CN1876830B

CN1876830B - 以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选检定方法

Info

Publication number: CN1876830B
Application number: CN2006100464251A
Authority: CN
Inventors: 张雪姝; 徐慧; 张颖; 陈冠雄; 陈玉; 张海燕
Original assignee: NORTHEAST PHARMACEUTICAL GROUP CO Ltd; Institute of Applied Ecology of CAS
Current assignee: Northeast Pharmaceutical Group Co., Ltd.; Shenyang Application Ecelogy Inst., Chinese Academy of Sciences
Priority date: 2006-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2026-04-26
Also published as: CN1876830A

Abstract

本发明涉及生物转化/生物催化技术、微生物菌株筛选领域，具体为一种以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株的筛选策略及方法。该筛选策略及具体操作方法在筛选过程中包括了菌株培养和转化产物鉴定两个大步骤。该筛选策略及具体操作方法的要点是实验室菌种的前期富集及采用生物检定与薄层层析(TLC)方法相结合的产物检定策略。由于自然界中能进行右旋至左旋磷霉素的菌种不多，且实验室已有菌种生长缓慢，前期菌种富集很重要。而且采用生物检定与TLC方法相结合的产物检定策略进行产物检测，可以准确确定产物中是否含有左旋磷霉素。

Description

以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选检定方法

技术领域

本发明涉及生物转化/生物催化技术、微生物菌株筛选领域，具体为一种以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株的筛选检定策略及方法。

背景技术

磷霉素[(-)-顺-(1R，2S)-1，2-环氧丙基磷酸，英文名：Fosfomycin，简称FOM]是一种广谱抗生素。磷霉素的化学结构简单且迥异于大多数常用抗生素，它具有毒性低、无抗原性、抗菌谱广、适应症多、不易形成耐药性等特点。近年的研究结果又发现了磷霉素的一些新功效，例如：与其它抗生素的协同作用、减轻其它抗生素的毒副反应、联合用药治疗危重感染、免疫增强作用。因此，磷霉素被称为二十一世纪的新抗生素。

目前，磷霉素生产主要采用化学合成法，即以丙炔醇为原料，经过酯化、水解、加氢、环氧化、拆分、成盐等工艺而最终获得左旋磷霉素。但是，化学合成工艺的生产收率不到20％，这是因为在环氧化过程中形成的是磷霉素消旋体，即50％左旋磷霉素和50％右旋磷霉素的混合物。将消旋体进行化学拆分，分离出的左旋磷霉素为有疗效的成品，分离出的右旋磷霉素则作为废弃物排放掉。这不仅导致生产成本提高和资源浪费，也同时形成了严重的环境污染问题。例如，某制药企业的有机磷废水排放量为20吨/日，COD值高达200000～300000mg/L。因此，实现左旋磷霉素的不对称合成或右旋磷霉素的再利用，是降低磷霉素生产成本、提高产值和利税、减少废水排放的一项迫切需求。

近年来，人们逐渐认识到生物转化(Biotransformation)/生物催化(Biocatalysis)将成为生产手性化合物的关键技术。因为大多数生物催化剂(微生物菌体或酶)本身就是手性催化剂，它们对底物构型往往有严格要求，能选择性地作用于对映体中的一个，而对另一个不起作用。生物转化或合成正是利用酶促反应的高度立体选择性，将化学合成的外消旋物、前体或潜手性化合物转化成单一光学活性产物。目前，生物转化作用产物的89％是手性的。生物转化作用的优点为手性专一性强、反应条件温和(20℃～50℃、pH中性)、立体选择性强、副反应少、收率高、产物光学纯度高，环境污染少。

发明内容

本发明的目的是提供一种以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选检定策略和方法，实现左旋磷霉素的不对称合成或右旋磷霉素的再利用，降低磷霉素生成成本。

本发明的技术方案是：

一种以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选检定方法，以实验室已有的菌株为出发菌株，采用以右旋磷霉素为底物的液体培养基振荡培养，采用生物检定盘及薄层层析(TLC)相结合的方法对振荡培养的转化产物进行检测，从而确定从中筛选出产物为左旋磷霉素的转化菌株。

