CN101186895A - 蜡状芽孢杆菌及其制备手性2,2-二甲基环丙甲酸/酰胺 - Google Patents
蜡状芽孢杆菌及其制备手性2,2-二甲基环丙甲酸/酰胺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株新的菌种—蜡状芽孢杆菌ZJB－07112(Bacilluscereus ZJB－07112)，及其在手性催化制备(S)－(+)－2，2－二甲基环丙甲酸和R－(－)－2，2－二甲基环丙甲酰胺中的应用。本发明的有益效果主要体现在：提供了一株含有酰胺酶的微生物菌株以及利用该微生物手性催化制备(S)－(+)－2，2－二甲基环丙甲酸和R－(－)－2，2－二甲基环丙甲酰胺的方法，具有良好的应用前景。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株新的菌种—蜡状芽孢杆菌ZJB-07112(Bacillus cereusZJB-07112)，及其在手性催化制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。
(二)背景技术
(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸与氨结合能生成(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。(S)-2，2-二甲基环丙甲酰胺是西司他丁合成的关键手性中间体。西司他丁，化学名为(Z)-7-[(2R)-(2氨基-2-羧基乙基)硫]-[(1S)-2，2-二甲基环丙甲酰胺基]-2-庚烯酸，是第一个应用临床的肾脱氢肽酶抑制剂。西司他丁与亚胺培南(imipenem)的复方制剂泰能(Tienam)是美国默克(Merck)公司在1979年研制开发的一种广谱β-内酰胺抗生素，于1985年在德国首次上市。R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺可以作为手性化合物的拆分试剂。利用传统的化学法制备光学纯(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸，需在反应中添加大量溶剂和昂贵并具有毒性的手性催化剂，会对环境造成极大危害。而用生物催化法制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸具有反应条件温和、产物单一、立体选择性强、环境友好等优点。目前，文献报道的生物法制备光学纯手性2，2-二甲基环丙甲酸/酰胺主要有以下几种：
韩国Lim等报道先将外消旋的2，2-二甲基环丙甲酸衍生化为对应的乙酯，通过光学选择性脂酶选择性水解其中的(S)-2，2-二甲基环丙甲酸乙酯为对应的酸和乙醇，得到(S)-2，2-二甲基环丙甲酸(WO2004/005241A1)。
中国科学院化学研究所王梅祥等(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2002，18：267-272)曾报道以外消旋的2，2-二甲基环丙甲腈为底物，以Rhodococcus sp.AJ270为催化剂来制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
(三)发明内容
本发明即是为了提供一种可用于制备光学纯(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和(R)-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的新菌种——蜡状芽孢杆菌ZJB-07112(Bacillus cereus ZJB-07112)，该微生物在一定的条件下能产酰胺酶。
本发明采用的技术方案是：
蜡状芽孢杆菌ZJB-07112(Bacillus cereus ZJB-07112)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期2007年9月6日，保藏编号CCTCC No：M 207139。
该新菌株的特征如下：
菌落形态：30℃培养40h，在牛肉膏蛋白胨平板培养上的菌落呈圆形，直径1毫米，隆起形状为凸镜状，淡黄色，边缘整齐，光滑。菌落随时间的延长而增大，数天后直径可达3mm以上。
细胞形态：20h培养物的细胞呈杆状，0.5-0.8μm×2.0-3.5μm，无鞭毛，约60h后有明显的椭圆形中生芽孢形成，不运动。培养时间延长，菌体逐步变短，老培养物变成球状。
生理生化特征：革兰氏阳性，接触酶阳性，硝酸盐还原阴性，具体特性见表1。
表1：蜡状芽孢杆菌ZJB-07112的生理生化特征
| 实验指标 | 实验指标 | ||
| Gram染色 | + | 脲酶的测定 | + |
| 氧化酶实验 | + | 石蕊牛奶 | 还原 | |
| 过氧化氢酶 | + | 丙二酸盐试验 | - | |
| M.R.实验 | - | 反硝化作用 | - | |
| V.P.反应 | - | ONPG | - | |
| V.P.pH值 | 6.5 | 三糖铁 | 发酵 | - |
| 卵磷脂酶 | - | 产气 | + | |
| 明胶水解 | - | 氨基酸脱羧酶 | L-精氨酸 | + |
| 酪氨酸水解 | + | L-赖氨酸 | + | |
| 酪素水解 | - | L-鸟氨酸 | + | |
| 苯丙氨酸脱氨 | - | 耐盐性 | NaCl 2％ | +++ |
| 淀粉水解 | - | NaCl 5％ | +++ | |
| 硝酸盐还原 | - | NaCl 8％ | + | |
| 产H2S试验 | + | NaCl 10％ | - | |
| 柠檬酸盐利用 | + | 生长 | 5.7 | + |
| 产吲哚 | - | 8.1 | + | |
注：表中+表示阳性，-表示阴性，++表示非常明显
16S rDNA序列鉴定：以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物P1和P2扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳图见图1，可以看出菌株CCTCC NO：M 207139经PCR扩增成功获得了一长约为1.5kb的片段，经测序确认菌株CCTCC NO：M 207139的16S rDNA的扩增产物的实际长度为1563bp，序列如下：
GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA
TGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGAT
TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC
GTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGG
CTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGC
GGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTT
GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGA
GAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCT
ACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTG
ACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAA
CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACC
TTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG
CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT
AAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGG
CTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTAGAGTGCAGA
AGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATA
TGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGAC
ACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTG
GTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCC
GCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAG
TACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCA
CAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCT
TACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCC
TTCGGGAGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTG
TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATC
TTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGAC
AAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT
GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCA
AGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGA
TTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCG
CGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTCGTACACAC
CGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTACCACCCGAAGTCGGTGGGGT
AACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTG
AAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGC
G。
将该序列已提交GenBank(GenBank登记号为No.EF206345)，与GenBank中相关数据进行相似性分析，结果表明，菌株CCTCC NO：M207139与芽孢杆菌属(Bacillus)的部分菌株序列同源性较高。菌株CCTCCNO：M 207139与Bacillu cereus strain G924(GenBank登记号为No.AY425946，序列同源性99.61％/1554bp，基于16S rDNA)和Bacilluscereus strain G3317(GenBank登记号为No.AY138278，序列同源性99.61％/1554bp，基于16S rDNA序列)的系统发育关系最近。
生理生化鉴定结合分子生物学鉴定，可确认该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
考察不同碳源对菌体生长和产酰胺酶的影响，在原来的液体培养基中分别加入葡萄糖、柠檬酸三钠、甘油、甘露醇、乙酰胺、苹果酸、乳糖、麦芽糖和富马酸作为碳源，由表2可知，葡萄糖是最佳的产酰胺酶碳源和最佳的菌体生长碳源。
表2：不同碳源对CCTCC NO：M 207139产酰胺酶的影响
| 碳源 | 添加量(g/L) | 菌体干重(g L-1) | 相对酶活(以(R，S)-2，2-二甲基环丙甲酰胺为底物)(％) |
| 柠檬酸三钠 | 14.85 | 1.050 | 69 |
| 葡萄糖 | 10 | 2.515 | 100 |
| 甘油 | 9.3 | 2.465 | 95 |
| 甘露醇 | 9.2 | 2.485 | 13 |
| 乙酰胺 | 8.9 | 0.825 | 35 |
| 苹果酸 | 10.2 | 1.935 | 70 |
| 乳糖 | 9.5 | 0.570 | 93 |
| 麦芽糖 | 9.5 | 1.160 | 63 |
| 富马酸 | 8.8 | 2.151 | 33 |
考察各种无机氮源和有机氮源对产酰胺酶和生长的影响。在液体培养基中分别添加牛肉浸膏、蛋白胨、酵母粉、尿素、氯化铵、硫酸铵、胰蛋白胨、黄豆、玉米粉作为氮源，其余成分与原液体培养基一致。结果如表3所示。由表3可知酵母粉是最佳的支持菌体生长的氮源，蛋白胨是最佳的产酰胺酶氮源，而酵母粉和蛋白胨的复配作为氮源时菌体干重和酶活都间于酵母粉和蛋白胨之间，由此可知酵母粉有利于菌体的生长，而蛋白胨有利于菌体产酰胺酶。
表3：不同氮源对菌种CCTCC NO：M 207139产酰胺酶的影响
| 氮源 | 添加量(g L-1) | 菌体干重(gL-1) | 酶活(U/ml发酵液) | 相对值(％) |
| 牛肉浸膏 | 7.0 | 3.361 | 1.242 | 36 |
| 蛋白胨 | 7.0 | 2.635 | 3.427 | 100 |
| 酵母粉 | 7.0 | 5.552 | 1.666 | 49 |
| 尿素 | 3.214 | 1.444 | 0.607 | 18 |
| 氯化铵 | 5.67 | 0.634 | 0.414 | 12 |
| 硫酸铵 | 7.0 | 0.590 | 0.363 | 11 |
| 胰蛋白胨 | 7.0 | 3.225 | 1.944 | 57 |
| 黄豆 | 7.0 | 2.289 | 0.458 | 13 |
| 玉米粉 | 7.0 | 2.482 | 0.496 | 14 |
| 酵母粉+蛋白胨 | 5.0+2.0 | 3.453 | 3.596 | 76 |
