CN105567756A - 一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明筛选得到来源于海洋的巴利阿里假单胞菌(Pseudomonas？balearica)，在加入底物酮、氨基供体和辅助底物情况下，利用该菌株的全细胞及粗酶液催化酮不对称还原胺化制备手性胺。本发明确定了该菌株全细胞催化和粗酶液催化的不对称还原胺化的反应体系和反应条件。本发明在生物催化制备手性胺领域具有较好的工业应用前景，对于今后海洋新型生物催化剂的开发和手性胺的绿色合成方法的研究具有重要意义。

Description

一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法
技术领域
本发明涉及一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法，利用全细胞以及粗酶液催化不对称还原胺化获得手性胺。
背景技术
海洋是复杂、开放、变化的生物有机系统，其复杂的结构特征造就了生物类群的多样性。海洋细菌有着其他生态系统成员不具有的特性，成为新型独特的生物催化剂的重要来源。海洋环境独特性以及细菌产酶多样性，使得海洋蛋白与陆地生物蛋白有着极大差异。独特海洋环境造就具有耐盐、耐热、适冷、耐压和耐酸、耐碱等特性的极端酶。近年来，国内外科研工作者在海洋细菌生物酶资源开发方面取得了许多成果。目前研究工作较多集中于脂肪酶、蛋白酶、溶菌酶、转移酶和多糖水解酶等。对海洋氧化还原酶的催化特性研究也逐渐受到重视，不仅可认知生物合成的新途径和新机理，探讨关键代谢过程和生物合成机制，也可可实现海洋资源高值化。
手性胺是许多生物活性分子的结构单元，是重要的医药和精细化工中间体。约40％的光学活性药物含有手性胺单元。我国已成为全球最大的原料药生产国和出口国，但长期以来面临着产品全世界使用，但污染留在中国的严峻问题。因此，高效生物催化是解决手性药物制造并减少环境污染等问题的重要途径。手性胺高效制备技术是手性药物领域发展的关键技术。手性胺的化学制备方法主要有：氨基酸或其衍生物的还原、醛或酮与亚胺的偶合以及环氧化合物的氨基化开环等。生物法制备手性胺主要通过酶催化拆分或不对称还原实现。用于制备手性胺的酶主要有脂肪酶、转胺酶和氧化还原酶。相比较而言，胺脱氢酶催化酮和氨基供体不对称还原胺化制备手性胺简洁高效而且易实现辅酶再生。
目前，胺脱氢酶主要由氨基酸脱氢酶突变获得，直接通过筛选获得的胺脱氢酶较少。研究报道，从StreptomycesvirginiaeIFO12827中分离纯化得到依赖辅酶NADH的胺脱氢酶，在pH10的条件下催化系列羟酮还原胺化生成氨基醇，pH7时反方向催化氨基醇生成相应的羟酮。但该酶的反应选择性尚属较低，且无基因和蛋白结构等信息的报道。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的胺脱氢酶的菌株是实现手性胺有效制备的关键。海洋环境中长期的演化过程使得海洋微生物体内的氧化还原酶具有与陆地来源酶不同的底物特异性和立体选择性。因此从海洋微生物中筛选得到新型胺脱氢酶将开辟新的胺脱氢酶的来源。
发明人之前筛选获得的来源于海洋的基尔假单细胞菌(Pseudomonaskilonensis)的胺脱氢酶，已获得专利授权(ZL201310198839.6)。在前期工作的基础上，本申请进一步对海洋来源菌株进行筛选。
发明内容
本发明提供了一种海洋菌株及其胺脱氢酶催化制备手性胺的方法，从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的胺脱氢酶的不同以往报道的新菌株巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)，并考察了氨基供体、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌株全细胞催化及其粗酶液催化酮不对称还原胺化制备的反应体系和反应条件。
本发明的技术方案如下：
一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，利用巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)进行培养，制备全细胞或粗酶液；以酮为底物，加入氨基供体以及辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞或者粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺；包括：
1)菌株的培养：将巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)以1％(ml/ml)的接种量接种入216L培养基中培养；所述巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市中国科学院微生物研究所，保藏日期为2014-03-25，CGMCC编号为8967；
2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；将细胞用缓冲液配制成25～5000mg/L的细胞液；
或
2’)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液，用缓冲液调节粗酶液浓度至5～1500mg/L；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的25～5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，25～5000mg/L的细胞，反应体系pH7～13，在0℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间30～180小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺；
或
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的5～1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，5～300mg/L的粗酶液，反应体系pH8～12，在10℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间10～90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺。
本发明的关键在于：
(1)微生物催化转化反应的反应体系
