CN101153302B - 一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药和生物催化领域，具体是一种把右旋磷霉素通过生物催化过程转变为左旋磷霉素的生物催化方法，解决右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的问题。将具有催化能力的菌株进行放大培养，离心、收集菌体后，接种于催化培养基中，催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH4)2SO40.5-1.0％，NaCl0.2％，KCl0.1％，MgSO4·7H2O0.01-0.02％，FeSO4·7H2O0.01-0.03％，KH2PO40.05-0.15％，余量为水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。发酵液中左旋磷霉素的定性和浓度检测分别由薄层层析和生物鉴定盘方法进行。本发明提出了一种把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的全新生物催化途径，使右旋磷霉素的生物催化成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体为一种通过微生物的生物催化过程把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的方法。
背景技术
左旋磷霉素[(-)-顺-(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，FOM]是一种广谱抗生素。与其它抗生素不同，磷霉素具有独特的化学结构与抗菌机制。磷霉素与其它抗生素之间没有交叉耐药性，且可呈现协同作用。同时，因为磷霉素还具有理化特性稳定、安全低毒、无抗原性(无需试敏)等优点，现已广泛用于临床治疗，被国际医学界和药学界称为二十一世纪的新抗生素。
目前，磷霉素生产工艺采用的是化学合成技术，该技术收率低，主要原因是工艺中的环氧化步骤是对称性的化学催化过程，所获得的产物为磷霉素消旋体，即左旋和右旋磷霉素各占一半。其中，左旋磷霉素有疗效，从消旋体中被拆分出来后，进一步精制成为产品；而右旋磷霉素[(+)-顺-(1S，2R)-1，2-环氧丙基磷酸]无疗效，被作为废物排放掉。这导致了严重的资源浪费和环境污染等问题。
国内外现有研究结果显示左旋磷霉素的不对称合成是可以通过生物催化/转化来实现的。一些细菌、放线菌和真菌可以完成由顺丙烯磷酸到左旋磷霉素的不对称环氧化过程，且只合成左旋磷霉素，而不生成右旋磷霉素。这方面的报道见：文献1[Itoh N.，M.Kusaka，T.Hirota et al，.Microbial production of antibioticfosfomycin by a stereoselective epoxidation and its formation mechanism.ApplMicrobiol Biotechnol.1995，43：394-401.]；文献2[Watanabe M.，Sumida N.，Murakami S.et al.A phosphonate-induced gene which promotes Penicillium-mediatedbioconversion of cis-propenylphosphonic acid to fosfomycin.Appl Environ Microbiol.1999.65：1036-1044.]；文献3[石家骥，崔福绵，葛猛.青霉菌立体选择性环氧化顺丙烯磷酸产生磷霉素.微生物学报.2001.41：353-356.]。但目前尚未见由催化右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的生物催化方法的报道。
目前，生物催化技术是大规模采用微生物或酶为催化剂生产化学品、医药、能源、材料等的技术，生物催化技术不但具有条件温和、转化率高、设备简单、反应速率快、反应步骤少等优点，而且可以合成手性化合物及高分子。生物催化技术的大致过程包括微生物或酶的制备、生物催化反应、产物分离和提纯等主要过程。
发明内容
本发明提出一种把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的生物催化方法，解决右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的问题。若由右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的生物催化途径比被证明存在，则不仅在理论上发现了一个新的催化/转化途径，也在实践上使现在被废弃的右旋磷霉素获得再利用成为可能。
本发明的技术方案是：
一种把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，通过生物催化方法把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素，利用微生物的生物催化能力完成该转化过程。
本发明将具有催化能力的微生物催化菌株进行放大培养，离心、收集菌体后，再接种于催化培养基中，催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH4)2SO4 0.5-1.0％，NaCl 0.2-0.5％，KCl0.1-0.3％，MgSO4·7H2O 0.01-0.02％，FeSO4·7H2O 0.01-0.03％，KH2PO40.05-0.15％，余量为水。pH7.5，121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度28-37℃、摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。最后，分别以常规的薄层层析和生物鉴定盘方法定性和定量检测发酵液中左旋磷霉素。
所述的放大培养采用细菌完全培养基，细菌完全培养基组分为：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.2％，琼脂2％，余量为水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。放大培养条件为恒温震荡培养，培养温度28-37℃，摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。
本发明中的催化菌株采用一种具有生物催化能力的微生物，或者采用两种以上具有生物催化能力的微生物的组合。
催化菌株可以采用自主筛选菌株或使用现成的商业菌株，如：鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii，ATCC 15309)、简单节杆菌(Arthrobacter simplex，ATCC15799)、耐辐照红色杆菌(Rubrobacter radiotolerans，ATCC51242)、酯香金杆菌(Flavobacterium esteraromaticum，ATCC8091)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida，ATCC17391)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis ATCC 31444)、星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids，ATCC 10904)等，以上述微生物的一种或两种以上组合加入到催化培养基。ATCC系美国典型物保藏中心，又称美国模式典型物收集中心的简称。本发明采用的上述催化菌株均可以为商业菌株。
本发明中，催化菌株以菌悬液的形式加入到催化培养基中，菌悬液的加入量占催化培养基重量的2-30％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为104-109个/ml的菌悬液。
本发明的有益效果：
1.本发明提出了一种全新的由右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的生物催化途径，使右旋磷霉素的生物催化成为可能。
2.本发明使现在被废弃的右旋磷霉素通过生物技术转化为左旋磷霉素，从而变废为宝、获得再利用成为可能。
具体实施方式
