CN105255844A - 一种利用高温破壁制备重组酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用高温破壁制备重组酶的方法，属于生物工程技术领域。为了解决现有的破壁效果差的问题，提供一种利用高温破壁制备重组酶的方法，该方法包括将含有表达重组酶的重组大肠杆菌接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行活化培养，使菌体活化之后再加入诱导剂，然后，再控制温度在25℃～37℃进行低温发酵培养；低温发酵培养结束之后，将温度升温至39℃～60℃继续进行高温发酵培养，高温发酵培养结束之后，直接从发酵液中提取相应的目标重组酶，得到相应的目标重组酶。本发明的方法能够使细胞在培养过程中就能够使细胞壁处于破壁状态，达到高效的破壁效果。

Description

一种利用高温破壁制备重组酶的方法
技术领域
本发明涉及一种利用高温破壁制备重组酶的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
近年来，随着我国社会对环境保护要求的提高，以酶工程技术为核心的绿色化工工艺取得了较多的应用。诸如阿托伐他汀、辛伐他汀、孟鲁司特、阿扎那韦等等医药化工产品的生产纷纷转向生物催化剂进行催化合成来实现。
而生物催化剂的生产则通常采用基因工程技术，以大肠杆菌为宿主，通常借助于强启动子T7，使宿主菌的资源充分用于外源蛋白(重组酶)的表达。发酵结束后，采用离心或膜过滤的方法收集大肠杆菌细胞，并使细胞破壁后释放其中的酶蛋白(重组酶)得到所需的生物催化剂。
目前，对于大肠杆菌或重组大肠杆菌进行破壁的方法主要有：研磨法：通过在细菌悬液中加入研磨剂，研磨时研磨剂颗粒碰撞而破碎细胞，可用的研磨剂有氧化铝、玻璃珠、玻璃粉等。超声波法：利用超声波对细胞内所产生的空穴作用破菌，同时超声过程产生的漩涡对菌体也有剪切力，有助于破菌。压力法：分为两种：a.气压法，就是对样品罐加压，使菌体内压力增加，然后泄压，此时菌体内压力高于外界，菌体自身涨破；b.高压均质机的破菌过程，细胞悬液以极快的速度撞击静止面，使菌体破碎，这是目前工业生产中应用最多的方法。渗透法：将悬液与高渗透压液体中平衡，再转移至低渗透压液体中，此时大量水分渗入细胞，使细胞破裂。冻融法：细胞内胞液冻结时产生冰晶，体积增大，撑破菌体。酶解法：分为菌体自溶和溶菌酶两种方法，菌体自溶可以在大肠杆菌发酵时加入低浓度抗生素，干扰胞壁形成，有助于菌自溶，但加入非质粒抗性的抗生素往往干扰菌的生长，难以得到较好的结果。溶菌酶就是水解1，4-糖苷键，破坏胞壁中的肽聚糖，对阳性菌作用较大。对于阴性菌，因为存在脂多糖，必须加入EDTA、去垢剂等以螯合连接相邻脂多糖的Ca、Mg离子，从而破坏脂多糖。但是，由于种种限制，上述各种破壁方法中，仅气压法中的采用高压均质机破壁法真正用于酶的工业化制备上。然而高压均质机破壁法对设备依赖严重，高压均质机价格高昂易损坏，对发酵原料要求也较高，同时还需要在发酵结束后先离心去掉发酵清液，再重新配制缓冲液将菌体重悬，均质破壁后还需要进一步离心或超滤去除菌体碎片，最终得到可以应用的生物催化剂。该过程对发酵原料要求高，对设备依赖严重，工序多，废水多，对于酶的高效制备，工业上仍期待有突破性的方法。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提出一种利用高温破壁制备重组酶的方法，解决的问题是如何通过高温处理对细胞壁进行破壁来提取相应重组酶的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种利用高温破壁制备重组酶的方法，该方法包括以下步骤：
A、将含有表达重组酶的重组大肠杆菌接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行活化培养，使菌体活化之后再加入诱导剂，然后，再控制温度在25℃～37℃进行低温发酵培养；
B、低温发酵培养结束之后，将温度升温至39℃～60℃继续进行高温发酵培养，高温发酵培养结束之后，直接从发酵液中提取相应的目标重组酶，得到相应的目标重组酶。
本发明利用高温破壁制备重组酶的方法，通过在低温条件下将菌体活化培养成活之后，再加入诱导剂，目的是为了更有效的使外源蛋白(即相应的重组酶)得到表达，使能够充分利用大肠杆菌中的资源，保证重组酶的产量和效率，相比与现有一般的菌体培养过程基本是将温度控制在37℃以下的条件下培养至结束，通过后续破壁来实现提取相应的外源蛋白(重组酶)，本发明是直接在培养过程中将温度升温继续高温培养，目的是使在细胞处于较年轻状态时提高温度来使细胞壁处于较脆弱的状态下加速代谢，从而使在营养物质消耗到一定程度时利于细胞裂解，从而实现直接在培养过程中就能够使细胞壁处于破壁状态，达到破壁的效果。从而避免了收集菌体、采用均质机进行破壁的过程，具有工艺简洁，废水量少的优点，是一种更为绿色环保的工艺路线，具有重要的应用价值；同时，还能够保证酶活的性能，实现既保证提高破壁的效果，降低生产成本，又能够实现高酶活的性能。由于本发明的主要如何实现对大肠杆菌细胞壁的破壁效果，因此，对于大肠杆菌中的重组酶并没有具体的限定要求，如所述的含有表达重组酶的重组大肠杆菌还可以是含有表达转氨酶、羰基还原酶、水解酶、异构酶或裂解酶等的重组大肠杆菌，同样能够实现本发明的效果。上述所述活化培养采用本领域常规的温度即可，一般控制温度在37℃以下进行活化培养即可，优选，活化培养的温度控制在25℃～37℃。