采用本发明生产手性胺时，是利用胺脱氢酶的高度对映体选择性，催化酮的不对称还原胺化，获得R-胺或S-胺，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NAD(P)H的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下(式中Microorganism意为全细胞，crudeenzyme意为粗酶液)：
反应体系所涉及的酮的分子结构式如通式I所示:
其中R1,R2是C2～10的烷基、芳香基或羟基，R1,R2均可任选被取代基取代一次或多次。
其中，对芳香酮以及分子式为CxHyO，其中x为4～7，y为8～14，酮的分子量为72～115的脂肪酮具有较好的催化活性和选择性。
相应地，反应体系中所涉及的胺的分子结构式如通式II所示:
其中，不对称还原胺化具有对映体选择性，对R型的选择性更好，得到的产物手性胺为R型。
反应体系涉及的氨基供体为：丙氨酸、氨水、NH4Cl、NH4NO3或氨基烷烃中的一种或多种，其中优选氨水和/或NH4Cl。
反应体系涉及的辅助底物为：葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇中的一种或多种，其中优选葡萄糖和甘油。
反应体系涉及的缓冲液为：pH为7～13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、碳酸钾中的一种或多种，其中优选pH为9的Tris-盐酸缓冲液。
所述步骤1)中的培养条件为：起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
所述步骤1)中，216L培养基组成为10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L柠檬酸钠,0.2g/LNH4NO3,1.0g/L醋酸钠，用海水配置。
(2)催化转化反应的条件
如上步骤1)～3)所示，本发明通过全细胞催化及粗酶液催化底物酮不对称还原胺化得到产物手性胺。反应体系中加入底物酮、氨基供体、辅助底物用于辅酶再生。优化了该菌株全细胞、粗酶液催化酮不对称还原胺化制备手性胺的反应体系和反应条件。
本发明采用以下方法分析检测产物手性胺：
分析检测方法为取上述步骤3)或3’)得到的反应液，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为DaicelOD-H，检测波长254nm，流动相为体积比为90/9.9/0.1的正己烷/乙醇/二乙胺，流速为1ml/min，柱温为35℃。产物胺的对映体纯度用高效液相色谱测定。收率的定义为反应结束后得到产物的摩尔数和反应开始时加入底物的摩尔数的比值；产品R-胺的对映体纯度的计算公式为：e.e.％＝(R-S)/(R+S)×100％,其中S代表S-胺的含量，R代表R-胺的含量。
本发明的有益效果是：
本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的胺脱氢酶的新菌株，与已报道的菌株相比，该菌株及其胺脱氢酶对部分底物酮不对称还原胺化具有对映体选择性，对R型的选择性更好；且对底物酮催化偏好与已报道的菌株不同，对芳香酮以及分子式为CxHyO(其中x为4～7，y为8～14，酮的分子量为72～115)的脂肪酮具有较好的催化活性和选择性；新菌株的获得及其催化特性的挖掘拓展了不对称还原制备手性胺的范围。
本发明还考察了氨基供体、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该菌株全细胞、粗酶液催化酮不对称还原胺化制备手性胺的反应体系和反应条件，为特定种类手性胺的工业化制备提供了思路和依据。
本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高等优点，设备简单，在生物催化制备手性胺和海洋生物资源高值化开发领域具有较好的工业应用前景。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为实施例1中涉及的4-甲基-2-戊酮、R-4-甲基-2-戊胺、S-4-甲基-2-戊胺标准样品的高效液相色谱图，其中4-甲基-2-戊酮保留时间为6.157min，S-4-甲基-2-戊胺和R-4-甲基-2-戊胺的保留时间分别为11.533min和11.637min。
图2为实施例8中涉及的苯氧基-2-丙酮、R-苯氧基-2-丙胺、S-苯氧基-2-丙胺标准样品的高效液相色谱图，其中苯氧基-2-丙酮的保留时间为6.435min，R-苯氧基-2-丙胺和S-苯氧基-2-丙胺的保留时间分别为7.24min和8.681min。
图3为实施例8中得到的产物R-苯氧基-2-丙胺的高效液相色谱图，显示胺脱氢酶不对称还原生成的R-苯氧基-2-丙胺具有较高的光学纯度。
图4为实施例9中涉及的5-甲基-2-己酮、S-5-甲基-2-己胺、R-5-甲基-2-己胺标准样品的的高效液相色谱，其中5-甲基-2-己酮的保留时间为8.658min，S-5-甲基-2-己胺和R-5-甲基-2-己胺的保留时间分别为14.529min和14.665min。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1
1)菌株的培养：巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)的培养：巴利阿里假单胞菌(P.balearica)以1％(ml/ml)的接种量，将菌种接入50mL216L培养基中。216L培养基组成为10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L柠檬酸钠,0.2g/LNH4NO3,1.0g/L醋酸钠，用海水配置。培养条件为：起始pH7.0，装液量体积分数为10％，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养时间72小时。
2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，10000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心操作3次获得细胞，将细胞用pH9.0的Tris-盐酸缓冲液配制成5000mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.05mol/L4-甲基-2-戊酮，0.002mol/L丙氨酸，0.003mol/L甘油，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，pH9.0，5000mg/L的细胞，反应体积1L，反应体系pH9.0，在反应温度0℃下，100rpm震荡反应36小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物R-4-甲基-2-戊胺。
