CN1440460A - 通过用丝状真菌对苯甲醛进行生物转化的微生物方法生产r－苯基乙酰基甲醇 - Google Patents
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Abstract
用丝状真菌对苯甲醛进行生物转化生产R－苯基乙酰基甲醇(PAC)的方法。
Description
本发明涉及用丝状真菌对苯甲醛进行生物转化生产R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的方法。
R-苯基乙酰基甲醇是生产制药化合物麻黄碱和伪麻黄碱的中间物，目前通过酵母培养物对苯甲醛进行生物转化来生产。该生物转化是由丙酮酸脱羧酶所催化的。该催化作用的实施既可以使用完整的微生物个体(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊假丝酵母(Candida utilis))也可以用不含细胞个体的微生物(如酿酒酵母、产朊假丝酵母和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis))提取物。
丙酮酸脱羧酶的基因已经从丝状真菌粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)(Alvarez等，1993)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)(Sanchis等，1994)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Lockington等，1997)中分离出来了。
文献中报道了下列丝状真菌菌株可以进行偶姻缩合：用黑曲霉(Aspergillus niger)对苯甲醛进行发酵，在用NaBH4处理后检测到二醇(Cardillo等，1991)。据报导卷枝毛霉(Mucor circinelloides)可以用无环不饱和醛而非苯甲醛作底物进行偶姻缩合(Stumpf和Kieslich 1991)。
本发明的目的是提供通过对苯甲醛进行生物转化来微生物生产R-苯基乙酰基甲醇的方法，该方法在总产率、对映体的纯度、微生物催化剂的稳定性和安全性或该方法的成本方面应优于现有技术的方法。
本发明的第一个实施方案是用丝状真菌对苯甲醛进行生物转化生产R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的方法。
丝状真菌是按照Alexopoulos和Mims的分类法来分类的(Alexopoulos和Mims，1979)。
本发明优选子囊菌亚门(Ascomycotina)、接合菌亚门(Zygomycotina)和担子菌亚门(Basidiomycotina)的丝状真菌，尤其是选自如下的丝状真菌：根霉属(Rhizopus)、脉孢菌属(Neurospora)、多孔菌属(Polyporus)、镰孢霉属(Fusarium)、丛梗孢属(Monilia)、拟青霉属(Paecilomyces)和毛霉属(Mucor)。
特别优选的是下列菌种的丝状真菌：爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、粗糙脉孢菌、Polyporus eucalyptorum、砖红镰孢(Fusarium lateritium)、好食丛梗孢(Monilia sitophila)、淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和Mucor rouxii，在以下的实验部分中将对它们作进一步详细说明。
这些丝状真菌对本领域的技术人员来说非常熟悉并能容易地用现有技术加以分离(Onions等，1981)，或可以从公共保藏单位获得。
可以根据各种真菌由糖产生乙醇的能力(Singh等，1992；Skory等，1997)，预选出适宜的丝状真菌。
将苯甲醛生物转化成R-苯基乙酰基甲醇需要有乙醛来源，这可以是乙醛本身也可以是丙酮酸。优选加入丙酮酸，尤其是每摩尔的苯甲醛加入1-2，优选1.5摩尔的丙酮酸。
用来做生物转化的丝状真菌可以是完整的真菌菌丝体形式或是含丙酮酸脱羧酶的提取物形式。提取物是指可溶解的或已溶解的真菌酶。由于经过了更高级别的提纯，与完整的真菌菌丝体相比，通常提取物含有更高比活性的酶。
提取物中的酶，尤其是丙酮酸脱羧酶，可以任选地通过加入如酶的天然辅因子、缓冲液、盐类来稳定。提取物中的丙酮酸脱羧酶也能以固定化的形式使用。
