CN103103156B - 短杆菌及用于腈水解合成α-环己基扁桃酸及衍生物的方法 - Google Patents
短杆菌及用于腈水解合成α-环己基扁桃酸及衍生物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了短杆菌及用于腈水解合成α-环己基扁桃酸及衍生物的方法，属于微生物技术领域。短杆菌 Brevibacterium sp.CCZU12-1，其保藏编号为CGMCC No.7042，建议的分类命名为短杆菌 Brevibacterium sp. 。以α-环己基扁桃腈及其衍生物为起始原料，利用短杆菌 Brevibacterium sp.CCZU12-1静息细胞为生物催化剂，在一定条件下进行α-环己基扁桃酸及其衍生物等产品的生物合成。本方法具有工艺路线简单、反应条件温和及无污染等特点。
Description
技术领域
本发明公开了土壤中分离的腈水解酶产生菌Brevibacterium sp. CCZU12-1及其用于催化腈水解合成光学纯α-环己基扁桃酸及其衍生物的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
手性α-环己基扁桃酸不仅可以用来合成奥昔布宁和脱乙基奥昔布宁等解痉药，还可以用来合成奥芬溴铵和羟苄利明等抗胆碱药；相比较它们的消旋结构，光学活性的药物有更有效的药理作用。因此,单一对映体α-环己基扁桃酸的市场前景非常巨大。α-环己基扁桃酸是一种重要的有机合成中间体，广泛地用于农药和医药等合成。随着其市场的不断扩展，对α-环己基扁桃酸的需求不断增加，应用范围也逐渐拓宽。目前，国内外已报道了很多α-环己基扁桃酸的生产方法，其中化学合成法主要是：(1) α-环己基扁桃腈水解法，(2)扁桃酸衍生化法，(3)拆分法。上述各种化学方法已取得了较好的效果，但同时也有一些不足之处，例如，产物中都含有杂质，并且化学合成法通常存在产品收率低、成本高和环境污染严重等缺点，与之相比，由于利用生物法实现α-环己基扁桃酸的合成具有反应条件温和，产品收率高等优点，符合绿色化学的发展要求，而越来越受到国内外学者的青睐。生物法中涉及腈水解的酶系主要有腈水解酶、腈水合酶和酰胺酶；腈水解酶能将腈水解生成相应的羧酸和氨，具有选择性好、反应条件温和及产品纯度高等优点，明显优于化学法水解。然而，少有报道利用α-环己基扁桃腈水解酶催化合成高光学纯度（e.e.>99.9%）α-环己基扁桃酸，筛选新的α-环己基扁桃腈水解酶菌株成为当务之急。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种短杆菌的培养及用于腈水解合成α-环己基扁桃酸及其衍生物的方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明短杆菌Brevibacterium sp. CCZU12-1，该菌株已于2012年12月26日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏编号为CGMCC No. 7042，建议的分类命名为短杆菌Brevibacterium sp.。
上述短杆菌Brevibacterium sp. CCZU12-1，CGMCC No. 7042，用于催化α-环己基扁桃腈水解合成α-环己基扁桃酸的方法，按照下述步骤进行：
（1）将短杆菌在培养基中进行扩增培养，离心得到静息细胞；
（2）收获静息细胞，悬浮于pH为6.0—8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入α-环己基扁桃腈及其衍生物，在25—35 °C条件下反应12—48 h后，得到α-环己基扁桃酸及其衍生物。
其中步骤（1）中所述的α-环己基扁桃腈及其衍生物浓度为20—100 mM。
其中步骤（1）中所述的静息细胞在磷酸钾缓冲溶液中的含量为0.01-0.1 g静息细胞/mL。
其中步骤（1）中所述的发酵培养基组分和含量如下：葡萄糖5—20 g，蛋白胨5—20 g，酵母膏5—20 g，KH2PO4 1—5 g，NaCl 0.1—1.5 g，MgSO4 0.1—0.5 g，诱导剂苯乙腈 0.1—1 g，水 1000 mL，pH 6.0—9.0。
其中步骤（2）中所述的α-环己基扁桃腈及其衍生物为羟基乙腈、扁桃腈、α-环己基扁桃腈、邻氯α-环己基扁桃腈、间氯α-环己基扁桃腈、对氯α-环己基扁桃腈、苯甲酰甲腈、苯乙腈、苯甲腈、对甲氧基苯乙腈、烟腈、邻苯二甲腈、间苯二甲腈或对苯二甲腈。
本发明的优点：本发明利用Brevibacterium sp. CCZU12-1生物催化剂实现腈水解催化合成α-环己基扁桃酸及其衍生物，具有工艺路线简单、反应条件温和、无污染、无副产物及转化率高等优点。
附图说明
