CN1840671A

CN1840671A - 一种微生物不对称拆分制备(r)－扁桃酸的方法

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Publication number: CN1840671A
Application number: CN 200610037941
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 张辉
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2006-01-18
Filing date: 2006-01-18
Publication date: 2006-10-04
Anticipated expiration: 2026-01-18
Also published as: CN100385007C

Abstract

一种微生物不对称拆分制备(R)－扁桃酸的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。本发明筛选得到黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AS 1.818，利用该菌株经过培养，全细胞制备，以外消旋扁桃酸为底物进行微生物细胞的催化转化反应，不对称转化外消旋扁桃酸得到产物(R)－扁桃酸，产物的光学纯度达到90％e.e.以上。本发明确定了该菌株全细胞不对称转化外消旋扁桃酸的反应体系和反应条件，其产物的光学纯度得到提高；本发明还有助于了解外消旋化合物拆分的生物多样性，对于今后拆分专用酶源的开发和拆分方法的研究具有较为重要的意义。

Description

一种微生物不对称拆分制备(R)-扁桃酸的方法

技术领域

一种微生物不对称拆分制备(R)-扁桃酸的方法，属于生物法拆分外消旋化合物技术领域。

背景技术

外消旋扁桃酸(又称为α-羟基苯乙酸，英文名Mandelic acid)，是由(R)-扁桃酸和(S)-扁桃酸两个对映体构成，其中(R)-扁桃酸是一种重要的手性中间体，被广泛应用于多种药物的合成，如被用于合成青霉素和头孢菌素等抗生素、减肥药物、抗肿瘤药物、治疗抑郁症药物和农药等；并可作为手性试剂，用于拆分其它手性化合物。

手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料和环保等领域都具有广泛的价值。

扁桃酸的化学结构为：

传统的化学工业拆分法，主要是利用旋光性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄碱和辛可宁等，通过非对映(立体)异构盐形成法，得到单一对映体，由于反应中所添加的手性拆分剂价格昂贵且均具有毒性，会对环境造成危害，因此利用生物法转化光学纯扁桃酸就成为研究的热点。

目前，国际上拆分外消旋化合物常见方法主要包括：色谱法、化学法和生物法等。

其中，制备手性色谱柱进行拆分法，被分离样品可变范围窄，需昂贵的手性添加剂，因此仅限于检测及实验室制备；化学法收率低、光学纯度低、生产工序繁杂、能耗大、环境污染严重、毒性大、成本高；利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类：一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从非手性或潜手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。

90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。酶促拆分消旋体是比较理想的选择。利用完整细胞对外消旋化合物进行转化，可以获得光学纯对映体，在非水相及有机—水双相反应体系中，也可酶促转化制备光学纯化合物。

目前国际上已报道的制备(R)-扁桃酸的生物方法主要有：

Yadav等利用脂肪酶在非水相中不对称水解扁桃酸甲酯制备(R)-扁桃酸，但水解率达到19％时，光学纯度仅为78％。

Kaul等利用腈水解酶不对称水解扁桃腈制备(R)-扁桃酸，但产率最高只能达到50％，且产物与底物较难分离。

0da等以1，2-苯乙二醇为底物，通过不对称氧化β-羟基而得到(R)-扁桃酸，但得率仅为40％，且副产物较多，且较难分离。

Yamazaki等利用苯乙酮酸脱氢酶催化不对称还原，但反应需在体系中加入辅酶(NADH)。

发明内容

(1)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种微生物不对称拆分制备(R)-扁桃酸的方法，提高产品(R)-扁桃酸的光学纯度和产率。

(2)技术方案

本发明首先从微生物出发，筛选能够高效转化外消旋扁桃酸的菌种。在此基础上，对该菌种的培养条件和不对称拆分转化的反应条件进行优化，以及转化方式和添加诱导剂的作用。

设计该转化方法的途径如下：

主要试剂

外消旋扁桃酸购于国药集团化学试剂有限公司

(R)-扁桃酸，(S)-扁桃酸，(R，S)-扁桃酸购于美国Fluka公司

(R)-扁桃酸和(S)-扁桃酸分析方法的确定

(R)-扁桃酸、(S)-扁桃酸、(R，S)-扁桃酸标样在Chiralcel OD-H柱上通过手性固定相高效液相色谱(CSPHPLC)进行分析，(S)-扁桃酸的保留时间为15.9min，(R)-扁桃酸的保留时间为19.6min。所用高效液相色谱仪为HP1100，紫外检测器，手性柱Chiralcel OD-H(250×4.6mm)购于日本Daicel Chemical Ind.，Ltd.

