p TUB228(Ohmura，K.等(1984)J.Biochem.，95，87-93)等载体，但并非仅限于此。

另外，如将启动子与编码枯草杆菌α-淀粉酶的信号肽序列的DNA序列加以连结，即可于菌体外产生分泌表达。

真核细胞的宿主细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞，其中脊椎动物细胞可以是源自哺乳动物的细胞，例如作为猿猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.(1981)Cell 23，175-182，ATCC CRL-1650)或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺损株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77，4126-4220)等。

脊椎动物细胞的表达启动子可使用位于所要常态表达的基因前段的启动子、RNA的剪接部位、聚合腺苷酸化部位，以及具有转录终结序列等的启动子，而依需要也更可具有复制起点。此种表达载体例如是具有SV40的初期启动子的pSV2dhfr(Subramani，S.等(1981)Mol.Cell.Biol.，1，854-864)等，但并非仅限于此。

以使用COS细胞作为宿主细胞的情形为例，其可使用具有SV40复制起点且可于COS细胞中自主增殖，且还具有转录启动子、转录终结信号及RNA剪接部位的表达载体。该表达载体可通过二乙氨基乙基(DEAE)-右旋糖酐(dextran)法(Luthman，H.and Magnusson，G.(1983)Nucleic Acids Res，11，1295-1308)、磷酸钙-DNA共沉淀法(Graham，F.L.and van der Eb，A.J.(1973)Virology，52，456-457)以及电脉冲穿孔法(Neumann，E.等(1982)EMBO J.，1，841-845)等方法送入COS细胞中，以获得所要求的转化细胞。另外，使用CHO细胞作为宿主细胞时，可使表达载体与令具有抗生物质G418耐性标记物功能的neo基因表达而得的载体(例如pRSVneo(Sambrook，J.等(1989)：“Molecular Cloning A Laboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，NY)及pSV2-neo(Southern，P.J.and Berg，P.(1982)J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341)等)进行协同转染，并选择G418耐性的菌落，而获得可稳定制造本发明的磷脂酶C的转化细胞。

使用昆虫细胞作为宿主细胞时，通常使用源自鳞翅类夜蛾科的Spodoptera frugiperda种的卵巢细胞的株化细胞(Sf-9或Sf-21)或源自粉斑夜蛾(Trichoplusia ni)的卵细胞的High Five细胞(Wickham，T.J.等(1992)Biotechnol.Prog.I：391-396)作为宿主细胞，其通常使用利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的多角体蛋白质启动子的pVL 1392/1393载体(Kidd，I.M.and V.C.Emery(1993)“The useof baculoviruses as expression vectors”，Applied Biochemistry andBiotechnology，42，137-159)作为杆状病毒转移载体。此外，也可使用利用杆状病毒的P10或同碱性蛋白质启动子的载体。再者，也可将AcNPV的包膜表面蛋白质GP67的分泌信号序列连结于目标蛋白质的N末端侧，而表达出作为分泌蛋白质的重组蛋白质(Zhe-mei Wang，等(1998)Biol.Chem.，379，167-174)。

在以真核微生物作为宿主细胞的特性表达系列中，周知的是酵母菌，其中较好的是Saccharomyces属酵母菌，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)。此酵母菌等真核微生物的表达载体例如可优选利用醇脱氢酶基因的启动子(Bennetzen，J.L.and Hall，B.D.(1982)J.Biol.Chem.，257，3018-3025)及酸性磷酸酶基因的启动子(Miyanohara，A.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，1-5)。另外，以分泌型蛋白质状态加以表达时，也可将分泌信号序列与宿主细胞所持有的内在性蛋白酶或已知蛋白酶的切断部位置于N末端侧，而得重组体以进行表达。例如，可以在毕赤酵母菌所表达的胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶系列的人类肥大细胞类胰蛋白酶的系统中，将酵母菌的α因子分泌信号序列与毕赤酵母菌所持有的KEX2蛋白酶的切断部位连结，使之表达，藉此于培养基中分泌活性型类胰蛋白酶(Andrew，L.Niles，等(1998)Biotechnol.Appl.Biochem.，28，125-131)。

以上述方式所获得的转化体可依一般方法加以培养，以于细胞内或细胞外制造本发明的磷脂酶C。在所用的培养基方面，可依照所采用的宿主细胞种类而适当选择惯用的各种培养基。例如，若使用上述COS细胞，则可使用RPMI 1640培养基或Dulbeco改造的Eagle培养基(以下称为“DMEM”)等培养基，并依需要添加胎牛血清等血清成分。在培养条件方面，只要CO₂浓度在0～50％的范围内即可，较佳是1～10％，更佳是5％。培养温度为0～99℃即可，较佳是20～50℃，更好的是35～40℃。

通过上述培养在转化体细胞内或细胞外，以重组蛋白质的型态而产生的本发明的磷脂酶C，其自培养产物中的分离纯化可藉助于利用蛋白质的物理化学性质、化学性质、生物化学性质(酶活性等)等性质的各种分离操作(参照“生化学数据书II”，1175-1259项，第1版第1次印刷，1980年6月23日东京化学同人股份有限公司发行；Biochemistry，Vol.25，No.25，8274-8277(1986)；Eur.J.Biochem.，163，313-321(1987)等等)。具体而言，该方法例如是：一般的重结晶处理、使用蛋白质沉淀剂的处理(盐析法)、离心分离、渗透压冲击法、冷冻溶解法、超声波破碎、超滤、凝胶过滤、吸附层析法、离子交换层析法、亲和层析法、高效液相色谱(HPLC)等各种液体层析法、透析法，以及这些方法的组合等。通过上述方法即可以高产率在工业规模下制造所要的重组蛋白质。另外，通过将包括6个残基的组氨酸分子连结于所要表达的重组蛋白质上，可使用镍亲和层析管柱时进行有效的纯化。上述方法也可组合使用，以更容易地以高收率及高纯度大量制造本发明的磷脂酶C。

另外，以上述方法制造的磷脂酶C也可作为本发明的较佳示例。

所谓磷脂酶C制造菌是指实质上能够制造磷脂酶C的微生物，其中包含在菌体内蓄积磷脂酶C的微生物及将磷脂酶C分泌至菌体外的微生物等。如欲使用磷脂酶C制造菌的培养上清液或自培养上清液中所纯化的磷脂酶C时，可使用于分泌磷脂酶C至菌体外的微生物。

