CN108165591B

CN108165591B - 一种l-木糖的酶法制备方法

Info

Publication number: CN108165591B
Application number: CN201711366823.6A
Authority: CN
Inventors: 陆茜
Original assignee: Shanghai Linkchem Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Linkchem Technology Co ltd
Priority date: 2017-12-18
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: CN108165591A

Abstract

本发明公开了一种L‑木糖的酶法制备方法，属于生物工程领域。本发明将2‑酮基‑L‑古龙酸溶于含有镁离子和焦磷酸硫胺素的缓冲液中，再向缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶，在适宜的温度下进行酶催化反应，反应结束后利用高效液相色谱仪检测，证明有L‑木糖的生成。采用本发明方法，找到一种新的生产L‑木糖的方法，原料成本低，对环境无污染，具有重要的经济效益和社会效益。

Description

一种L-木糖的酶法制备方法

技术领域

本发明涉及一种L-木糖的酶法制备方法，属于生物工程领域。

背景技术

木糖是一种五碳糖，D-木糖主要存在于植物和动物体内。木糖属于无热量甜味剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。食用木糖能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂。

目前制备木糖均采用酸法提取，酸法生产木糖多采用硫酸进行水解，但酸法生产木糖有如下缺点：①生产过程中采用大量硫酸，硫酸使原料中的纤维素和半纤维素及其它糖类物质水解，产生多种副产物，影响后提取工艺和产品质量。②酸法提取木糖由于生产过程中加入大量强酸强碱液体，生产过程中产生大量生产废液，对环境造成了巨大污染。③由于酸水解的糖液杂质多，使得后处理效率低，化工程序多，对设备要求高，增加环保成本。

目前，L-木糖的生产主要是由化学合成的方法，存在上述的不利因素。L-木糖也可由L-木酮糖转化生成，但是L-木酮糖属于稀有糖，价格较高，不宜作为生产L-木糖的原料。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶法催化反应制备L-木糖的方法。

本发明所述的酶法催化反应制备L-木糖的方法，其步骤如下：

步骤1：将2-酮基-L-古龙酸溶于缓冲液中。

步骤2：向缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶、氯化镁以及焦磷酸硫胺素得到催化反应体系。

步骤3：将催化反应体系放在一定温度环境下进行反应。

在本发明的一种实施方式中，步骤1中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为100-600mM，例如300mM。

在本发明的一种实施方式中，步骤2缓冲液浓度为10-100mM、pH为5-9，例如pH为7.5的50mM柠檬酸缓冲液或者磷酸缓冲液或者MES缓冲液。

在本发明的一种实施方式中，步骤2中丙酮酸脱羧酶的酶用量为40～48U/mL，例如2.5mL反应体系中添加2mL酶活50-60U/mL的酶液。

在本发明的一种实施方式中，步骤2催化反应体系中氯化镁浓度1～10mM，焦磷酸硫胺素的浓度为0～2mM；例如氯化镁浓度5mM，焦磷酸硫胺素的浓度为1mM。

在本发明的一种实施方式中，步骤3在40-60℃条件下进行催化反应，例如在50℃环境下反应15h。

2-酮基-L-古龙酸为维生素C前体，已实现工业化生产，原料价格低，由2-酮基-L-古龙酸在丙酮酸脱羧酶的催化下生成L-木糖，尚未发现与此相关的文献报道。由实验验证可得，采用本发明的方法，可以由2-酮基-L-古龙酸在丙酮酸脱羧酶的催化下生成L-木糖，为L-木糖的生产提供了新的原料和方法。而且由于酶法制备木糖，具有高效、专一、能耗低、污染小、操作简单易控，而且原料单一，副产物少，产物易纯化；利用酶法制备L-木糖对菌种无毒害性，可直接用于酵母菌的生物转化实验，生产木糖醇，此种方法不需要脱毒，发酵性能好，利于木糖转化为木糖醇，并且酶法催化2-酮基-L-古龙酸制备L-木糖的过程中没有强酸强碱等腐蚀性溶液的加入，不会给环境带来污染，因此，这种制备L-木糖的方法为以后绿色工业化生产奠定基础。