该生物转化的方法通常在作为溶剂的水中，优选在pH6.5～7.0之间进行。温度可在0～60℃的较大范围内变化，优选10～40℃并尤以20～30℃为优。
该方法既可以连续实施也可以分批进行。
以下实施例进一步提供了本发明的实施方案和具体细节。
实施例1
丙酮酸脱羧酶活性的测定
丙酮酸脱羧酶的活性(醛连接活性)通过从底物丙酮酸和苯甲醛在25℃时20分钟内形成苯基乙酰基甲醇的情况来测定。样品中含有200μl酶溶液和200μl的2倍浓缩底物溶液(80mM苯甲醛，200mM丙酮酸，3M乙醇，2mM硫胺焦磷酸素，20mM MgSO4，在50mM MES/KOH中，pH7.0)。一个单位(U)被定义为每分钟能产生1微摩尔苯基乙酰基甲醇的酶量。蛋白质的浓度是按照Bradford方法来估计的。苯基乙酰基甲醇的浓度是由HPLC在使用Alltima C8柱时参照苯基乙酰基甲醇标准根据峰面积来确定的。为确定苯基乙酰基甲醇对映体，使用的是手性OD柱。
实施例2
用真菌菌丝体的提取物来进行生物转化
对下列丝状真菌菌株的粗提取物将苯甲醛和丙酮酸转化为苯基乙酰基甲醇的能力进行测试：
爪哇根霉NRRL 13161
爪哇根霉NRRL 2871
米根霉(Rhizopus oryzae)NRRL 6201
米根霉NRRL 1501
米曲霉(Aspergillus oryzae)NRRL 694
溜曲霉(Aspergillus tamarii)NRRL 429
粗糙脉孢菌 ATCC 9277
粗糙脉孢菌 ATCC 9683
Polyporus eucalyptorum UNSW 805400
砖红镰孢UNSW 807100
镰孢霉UNSW 871900
好食丛梗孢NRRL 1275
淡紫拟青霉NRRL 1746
Mucor rouxii ATCC 44260
NRRL是指农业研究机构保藏中心(现在的国家农业应用研究中心(National Center For Agricultural Utilization Research))。
UNSW是指新南威尔士大学。
菌株在用棉花塞口的锥型瓶中30℃条件下液体培养基中生长，所述液体培养基的组成为：酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖90g/l，起始pH值为6。用230rpm的速率振荡培养20-70小时，为快速生物质产生提供氧气。然后将锥型瓶用石蜡封口膜进行封口，并用60rpm的速率振荡培养23-29小时。
用布氏漏斗收集菌丝体，并用缓冲液冲洗两遍。将冰冻的菌丝在研钵中以玻璃珠作研磨剂磨成粉末。加入裂解缓冲液后用离心法将提取物澄清，并将其调整到设定的体积。如此，这种粗提取物相对培养液体积发生四倍浓缩。将其等分储存于-70℃的条件下。
生物转化是在旋紧盖的2ml小玻璃瓶中以1.2ml的级别进行的，瓶中包含有80％v/v粗提取物，浓度为100mM苯甲醛和150mM丙酮酸的底物，还有20mM MgSO4、1mM TPP、1片完全蛋白酶抑制剂(Boehringer)/25ml和50mM MES/KOH，pH7.0。
这些小瓶在22.5℃条件下以35rpm的速率垂直旋转。20分钟后及20小时后取出300μl的样品，并加入到30μl 100％[w/v]的三氯乙酸中。通过离心法除去蛋白质后，用HPLC对上清液中的苯基乙酰基甲醇进行分析。
如图1所示，最大的醛连接比活性来自具有0.27至0.45U/mg蛋白质的根霉属、镰孢霉属和毛霉属。根霉属的菌株还产生了最高的丙酮酸脱羧酶总量(8.1-15.5U)，其可从20ml的培养液回收得到。
使用根霉属和毛霉属的粗提取物在20分钟内得到3.8-6.5g/l苯基乙酰基甲醇的最好初始产量(见表3)。根霉属和镰孢霉属导致最高的最终苯基乙酰基甲醇浓度78-84mM(11.7-12.6g/l，见图4)。这是基于最初苯甲醛浓度的理论产量的78-84％。这些结果是在没有对实验条件进行任何优化的情况下获得的。
生物转化的最终样品中R-苯基乙酰基甲醇的对映体过量见下表：
| 菌株 | R-PAC的对映体过量[％] |
| 爪哇根霉NRRL 13161 | 90.4 |
| 爪哇根霉NRRL 2871 | 93.0 |
| 米根霉NRRL 6201 | 92.9 |
| 米根霉NRRL 1501 | 91.4 |
| 米曲霉NRRL 694 | 92.6 |
| 溜曲霉NRRL 429 | 92.2 |
| 粗糙脉孢菌ATCC 9277 | 73.4 |
| 粗糙脉孢菌ATCC 9683 | 未确定 |
| Polypous eucalyptorum UNSW805400 | 98 |
| 砖红镰孢UNSW 807100 | 91 |
| 镰孢霉UNSW 871900 | 92 |