本发明所使用的磷脂酶C可为源自米曲霉(Aspergillus oryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)的磷脂酶C，较佳是源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株。磷脂酶C可为上述多种磷脂酶C制造菌本身所制造的，也可为其变异体或修饰体所制造的，且也可为将上述多种磷脂酶C制造菌的磷脂酶C基因导入宿主而得的转化体所制造的重组蛋白质。

磷脂酶C制造菌的得到

米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株可自独立行政法人制品评价技术基础机构的生物技术本部的生物遗传资源部门(NBRC：NITE Biological Resource Center；

292-0818日本国千叶县木更津市Kazusa鎌足2-5-8，主页网址<http://www.nite.go.jp/>)购得。

溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907(＝IAM 13907)株可自东京大学分子细胞生物学研究所(IAM：Institute of Molecular andCellular Biosciences，The University of Tokyo；

113-0032东京都文京区弥生1-1-1，主页网址<http://www.iam.u-tokyo.ac.jp/indexe.html>)购得。

米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的菌学特征如下所示。

首先根据Klich的文献(Klich，M.A.(2002)“Identification ofcommon Aspergillus Centraalbureau voor Schimmelcultures”，Utrecht，The Netherlands)，于四种培养基(CYA培养基、CY20S培养基、CZ培养基、MEA培养基)中接种米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERMABP-10200株，观察其菌学特征。

色调显示方面，是依据“Methuen handbook of colour”一书(Kornerup，A.and Wanscher，J.H.(1978)Methuen handbook of colour(3rd.edition).Erye Methuen，London)。

四种培养基(CYA培养基、CY20S培养基、CZ培养基、MEA培养基)的组成如下：

CYA培养基[Czapek酵母琼脂(Czapek Yeast Extract Agar)培养基]

(1.0g K₂HPO₄、10ml^*Czapek浓缩液、5g酵母提取物、30g蔗糖、15g琼脂、1000ml蒸馏水)

^*Czapek浓缩液(30g NaNO₃、5g KCl、5g MgSO₄·7H₂O、0.1gFeSO₄·7H₂O、0.1g ZnSO₄·7H₂O、0.05g CuSO₄·5H₂O、100ml蒸馏水)

CY20S培养基[20％蔗糖Czapek酵母琼脂(Czapek Yeast ExtractAgar with 20％Sucrose)培养基]

(1.0g K₂HPO₄、10ml^*Czapek浓缩液、5g酵母提取物、200g蔗糖、15g琼脂、1000ml蒸馏水)

CZ培养基[Czapek氏琼脂(Czapek Dox Agar)培养基]

(1.0g K₂HPO₄、10ml^*Czapek浓缩液、30g蔗糖、17.5g琼脂、1000ml蒸馏水)

MEA培养基[麦芽提取物琼脂(Malt Extract Agar)培养基]

(20g麦芽提取物、1g蛋白胨、20g葡萄糖、20g琼脂、1000ml蒸馏水)

1)菌学特征

米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的菌学特征

CYA培养基中的菌落，于25℃下培养一周后其直径为36-40mm。菌落稍厚，呈羊毛状，中心部分成为棉毛状，且自中心部分形成放射状的沟纹。菌丝为白色，且分生孢子松散地形成于中心部分，而呈灰黄色(4B4)至黄白色(4A2)。未观察到浸出液、菌核。背面为淡黄色(2A4)至白色(2A1)，且自中心部分形成放射状的沟纹。未观察到可溶性色素。

CYA培养基中的菌落，于37℃下培养一周后直径为54-58mm。菌落较厚，呈羊毛状。菌丝为白色，且分生孢子形成于中心部分，而呈灰黄色(4B4)至黄白色(4A2)。未观察到浸出液、菌核。背面为淡橙色(4A4)至白色(4A2)，且自中心部分形成放射状的沟纹。未观察到可溶性色素。

CY20S培养基中的菌落于25℃下培养一周后直径为35-41mm。其菌落特征与CYA培养基相同，但中心部分的棉毛状菌丝略多。

CZ培养基中的菌落于25℃下培养一周后直径为17-21mm。其菌落特征与CYA培养基相同，但菌落较小，且分生孢子的形成松散。

MEA培养基中的菌落于25℃下培养一周后直径为37-41mm。菌落较薄，且呈棉毛状。菌丝为白色，且分生子松散地形成于中心部分，而呈暗绿色(26D4)至灰绿色(26D6)。未观察到浸出液、菌核。背面呈灰黄色(4B3)至黄白色(4A2)，但未观察到可溶性色素。

此菌类于14℃至42℃下繁殖，于18℃至38℃下可观察到分生孢子形成。

分生孢子头部为放射状至平缓的圆柱状。分生孢子柄宽度为6.7～13.6μm，长度为302.2～1398.0μm，且无色、粗面。顶囊呈偏球形至烧瓶形，宽度为14.6-29.3μm。曲霉(aspergilla)主要呈单列状(uniseriate)，很少呈两列状(biseriate)，且自顶囊的上半部形成分生孢子的梗基(metulae)或瓶梗(phialide)。梗基尺寸为11.3～28.3×5.2～9.9μm。瓶梗为烧瓶形，尺寸为8.4～21.3×3.8～7.7μm。分生孢子具光滑面，呈偏球形至蛋形，且直径为4.2～6.3μm。

根据以上菌学特征检索符合本菌的菌种时，发现其与Klich文中所记载的米曲霉(Aspergillus oryzae)(Ahlburg)Chon特征基本上一致。因此，将FERM ABP-10200株鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae)(Ahlburg)Chon，且寄存于日本独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物寄存中心。

自磷脂酶C制造菌所得的磷脂酶C的具体性质如下所示，但本发明的磷脂酶C所具有的性质非仅限于此。

由米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC4190株或是溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株所制造并经纯化的磷脂酶C具有以下性质：

1)以SDS-PAGE法测得其分子量约87000。

2)于pH3至pH9的范围内可水解源自蛋黄的卵磷脂(NACALAITESQUE股份有限公司生产)。

3)于0～80℃范围内具有4)所述的水解活性。

4)当pH4.5时，于小于等于45℃的温度下是稳定的。

5)于pH3至pH10的范围内是稳定的。

6)如2)所述的水解活性最佳时的pH值为4.5。

7)于pH4.5时，如3)所述的水解活性最佳时的温度为65℃。

8)会水解磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇及磷脂酰甘油，但实质上不会水解甘油磷酰胆碱及对硝基苯基磷酸。