所述实验步骤如下：

1)完全液体培养基

按重量百分数计，完全液体培养基有如下配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，余量为蒸馏水，将上述组分均匀混合，调pH 7.2-7.4，115℃灭菌30分钟，备用；

2)待测菌株的培养

将待测菌株接种于完全液体培养基中进行30℃富集，摇床160rpm，振荡培养3天，然后加入转化底物右旋磷霉素0.1～0.8％，并加入微量元素NaVO₃0.02％，CoCl₂0.05％(按重量百分比计算)进行30℃摇床振荡转化培养5天，160rpm。

3)生物检定及其平板的制备

培养基I成分：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2％，余量为蒸馏水，将上述组分均匀混合，调pH 7.0-7.2；培养基II成分：按重量百分数计，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，余量为蒸馏水，将上述组分均匀混合，调pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121℃灭菌20分钟；将融化的培养基I倒入生物鉴定盘，制成下层平板；再将融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌悬液，混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板；

将转化发酵液4500rpm、20分钟离心取上清，加10μl于灭好菌的滤纸片上，待1小时干燥后，放于生物鉴定盘上，37℃培养16小时，观察并测量抑菌圈直径，依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株。

4)转化产物的鉴定及平板的制备

本发明利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(体积比3∶1∶1)，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr，含有磷霉素部分产生抑菌圈。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新的、效率高、操作简易的筛选策略及相应的具体操作方法，用于筛选以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株。该筛选策略及具体操作方法的要点是实验室菌种的前期富集及采用生物检定与薄层层析(TLC)方法相结合的产物检定策略。由于自然界中能进行右旋至左旋磷霉素的菌种不多，且实验室已有菌种生长缓慢，前期菌种富集很重要。而且采用生物检定与TLC方法相结合的产物检定策略进行产物检测，可以准确确定产物中是否含有左旋磷霉素。

具体实施方式

本发明筛选策略把筛选过程分为两个步骤，即培养和鉴定步骤。以实验室已有的菌株为出发菌株，采用以右旋磷霉素为底物的液体培养基振荡培养，采用生物检定盘及薄层层析(TLC)相结合的方法对振荡培养的转化产物进行检测，从而确定从中筛选出产物为左旋磷霉素的转化菌株。

本发明中除特别说明外，所述百分含量均为重量百分数，所述pH调节采用重量浓度为10％的NaOH溶液或重量浓度为10％的HCl溶液。

所述实验室菌株采用以顺丙烯磷酸(cPA)为唯一碳源筛选模型获得。以cPA为唯一碳源菌株筛选模型设计思路：能够以顺丙烯磷酸为唯一碳源生长的细菌，必定存在可以作用于顺丙烯磷酸的酶。所以从土壤样品中筛选出的细菌具有环氧化顺丙烯磷酸合成磷霉素的能力。具体过程如下：

一、制备土壤悬液：

称取土壤样品5g，放入盛有100mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的250mL的三角瓶中，置摇床振荡30min，使土壤样品在水中分散均匀，制成为土壤悬液。

二、菌株筛选：

1.顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基

顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基配方如下：按重量百分数计，(NH₄)₂SO₄0.3％，KCl0.1％，NaCl0.2％，MgSO₄·7H₂O0.02％，KH₂PO₄0.05％，琼脂粉2％，维生素复合液0.1％，顺丙烯磷酸1.0％，余量为蒸馏水。pH7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。其中，维生素复合液的组成如下：按重量百分数计，叶酸0.002‰、生物素0.002‰、维生素B₆0.01‰、维生素B₁0.005‰、泛酸钙0.005‰、维生素B₂0.005‰、维生素B₁₂0.0001‰，余量为蒸馏水。维生素复合液须经0.2μm滤膜过滤除菌，并在培养基灭菌后以无菌操作加入。

2.筛菌过程：

吸取0.1mL土壤悬液，加到顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基平板上，涂布均匀。倒置于37℃培养5～7天。每天观察菌落生长状况。

3.筛选获得菌株的分离纯化并保藏菌种

分离纯化培养基配方如下：按重量百分数计，(NH₄)₂SO₄0.3％，KCl0.1％，NaCl0.2％，MgSO₄·7H₂O0.02％，KH₂PO₄0.05％，琼脂粉2％，pH7.2-7.4，维生素复合液0.1％，酵母膏0.1％，顺丙烯磷酸0.3％，余量为蒸馏水。121℃灭菌20分钟。