4)分离与检测：取步骤3)中反应结束后的反应液离心除去细胞，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为DaicelOD-H，检测波长254nm，流动相为体积比为90/9.9/0.1的正己烷/乙醇/二乙胺，流速为1ml/min，柱温为35℃。产物胺的对映体纯度用高效液相色谱测定。收率的定义为反应结束后得到产物的摩尔数和反应开始时加入底物的摩尔数的比值；产品胺的对映体纯度的计算公式为：e.e.％＝(R-S)/(R+S)×100％,其中S代表S-胺的含量，R代表R-胺的含量。
经检测，实施例1中的产物的高效液相色谱图中，在与R-4-甲基-2-戊胺标准品相应的位置处出现样品峰，表明得到的产物为R-4-甲基-2-戊胺，且具有较高的光学纯度；产物R-4-甲基-2-戊胺光学纯度为e.e99.0％，收率为89.5％。
实施例2
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH10的0.2mol/L的磷酸钾缓冲液配制成2500mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的2500mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.01mol/L5-癸酮，0.01mol/L2-氨基丙烷，0.02mol/L仲丁醇，0.2mol/L的磷酸钾缓冲液，pH10，2500mg/L的细胞，反应体积500mL，反应体系pH10，在反应温度50℃下，300rpm震荡反应70小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到R-5-癸胺。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物胺收率为60.1％，e.e.值为95.7％。
实施例3
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH7.5的0.2mol/L的Tris-盐酸缓冲液配制成25mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的25mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.01mol/L苯乙酮，0.02mol/L氨水，0.01mol/L异丙醇，0.2mol/L的Tris-盐酸缓冲液，25mg/L的细胞，反应体系pH7.5，反应体积5L，在反应温度10℃下，300rpm震荡反应，反应时间180小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物R-苯乙胺。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物胺收率为91.7％，e.e.值为93.2％。
实施例4
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH13的0.01mol/L的乙酸钠缓冲液配制成1500mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的1500mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.02mol/L2-丁酮，0.2mol/LNH4Cl，0.2mol/L葡萄糖，0.01mol/L的乙酸钠缓冲液，1500mg/L的细胞，反应体积500mL，反应体系pH13，在反应温度50℃下，200rpm震荡反应，反应时间30小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺R-2-丁胺。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，计算产物胺的收率为81.1％，e.e.值为97.7％。
实施例5
1)～2)实验步骤如实施例1的步骤1)～2)，且步骤2)中将细胞用pH9.0的0.2mol/L的碳酸钠缓冲液配制成250mg/L的细胞液；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的250mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.05mol/L2-羟基-3-丁酮，0.1mol/L丙氨酸，0.05mol/L乙醇，0.2mol/L的碳酸钠缓冲液，pH9.0，250mg/L的细胞，反应体积1L，反应体系pH9.0，在反应温度70℃下，300rpm震荡反应，反应时间30小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物R-2-羟基-3-丁胺。
4)分离与检测：按照实施例1中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物胺收率为70.1％，e.e.值为95.7％。
实施例6
1)实验步骤如实施例1的步骤1)；
2’)粗酶液制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，10000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-HCl缓冲液(pH7.6)重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心操作3次获得细胞，配制成浓度为150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液进行破碎处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声2秒，间隔4秒，超声40次，功率200W，然后4℃、12000rpm将破碎液离心15min去除不溶性细胞碎片，收集上清液即为含有胺脱氢酶的粗酶液，用pH11的0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液调节粗酶液浓度为300mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的300mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.04mol/L3-羟基-5-庚酮，0.2mol/LNH4NO3，0.001～0.2mol/L甲酸，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，300mg/L的粗酶液，反应体系pH11，在反应温度10℃下，100～300rpm震荡反应，反应时间90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物R-3-羟基-5-庚胺。