例如，酶对各种基质的相对活性示于表1中，其中对源自蛋黄的磷脂酰胆碱的活性设为100％。表1中主要记载源自蛋黄的基质及源自大豆的基质，其中源自蛋黄的卵磷脂是自NACALAI TESQUE股份有限公司购得，源自大豆的卵磷脂则是自辻制油股份有限公司购得，除此以外的基质是自SIGMA-ALDRICH Japan股份有限公司购得。

表1

9)具有如下所示的部分氨基酸序列(自N末端开始)：

Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Thr-Ala-IIe-Gly-Tyr-Val-Thr-Pro-Ser-Met(序列号1)。

Glu-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu-Leu-Thr-Pro-Pro(序列号2)。

Val-Pro-Pro-Ser-His-Asn-Pro-Gln-Trp-Ala(序列号3)。

10)蛋白质杯被糖链修饰。

根据以上内容，即可列举出本发明的磷脂酶C所具有的性质如下，但并非仅限于此。

1)以SDS-PAGE法测得的分子量约87000。

2)于pH3至pH9的范围内可水解源自蛋黄的卵磷脂(NACALAITESQUE股份有限公司制造)。

3)于0～80℃范围内具有如4)所述的水解活性。

4)当pH4.5时，于小于等于45℃的温度下是稳定的。

5)于pH3至pH10范围内为稳定的。

另外，制造本发明的磷脂酶C的方法也包含于本发明的范围中。

于培养基的中培养以米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERMABP-10200株或NBRC 4190株或溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM13907株为代表的磷脂酶C制造微生物，即可制造磷脂酶C。例如，可使用在0.1～5.0％多蛋白胨(和光纯药工业股份有限公司制)及0.1～1.0％酵母提取物(日本Becton Dickinson股份有限公司制)中添加0.05～1.0％脱氧胆酸钠而得的培养基，或是于0.1～4.0％PharmaMedia(TRANDERS PROTEIN股份公司制)中添加0.05～1.0％的Triton^TM X-100(SIGMA-ALDRICH Japan股份有限公司制)或0.05～0.3％的蛋黄卵磷脂所得的培养基，或者是含1～10％鱼粉(池口喜一郎商店)的培养基，于16℃至45℃下以100～250rpm的转速振荡培养1至15天。

实施例

以下举出一些实施例以及试验例，但本发明的范围并非仅限于此。

实施例1：自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株中纯化出磷脂酶C

1)调制粗酶液

于加入100ml的经灭菌且具有表2所示组成的培养基的500ml三角烧瓶(种烧瓶)中，接种1ml经过滤灭菌的5％脱氧胆酸钠溶液，以及米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的菌体，并于26℃下以170rpm转速振荡培养7天。

表2

培养结束后，于4℃下以10000G进行十分钟离心分离，并将所得的上清液作为粗酶液。

2)酶活性测定方法

磷脂酶C的水解活性是以下述方式进行测定。

<1>卵磷脂的水解反应

将1.5g蛋黄卵磷脂(NACALAI TESQUE股份有限公司制)溶于50ml的4％(wt/v)Triton X-100中得到的基质溶液，再向该基质溶液60μl中添加60μl的200mM醋酸缓冲液(pH5.5)，并保持于37℃下。接着于该混合液中添加60μl酶液后搅拌均匀，并保持于37℃下而进行3小时的酶反应。

<2>游离磷酰碱的水解反应

此步骤是以碱性磷酸酶水解于酶反应中所产生的磷酰碱。首先于50μl的<1>中所调制的酶反应液中加入50μl的200mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH8.0)及1μl碱性磷酸酶(SIGMA-ALDRICH Japan股份有限公司制)，再于37℃下反应40分钟。再者，此时也同时制做未添加碱性磷酸酶的样品作为空白对照组。

<3>无机磷酸的定量

此步骤是以Phospha C Test Wako(和光纯药工业股份有限公司制)对<2>所得的无机磷酸进行定量。首先于100μl的于<2>所得的反应液中添加Phospha C Test Wako的A液及B液各1ml，再于37℃下反应20分钟。接着测定该混合液于750nm波长的吸光度，其与空白对照组的差即为磷脂酶C的活性。以下将每1分钟酶反应生成1μmol磷酰碱的酶活性设为1单位。

3)调制纯化酶液

首先使用8000ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)，对1200ml的于1)所得的粗酶液每12小时透析8次。接着将其加入预先以10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的DEAE Toyo-Pearl管柱(直径2.2cm×长度20cm，Tosoh股份有限公司制)，使之吸附。以10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)充分清洗该管柱后，于600ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)中产生0至0.2M的氯化钠线性浓度梯度，以使吸附于该管柱的成分溶出。对来自蛋黄的卵磷脂具分解活性的溶出部分为氯化钠浓度0.05～0.08M时的溶出部分(90ml)，故将其作为粗纯化酶溶出部分。

接着使用4000ml的20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)对90ml所获得的活性溶出部份每12小时透析3次后，添加至预先以20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的MonoQ管柱(直径10mm×长度10cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，使之吸附于管柱中。接着以2.0mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)充分清洗该管柱后，于250ml的20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)中产生0～0.2M的氯化钠线性浓度梯度，以溶出吸附于该管柱中的成分。具有对来自蛋黄的卵磷脂的分解活性的溶出部分为氯化钠浓度0.1～0.12M时的溶出部分(25ml)。

接着将25ml所得活性溶出部分加以浓缩，再加至预先以含0.15M氯化钠的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的HiLoad Sephadex200pg管柱(直径16mm×60cm，Amersham生物科技股份有限公司制)中，然后以含0.15M氯化钠的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)将其溶出。具有对来自蛋黄的卵磷脂的分解活性的溶出部分为溶出量介于60ml至70ml之间者。

因此，该溶出部分即作为纯化酶溶液。

4)纯化酶的分子量测定

纯化酶的分子量是以使用12.5％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE法(请见Laemmli，U.K.，Nature，227，680(1970))求得，并使用下述的标准蛋白质：a.分子量94000的磷酸化酶(phosphorylase)、b.分子量67000的白蛋白(albumin)、c.分子量43000的卵白蛋白(ovalbumin)、d.分子量30000的碳酸酐酶(carbonic anhydrase)、e.分子量20100的胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor)、f.分子量14400的α-乳白蛋白(α-lactalbumin)。

该纯化酶显示出分子量约87000的单一带(band)。

实施例2：自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株中纯化出磷脂酶C

1)调制粗酶液

于加入有100ml的表2所示组成的培养基的500ml容量三角烧瓶(种烧瓶)中，接种1ml经过滤器灭菌的5％脱氧胆酸钠溶液及溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的菌体，并于26℃下以170rpm转速振荡培养5天。培养结束后，于4℃下以10000G进行10分钟离心分离，并将所得的上清液作为粗酶液。