考察各种金属离子对菌体生长和产酰胺酶的影响，金属离子的浓度为10mg/L。如图2所示，各种金属离子对菌株CCTCC NO：M 207139的生长均没有很大的影响，但是对产酰胺酶具有很大的影响，特别是当没加金属离子时，细胞就没有酰胺酶活力，当加了不同金属离子时酰胺酶活力变化不是很大，且当同时加镁离子和亚铁离子(各5mg/L)时，酶活达最大。
考察各种添加剂对菌体生长和产酰胺酶的影响，在培养基中分别加入了丙烯腈、烟酰胺、己内酰胺、环丙酰胺等作为诱导剂，加量为2g/L，结果如表4所示，在没加添加剂时，菌体生长没有变化，但酰胺酶活力为零，所以此酶是诱导型的；菌体在含有丙烯腈和环丙腈的培养基中微弱生产，表明这两种物质对它有一定的毒害；在含有其他添加剂的培养基里，菌体生长变化不大，但酶活变化较大，其中在加有己内酰胺的菌体，酶活达最高。
表4：不同添加剂对CCTCC NO：M 207139产酰胺酶的影响
| 种类 | 菌体干重(g L-1) | 酶活(U ml-1发酵液) | 相对值(％) |
| 空白 | 3.340 | 0 | 0 |
| 烟酰胺 | 3.360 | 3.976 | 86 |
| 己内酰胺 | 3.356 | 4.612 | 100 |
| 环丙酰胺 | 3.327 | 4.023 | 87 |
| 氯化铵 | 3.280 | 2.962 | 64 |
| 硫酸铵 | 3.284 | 2.935 | 64 |
| 硝酸铵 | 3.289 | 2.943 | 64 |
| 谷氨酸钠 | 3.338 | 2.475 | 54 |
| 乙醇 | 3.276 | 1.679 | 36 |
| 尿素 | 3.329 | 1.620 | 35 |
| 丙烯腈 | 1.692 | 0.532 | 11 |
| 环丙腈 | 1.865 | 0.587 | 13 |
通过考察碳源、氮源、诱导剂与金属离子等培养基组分对蜡状芽孢杆菌ZJB-07112菌株酶活的影响；同时采用旋转中心组合设计法对葡萄糖、酵母粉和乙酰胺等3个因素进行优化，得到蜡状芽孢杆菌ZJB-07112的液体培养基组成为(终浓度)：葡萄糖10.0～20.0g/L，酵母粉13.0～18.0g/L，KH2PO40.5～2.0g/L，K2HPO40.5～1.5g/L，NaCl1～2g/L，乙酰胺5～11.0g/L，自来水配制。
菌株CCTCC NO：M 207139的培养条件为：起始pH 6.0～8.5，装液量5～30％，培养温度20～35℃，摇床转速100～300rpm，培养时间48～72小时。
本发明中用毛细管气相色谱法测定底物和产物的浓度，用手性毛细管气相色谱法测定底物、产物的对映体过量值(e.e.)。
所用气相色谱仪为GC-14C，毛细管柱为UA-5(Frontier Lab，Japan)，色谱条件为：进样量0.8μL，进样口、检测器的温度均为220℃；程序升温条件为：初始温度为90℃，以10℃min-1的速度升到160℃。载气为氮气，流速为1.5mL min-1，补充气为高纯氮气，流量为40mL min-1，分流比为30∶1。
所用手性毛细管柱为BGB-175，色谱条件为：进样量0.8μL，进样口、检测器的温度均为220℃；产物酸的手性分离条件为：初始温度为90℃，以5℃min-1的速度升到170℃，最后在170℃保温6min；底物酰胺的手性分离条件为：恒温170℃。载气为氦气，流速为1.6ml min-1，流量为40mL min-1，分流比为30∶1。
本发明还涉及蜡状芽孢杆菌ZJB-07112在手性催化制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。
所述的应用为：以外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺为底物，加入蜡状芽孢杆菌ZJB-07112经产酰胺酶培养获得的湿菌体细胞，25～45℃下、于pH6.5～9.0的缓冲液中反应1～4小时，反应液经分离纯化得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。反应式如下：
外消旋2，2-二甲基环 R-(-)-2，2-二甲基环 (S)-(+)-2，2-二甲基
丙甲酰胺 丙烷甲酰胺 环丙甲酸
优选的，所述缓冲液为pH7.0～8.2的磷酸盐缓冲溶液或者pH7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。
所述缓冲液中可以添加有占体积百分比3～10％的共溶剂，以增加底物的溶解度，所述共溶剂为下列之一：①甲醇、②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、⑤正丙醇、⑥异丙醇。
所述缓冲液中蜡状芽孢杆菌ZJB-07112湿菌体细胞的初始浓度为25～30g/L，底物外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺的初始浓度为5～15g/L。
所述蜡状芽孢杆菌ZJB-07112湿菌体细胞由如下方法制备得到：产酰胺酶培养基终浓度组成：葡萄糖12～18g/L，酵母粉16～20g/L，2，2-二甲基环丙甲酰胺2～5g/L，KH2PO4 0.5～2g/L，K2HPO4 0.5～2g/L，MgSO4·7H2O0.05～0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，pH 6.0～8.5；接种蜡状芽孢杆菌ZJB-07112，20～35℃、100～300rpm振荡培养48～72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞。本发明中所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-07112湿菌体细胞的含水量为75-85％。
所述分离纯化方法如下：反应液离心，取上清液，用HCl调节pH 2-3，用等体积的等体积乙酸乙酯萃取，分为上下两层，收集上层液体，减压蒸发，除去乙酸乙酯，得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸；收集下层液体，加入NaOH调pH为10，用等体积乙酸乙酯萃取，收集上层有机相，减压蒸发，将得到的固体溶解于甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到R-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
具体的，所述应用如下：
(1)产酰胺酶培养基终浓度组成：葡萄糖15.8g/L，酵母粉17.89g/L，2，2-二甲基环丙甲酰胺3.47g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，pH 7.0；接种蜡状芽孢杆菌ZJB-07112，20℃、150rpm振荡培养72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞；