4)分离与检测：取步骤3’)中反应结束后的反应液，加入等体积的正己烷，混合震荡均匀，离心吸取上清液备用，重复上述过程，合并萃取液。用高效液相色谱检测，色谱柱为DaicelOD-H，检测波长254nm，流动相为体积比为90/9.9/0.1的正己烷/乙醇/二乙胺，流速为1ml/min，柱温为35℃。产物胺的对映体纯度用高效液相色谱测定。收率的定义为反应结束后得到产物的摩尔数和反应开始时加入底物的摩尔数的比值；产品胺的对映体纯度的计算公式为：e.e.％＝(R-S)/(R+S)×100％，其中S代表S-胺的含量，R代表R-胺的含量。
经检测，产物胺收率为91.2％，e.e.值为90.4％。
实施例7
1)～2’)实验步骤如实施例6的步骤1)～2’)，且步骤2’)中用pH11的0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液调节粗酶液浓度为5mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的5mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.01mol/L3-己酮，0.2mol/L丙氨酸，0.001～0.2mol/L甲酸，0.01mol/L的Tris-盐酸缓冲液，5mg/L的粗酶液，反应体系pH11，在反应温度70℃下，100～300rpm震荡反应，反应时间90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺R-3-己胺。
4)按照实施例6中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，产物胺收率为69.1％，e.e.值为88.4％。
实施例8
1)～2’)实验步骤如实施例6的步骤1)～2’)，且步骤2’)中用pH12的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液调节粗酶液浓度为1500mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.05mol/L苯氧基-2-丙酮，0.2mol/LNH4Cl，0.2mol/L甘油，0.05mol/L的乙酸钠缓冲液，1500mg/L的粗酶液，反应体系pH12，在反应温度70℃下，200rpm震荡反应，反应时间45小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺R-苯氧基-2-丙胺。
4)按照实施例6中的步骤4)进行分离检测，结果显示，高效液相色谱图中，在与R-苯氧基-2-丙胺标准品相应的位置处出现样品峰，表明得到的产物为R-苯氧基-2-丙胺，且具有较高的光学纯度；用高效液相色谱检测，计算产物胺的收率为97.5％，e.e.值为92.7％。
实施例9
1)～2’)实验步骤如实施例6的步骤1)～2’)，且步骤2’)中用pH12的0.05mol/L的乙酸钠缓冲液调节粗酶液浓度为1500mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系为0.05mol/L5-甲基-2-己酮，0.2mol/LNH4Cl，0.2mol/L甘油，0.05mol/L的乙酸钠缓冲液，1500mg/L的粗酶液，反应体系pH12，反应体积800mL，在反应温度70℃下，200rpm震荡反应，反应时间30小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物R-5-甲基-2-己胺。
4)按照实施例6中的步骤4)进行分离检测，结果显示，高效液相色谱图中，在与R-5-甲基-2-己胺标准品相应的位置处出现样品峰，表明得到的产物为R-5-甲基-2-己胺，且具有较高的光学纯度；用高效液相色谱检测，计算产物R-5-甲基-2-己胺的收率为95.5％，e.e.值为98.7％。
实施例10
1)～2’)实验步骤如实施例6的步骤1)～2’)，且步骤2’)中用pH8的0.01～0.2mol/L的乙酸钠缓冲液调节粗酶液浓度为100mg/L；
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的100mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.001mol/L2-异辛酮，0.002mol/L氨水，0.004mol/L乙醇，0.01～0.2mol/L的乙酸钠缓冲液，100mg/L的粗酶液，反应体系pH8，反应体积2L，在反应温度50℃下，200rpm震荡反应，反应时间50小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺R-2-异辛胺。
4)按照实施例6中的步骤4)进行分离，用高效液相色谱检测，计算产物胺的收率为71.5％，e.e.值为95.7％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实例揭露如上，然而并非用于限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许改变或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，根据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：利用巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)进行培养，制备全细胞或粗酶液；以酮为底物，加入氨基供体以及辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞或者粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺；包括：