2)调制纯化酶液

此例是以实施例1中3)所述的相同方式进行纯化，而得纯化酶溶液。

3)纯化酶的分子量测定

此例是以实施例1中4)所述的相同方法进行测定。此纯化酶显示出分子量约87000的单一带。

实施例3：自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株中纯化出磷脂酶C

1)调制粗酶液

于加入100ml经灭菌的具有表3所示组成的培养基的500ml三角烧瓶(种烧瓶)中，接种米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的菌体，并于26℃下以170rpm转速振荡培养7天。

表3

待培养结束后，于4℃下以10000G进行10分钟离心分离，并将所得的上清液作为粗酶液。

2)调制纯化酶液

首先使用8000ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)，对600ml的1)中所得的粗酶液每12小时透析5次。接着将其添加至预先以10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的DEAE Toyo-Pearl管柱(直径2.2cm×长度20cm，Tosoh股份有限公司制)，使的吸附于管柱中。接着以10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)充分清洗该管柱后，于600ml的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)中产生0～0.6M的氯化钠线性浓度梯度，以溶出该管柱吸附的成分。具有分解来自蛋黄的卵磷脂的活性的溶出部分为氯化钠浓度0.30～0.35M时的溶出部分(50ml)，故以其为粗纯化酶液。

接着使用4000ml的20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)，对50ml所得的活性溶出部分每12小时透析3次后，再加入预先以20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的MonoQ管柱(直径10mm×长度10cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，使之吸附于管柱中。接着以20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)充分清洗该管柱，再于250ml的20mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)中产生0～0.6M的氯化钠线性浓度梯度，以溶出该管柱所吸附成分。具有对来自蛋黄的卵磷脂的分解活性的溶出部分是氯化钠浓度为0.12～0.20M时的溶出部分(35ml)。

接着将35ml所得的活性溶出部分浓缩，再添加至预先以含有0.15M氯化钠的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡化的HiLoad Sephadex200pg管柱(直径16mm×60cm，Amersham生物科技股份有限公司制)，再以含有0.15M氯化钠的10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.5)将其溶出。具有对来自蛋黄的卵磷脂的分解活性的溶出部分是溶出量为60～70ml间的溶出部分。

因此，该溶出部分是为纯化酶溶液。

3)纯化酶的分子量测定

此测定是以实施例1的4)所述的相同方法来进行，结果发现纯化酶显示出分子量约87000的单一带。

实施例4：源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的磷脂酶C的部分氨基酸序列的决定

首先使用超滤膜(Sartorius股份有限公司制的VIVASPIN2，其截断分子量为1万)将纯化的酶溶液浓缩至1mg/ml左右，再于150μl的浓缩酶液中添加150μl改性缓冲液(Denature buffer，含6M的盐酸胍(guanidine)、10mM EDTA及0.1M碳酸氢铵，pH7.8)以及6μl的50mM二硫代苏糖醇溶液，再于95℃下反应10分钟。待冷却至室温后，于反应液中添加30μl溶有50mM碘乙酰胺的改性缓冲液，再于暗室中于室温下反应1小时。接着将该溶液添加于预先以20mM碳酸氢铵(pH8.0)平衡化的Hitrap Desalting管柱(安玛西亚Amersham生物科技(股份)公司)中，再以20mM碳酸氢铵溶液(pH8.0)溶出的。接着对溶出量1.5～2.5ml间的溶出部分进行冷冻干燥，再溶于100μl的20mM碳酸氢铵(pH8.0)中。接着于所得的溶液中添加60单位胰蛋白酶(经修饰的，Promega股份有限公司制)，再于37℃下进行18小时的酶反应。接着将反应液注入高效液相色谱仪(日立制作所股份有限公司制)中，而将分解出的氨基酸的峰加以分离，其条件如下：

管柱：Tosoh股份有限公司制的TSKgel ODS-120T管柱(4.6mm×150mm)

A缓冲液：0.1％三氟乙酸(TFA)/水

B缓冲液：0.1％TFA/乙腈

梯度：10→70％B 2％/ml

流速：1ml/分钟

接着挑出经分离的分解氨基酸的3个峰(B缓冲液浓度为30％至38％左右)，再以氨基酸序列解析装置(Procise cLC，AppliedBiosystems JAPAN股份有限公司制)进行解析。所得的部分氨基酸序列自氨基端开始表记。

Thr-Ala-Asp-Ser-Ala-Thr-Ala-Ile-Gly-Tyr-Val-Thr-Pro-Ser-Met(序列号1)。

Glu-Ala-Tyr-Gly-Ser-Leu-Leu-Thr-Pro-Pro(序列号2)。

Val-Pro-Pro-Ser-His-Asn-Pro-Gln-Trp-Ala(序列号3)。

实施例5：鉴定源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的编码磷脂酶C的DNA

1)全RNA的纯化

首先于20ml的液体培养基(2％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.02％磷酸氢二钾、0.05％硫酸镁)中，于26℃下对米曲霉(Aspergillusoryzae)的NBRC 4190株进行1天的前培养。其后，对另一液体培养基(5％鱼粉)进行1％植菌，并于26℃下培养4天。接着将经过培养的菌体吸引进行集菌，再转移至-80℃下的经高压蒸气灭菌后再冷冻的研钵中。接着一面添加液体氮，一面使用研棒将菌体磨碎成粉末状。接着使用植物全RNA提取套件(RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen股份有限公司制)对完全成为粉末状的菌体进行全RNA的纯化，而得50μl的905ng/μl浓度的溶液。

2)磷脂酶C基因的解读

此处是以5’RACE法及3’RACE法解读基因序列。具体而言，是使用5’RACE系统及3’RACE系统(均由Invitrogen股份有限公司制造)及聚合酶Ex Taq^TM(TAKARA BIO股份有限公司制)进行聚合酶锁反应(PCR)。此时PCR引子在扩增5’侧的基因序列用时为5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’及5’-GACAGTGTAGTCGAGCACAGCGAA-3’，在扩增3’侧的基因序列用时为5’-GACTCTGCCACCGCAATCGGCTA-3’及5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’。PCR循环放大的设定依序是94℃/5分钟、(94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/2分30秒)×30次、72℃/10分钟、4℃，从而扩增5’侧的基因序列约1200个碱基对(b.p.)及3’侧的约800个b.p.。