(2)取50mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞至细胞浓度为200g/L，并加入底物外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺至底物浓度为10g/L，35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，用HCl调节pH 2-3，用等体积的等体积乙酸乙酯萃取，分为上下两层，收集上层液体，减压蒸发，除去乙酸乙酯，得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸；收集下层液体，加入NaOH调pH为10，用等体积乙酸乙酯萃取，收集上层有机相，减压蒸发，将得到的固体溶解于甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到R-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
本发明的有益效果主要体现在：提供了一株含有酰胺酶的微生物菌株以及利用该微生物手性催化制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的方法，具有良好的应用前景。
(四)附图说明
图1为菌株CCTCC No：M 207139的16S rDNA基因PCR扩增argrose电泳图；
图2为不同金属离子对细胞活力的影响；1，None；2，CoCl2，10mg/L；3，FeSO4，10mg/L；4，MnSO4，10mg/L；5，CaCl2，10mg/L；6，NiCl2，10mg/L；7，CuSO4，10mg/L；8，BaCl2，10mg/L；9，ZnSO4，10mg/L；10，FeCl2，10mg/L，11，MgSO4，10mg/L，12，FeCl2(5mg/L)+MgSO4(5mg/L)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株的分离
产S-酰胺酶产生菌的分离：在9mL 0.85％的生理盐水中加入1g土样(来源于浙江省)、适量玻璃珠，摇匀，使成均匀的土壤悬液；吸取0.5mL的土壤悬液接种到装有30mL富集培养基的250mL的三角瓶中，置于30℃，150rpm的摇床培养4天，等富集液出现浑浊后，再吸取0.5mL转接到新鲜的培养基中，继续培养4天；如此重复4～5个循环后，将富集液稀释多个梯度，涂布到分离平板上，获得单菌落；
富集培养基以2，2-二甲基环丙甲酰胺为唯一氮源，组成如下(终浓度)：KH2PO40.5g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，CaCl20.03g/L，2，2-二甲基环丙甲酰胺，1.5g/L，pH 7.0，以自来水配制，120℃下灭菌20min。
挑取的单菌落接种到富集培养基中，培养48h、72h后取样，用手性气相色谱法检测产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的对应体过量值(e.e.值)，e.e.值超过88％的，即为本发明所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-07112。
实施例2：菌株的培养
斜面培养基组成(终浓度)：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂18g/L，用自来水配制；
于平板上挑取CCTCC No：M 207139的单菌落，接种至斜面，于30℃恒温培养箱内培养48h后，放入4℃冰箱内保藏备用。
实施例3：湿菌体细胞的获得
培养基配制：葡萄糖15.8g，酵母粉17.89g，2，2-二甲基环丙甲酰胺3.47g，KH2PO41g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.03g；自来水补足至1L，pH 7.0；
250ml摇瓶装液量30％，接种一环CCTCC No：M 207139，于20℃、150rpm振荡培养72h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，湿菌体细胞的含水量为80％，悬浮于50mM、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，得湿菌体细胞含量为0.5g/mL的菌悬液，备用。
实施例4：湿菌体细胞的获得
培养基配制：葡萄糖15.8g，酵母粉17.89g，2，2-二甲基环丙甲酰胺3.47g，KH2PO41g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.03g；自来水补足至1L，pH 7.0；
250ml摇瓶装液量20％，接种一环CCTCC No：M 207139，于35℃、100rpm振荡培养48h；培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，收集湿菌体细胞，湿菌体细胞的含水量为80％，悬浮于50mM、pH 7.8的磷酸盐缓冲溶液中，得湿菌体细胞含量为0.5g/mL的菌悬液，备用。
实施例5：
在10mL、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时。反应液离心，取上清液，用HCl调节pH 2，用等体积的等体积乙酸乙酯萃取，分为上下两层，收集上层液体，减压蒸发，除去乙酸乙酯，得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸；收集下层液体，加入NaOH调pH为10，用等体积乙酸乙酯萃取，收集上层有机相，减压蒸发，将得到的固体溶解于甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到R-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。底物转化率82％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为61％，e.e.为88.5％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率61％，ee.为89％。
实施例6：
在10ml、50mM的Tris-HCl盐缓冲溶液中(pH 7.8)，加入1.6mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应3小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率85％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为52％，e.e.为89.5％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率53％，ee.为89.5％。
实施例7：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.8)，加入6mL实施例4所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应1小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率53％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为45％，e.e.为88％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率44％，ee.为89.6％。