附图说明

图1：2-酮基-L-古龙酸在丙酮酸脱羧酶的催化下生成L-木糖的原理

图2:丙酮酸脱羧酶蛋白电泳图

图3:L-木糖标准样品的液相色谱图

图4：2-酮基-L-古龙酸的液相色谱图

图5：优化条件下的转化进程图

具体实施方式

实施例1：

(1)制备丙酮酸脱羧酶

根据Genebank中酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因序列设计引物，如下：

上游引物：CATGCCATGGATTCAATTACTTTGGGTAAATATTTGTTCG

下游引物：CCGCTCGAGTTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCAGTC

将丙酮酸脱羧酶的PCR产物插入到质粒pET-22b后，构建重组表达质粒pET-22b-pdc。

取0.01g重组表达质粒pET-22b-pdc转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后，在600μL的LB培养基中培养1h，取100μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的固体LB平板，37℃培养10h，从而获得可以高效表达丙酮酸脱羧酶的基因工程菌。

将构建好的工程菌接种于含有氨苄青霉素的TB培养基中，37℃下培养至菌体OD₆₀₀达到0.6时，加诱导剂IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃下继续培养13h，离心收集菌体细胞，用磷酸缓冲液重悬，用超声破碎仪对细胞进行超声破碎，10000×离心20min，上清即为丙酮酸脱羧酶酶液，经测定，酶液的酶活为56.8U/mL。(蛋白电泳图如图2)

(2)反应体系包含2mL步骤(1)制备的丙酮酸脱羧酶，1-10mM氯化镁，0-2mM焦磷酸硫胺素和300mM的2-酮基-L-古龙酸溶解于50mM的pH5.8的柠檬酸缓冲液中，将反应体系放置于50℃条件下反应15h。

(3)反应结束后，离心去除不溶物，并将上清过0.22mm滤膜，所得的反应液采用高效液相色谱法进行检测，木糖含量的分析使用Aminex HPX-87H色谱柱，色谱条件:柱温：40℃；流动相：5mM/L H₂SO₄；进样量：10μL；检测器：RID；流速：0.5mL/min。(色谱图如图3、4、5)。结果显示5mM氯化镁，1mM焦磷酸硫胺素时，2-酮基-L-古龙酸的转化率最高，值为45.3％，即生成了20.4g/LL-木糖。

实施例2

与实施例1基本相同，不同之处在于缓冲液为MES缓冲液，pH7.5，5mM氯化镁，1mM焦磷酸硫胺素和300mM 2-酮基-L-古龙酸，转化率与实施例1相比，提高了16.9％，即生成了28.0g/L L-木糖。

实施例3

与实施例1基本相同，不同之处在于反应温度为45℃，5mM氯化镁、1mM焦磷酸硫胺素、300mM 2-酮基-L-古龙酸，转化率与实施例1相比，提高了24.5％，即生成了31.4g/L L-木糖。

实施例4

实施例1基本相同，不同之处在于，缓冲液为MES缓冲液，pH7.5，5mM氯化镁，1mM焦磷酸硫胺素和300mM 2-酮基-L-古龙酸，在45℃下进行转化反应，结果显示，转化率与实施例1相比，提高了49.6％，总转化率为94.9％，即生成了42.7g/L L-木糖。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凌凯医药科技有限公司

<120> 一种L-木糖的酶法制备方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catgccatgg attcaattac tttgggtaaa tatttgttcg 40

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgctcgagt tgcttagcgt tggtagcagc agtc 34

Claims

1.一种酶法催化反应制备L-木糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将2-酮基-L-古龙酸溶于pH 7.5的50mM的MES缓冲液中；

步骤2：向pH 7.5的50mM的MES缓冲液中加入丙酮酸脱羧酶、氯化镁以及焦磷酸硫胺素得到催化反应体系，所述氯化镁浓度为5mM，所述焦磷酸硫胺素的浓度为1mM；

步骤3：将催化反应体系放在45℃的温度环境下进行反应。

2.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法，其特征在于，步骤1中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为100-600mM。

3.根据权利要求1所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法，其特征在于，步骤2中丙酮酸脱羧酶的酶用量为40～48U/mL。

4.根据权利要求1或2所述的一种酶法催化反应制备L-木糖的方法，其特征在于，步骤1中使用的原料2-酮基-L-古龙酸浓度为300mM。