对各PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳处理后，以QIAquick GelExtraction Kit(Qiagen股份有限公司制)进行纯化，再使用TOPO^TMTA筛选套件(Invitrogen(股份)公司)连结纯化物与载体以进行转化。接着于37℃下于琼脂培养基(L B/Agar，和光纯药工业股份有限公司制)上，将经转化的大肠菌培养一晚后，于37℃下于液体培养基(LB肉汤，和光纯药工业股份有限公司制)中，将已繁殖的菌落培养一晚。接着使用QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen股份有限公司制)自已增殖的大肠菌中纯化出质体，并进行DNA序列的解析。DNA序列解析的结果示于序列号4中，而依据DNA序列所推测的氨基酸序列示于序列号5中。

实施例6：对源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的磷脂酶C进行糖肽酶处理

1)酶反应

首先使用超滤膜(Sartorius股份有限公司制造的VIVASPIN2，其截断分子量为1万)浓缩经纯化的酶溶液，再于20μl的浓缩酶液中添加15μl蒸馏水、10μl的0.25mM磷酸缓冲液(pH7.5)及2.5μl的1M 2-巯基乙醇/2％十二烷基硫酸钠溶液，并于95℃下反应5分钟。在快速冷却后，添加2.5μl的15％Triton X-100(SIGMA-ALDRICHJapan股份有限公司制)，并添加10单位的糖肽酶F(SIGMA-ALDRICH Japan股份有限公司制)，再于37℃下反应20小时。

2)反应后的分子量测定

此测定所用方法与实施例1的4)相同。酶反应后显示出分子量约63000的单一带。

试验例1：源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株的磷脂酶C的纯化酶液的各项性质

接着对实施例1的3)所得的纯化酶液进行活性测定。

1)pH活性

此测定是依照实施例1的2)所示的方法，其中酶反应条件设为37℃下10分钟。另外，缓冲液使用情形如下：于pH2.3至pH3.7时使用甘氨酸-盐酸缓冲液，于pH3.3至pH6.2时使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于pH6.1至pH8.0时使用MOPS缓冲液，而于pH8.2至pH9.2时使用Atkins-Pantin缓冲液。接着将活性最高的pH条件下的水解活性作为100％，而将各pH值下酶的相对水解活性绘于图1中。在使用柠檬酸缓冲液的情形下活性最高的pH值4.5左右。

2)温度活性

接着测定于pH4.5的柠檬酸缓冲液中的温度活性，是依照实施例1的2)所示的方法来进行，其中酶反应条件设为37℃下20分钟。接着将活性最高的温度下的水解活性设为100％，而将各温度下的相对酶水解活性绘于图2中。由图2可知，活性最高的温度为65℃附近。

3)热稳定性

首先将纯化酶溶液分别于各种温度下处30分钟，再测定其残存水解活性。详细过程是先向预先保持于处理温度下的90μl的25mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)中添加10μl的纯化酶液，并在搅拌均匀后保温30分钟。接着于60μl实施例1所制备的蛋黄卵磷脂溶液中添加60μl的200mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)，并保持于37℃而添加60μl经加温处理的酶液，然后于37℃下进行30分钟酶反应。接着依据实施例1的2)的方法定量游离的磷酰碱分子。接着将最高残存水解活性当作100％，而将各温度的相对水解活性绘于图3中。由图3可知，当pH4.5时，酶至少在小于等于60℃的温度时是稳定的。

4)pH稳定性

首先于多个30μl纯化酶液样品中分别添加30μl的下述各pH值的200mM缓冲液，再于37℃下保温30分钟。缓冲液使用情形如下：于pH2.7至pH3.2时使用甘氨酸-盐酸缓冲液，于pH3.5至pH6.1时使用醋酸-醋酸钠缓冲液，于pH6.3至pH7.9时使用MOPS缓冲液，而于pH8.3至pH10.8时使用Atkins-Pantin缓冲液。接着于60μl的200mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)与60μl实施例1的2)所述的卵黄卵磷脂溶液的混合液中，加入60μl的下述溶液后搅拌均匀，再于37℃下进行10分钟酶反应，所述溶液为于60μl经加温的酶混合液中添加60μl水而得的溶液。游离的磷酰碱分子的定量是依照实施例1的2)所述者进行。接着以最高残存水解活性为100％，而将各pH值下的相对水解活性绘于图4中。由图4可知，该酶于pH3至pH10的范围内是稳定的。

5)纯化酶的基质选择性

接着测定基质选择性，其是使用实施例1的3)所制备的纯化酶液，而测定方法如实施例1的2)所述。其中，基质溶于pH4.5的200mM柠檬酸缓冲液中且保温在37℃下，进行10分钟的酶反应。以对源自蛋黄的磷脂酰胆碱水解活性为100％时，对其他基质的相对活性示于表4中。

表4

试验例2：源自溜曲霉(Aspergillus tamarii)的IAM 13907株的磷脂酶C的纯化酶液的各项性质

接着对实施例2的2)所得纯化酶液进行活性测定。

1)pH活性

此测试是依试验例1所示方法。在此也将活性最高的pH条件下的活性当作100％，而将各pH值下的相对酶活性绘于图5中，由其可知活性最高的pH值在4.5附近。

2)温度活性

此测试同样依试验例1所示方法。在此也将活性最高的温度下的活性当作100％，而将各温度下的相对酶活性绘于图6中，由其可知活性最高的温度在65℃附近。

3)热稳定性

此测试同样依试验例1所示方法。在此也将最高残存水解活性当作100％，而将各温度下的相对水解活性绘于图7中。由图7可知，当pH4.5时，该酶于小于等于45℃的温度下是稳定的。

4)pH稳定性

此测试同样依试验例1所示方法。在此也将最高残存活性设为100％，而将各pH值下的相对水解活性绘于图8中。由图8可知，该酶于pH3至pH10的范围内是稳定的。

2)纯化酶的基质选择性

此测试同样依试验例1所示方法。在此也以对源自蛋黄的磷脂酰胆碱的水解活性为100％，而将该酶对各基质的相对活性示于表5中。

表5

试验例3：源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的NBRC 4190株的磷脂酶C的纯化酶液的各项性质