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，还包括向发酵液中加入能够与目标重组酶相互作用的载体进行固定化，得到固定化后的重组酶。由于本发明发酵结束之后就能够实现破壁的效果，避免了菌体收集、破壁、酶提取纯化等过程，直接离心收集的上清液即可用于相应的催化反应，具有工艺更简洁的效果。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤A中所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌选自含有表达羰基还原酶的重组大肠杆菌或含有表达转氨酶的重组大肠杆菌。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌选自含有表达His-tag标记的羰基还原酶的重组大肠杆菌或含有表达His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌。通过His-tag标记目的是为了有利于后续相应的酶与载体具有更好的连接效果，使实现更好的固定化作用。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤A中所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌中还含有T7启动子。T7启动子能高效启动下游外源蛋白的表达。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤A中所述诱导剂选自乳糖或异丙基巯基半乳糖苷。有利于发酵培养过程中相应的重组酶的表达，使充分利用大肠杆菌中的资源生成相应的重组酶，有利于提高收率效果。作为进一步的优选，所述异丙基巯基半乳糖苷的浓度为0.1mmol/L～10mmol/L或所述乳糖的浓度为5～50g/L。通过诱导剂在发酵液中的浓度优化更有利于重组酶的表达。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤A中所述低温发酵培养的时间为0.5～8.0小时。通过控制加入诱导剂后的发酵时间，目的是为了控制细胞壁的生成状态，使细胞处于较年轻的状态(即生长不完全)进入高温状态培养，从而使细胞较脆弱，在高温状态时就能够加速代谢，实现对细胞壁进行破壁的效果。作为进一步的优选，所述低温发酵培养的时间为1.0～4.0小时。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤B中所述能与目标重组酶相互作用的载体选自带有环氧基团的树脂、带有活性醛的树脂或带有金属离子的树脂。能够与相应的重组酶(酶蛋白)直接作用，将重组酶偶联到树脂上，从而起到更好的固定重组酶的效果。作为进一步的优选，所述带有环氧基团的树脂可以选自采用如西安蓝晓科技新材料股份有限公司的SepliteLX-1000EP或SummitPharmaceuticalsInternational的EP113/M等；所述含有活性醛的树脂如选自经戊二醛活化的LX-1000EA或LX-1000HA等；所述含金属离子的树脂如用Ni离子或钴离子活化的SepliteLX-1000IDA或FP-IDA405/EB等。
在上述利用高温破壁制备重组酶的方法中，作为优选，步骤A中所述发酵培养基选自LB培养基或TB培养基。具有原料易于，对大肠杆菌培养效果好的优点。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明利用高温破壁制备重组酶的方法，通过在培养过程中使细胞壁中在细胞处于较年轻状态时提高温度来使细胞壁处于较脆弱的状态下加速代谢，从而使在营养物质消耗到一定程度时利于细胞裂解，从而实现直接在培养过程中就能够使细胞壁处于破壁状态，达到破壁的效果。
2.本发明利用高温破壁制备重组酶的方法，直接将载体加入发酵液得到相应的固定化酶或将上清液直接用于催化合成反应即可，无需后续复杂用采用高成本的均质机进行破壁处理，大大的简化了生产工艺，提高生产效率，且也降低了生产的成本，有利于工业化的生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达氯酮还原酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌进行活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液450mL，继续控制温度在37℃进行低温发酵培养5h之后，将温度逐渐提高到40℃，再进行高温发酵培养30h，发酵过程取样测定酶活，基本上高温发酵培养24h和30h的酶活基本上相当，高温发酵培养结束后，直接从发酵液中提取目标重组酶，得到相应的目标重组酶，如直接将发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物。上清液可以直接用于下游生物转化反应。对上述培养30h的发酵液进行离心，得到相应的上清液和沉淀物，其中上清液中酶活为2100U/m，而沉淀为850U/ml。可见，本发明的方法培养结束之后即实现了破壁的效果，无需后续再采用均质机等进行破碎细胞壁的过程。
实施例2