确定具体色谱条件为：手性柱Chiralcel OD-H柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝90∶10∶0.1，流速为0.5mL/min，柱温18℃，柱压常压；检测波长UV 225nm，进样量5μl。

产物(R)-扁桃酸的光学纯度通过对映体过量值(％e.e.)来评价：

对映体过量值(％e.e.)＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(R)-扁桃酸得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_S为反应后(S)-对映体的峰面积，S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S₀为反应前(S)-和(R)-对映体的峰面积之和。

一、微生物的确定：经过对实验室保藏的包括细菌、酵母和霉菌等大量微生物进行筛选，从所得转化产物的光学纯度和产率两个方面考虑，选定一株菌种为催化转化反应用的出发菌株黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AS 1.818，产物(R)-扁桃酸，光学纯度为90～100％e.e.，产率35～50％。

二、菌株的培养和产酶条件优化

培养基成分优化

分别考察了碳源、氮源、磷源对转化及菌体量的影响，并经过正交实验最终确定出发菌株黄色短杆菌B.flavum AS 1.818培养基组成为(g/100ml)：葡萄糖0.25～1.0，肉膏0.5～2.0，蛋白胨0.5～2.0，酵母膏0.1～0.5，(NH₄)₂HPO₄ 0.5～1.0，KH₂PO₄ 0.25～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.025～0.1，NaCl 0.001～0.005，ZnSO₄·7H₂O0.001～0.005，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.005，CuSO₄·5H₂O 0.0001～0.0005，MnSO₄·4H₂O 0.0001～0.0005。

培养条件优化

分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对转化及菌体量的影响。

最终确定了出发菌株B.flavum AS 1.818培养条件为：起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间24～72小时。

优化后，B.flavum AS 1.818转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为94～100％e.e.。

三、全细胞催化转化反应体系及反应条件的优化

菌种的培养及转化用细胞的制备

B.flavum AS 1.818接种在装液量体积分数为5～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时。培养结束后，将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于拆分反应。

微生物细胞的催化转化反应

催化转化反应在0.2mol/L的磷酸钾缓冲溶液中进行，菌体细胞溶于其中，细胞的重量/体积浓度为5％～20％，底物外消旋扁桃酸的重量/体积浓度为0.5％～5％，反应体系pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，100～300rpm振荡反应，反应时间24～72小时。

通过对转化过程的考察发现，B.flavum AS 1.818优先将(S)-扁桃酸降解，而(R)-扁桃酸基本保持不变，直至(S)-扁桃酸降解完全后，(R)-扁桃酸含量才开始下降，转化后期并无明显的副产物积累。因此，反应后(R)-扁桃酸产率不大于50％。

考察了不同转化方式的转化结果

在培养6～24小时的发酵液中，直接加入外消旋扁桃酸0.5～2g/100mL，调节pH6.0～8.0，继续培养24～120小时，转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率40～50％。

或以0.5～2g/100mL的外消旋扁桃酸代替葡萄糖作为唯一碳源，其它培养基成分不变，培养24～144小时，转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率40～50％。

考察了在培养基中添加结构类似物对转化的影响

在培养基添加0.05～1g/100mL的扁桃酸结构类似物，如扁桃酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙醇酸、苯乙酮酸等等，发现添加这些诱导物后得到的菌体转化效率显著提高，最终转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率40～50％。

考察了在转化体系中添加金属离子对转化的影响

添加0.5～5mmol/L的各种金属离子，发现Mg，Mn，Fe，Ca，Cu等离子的存在有助于提高转化效率，而其它离子作用不明显或有抑制作用，最终转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率40～50％。

生物材料样品的来源：所用菌种黄色短杆菌B.flavum AS 1.818来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

(3)有益效果

本发明通过筛选得到一株转化效果较好的菌株黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)AS 1.818。

用该菌株进行不对称转化外消旋扁桃酸得到产物(R)-扁桃酸，光学纯度均为90％e.e.以上。

经培养基组成和培养条件优化后，所用菌株不对称转化外消旋扁桃酸，产物(R)-扁桃酸光学纯度有所提高，确定了优化的培养基组成和培养条件。

确定了该菌全细胞不对称转化外消旋扁桃酸的反应体系及反应条件。

研究了该菌转化过程、转化方式、在培养基中添加诱导物和转化体系中添加金属离子的因素对转化的影响，确定了外在因素的作用。

这些工作有助于了解外消旋化合物拆分的生物多样性，对于今后拆分专用酶源的开发和拆分方法的研究具有较为重要的意义。

具体实施方式

实施例1

菌株的培养：培养基组成为每100ml培养液所含组分以g计：葡萄糖0.25～1.0，肉膏0.5～2.0，蛋白胨0.5～2.0，酵母膏0.1～0.5，(Nh₄)₂HPO₄ 0.5～1.0，KH₂PO₄ 0.25～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.025～0.1，NaCl 0.001～0.005，ZnSO₄·7H₂O0.001～0.005，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.005，CuSO₄·5H₂O 0.0001～0.0005，MnSO₄·4H₂O 0.0001～0.0005。