此例是对实施例3的2)所得纯化酶液进行活性测定。

1)pH活性

此测试同样依试验例1的方法。在此也将活性最高的pH条件下的活性当作100％，而将各pH值下的相对水解活性绘于图9中，由其可知活性最大的pH值为4.5左右。

2)纯化酶的基质选择性

此测试同样依试验例1所示方法。在此也将对源自蛋黄的磷脂酰胆碱的水解活性当作100％，而将该酶对各基质的相对活性示于表6中。

表6

发明的效果

如上述，本发明的磷脂酶C是源自米曲霉(Aspergillus oryzae)的FERM ABP-10200株或NBRC 4190株或是溜曲霉(Aspergillustamarii)的IAM 13907株的酶，其安全性佳，具有于酸性pH区域或中性pH区域附近有效水解各种甘油磷脂的能力，于柠檬酸缓冲液中也具有活性，且具有一定程度的热稳定性，又不会水解除磷脂以外的磷酸酯。因此，于食品工业以及制油工业领域也可发挥优良的效果。

序列表

<110>三菱化学食品株式会社

<120>新型磷脂酶C

<130>KP-11293

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>1

Thr Ala Asp Ser Ala Thr Ala Ile Gly Tyr Val Thr Pro Ser Met

1 5 10 15

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>2

Glu Ala Tyr Gly Ser Leu Leu Thr Pro Pro

1 5 10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>3

Val Pro Pro Ser His Asn Pro Gln Trp Ala

1 5 10

<210>4

<211>2085

<212>DNA

<213>米曲霉

<220>

<221>CDS

<222>(46)..(1899)

<223>

<400>4

gctgcagctt ggtcagcgat cttgacctcg tatcaaacta gggac atg aga cca gct 57

Met Arg Pro Ala

1

ttc ttc ctt gcg gcc ctg gcc tcc ctg gct agt act cat gct aat cct 105

Phe Phe Leu Ala Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser Thr His Ala Asn Pro

5 10 15 20

gag gcc gac ttg gct ggc tcg atc tgg gat gat ttc aaa gga gca gtc 153

Glu Ala Asp Leu Ala Gly Ser Ile Trp Asp Asp Phe Lys Gly Ala Val

25 30 35

acc tgt gct ggc tgt gag ggc ctg ctc ggg gca ctc aaa cta gta gcc 20l

Thr Cys Ala Gly Cys Glu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Lys Leu Val Ala

40 45 50

ggt ctg ggt caa agt gca ttg gaa cat gtt gtg acc gac gcg tgt acg 249

Gly Leu Gly Gln Ser Ala Leu Glu His Val Val Thr Asp Ala Cys Thr

55 60 65

ttg gca ggg atc gag gat gac gat gtc tgt gag ggc gca atc aaa gaa 297

Leu Ala Gly Ile Glu Asp Asp Asp Val Cys Glu Gly Ala Ile Lys Glu

70 75 80

gaa ggc gcg gcc gtg tat tac gcc ctg aag aat ctg aag gtc ggc tcg 345

Glu Gly Ala Ala Val Tyr Tyr Ala Leu Lys Asn Leu Lys Val Gly Ser

85 90 95 100

cat aca tcc aaa act ttc tgc tca agt att gcc ggc ctg tgc gat tac 393

His Thr Ser Lys Thr Phe Cys Ser Ser Ile Ala Gly Leu Cys Asp Tyr

105 110 115

cct gac gtt cgg cca tac aac ctc aca ttc ccc gta gcc aag tcc tcg 441

Pro Asp Val Arg Pro Tyr Asn Leu Thr Phe Pro Val Ala Lys Ser Ser

120 125 130

gtc act cgt cca ccc ccg agt ggc cag tct ccg atc cgt gtc gca cac 489

Val Thr Arg Pro Pro Pro Ser Gly Gln Ser Pro Ile Arg Val Ala His

135 140 145

att agt gac acg cac gtt gat ttg cag tac acc ccc gga gcc aat gca 537

Ile Ser Asp Thr His Val Asp Leu Gln Tyr Thr Pro Gly Ala Asn Ala

150 155 160

caa tgc acc aag cct att tgc tgt cgt agt ttc acc ccg gaa gac gcc 585

Gln Cys Thr Lys Pro Ile Cys Cys Arg Ser Phe Thr Pro Glu Asp Ala

165 170 175 180

ccc ggt aac gcc tca agc ccc tgc ggg ctc tgg ggt gac cat cac tgt 633

Pro Gly Asn Ala Ser Ser Pro Cys Gly Leu Trp Gly Asp His His Cys

185 190 195

gat cct cca ctt cgt ctc gag gac tcc atg atg gac gct atc gcg gcc 681

Asp Pro Pro Leu Arg Leu Glu Asp Ser Met Met Asp Ala Ile Ala Ala

200 205 210

ctc aat cca acg ttc tcc atc tat acg ggt gac gtt ccc cca cac gac 729

Leu Asn Pro Thr Phe Ser Ile Tyr Thr Gly Asp Val Pro Pro His Asp

215 220 225

atc tgg ctt gtg aac cag agc tca gtc ctg cag agc ttc aac tcc acc 777

Ile Trp Leu Val Asn Gln Ser Ser Val Leu Gln Ser Phe Asn Ser Thr

230 235 240

tac tcc aac ctg ggg aaa ctg ggc gtc gtc tac gcg gcc ttg gga aat 825

Tyr Ser Asn Leu Gly Lys Leu Gly Val Val Tyr Ala Ala Leu Gly Asn

245 250 255 260

cac gac gca gcc cca gtc aac ctc ttc cct tcg gac aaa gtc ccg ccc 873

His Asp Ala Ala Pro Val Asn Leu Phe Pro Ser Asp Lys Val Pro Pro

265 270 275

tct cac aac ccc caa tgg gcc tac gat gcc ctg gcc agc gac tgg tcc 921

Ser His Asn Pro Gln Trp Ala Tyr Asp Ala Leu Ala Ser Asp Trp Ser

280 285 290

aac ctc gtc gag ggt tca cct agc tca act acc aaa cac ggt tcc tac 969

Asn Leu Val Glu Gly Ser Pro Ser Ser Thr Thr Lys His Gly Ser Tyr

295 300 305

tcc atc atc cac ccc aat tcc aac ctc cgc atc atc tcc tac aac agc 1017

Ser Ile Ile His Pro Asn Ser Asn Leu Arg Ile Ile Ser Tyr Asn Ser

310 315 320

gtc ttc tac tac aaa tac aac ttc tac gca ttc cag gaa cca atg gaa 1065

Val Phe Tyr Tyr Lys Tyr Asn Phe Tyr Ala Phe Gln Glu Pro Met Glu

325 330 335 340

tac gac ccg gac aac caa ctc cac tgg ctc atc tcc gag ctg caa gcc 1113

Tyr Asp Pro Asp Asn Gln Leu His Trp Leu Ile Ser Glu Leu Gln Ala

345 350 355

gcc gag acc gcc ggc cag cgc gtc tgg atg atc gct cac atc ccc acc 1161

Ala Glu Thr Ala Gly Gln Arg Val Trp Met Ile Ala His Ile Pro Thr

360 365 370

ggc aac acc gac acc ctg cac gac tac tca cac tac ctc gat cag atc 1209

Gly Asn Thr Asp Thr Leu His Asp Tyr Ser His Tyr Leu Asp Gln Ile

375 380 385

atc aac cgc tac agc gcc agc atc gcc gcc ctc ttc ttc ggc cac act 1257

Ile Asn Arg Tyr Ser Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe Phe Gly His Thr