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达氯酮还原酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌进行活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液且使乳糖在整体发酵液中的浓度达到50g/L，继续控制温度在37℃进行低温发酵培养2h之后，将温度逐渐提高到39℃，再进行高温发酵培养24h，高温发酵培养结束后，如直接将发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物。上清液可以直接用于下游生物转化反应，其中上清液中酶活为3600U/m，而沉淀物中酶活小于100U/ml。可见，本发明的方法培养结束之后即实现了破壁的效果，无需后续再采用均质机等进行破碎细胞壁的过程。
实施例3
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达N-端含有His-tag标记的氯酮还原酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，上述的含有T7启动子和表达N-端含有His-tag标记的氯酮还原酶的重组大肠杆菌可以按照常规的基因工程在含有T7启动子和表达氯酮还原酶的重组大肠杆菌接入His-tag标记即可，然后，控制温度在35℃下通气搅拌进行活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入异丙基巯基半乳糖苷且使其在发酵液中的浓度达到0.1mmol/L，继续控制温度在25℃进行低温发酵培养4h之后，将温度逐渐提高到45℃，再进行高温发酵培养22h，高温发酵培养结束后，取1.0L发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物。上清液可以直接用于下游生物转化反应，其中上清液中酶活为2840U/mL，而沉淀物中酶活小于100U/mL。另取2.0L发酵液加入50g螯合钴离子的FP-IDA载体进行固定化，在室温条件下搅拌1h，过滤后洗涤得到相应固定化后的氯酮还原酶，可用于相应化合物的生物催化反应。
当然，本实施例中的能够与目标重组酶相互作用的载体螯合钴离子的FP-IDA载体也可以采用经戊二醛活化的LX-1000EA或LX-1000HA；或者用Ni离子或钴离子活化的FP-IDA405/EB等载体代替，同样能够实现对相应目标重组酶进行固化的效果。
实施例4
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达转氨酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后，控制温度在25℃下通气搅拌进行活化培养0.5h后，再加入含有20wt％乳糖溶液且使乳糖在整体发酵液中的浓度达到50g/L，继续控制温度在25℃进行低温发酵培养1.0h之后，将温度逐渐提高到45℃，再进行高温发酵培养24h，高温发酵培养结束后，将发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物。上清液可以直接用于下游生物转化反应。
实施例5
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的TB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达N-端含有His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，上述的含有T7启动子和表达His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌可以按照常规的基因工程在含有T7启动子和表达转氨酶的重组大肠杆菌接入His-tag标记即可，然后，控制温度在30℃下通气搅拌进行活化培养1.0h后，再加入含有20wt％乳糖溶液且使乳糖在整体发酵液中的浓度达到20g/L，继续控制温度在30℃进行低温发酵培养0.5h之后，将温度逐渐提高到40℃，再进行高温发酵培养20h。发酵结束后在发酵液中加入150gFP-IDA-Co树脂，在室温条件下搅拌1h，过滤后洗涤得到相应的固定化转氨酶，可用于相应化合物的生物催化反应。
实施例6
LB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物30g，蛋白胨60g，氯化钠30g，去离子水5L，调节pH值至7.0-7.2，在121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的LB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达N-端含有His-tag标记的氯酮还原酶的重组大肠杆菌菌种接入LB培养基中，上述的含有T7启动子和表达His-tag标记的氯酮还原酶的重组大肠杆菌可以按照常规的基因工程在含有T7启动子和表达氯酮还原酶的重组大肠杆菌接入His-tag标记即可，然后，控制温度在30℃下通气搅拌进行活化培养2.0h后，再加入异丙基巯基半乳糖苷溶液且使其在整体发酵中的浓度达到10.0mmol/L，继续控制温度在30℃进行低温发酵培养3.0h之后，将温度逐渐提高到45℃，再进行高温发酵培养24h，高温发酵培养结束后，取3.0L发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，其中上清液中酶活为3058U/mL，而沉淀中酶活小于100U/mL。上清液可以直接用于下游生物转化反应。另取2.0L发酵液，直接加入50gSepliteLX-1000IDA-Co,在室温条件下搅拌1h，过滤后洗涤得到固定化后的氯酮还原酶，可用于相应化合物的生物催化反应。
