DE10032058A1 - Mikrobielle Produktion von R-Phenylacetylcarbinol durch biologische Umwandlung von Benzaldehyd durch filamentöse Pilze - Google Patents
Mikrobielle Produktion von R-Phenylacetylcarbinol durch biologische Umwandlung von Benzaldehyd durch filamentöse PilzeInfo
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Abstract
Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch biologische Stoffumwandlung von Benzaldehyd mittels filamentöser Pilze.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von R-Phenylacetylcarbinol (R-PAC) durch biologische Umwandlung
von Benzaldehyd mittels filamentöser Pilze.
R-Phenylacetylcarbinol ist ein Zwischenprodukt bei der Her
stellung der pharmazeutischen Verbindung Ephedrin und Pseudo
ephedrin und wird z. Z. über eine biologische Umwandlung von Benz
aldehyd durch Hefekulturen hergestellt. Die biologische Umwand
lung wird durch das Enzym Pyruvat-Decarboxylase katalysiert.
Diese Katalyse kann entweder mit vollständigen Mikroorganismen
(bspw. Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis) oder mit
zellfreien Mikroorganismusextrakten (bspw. von Saccharomyces
cerevisiae, Candida utilis, Zymomonas mobilis) erfolgen.
Gene von Pyruvat-Decarboxylasen wurden aus den filamentösen
Pilzen Neurospora crassa (Alvarez et al., 1993), Aspergillus
parasiticus (Sanchis et al. 1994) und Aspergillus nidulans
(Lockington et al., 1997) isoliert.
In der Literatur wird beschrieben, dass folgende filamentöse
Pilzstämme Acyloin-Kondensationen ausüben: Bei einer Fermentation
von Benzaldehyd durch Aspergillus niger wurde nach Behandlung
mit NaBH4 (Cardillo et al., 1991) ein Diol nachgewiesen. Mucor
circinelloides soll Berichten zufolge Acyloin-Kondensationen mit
azyklisch ungesättigten Aldehyden, jedoch nicht mit Benzaldehyd,
als Substrat eingehen (Stumpf und Kieslich, 1991).
Es war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur mikrobiellen Produktion von R-Phenylacetylcarbinol durch
biologische Umwandlung von Benzaldehyd bereit zu stellen, welches
hinsichtlich der Gesamtausbeute, der enantiomeren Reinheit,
Stabilität und Sicherheit des mikrobiellen Katalysators oder Ver
fahrenskosten gegenüber Verfahren des Standes der Technik vor
teilhaft sein sollte.
Eine erste Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch biologische Umwand
lung von Benzaldehyd durch filamentöse Pilze.
Filamentöse Pilze werden gemäß Alexopoulos und Mims klassifiziert
(Alexopoulos und Mims, 1979). Erfindungsgemäß bevorzugt sind
filamentöse Pilze der Unterordnungen Ascomycotina, Zygomycotina
und Basidiomycotina, insbesondere solche aus der Gruppe Rhizopus,
Neurospora, Polyporus, Fusarium, Monilia, Paecilomyces, Mucor.
Besonders bevorzugt sind solche der Art Rhizopus javanicus,
Neurospora crassa, Polyporus eucalyptorum, Fusarium, lateritium,
Monilia sitophila, Paecilomyces lilacinus, Mucor rouxii, die im
nachstehenden experimentellen Abschnitt näher definiert sind.
Diese filamentösen Pilze sind dem Fachmann bekannt und lassen
sich leicht durch bekannte Techniken isolieren (Onions et al.,
1981), oder lassen sich von öffentlichen Aufbewahrungsorten
erhalten.
Eine Vorauswahl für geeignete filamentöse Pilze kann aus der
Kapazität des entsprechenden Pilzes zur Herstellung von Ethanol
aus Zucker getroffen werden (Singh et al., 1992; Skory et al.,
1997).
Die biologische Umwandlung von Benzaldehyd zu R-PAC erfordert die
Gegenwart einer Acetaldehyd-Quelle, die bspw. Acetaldehyd selbst
oder Pyruvat sein kann. Die Zugabe von Pyruvat ist bevorzugt,
insbesondere in einer Menge von 1 bis 2, vorzugsweise 1,5 Mol
Pyruvat pro Mol Benzaldehyd.
Die filamentösen Pilze lassen sich für die biologische Umwandlung
als vollständige Pilzmycelien oder in Form von Extrakten ver
wenden, die Pyruvat-Decarboxylase enthalten. Extrakte bedeutet
lösliche oder solubilisierte Formen von Enzymen der Pilze. Die
Extrakte enthalten aufgrund eines höheren Reinheitsgrads gewöhn
lich Enzyme mit einer höheren spezifischen Aktivität als die
vollständigen Pilzmycelien.