390 395 400

cac act gac ctc ttc caa att tcg tac acc aac tac acc gcc cgc acc 1305

His Thr Asp Leu Phe Gln Ile Ser Tyr Thr Asn Tyr Thr Ala Arg Thr

405 410 415 420

gcc gac tct gcc acc gca atc ggc tac gtc acc cca tcc atg acc ccg 1353

Ala Asp Ser Ala Thr Ala Ile Gly Tyr Val Thr Pro Ser Met Thr Pro

425 430 435

gac tcg ggc gcc cca gcc ttc cgc atc tac gac att gac ccc gtc acc 1401

Asp Ser Gly Ala Pro Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Ile Asp Pro Val Thr

440 445 450

ttc gct gtg ctc gac tac act gtc tac acg gcc gac atc aac agc acc 1449

Phe Ala Val Leu Asp Tyr Thr Val Tyr Thr Ala Asp Ile Asn Ser Thr

455 460 465

gat tcc ccc aac acc cca cct aaa tgg gtc aaa tac tac tcc gcc aaa 1497

Asp Ser Pro Asn Thr Pro Pro Lys Trp Val Lys Tyr Tyr Ser Ala Lys

470 475 480

gaa gcc tac ggc tcc ctt ctg acc cca ccc gtc acc gac ccc aat gtt 1545

Glu Ala Tyr Gly Ser Leu Leu Thr Pro Pro Val Thr Asp Pro Asn Val

485 490 495 500

gaa atg acc ccc tcc ttc tgg cac aag gtc aca gcc caa atg gag aag 1593

Glu Met Thr Pro Ser Phe Trp His Lys Val Thr Ala Gln Met Glu Lys

505 510 515

gat gac tcc gtc ttc cag gcg tgg tgg tcg cgc acc acg aga ggt tac 1641

Asp Asp Ser Val Phe Gln Ala Trp Trp Ser Arg Thr Thr Arg Gly Tyr

520 525 530

aat gtc acg gag tgc acg ggg gag tgt gca aag aat aag att tgc tcc 1689

Asn Val Thr Glu Cys Thr Gly Glu Cys Ala Lys Asn Lys Ile Cys Ser

535 540 545

ctg cgc ggc gga gac gca cag ttc aac tgc gag ggt ccg ggg acg ccg 1737

Leu Arg Gly Gly Asp Ala Gln Phe Asn Cys Glu Gly Pro Gly Thr Pro

550 555 560

ttt agt att acg aag cgg agt gat ggt gta aac gag gtg cat gtg gag 1785

Phe Ser Ile Thr Lys Arg Ser Asp Gly Val Asn Glu Val His Val Glu

565 570 575 580

agg ccc ttc tgt gag gat gca gtg ttg gcg agg att gtc ggg ggg ttg 1833

Arg Pro Phe Cys Glu Asp Ala Val Leu Ala Arg Ile Val Gly Gly Leu

585 590 595

gcg cgg aag ggt gtc gat gcg gaa aag ttt gtt cgg gag aag gcg aag 1881

Ala Arg Lys Gly Val Asp Ala Glu Lys Phe Val Arg Glu Lys Ala Lys

600 605 610

ctt tat gag aag gct taa gttgactggg gaaggattca atctctgtga 1929

Leu Tyr Glu Lys Ala

615

cgttgttgat atcttgtctt ggtatatata atgttgagtg tctaatgatc caccttcgga 1989

aacattaact ttaggactct ctttagaaag gatctactta tgccacggca taggatccgg 2049

agtatatagc gagaaagaaa ccaagcgtga cctgat2085

<210>5

<211>617

<212>PRT

<213>米曲霉

<400>5

Met Arg Pro Ala Phe Phe Leu Ala Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser Thr