| 好食丛梗孢NRRL 1275 | 82 |
| 淡紫拟青霉NRRL 1746 | 93 |
| Mucor rouxii ATCC 44260 | 91 |
实施例3
用完整的真菌菌丝体进行生物转化
对使用完整的菌丝体时以下丝状真菌将苯甲醛转化为苯基乙酰基甲醇的能力进行检测：
爪哇根霉NRRL 13161
爪哇根霉NRRL 2871
米根霉NRRL 6201
米根霉NRRL 1501
米曲霉NRRL 694
溜曲霉NRRL 429
这些菌株在用棉花塞口的锥型瓶中30℃条件下生长在YEPG培养基中，该培养基的组成为：葡萄糖90g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，起始pH值为6。根霉属菌株用230rpm的速率振荡培养12小时，而曲霉属菌株振荡培养48小时。为了诱导丙酮酸脱羧酶，培养物被转入到无菌拧紧盖的小玻璃瓶中，于30℃条件下静置3.5小时。气体以高的速度产生，这表明高的丙酮酸脱羧酶活性。
将液体培养基抛弃后加入等量的YEPG培养基(包括100mM苯甲醛)。将培养物在拧紧盖的小玻璃瓶中在30℃条件下以230rpm的速率振荡培养。12小时从100mM苯甲醛只产生了0.2-0.7mM苯基乙酰基甲醇，并且再过12小时苯基乙酰基甲醇的浓度也没有增加。尽管产量低，但实验表明不预先破碎菌丝体也可以从苯甲醛产生苯基乙酰基甲醇。
实施例4
用爪哇根霉的丙酮酸脱羧酶PDC对苯甲醛进行生物转化
通过丙酮沉淀反应对爪哇根霉的丙酮酸脱羧酶(PDC)进行部分纯化。
反应组成：
0.6-2M(优选2M)MOPS/KOH，pH7
20mM MgSO4
1mM TPP
150-600mM 丙酮酸(丙酮酸/苯甲醛的比＝1.5)
100-394mM 苯甲醛
7.2U/ml PDC 醛连接酶活性
(1个单位醛连接酶活性被定义为：在25℃和pH值为7的条件下，1分钟内由40mM苯甲醛和100mM丙酮酸产生出1μmol苯基乙酰基甲醇PAC所用的酶量。)
加入丙酮酸脱羧酶(PDC)以起始反应。在6℃条件下混合18小时后，用10％[w/v]的三氯乙酸将样品稀释20倍以终止反应。用离心法将蛋白质去除后，用HPLC对苯基乙酰基甲醇PAC的浓度进行分析。
结果
结果如表5所示。使用爪哇根霉的丙酮酸脱羧酶(PDC)时，得到浓度高达43g/l的苯基乙酰基甲醇PAC。基于起始的苯甲醛，PAC的产量在苯甲醛起始为295mM时是86％，在苯甲醛起始为394mM时是73％。对映体过量(ee-值)为98.7。
已报道的生物转化产生的苯基乙酰基甲醇(PAC)的最高浓度，使用来自产朊假丝酵母(Shin and Rogers，1996；Rogers，Shin and Wang，1997)的部分纯化的丙酮酸脱羧酶(PDC)时为28.6g/l，而使用球拟酵母属(Torulopsis)酵母(JP 2000-93189A)进行发酵时为30.2g/l。
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图1显示粗提取物的醛连接比活性。误差条表示的是来自每个菌株的三个培养物的最小和最大值。
图2显示每个含20ml培养液的锥形瓶中总的醛连接活性。误差条表示的是来自每个菌株的三个培养物的最小和最大值。
图3显示苯基乙酰基甲醇(PAC)的最初产量。误差条表示的是来自每个菌株的三个培养物的最小和最大值。
图4显示苯基乙酰基甲醇(PAC)的最初浓度及基于起始苯甲醛浓度的理论产量。误差条表示的是来自每个菌株的三个培养物的最小和最大值。
图5显示用爪哇根霉的丙酮酸脱羧酶(PDC)时底物浓度对苯基乙酰基甲醇(PAC)产量的影响。
Claims (9)
1.通过丝状真菌对苯甲醛进行生物转化生产R-苯基乙酰基甲醇的方法。
2.依照权利要求1的方法，其中所述丝状真菌选自：根霉属、脉孢菌属、多孔菌属、镰孢霉属、丛梗孢属、拟青霉属和毛霉属。
3.依照权利要求2的方法，其中所述丝状真菌选自：根霉属、镰孢霉属和毛霉属。
4.依照权利要求3的方法，其中所述丝状真菌是爪哇根霉或Mucorrouxii。
5.依照权利要求1-4的方法，其中在有丙酮酸的条件下对苯甲醛进行所述生物转化。
6.依照权利要求5的方法，其中每摩尔苯甲醛中加入1-2摩尔丙酮酸。
7.依照权利要求1-6的方法，其中用丝状真菌的提取物来进行所述生物转化。
8.依照权利要求7的方法，其中所述提取物中含有丙酮酸脱羧酶。
9.依照权利要求8的方法，其中使所述丙酮酸脱羧酶处于稳定状态。
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