培养条件为：起始pH6.0～8.0，装液量20％，培养温度30℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间48小时。

实施例2

全细胞的制备：B.flavum AS 1.818接种在装液量为20％的250ml摇瓶中于30℃、100～300rpm振荡培养48小时；培养结束后将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于拆分反应。

实施例3

微生物法不对称拆分制备(R)-扁桃酸：在含10mg外消旋扁桃酸的0.2mol/L、pH7.0的2mL磷酸钾缓冲液中，加入0.1g(即重量体积比5％)B.flavumAS 1.818菌体细胞，25℃，150转/分，转化72h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度90.83％e.e，产率38.63％。

实施例4

称取0.2g(10％)黄色短杆菌B.flavum AS 1.818菌体细胞，置于含20mg外消旋扁桃酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，35℃，150转/分，转化36h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度95.11％e.e，产率48.7％。

实施例5

称取0.4g(20％)黄色短杆菌B.flavum AS 1.818菌体细胞，置于含100mg外消旋扁桃酸的0.2mol/L、pH7.0的2mL磷酸钾缓冲液中，40℃，150转/分，转化48h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度96.57％e.e，产率40.61％。

实施例6

接种黄色短杆菌B.flavum AS 1.818至以0.5％外消旋扁桃酸为唯一碳源的培养基中(除不加葡萄糖外，如实施例1)，装液量20％，250mL三角瓶，30℃，150转/分培养96小时后，取样离心，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度91.71％e.e，产率44.56％。

实施例7

在如实施例1的培养条件下，黄色短杆菌B.flavum AS 1.818接种培养24小时后，往发酵液中添加0.5％(W/V)外消旋扁桃酸，调节pH不变，继续培养60小时，取样离心，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度94.51％e.e，产率42.72％。

实施例8

在如实施例1的培养基中加入0.3g/100mL乙醇酸，按实施例2制备菌体细胞，按实施例4转化，产物(R)-扁桃酸光学纯度96.16％e.e，产率48.56％。

除乙醇酸外，还可以用说明书例举的其他诱导剂进行诱导培养，具有相似结果。

实施例9

称取0.2g(10％)黄色短杆菌B.flavum AS 1.818菌体细胞，置于含10mg外消旋扁桃酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，并加入2mmol/LCuCl₂，30℃，150转/分，转化6h，与同样条件下不加金属离子的对照相比，转化活力提高了60％。

除铜离子外，还可以用说明书例举的其他具有促进作用的金属离子来提高转化活力，具有相似结果。

Claims

1、一种微生物不对称拆分制备光学纯(R)-扁桃酸的方法，其特征是

出发菌株采用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AS 1.818，经过菌株的培养，全细胞的制备，以外消旋扁桃酸为底物，进行微生物细胞的催化转化反应：催化转化反应在0.2mol/L的磷酸钾缓冲溶液中进行，菌体细胞溶于其中，细胞的重量/体积浓度为5％～20％，底物外消旋扁桃酸的重量/体积浓度为0.5％～5％，反应体系pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，100～300rpm振荡反应，反应时间24～72小时。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征是菌株的培养

培养基组成为每100ml培养液所含组分以g计：葡萄糖0.25～1.0，肉膏0.5～2.0，蛋白胨0.5～2.0，酵母膏0.1～0.5，(NH₄)₂HPO₄ 0.5～1.0，KH₂PO₄0.25～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.025～0.1，NaCl 0.001～0.005，ZnSO₄·7H₂O 0.001～0.005，FeSO₄·7H₂O 0.001～0.005，CuSO₄·5H₂O 0.0001～0.0005，MnSO₄·4H₂O0.0001～0.0005；

培养条件为：起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间24～72小时。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征为菌株的培养

培养基组成中以0.5～2g/100mL的外消旋扁桃酸为唯一碳源，以代替葡萄糖，培养24～144小时，直接制备(R)-扁桃酸；

或按权利要求2所述的培养基组成和培养条件进行培养6～24小时后，向发酵液中添加0.5～2g/100mL的外消旋扁桃酸，继续培养24～120小时，直接制备(R)-扁桃酸。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征是菌株的培养，在菌株的培养基中添加0.05～1g/100mL的扁桃酸结构类似物：扁桃酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙醇酸或苯乙酮酸来进行诱导培养。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征是全细胞的制备

黄色短杆菌(Brevibacterium favum)AS 1.818接种在装液量体积分数为5％～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时；培养结束后将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于拆分反应。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征是在转化体系中添加0.5～5mmol/L的Mg，Mn，Fe，Ca或Cu金属离子能提高转化效率。