1 5 10 15

His Ala Asn Pro Glu Ala Asp Leu Ala Gly Ser Ile Trp Asp Asp Phe

20 25 30

Lys Gly Ala Val Thr Cys Ala Gly Cys Glu Gly Leu Leu Gly Ala Leu

35 40 45

Lys Leu Val Ala Gly Leu Gly Gln Ser Ala Leu Glu His Val Val Thr

50 55 60

Asp Ala Cys Thr Leu Ala Gly Ile Glu Asp Asp Asp Val Cys Glu Gly

65 70 75 80

Ala Ile Lys Glu Glu Gly Ala Ala Val Tyr Tyr Ala Leu Lys Asn Leu

85 90 95

Lys Val Gly Ser His Thr Ser Lys Thr Phe Cys Ser Ser Ile Ala Gly

100 105 110

Leu Cys Asp Tyr Pro Asp Val Arg Pro Tyr Asn Leu Thr Phe Pro Val

115 120 125

Ala Lys Ser Ser Val Thr Arg Pro Pro Pro Ser Gly Gln Ser Pro Ile

130 135 140

Arg Val Ala His Ile Ser Asp Thr His Val Asp Leu Gln Tyr Thr Pro

145 150 155 160

Gly Ala Asn Ala Gln Cys Thr Lys Pro Ile Cys Cys Arg Ser Phe Thr

165 170 175

Pro Glu Asp Ala Pro Gly Asn Ala Ser Ser Pro Cys Gly Leu Trp Gly

180 185 190

Asp His His Cys Asp Pro Pro Leu Arg Leu Glu Asp Ser Met Met Asp

195 200 205

Ala Ile Ala Ala Leu Asn Pro Thr Phe Ser Ile Tyr Thr Gly Asp Val

210 215 220

Pro Pro His Asp Ile Trp Leu Val Asn Gln Ser Ser Val Leu Gln Ser

225 230 235 240

Phe Asn Ser Thr Tyr Ser Asn Leu Gly Lys Leu Gly Val Val Tyr Ala

245 250 255

Ala Leu Gly Asn His Asp Ala Ala Pro Val Asn Leu Phe Pro Ser Asp

260 265 270

Lys Val Pro Pro Ser His Asn Pro Gln Trp Ala Tyr Asp Ala Leu Ala

275 280 285

Ser Asp Trp Ser Asn Leu Val Glu Gly Ser Pro Ser Ser Thr Thr Lys

290 295 300

His Gly Ser Tyr Ser Ile Ile His Pro Asn Ser Asn Leu Arg Ile Ile

305 310 315 320

Ser Tyr Asn Ser Val Phe Tyr Tyr Lys Tyr Asn Phe Tyr Ala Phe Gln

325 330 335

Glu Pro Met Glu Tyr Asp Pro Asp Asn Gln Leu His Trp Leu Ile Ser

340 345 350

Glu Leu Gln Ala Ala Glu Thr Ala Gly Gln Arg Val Trp Met Ile Ala

355 360 365

His Ile Pro Thr Gly Asn Thr Asp Thr Leu His Asp Tyr Ser His Tyr

370 375 380

Leu Asp Gln Ile Ile Asn Arg Tyr Ser Ala Ser Ile Ala Ala Leu Phe

385 390 395 400

Phe Gly His Thr His Thr Asp Leu Phe Gln Ile Ser Tyr Thr Asn Tyr

405 410 415

Thr Ala Arg Thr Ala Asp Ser Ala Thr Ala Ile Gly Tyr Val Thr Pro

420 425 430

Ser Met Thr Pro Asp Ser Gly Ala Pro Ala Phe Arg Ile Tyr Asp Ile

435 440 445

Asp Pro Val Thr Phe Ala Val Leu Asp Tyr Thr Val Tyr Thr Ala Asp

450 455 460

Ile Asn Ser Thr Asp Ser Pro Asn Thr Pro Pro Lys Trp Val Lys Tyr

465 470 475 480

Tyr Ser Ala Lys Glu Ala Tyr Gly Ser Leu Leu Thr Pro Pro Val Thr

485 490 495

Asp Pro Asn Val Glu Met Thr Pro Ser Phe Trp His Lys Val Thr Ala

500 505 510

Gln Met Glu Lys Asp Asp Ser Val Phe Gln Ala Trp Trp Ser Arg Thr

515 520 525

Thr Arg Gly Tyr Asn Val Thr Glu Cys Thr Gly Glu Cys Ala Lys Asn

530 535 540

Lys Ile Cys Ser Leu Arg Gly Gly Asp Ala Gln Phe Asn Cys Glu Gly

545 550 555 560

Pro Gly Thr Pro Phe Ser Ile Thr Lys Arg Ser Asp Gly Val Asn Glu

565 570 575

Val His Val Glu Arg Pro Phe Cys Glu Asp Ala Val Leu Ala Arg Ile

580 585 590

Val Gly Gly Leu Ala Arg Lys Gly Val Asp Ala Glu Lys Phe Val Arg

595 600 605

Glu Lys Ala Lys Leu Tyr Glu Lys Ala

610 615

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>米曲霉的引物序列

<400>6

ggccacgcgt cgactagtac20

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>米曲霉的引物序列

<400>7

gacagtgtag tcgagcacag cgaa24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>米曲霉的引物序列

<400>8

gactctgcca ccgcaatcgg cta23

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>米曲霉的引物序列

<400>9

ggccacgcgt cgactagtac20

Claims

1.一种磷脂酶C，其于酸性至中性pH下显示活性，且实质上不水解除磷脂以外的磷酸酯。

2.根据权利要求1所述的磷脂酶C，其不具有对磷脂酰肌醇的特异性。

3.根据权利要求1或2所述的磷脂酶C，其最适pH值在pH3至pH6的范围内。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的磷脂酶C，其于pH7时的相对活性为20％以上。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的磷脂酶C，其由丝状菌产生。

6.根据权利要求5所述的磷脂酶C，所述丝状菌为曲霉属。

7.根据权利要求6所述的磷脂酶C，其由米曲霉(Aspergillusoryzae)或溜曲霉(Aspergillus tamarii)产生。

8.根据权利要求7所述的磷脂酶C，其由米曲霉的FERMABP-10200株或NBRC 4190株，或者溜曲霉的IAM 13907株产生。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的磷脂酶C，其具有以下性质：

1)以SDS-PAGE电泳法测得的分子量约为87000；

3)实质上不水解甘油磷酰胆碱及对硝基苯基磷酸；

4)于pH3至pH9范围内，水解源自蛋黄的卵磷脂；

5)于0℃至80℃的范围内，具有4)所述的水解活性；

6)在温度稳定性方面，当pH4.5时，在45℃以下的温度下是稳定的；以及

7)在pH稳定性方面，于pH3至pH10范围内是稳定的。

10.一种磷脂酶C，其是以下a)～d)中任一项所述的蛋白质：

a)包含序列号5所记载的氨基酸序列的蛋白质；

b)包含由序列号4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列的蛋白质；

c)包含a)或b)所述的氨基酸序列中减少、取代或附加一或多个氨基酸后的氨基酸序列，且具有磷脂酶C活性的蛋白质；以及

d)包含a)或b)所述的氨基酸序列而得的蛋白质。

11.一种被分离的丝状菌，其具有制造权利要求1～4、9和10中任一项所述的磷脂酶C的能力，且属于米曲霉或溜曲霉，但溜曲霉的IAM 13907株除外。

12.根据权利要求11所述的丝状菌，其为米曲霉的FERMABP-10200株或NBRC 4190株。

13.一种DNA，其是以下a)～d)中任一项所述的DNA：

a)包含序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA；

b)包含与a)所述DNA具有70％以上的核苷酸序列相同性的核苷酸序列，且编码具有磷脂酶C活性的蛋白质的DNA；

c)编码包含序列号5所记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA；以及

d)包含序列号4的编码区域(CDS)的核苷酸序列的DNA。

14.一种磷脂酶C，其是由权利要求13所述的DNA所编码的蛋白质。

15.一种磷脂酶C的制造方法，包括：

1)培养权利要求9所述的米曲霉或溜曲霉的工序；以及

2)从1)的培养产物中将磷脂酶C分离/纯化的工序。

16.根据权利要求15所述的磷脂酶C的制造方法，其中米曲霉为FERM ABP-10200株或NBRC 4190株的米曲霉，溜曲霉为IAM 13907株的溜曲霉。