Die Enzyme des Extraktes, insbesondere die Pyruvat-Decarboxylase,
kann gegebenenfalls durch Zugabe von bspw. natürlichen Cofaktoren
der Enzyme, Puffern, Salzen stabilisiert werden. Die Pyruvat-
Decarboxylase des Extraktes lässt sich auch in immobilisierter
Form verwenden.
Das biologische Umwandlungsverfahren erfolgt gewöhnlich im
Lösungsmittel Wasser, vorzugsweise in einem pH-Wert-Bereich
zwischen 6,5 und 7,0. Die Temperatur kann in einem breiten
Bereich von 0 bis 60, vorzugsweise von 10 bis 40 und besonders
bevorzugt von 20 bis 30°C variiert werden.
Das Verfahren lässt sich entweder kontinuierlich oder als Batch-
Verfahren durchführen.
Die nachstehenden Beispiele stellen weitere Ausführungsformen und
Einzelheiten der Erfindung bereit.
Die Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität (Carboligierungs-Aktivität)
wurde durch Bildung von Phenylacetylcarbinol aus den Substraten
Pyruvat und Benzaldehyd in 20 min bei 25°C bestimmt. Die Proben
enthielten 200 µl Enzymlösung und 200 µl 2fach konzentrierte
Substratlösung (80 mM Benzaldehyd, 200 mM Pyruvat, 3 M Ethanol,
2 mM Thiaminpyrophosphat, 20 mM MgSO4 in 50 mM MES/KOH pH-Wert
7,0). Eine Einheit (U) wurde definiert als Enzymmenge, die 1 µmol
Phenylacetyl pro min erzeugt. Die Proteinkonzentrationen wurden
nach Bradford bestimmt. Die Phenylcarbinolkonzentrationen wurden
mittels HPLC, auf der Basis von Peakflächen, bezogen auf Phenyl-
acetylcarbinol-Standards mit einer Alltima C8-Säule bestimmt.
Zur Bestimmung der Phenylacetylcarbinolenantiomere wurde eine
Chiracel OD-Säule verwendet.
Rohextrakte der folgenden filamentösen Pilzstämme wurde auf ihre
Fähigkeit zur Umwandlung von Benzaldehyd und Pyruvat in Phenyl
acetylcarbinol untersucht:
Rhizopus javanicus NRRL 13161
Rhizopus javanicus NRRL 2871
Rhizopus oryzae NRRL 6201
Rhizopus oryzae NRRL 1501
Aspergillus oryzae NRRL 694
Aspergillus tamarii NRRL 429
Neurospora crassa ATCC 9277
Neurospora crassa ATCC 9683
Polyporus eucalyptorum UNSW 805400
Fusarium lateritium UNSW 807100
Fusarium sp. UNSW 871900
Monilia sitophila NRRL1275
Paecilomyces lilacinus NRRL 1746
Mucor rouxii ATCC 44260
Rhizopus javanicus NRRL 13161
Rhizopus javanicus NRRL 2871
Rhizopus oryzae NRRL 6201
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Neurospora crassa ATCC 9277
Neurospora crassa ATCC 9683
Polyporus eucalyptorum UNSW 805400
Fusarium lateritium UNSW 807100
Fusarium sp. UNSW 871900
Monilia sitophila NRRL1275
Paecilomyces lilacinus NRRL 1746
Mucor rouxii ATCC 44260
NRRL bedeutet Northern Regional Research Laboratory (inzwischen
das National Center For Agricultural Utilization Research).
UNSW bedeutet University of New South Wales.
Die Stämme wurden in Erlenmeyer-Kolben mit Baumwollstopfen bei
30°C in flüssigem Medium aus 10 g/l Hefeextrakt, 20 g/l Pepton,
90 g/l Glukose mit einem Anfangs-pH-Wert von 6 gezüchtet. Das
Schütteln für 20 bis 70 Std. bei 230 U/min. lieferte Sauer
stoff für eine rasche Biomasseproduktion. Die Kolben wurden
dann mit Parafilm verschlossen und 23 bis 29 Std. bei 60 U/min
geschüttelt.
Die Mycelien wurden in einem Büchner-Trichter geerntet und
zweimal mit Puffer gewaschen. Das gefrorene Mycel wurde mittels
Mörser und Glasperlen als Mahlmittel zu einem Pulver gemahlen.