当然，本实施例中的能够与目标重组酶相互作用的载体也可以采用经戊二醛活化的LX-1000EA或LX-1000HA；或者用Ni离子或钴离子活化的FP-IDA405/EB等载体代替，同样能够实现对相应目标重组酶进行固化的效果。
实施例7
LB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物30g，蛋白胨60g，氯化钠30g，去离子水5L，调节pH值至7.0-7.2，在121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的LB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达N-端含有His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌菌种接入LB培养基中，上述的含有T7启动子和表达His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌可以按照常规的基因工程在含有T7启动子和表达转氨酶的重组大肠杆菌接入His-tag标记即可，然后，控制温度在35℃下通气搅拌进行活化培养2.0h后，再加入异丙基巯基半乳糖苷溶液且使其在整体发酵中的浓度达到5.0mmol/L，继续控制温度在28℃进行低温发酵培养6.0h之后，将温度逐渐提高到40℃，再进行高温发酵培养21h，高温发酵培养结束后，将发酵液在10000rpm的条件下离心10min，得到上清液和沉淀物，上清液中即含有相应的转氨酶。
取上述酶液(上清液)14ml，加入异丙胺盐酸盐1.83g，磷酸吡哆醛21mg，DMSO2ml，于43℃搅拌分次加入西它列丁中间体1.0g(2.0mlDMSO溶解)，反应20h后检测，转化率为92％。
对照例1
TB培养基的制作：在10L发酵罐中加入酵母抽提物144g，蛋白胨72g，甘油24g，水4L，磷酸二氢钾13.8g，磷酸氢二钾75.2g，121℃灭菌20min，冷却至37℃，得到相应的LB培养基用于发酵；
将60mL含有T7启动子和表达重组氯酮还原酶的重组大肠杆菌菌种接入TB培养基中，然后，控制温度在37℃下通气搅拌活化培养2h后，将温度降到25℃，再加入含有20wt％乳糖的乳糖溶液450mL，继续控制温度在37℃进行发酵培养至24h，培养结束后发酵得到相应的发酵液6.5L。取样离心，得到相应的清液和沉淀物，分别进行测定酶活，其中，清液中酶活＜100U/ml，而沉淀中酶活为3100U/m。
将发酵液经10000rpm离心10min，得到相应的上清液和沉淀，其中沉淀以1.0L50mmol/L且pH值为7.0的磷酸钠缓冲液进行重悬，而后经高压均质破壁2遍后得到相应的破壁酶液，再经10000rpm离心10min，得到待用酶液，相应的酶活为3300U/m。
上述酶活测试表明，采用低温状态下的发酵液需经后续破壁处理后才能得到相应的重组酶。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
A、将含有表达重组酶的重组大肠杆菌接种到经过灭菌处理的发酵培养基中进行活化培养，使菌体活化之后再加入诱导剂，然后，再控制温度在25℃～37℃进行低温发酵培养；
B、低温发酵培养结束之后，将温度升温至39℃～60℃继续进行高温发酵培养，高温发酵培养结束之后，直接从发酵液中提取目标重组酶，得到相应的目标重组酶。
2.根据权利要求1所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，还包括向发酵液中加入能够与目标重组酶相互作用的载体进行固定化，得到固定化后的目标重组酶。
3.根据权利要求1或2所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌选自含有表达羰基还原酶的重组大肠杆菌或含有表达转氨酶的重组大肠杆菌。
4.根据权利要求3所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌选自含有表达His-tag标记的羰基还原酶的重组大肠杆菌或含有表达His-tag标记的转氨酶的重组大肠杆菌。
5.根据权利要求1或2所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌中还含有T7启动子。
6.根据权利要求3所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述含有表达重组酶的重组大肠杆菌中还含有T7启动子。
7.根据权利要求1或2所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述诱导剂选自乳糖或异丙基巯基半乳糖苷。
8.根据权利要求1或2所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述低温发酵培养的时间为0.5～8.0小时。
9.根据权利要求2所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤B中所述能够与目标重组酶相互作用的载体选自带有环氧基团的树脂、带有活性醛的树脂或带有金属离子的树脂。
10.根据权利要求1所述利用高温破壁制备重组酶的方法，其特征在于，步骤A中所述发酵培养基选自LB培养基或TB培养基。
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