1)菌株的培养：将巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)以1％的接种量接种入216L培养基中培养；所述巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC编号为8967；
2)全细胞的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；将细胞用缓冲液配制成25～5000mg/L的细胞液；
或
2’)粗酶液的制备：将步骤1)培养结束获得的发酵液，离心获得细胞，弃上清液，沉淀重悬，充分洗涤后离心，重复上述沉淀重悬-洗涤-离心若干次，获得细胞；细胞用超声破碎仪破碎后离心，得到含有胺脱氢酶的粗酶液，用缓冲液调节粗酶液浓度至5～1500mg/L；
3)全细胞催化：以步骤2)得到的25～5000mg/L的细胞液为基础配制全细胞催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，25～5000mg/L的细胞，反应体系pH7～13，在0℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间30～180小时，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性胺；
或
3’)粗酶液催化：以步骤2’)得到的5～1500mg/L的粗酶液为基础配制粗酶液催化体系：0.001～0.05mol/L酮，0.002～0.2mol/L氨基供体，0.001～0.2mol/L辅助底物，0.01～0.2mol/L的缓冲液，5～300mg/L的粗酶液，反应体系pH8～12，在10℃～70℃反应温度下，100～300rpm震荡反应，反应时间10～90小时，利用粗酶液催化不对称还原胺化得到产物手性胺。
2.根据权利要求1所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述催化不对称还原胺化得到的产物手性胺为R型。
3.根据权利要求1所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述的酮为通式Ⅰ所示的脂肪酮、芳香酮和羟基酮：
其中R1，R2是C2～10的烷基、芳香基或羟基。
4.根据权利要求3所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述的脂肪酮的分子式为CxHyO，其中x为4～7，y为8～14，酮的分子量为72～115。
5.根据权利要求1所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述的氨基供体为丙氨酸、氨水、NH4Cl、NH4NO3或氨基烷烃中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述的辅助底物为浓度0.001～0.2mol/L的葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述缓冲液为pH为7～13的Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养条件为：起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
9.根据权利要求1所述的一种海洋菌株催化制备手性胺的方法，其特征在于：所述步骤1)中，216L培养基组成为10.0g/L蛋白胨,5.0g/L酵母粉,0.5g/L牛肉膏,0.5g/L柠檬酸钠,0.2g/LNH4NO3,1.0g/L醋酸钠，用海水配置。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019008110A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives PROCESS FOR THE PREPARATION OF AMINES FROM ALDEHYDES AND KETONES BY BIOCATALYSIS

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076634A (zh) * 2008-06-27 2011-05-25 默克弗罗斯特加拿大有限公司 手性胺的合成
CN102408344A (zh) * 2011-08-01 2012-04-11 温州大学 一类手性溶剂化试剂
US8349593B2 (en) * 2007-10-26 2013-01-08 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for production of succinic acid amide compound
CN103224963B (zh) * 2013-05-24 2015-04-22 厦门大学 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8349593B2 (en) * 2007-10-26 2013-01-08 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for production of succinic acid amide compound
CN102076634A (zh) * 2008-06-27 2011-05-25 默克弗罗斯特加拿大有限公司 手性胺的合成
CN102408344A (zh) * 2011-08-01 2012-04-11 温州大学 一类手性溶剂化试剂
CN103224963B (zh) * 2013-05-24 2015-04-22 厦门大学 一种海洋菌株催化不对称还原制备手性胺的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEONG EON LEE等: "Removal of Methylmercury and Tributyltin (TBT) Using Marine Microorganisms", 《BULL ENVIRON CONTAM TOXICOL》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019008110A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives PROCESS FOR THE PREPARATION OF AMINES FROM ALDEHYDES AND KETONES BY BIOCATALYSIS

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