Aufbrech-Puffer wurde zugegeben, und die Extrakte wurden durch
Zentrifugation geklärt und auf ein vorbestimmtes Volumen ein
gestellt. Die Rohextrakte waren daher in Bezug auf das Anzucht
volumen etwa 4fach konzentriert. Sie wurden in Aliquots bei -70°C
aufbewahrt.
Biologische Umwandlungen wurden in einem Maßstab von 1,2 ml
in 2 ml Schraubglasgefäßen mit 80% (Vol./Vol.) Rohextrakt und
Substratkonzentrationen von 100 mM Benzaldehyd und 150 mM Pyruvat
in Gegenwart von 20 mM MgSO4, 1 mM TPP, 1 Tablette Complete-
Protease-Inhibitor (Boehringer)/25 ml und 50 mM MES/KOH, pH-Wert
7,0, durchgeführt.
Die Gefäße wurden vertikal bei 35 U/min und 22,5°C gedreht. Nach
20 min und nach 20 Std. wurden 300 µl-Proben entnommen und zu
30 ml 100% (Gew./Vol.) Trichloressigsäure dazugegeben. Nach Ent
fernung des Proteins durch Zentrifugation wurden die Überstände
mittels HPLC auf Phenylacetylcarbinol analysiert.
Die höchsten spezifischen Carboligierungsaktivitäten wurden der
Fig. 1 zufolge von Rhizopus, Fusarium und Mucor mit 0,27 bis
0,45 U/mg Protein erhalten. Die Rhizopus-Stämme ergaben eben
falls die höchste Gesamtmenge an Pyruvat-Decarboxylase (8,1 bis
15,5 U), die sich aus einer 20-ml-Kultur gewinnen ließ.
Die besten Anfangs-Produktivitäten von 3,8 bis 6,5 g/l Phenyl
acetylcarbinol in 20 min wurde mit Rohextrakten aus Rhizopus und
Mucor erhalten (s. Fig. 3). Rhizopus und Fusarium ergaben die
höchsten endgültigen Phenylacetylcarbinol-Konzentrationen von 74
bis 84 mM (11,7 bis 12,6 g/l, s. Fig. 4). Dies waren 78 bis 84%
der theoretischen Ausbeute, bezogen auf die Benzaldehyd-Anfangs
konzentration. Diese Ergebnisse wurden ohne Optimierung der
experimentellen Bedingungen erzielt.
Der enantiomere Überschuss von R-Phenylacetylcarbinol aus den
endgültigen Biotransformations-Proben ist in der nachstehenden
Tabelle gezeigt.
Die nachstehenden filamentösen Pilzstämme wurden unter Verwendung
vollständiger Mycelien auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von
Benzaldehyd in Phenylacetylcarbinol untersucht:
Rhizopus javanicus NRRL 13161
Rhizopus javanicus NRRL 2871
Rhizopus oryzae NRRL 6201
Rhizopus oryzae NRRL 1501
Aspergillus oryzae NRRL 694
Aspergillus tamarii NRRL 429
Rhizopus javanicus NRRL 13161
Rhizopus javanicus NRRL 2871
Rhizopus oryzae NRRL 6201
Rhizopus oryzae NRRL 1501
Aspergillus oryzae NRRL 694
Aspergillus tamarii NRRL 429
Die Stämme wurden in YEPG-Medium (90 g/l Glucose, 10 g/l Hefe
extrakt, 20 g/l Pepton, Anfangs-pH-Wert 6) in Erlenmeyerkolben
mit Baumwollstopfen bei 30°C gezüchtet. Die Rhizopus-Stämme wurden
12 Std. bei 230 U/min geschüttelt, die Aspergillus-Stämme 48 Std.
Zur Induktion der Pyruvat-Decarboxylase wurden die Kulturen in
sterile Schraubglasgefäße überführt und 3,5 Std. bei 30°C stehen
gelassen. Es erfolgte eine starke Gasentwicklung, was auf eine
starke Pyruvat-Decarboxylase-Aktivität hinwies.
Die Kulturbrühe wurde verworfen, und eine gleiche Menge YEPG,
einschließlich 100 mM Benzaldehyd wurde zugegeben. Die Kulturen
wurden in den Schraubglasgefäßen bei 30°C und 230 U/min ge
schüttelt.
Nur 0,2 bis 0,7 mM Phenylacetylcarbinol wurde aus 100 mM
Benzaldehyd in 12 Std. erzeugt, und die Phenylacetylcarbinol
konzentrationen wurden nach weiteren 12 Std. nicht erhöht. Trotz
der geringen Mengen wird gezeigt, dass sich Phenylacetylcarbinol
ohne vorhergehendes Aufbrechen der Mycelien erzeugen lässt.