本发明把右旋磷霉素转变为左旋磷霉素的生物催化方法，具体操作步骤如下：
(1)放大培养催化菌株，采用的放大培养基如下：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.2％，琼脂2％，余量为水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。放大培养条件为恒温震荡培养：培养温度28-37℃，摇床转速150-250rpm，培养3-7天。
(2)把上述发酵液离心，弃去培养液，收集菌体，把菌体再接种于催化培养基，催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH4)2SO40.5-1.0％，NaCl0.2％，KCl0.1％，MgSO4·7H2O 0.01-0.02％，FeSO4·7H2O 0.01-0.03％，KH2PO40.05-0.15％，余量为水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。培养条件为恒温震荡培养：恒温28-37℃，摇床转速150-250rpm，培养3-7天。
本发明中，催化菌株以菌悬液的形式加入到催化培养基中，菌悬液的加入量占催化培养基重量的2-30％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为104-109个/ml的菌悬液。
(3)以薄层层析鉴定发酵液中是否存在左旋磷霉素；以生物鉴定盘鉴定发酵液左旋磷霉素含量。
实施例1：
采用催化菌株组合菌系No.1，No.1菌系中含有三种细菌-鲁氏不动杆菌、简单节杆菌、耐辐照红色杆菌。将这3种菌株分别放大培养，采用的放大培养基如下：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.2％，琼脂2％，余量为自来水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。培养条件：温度28℃，200rpm，培养5天。离心、收集菌体后，再同时接种于催化培养基中，三种催化菌株分别以菌悬液的形式加入到催化培养基中，每种催化菌株菌悬液的加入量占催化培养基重量的3％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为107个/ml的菌悬液。催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5％，(NH4)2SO40.5％，NaCl0.2％，KCl0.1％，MgSO4·7H2O0.01％，FeSO4·7H2O0.01％，KH2PO40.05％余量为自来水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度28℃、摇床转速200rpm，培养时间5天。以薄层层析定性鉴定发酵液中含有左旋磷霉素，以生物鉴定盘方法定量检测发酵液中左旋磷霉素浓度为30.5μg/ml。
实施例2：
采用催化菌株组合菌系No.3，No.3菌系中含有五种细菌-鲁氏不动杆菌、简单节杆菌、耐辐照红色杆菌、酯香金杆菌和恶臭假单胞菌。把五种细菌分别放大培养，采用的放大培养基如下：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.2％，琼脂2％，余量为自来水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。培养条件：温度30℃，150rpm，培养4天。离心、收集菌体后，再同时接种于催化培养基中，五种催化菌株分别以菌悬液的形式加入到催化培养基中，每种催化菌株菌悬液的加入量占催化培养基重量的2％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为108个/ml的菌悬液。催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素3.0％，(NH4)2SO41.0％，NaCl0.2％，KCl0.1％，MgSO4·7H2O0.01％，FeSO4·7H2O0.02％，KH2PO40.10％，余量为自来水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度30℃、摇床转速150rpm，培养时间4天。以薄层层析定性鉴定发酵液中含有左旋磷霉素，以生物鉴定盘方法定量检测发酵液中左旋磷霉素浓度为41.6μg/ml。
实施例3：
采用一种催化菌株-耐辐照红色杆菌，将其放大培养，采用的放大培养基如下：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.2％，琼脂2％，余量为水，pH7.5。121℃湿热灭菌20min。培养条件：温度28℃，180rpm，培养7天。离心、收集菌体后，再同时接种于催化培养基中，催化菌株以菌悬液的形式加入到催化培养基中，菌悬液的加入量占催化培养基重量的20％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为106个/ml的菌悬液。催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素1.0％，(NH4)2SO40.5％，NaCl0.2％，KCl0.1％，MgSO4·7H2O 0.01％，FeSO4·7H2O 0.01％，KH2PO40.05％，余量为水，pH7.5，121℃湿热灭菌20min。恒温震荡培养，培养温度28℃、摇床转速180rpm，培养时间7天。以薄层层析定性鉴定发酵液中含有左旋磷霉素，以生物鉴定盘方法定量检测发酵液中左旋磷霉素浓度为24.7μg/ml。
Claims (6)
1.一种把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：通过生物催化方法把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素，利用微生物的生物催化能力完成该转化过程；具有生物催化能力的微生物为：鲁氏不动杆菌、简单节杆菌和耐辐照红色杆菌组成的组合菌系，或者鲁氏不动杆菌、简单节杆菌、耐辐照红色杆菌、酯香金杆菌和恶臭假单胞菌组成的组合菌系，或者耐辐照红色杆菌。
2.按照权利要求1所述的把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：先把微生物催化菌株放大培养、离心、收集菌体。
3.按照权利要求2所述的把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：放大培养采用细菌完全培养基，细菌完全培养基组分为：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，琼脂2％，pH 7.5，余量为水；121℃湿热灭菌20min；放大培养条件为恒温震荡培养，培养温度28-37℃，摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。
4.按照权利要求2所述的把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：将所收集菌体接种于催化培养基，恒温震荡培养，催化培养基组分为：按重量百分数计，右旋磷霉素0.5-3.0％，(NH4)2SO4 0.5-1.0％，NaCl 0.2-0.5％，KCl 0.1-0.3％，MgSO4·7H2O 0.01-0.02％，FeSO4·7H2O 0.01-0.03％，KH2PO4 0.05-0.15％，余量为水；121℃湿热灭菌20min；培养条件为恒温震荡培养，培养温度28-37℃，摇床转速150-250rpm，培养时间3-7天。
5.按照权利要求4所述的把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：催化菌株以菌悬液的形式加入到催化培养基中，菌悬液的加入量占催化培养基重量的2-30％；其中，催化菌株菌悬液为催化菌株加入到生理盐水中，形成催化菌株浓度为104-109个/ml的菌悬液。
6.按照权利要求1所述的把右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的方法，其特征是：分别以薄层层析和生物鉴定盘方法定性和定量检测左旋磷霉素。
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