图1 Brevibacterium sp. CCZU12-1静息细胞催化水解α-环己基扁桃腈合成R-α-环己基扁桃酸反应进程曲线，其中符号说明：◆α-环己基扁桃腈，◇R-α-环己基扁桃酸，●R-α-环己基扁桃酸e.e.值。
具体实施方式
本发明发明人从常州大学白云校区及常州科教城附近的土壤中，经初筛、复筛及分离纯化得到一株腈水解酶菌株，经过16S rDNA及理化特征鉴定，该菌株为红球菌Brevibacterium sp.，编号为Brevibacterium sp. CCZU12-1。该菌株已于2012年12月26日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 7042，建议的分类命名为短杆菌Brevibacterium sp.。
上述菌株的筛选过程如下：
采集了不同环境条件下960份土壤样品，利用α-环己基扁桃腈为唯一氮源进行两轮液体富集培养，筛选腈水解酶产生菌。通过反复筛选，分离得到一株高活力的腈水解酶产生菌。
本发明中α-环己基扁桃酸的含量用HPLC进行分析。腈水解酶催化剂的活力单位定义：每分钟水解α-环己基扁桃腈产生1 μmol α-环己基扁桃酸所需要的生物催化剂量。
菌株理化特征如表1所示：
表 1 CCZU12-1菌株理化特征
“+”代表阳性；”-”代表阴性
实施例1
Brevibacterium sp. CCZU12-1静息细胞催化α-环己基扁桃腈水解生产α-环己基扁桃酸
配制种子培养基(葡萄糖5 g，蛋白胨 5 g，酵母膏 5 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.1 g，MgSO4 0.1 g，诱导剂苯乙腈 0.1 g，水 1000 mL，pH 6.0)，在1 L摇瓶中装入250 mL培养基，在转速160 rpm及温度25 °C条件下培养Brevibacterium sp. CCZU12-1 48 h，离心、洗涤得到静息细胞。称取湿重0.1 g静息细胞，将细胞悬浮于1.0 mL pH 6.0磷酸钾缓冲溶液中，加入α-环己基扁桃腈，终浓度为100 mM，在25 °C和120 rpm的恒温摇床振荡反应。如图1 所示，48 h R-α-环己基扁桃酸的分析产率49.3%，e.e.>99.9%。
实施例2
Brevibacterium sp. CCZU12-1静息细胞催化不同腈及其衍生物
配制培养基(葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏20 g，KH2PO4 5 g，NaCl 1.5 g，MgSO4 0.5 g，诱导剂苯乙腈1 g，水 1000 mL，pH 9.0)，在1 L摇瓶中装入250 mL培养基，在转速160 rpm及温度35 °C条件下培养Brevibacterium sp. CCZU12-1 48 h，离心、洗涤得到静息细胞。称取湿重0.01 g静息细胞，将细胞悬浮于1.0 mL pH 8.0磷酸钾缓冲溶液中，分别加入不同的底物腈，终浓度为20 mM，在35 °C和160 rpm的恒温摇床振荡反应，反应12 h 后，测定产物结果如表2所示。
表2 底物谱的扩展
Claims (5)
1.短杆菌CCZU12-1，其保藏编号为CGMCC No. 7042，建议的分类命名为短杆菌Brevibacterium sp.。
2.权利要求1所述的短杆菌CCZU12-1用于催化α-环己基扁桃腈水解合成α-环己基扁桃酸的方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）将短杆菌在培养基中进行扩增培养，离心得到静息细胞；
（2）收获静息细胞，悬浮于pH为6.0—8.0的磷酸钾缓冲溶液中，加入α-环己基扁桃腈，在25—35°C条件下反应12—48 h后，得到α-环己基扁桃酸。
3.根据权利要求2所述的短杆菌CCZU12-1用于催化α-环己基扁桃腈水解合成α-环己基扁桃酸的方法，其特征在于其中步骤（2）中所述的α-环己基扁桃腈浓度为20—100 mM。
4.根据权利要求2所述的短杆菌CCZU12-1用于催化α-环己基扁桃腈水解合成α-环己基扁桃酸的方法，其特征在于其中步骤（2）中所述的静息细胞在磷酸钾缓冲溶液中的含量为0.01-0.1 g静息细胞/mL。
5.根据权利要求2所述的短杆菌CCZU12-1用于催化α-环己基扁桃腈水解合成α-环己基扁桃酸的方法，其特征在于其中步骤（1）中所述的培养基组分和含量如下：葡萄糖5—20 g，蛋白胨5—20 g，酵母膏5—20 g，KH2PO4 1—5 g，NaCl 0.1—1.5 g，MgSO4 0.1—0.5 g，诱导剂苯乙腈 0.1—1 g，水 1000 mL，pH 6.0—9.0。
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