Die PDC von Rhizopus javanicus wurde mittels Aceton-Fällung
partiell gereinigt.
0,6-2 M (vorzugsweise 2 M) MOPS/KOH, pH-Wert 7
20 mM MgSO4
20 mM MgSO4
1 mM TPP
150-600 mM Pyruvat (Verhältnis: Pyruvat/Benzaldehyd) = 1,5
100-394 mM Benzaldehyd
7,2 U/ml PDC Carboligase-Aktivität
(1 Einheit Carboligase-Aktivität ist definiert als die Menge
Enzym, die 1 µmol PAC aus 40 mM Benzaldehyd und 100 mM Pyruvat in 1 min bei pH-Wert 7 und 25°C erzeugt).
150-600 mM Pyruvat (Verhältnis: Pyruvat/Benzaldehyd) = 1,5
100-394 mM Benzaldehyd
7,2 U/ml PDC Carboligase-Aktivität
(1 Einheit Carboligase-Aktivität ist definiert als die Menge
Enzym, die 1 µmol PAC aus 40 mM Benzaldehyd und 100 mM Pyruvat in 1 min bei pH-Wert 7 und 25°C erzeugt).
Die Umsetzung wurde durch Zugabe von PDC-Enzym gestartet. Nach
dem Mischen für 18 Std. bei 6°C wurde die Umsetzung gestoppt,
indem die Proben 20fach mit 10% (Gew./Vol.) Trichloressigsäure
verdünnt wurden. Das Protein wurde durch Zentrifugation entfernt,
und die PAC-Konzentrationen wurden durch HPLC analysiert.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 5 gezeigt. PAC-Konzentrationen
bis zu 43 g/l wurden mit Rhizopus javanicus PDC erhalten. Die
Ausbeuten von PAC, bezogen auf das anfängliche Benzaldehyd, waren
86% für 295 mM anfängliches Benzaldehyd und 73% für 394 mM
anfängliches Benzaldehyd. Der enantiomere Überschuss (ee-Wert)
betrug 98,7.
Die höchsten beschriebenen PAC-Konzentrationen aus biologischen
Umwandlungen sind 28,6 g/l mittels partielle gereinigter PDC aus
der Hefe Candida utilis (Shin und Rogers, 1996; Rogers, Shin und
Wang, 1997) und 30,3 g/l bei einem Fermentationsverfahren mit der
Hefe Torulopsis (JP 2000-93189A).
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Fig. 1 zeigt spezifische Carboligierungsaktivitäten in
Rohextrakten. Die Fehlerbalken zeigen Minimal- und
Maximalergebnisse aus den drei Kulturen pro Stamm an.
Fig. 2 zeigt die Gesamt-Carboligierungsaktivitäten pro Kolben
mit 20 ml-Kultur. Die Fehlerbalken zeigen Minimal- und
Maximalergebnisse aus den drei Kulturen pro Stamm an.
Fig. 3 zeigt die Anfangsproduktivität für Phenylacetylcarbinol
(PAC). Die Fehlerbalken zeigen Minimal- und Maximal
ergebnisse aus den drei Kulturen pro Stamm an.
Fig. 4 zeigt die Anfangs-Phenylacetylcarbinol-(PAC)-
Konzentrationen und die theoretischen Ausbeuten auf
der Basis der anfänglichen Benzaldehydkonzentrationen.
Die Fehlerbalken zeigen Minimal- und Maximalergebnisse
aus den drei Kulturen pro Stamm an.
Fig. 5 zeigt die Auswirkung der Substratkonzentration auf die
PAC-Konzentration mit PDC auf Rhizopus javanicus.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von R-Phenylacetylcarbinol durch
biologische Umwandlung von Benzaldehyd mittels filamentöser
Pilze.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die filamentösen Pilze
aus der Gruppe Rhizopus, Neurospora, Polyporus, Fusarium,
Monilia, Paecilomyces, Mucor ausgewählt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die filamentösen Pilze aus
der Gruppe Rhizopus, Fusarium, Mucor ausgewählt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die filamentösen Pilze
Rhizopus javanicus oder Mucor rouxii sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, wobei die biologische
Umwandlung von Benzaldehyd in Gegenwart von Pyruvat erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei 1 bis 2 Mol Pyruvat pro Mol
Benzaldehyd zugegeben werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, wobei die biologische
Umwandlung mit Extrakten filamentöser Pilze erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Extrakte Pyruvat-
Decarboxylase enthalten.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Pyruvat-Decarboxylase
stabilisiert ist.
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