实施8：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入50mg(0.5％)外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率80％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为52％，e.e.为89.5％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率53％，ee.为89.5％。
实施例9：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例4所得菌悬液；加入150mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于35℃恒温水浴摇床振荡反应4小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率80％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为52％，e.e.为89.5％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率53％，ee.为89.5％。
实施例10：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 6.5)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于25℃恒温水浴摇床振荡反应4.5小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率90％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为70％，e.e.为89％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率63％，ee.为89％。
实施例11：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 9.0)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg(1.0％)外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物。于45℃恒温水浴摇床振荡反应3小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率40％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为32％，e.e.为89.5％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率33％，ee.为89.5％。
实施例12：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.8)，加入4mL实施例4所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺作为底物和1mL甲醇。于35℃恒温水浴摇床振荡反应1.8小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率42％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为41％，e.e.为90％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率43％，ee.为90％。
实施例13：
在10ml、50mM的Tris-HCl缓冲溶液中(pH 7.4)，加入4mL实施例3所得菌悬液；加入100mg外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺和0.6mL乙酸乙酯。于40℃恒温水浴摇床振荡反应2.5小时。产物分离提取方法同实施例5，底物转化率60％，产物(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸的收率为58％，e.e.为90％。产物R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺的收率51％，ee.为89.2％。
序列表_ST25
SEQUENCE LISTING
Claims (10)
1.蜡状芽孢杆菌ZJB-07112(Bacillus cereus ZJB-07112)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年9月6日，保藏编号CCTCC No：M 207139。
2.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-07112，其特征在于所述蜡状芽孢杆菌ZJB-07112的16S rDNA序列如下：
GAGCGGATAACAATTTCACACAGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGG
ATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGG
ATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAA
CACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAAC
CGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATT
GAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCAT
TAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTA
GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGG
CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG
GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTT
TCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTG
AATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCT
AACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTA
TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGT
CTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA
CTGGGAGACTAGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGT
AGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAG
GCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGG
GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGA
TGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTT
AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGA
AACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG
TGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACA
TCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAAAG
TGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT
GGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAT
CATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGA
GGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGG
GCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACC
GCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGT
AGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCG
GATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTCGTACACACC
GCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTACCACCCGAAGTCGGTGGGG
TAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGG
GTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGTCGTGACTGGGAAAACCC
TGGCG。
3.如权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌ZJB-07112在手性催化制备(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：以外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺为底物，加入蜡状芽孢杆菌ZJB-07112经产酰胺酶培养获得的湿菌体细胞，25～45℃下、于pH 6.5～9.0的缓冲液中反应1～4小时，反应液经分离纯化得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸和R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH7.0～8.2的磷酸盐缓冲溶液或者pH7.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液中添加有占体积百分比3～10％的共溶剂，所述共溶剂为下列之一：①甲醇、②乙醇、③乙酸乙酯、④丙酮、⑤正丙醇、⑥异丙醇。
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述缓冲液中蜡状芽孢杆菌ZJB-07112湿菌体细胞的初始浓度为25～30g/L，底物外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺的初始浓度为5～15g/L。
8.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述蜡状芽孢杆菌ZJB-07112湿菌体细胞由如下方法制备得到：产酰胺酶培养基终浓度组成：葡萄糖12～18g/L，酵母粉16～20g/L，2，2-二甲基环丙甲酰胺2～5g/L，KH2PO40.5～2g/L，K2HPO40.5～2g/L，MgSO4·7H2O 0.05～0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.1g/L，溶剂为水，pH 6.0～8.5；接种蜡状芽孢杆菌ZJB-07112于产酰胺酶培养基中，20～35℃、100～300rpm振荡培养48～72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述分离纯化方法如下：反应液离心，取上清液，用HCl调节pH 2-3，用等体积的等体积乙酸乙酯萃取，分为上下两层，收集上层液体，减压蒸发，除去乙酸乙酯，得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸；收集下层液体，加入NaOH调pH为10，用等体积乙酸乙酯萃取，收集上层有机相，减压蒸发，将得到的固体溶解于甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到R-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用如下：
(1)产酰胺酶培养基终浓度组成：葡萄糖15.8g/L，酵母粉17.89g/L，2，2-二甲基环丙甲酰胺3.47g/L，KH2PO41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，溶剂为水，pH 7.0；接种蜡状芽孢杆菌ZJB-07112于产酰胺酶培养基中，20℃、150rpm振荡培养72小时，将菌体离心经生理盐水洗涤，收集得湿菌体细胞；
(2)取50mM pH 7.8的磷酸盐缓冲液，加入步骤(1)所得湿菌体细胞至细胞浓度为200g/L，并加入底物外消旋2，2-二甲基环丙甲酰胺至底物浓度为10g/L，35℃恒温水浴摇床振荡反应2小时，反应结束后将反应液离心，取上清液，用HCl调节pH 2，用等体积的等体积乙酸乙酯萃取，分为上下两层，收集上层液体，减压蒸发，除去乙酸乙酯，得到(S)-(+)-2，2-二甲基环丙甲酸；收集下层液体，加入NaOH调pH为10，用等体积乙酸乙酯萃取，收集上层有机相，减压蒸发，将得到的固体溶解于甲醇，在冰浴中放置过夜，析出的晶体过滤后，置于蒸发皿中干燥，即得到R-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺。
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