挑取在顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基上生长的菌落，划线接种于上述分离纯化培养基斜面上进行纯化，然后再接种于相同培养基斜面上进行保藏。

本发明的具体操作步骤如下：

一、完全液体培养基的制备与菌株培养

按重量百分数计，完全液体培养基有如下配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，余量为蒸馏水，pH7.2-7.4，115℃灭菌30分钟，备用。

将待测菌株接种于完全液体培养基中进行30℃富集，摇床160rpm，振荡培养3天，与空白对照完全液体培养基相比较用肉眼观察出现明显浑浊，然后加入转化底物右旋磷霉素，使其重量比为0.1～0.8％，并加入微量元素NaVO₃和CoCl₂，使重量比分别为0.02％、0.05％，进行30℃转化培养5天，摇床振荡160rpm，得到底物转化后的发酵液。

二、产物鉴定

1、指示菌培养与悬液的配制

指示菌为大肠杆菌(E.coli)。

按重量百分数计，指示菌培养基组成：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，琼脂2％，余量为自来水。加热溶解后，采用NaOH10％与HCl10％溶液，并用pH试纸测试使培养基达pH7.0-7.2。装入茄型瓶90mL，121℃湿热灭菌20分钟后，摆斜面备用。

指示菌培养：37℃培养24hr，菌苔呈半透明至白色。

指示菌悬液的制备：把100mL灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的空锥瓶中，测定吸光度(O.D.值)为0.54-0.57。

2、生物检定培养基及其平板的制备：

按重量百分数计，培养基I成分：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，琼脂2％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基II成分：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121 ℃灭菌20分钟。将200mL融化的培养基I倒入生物鉴定盘(20×30cm)，制成下层平板；再将100mL融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌悬液1mL，混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板。

将转化发酵液4500rpm、20分钟离心取上清，加10μl于灭好菌的滤纸片上，待1小时干燥后，放于生物鉴定盘上，37℃培养16小时，观察并测量抑菌圈直径。生物转化过程首先需要菌体吸收外源性前体，通过菌体内酶催化作用可将右旋磷霉素转化为具有抑菌作用的左旋磷霉素。因此可依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株。只要有抑菌圈产生即可认为菌株具有磷霉素生物转化能力；抑菌圈越大，转化能力越强。

3、薄层层析鉴定转化产物磷霉素

利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水(体积比3∶1∶1)，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr，含有磷霉素部分产生抑菌圈。比较样品与磷霉素标准品的Rf值(比移值)，从而验证转化产物，Rf值为3.53时，转化产物为具有以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株。

实施例：

将实验室前期经以cPA为唯一碳源菌株筛选模型从土壤中筛选出的菌株，经过前期富集培养，与其后的生物检定与薄层层析检验，比较Rf值，从中筛选出具有以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株。

Claims

1.一种以右旋磷霉素为底物的左旋磷霉素生物转化菌株筛选检定方法，其特征在于：包括培养和转化产物鉴定两个步骤，培养出发菌株，进行前期富集培养，前期培养采用完全液体培养基进行菌种富集，然后加入右旋磷霉素，以右旋磷霉素做为发酵底物进行生物转化；转化产物鉴定采用生物检定盘及薄层层析相结合的方法，对产物中是否含有左旋磷霉素进行检定；

所述出发菌株具体培养过程如下：

第一步，制备土壤悬液：

称取土壤样品5g，放入盛有100mL无菌生理盐水并带有玻璃珠的250mL的三角瓶中，置摇床振荡30min，使土壤样品在水中分散均匀，制成为土壤悬液；

第二步，菌株筛选：

(1)顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基

顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基配方如下：按重量百分数计，(NH₄)₂SO₄0.3％，KCL 0.1％，NaCl 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KH₂PO₄ 0.05％，琼脂粉2％，维生素复合液0.1％，顺丙烯磷酸1.0％，余量为蒸馏水；pH7.2-7.4，121℃灭菌20分钟；其中，维生素复合液的组成如下：按重量百分数计，叶酸0.002‰、生物素0.002‰、维生素B₆0.01‰、维生素B₁0.005‰、泛酸钙0.005‰、维生素B₂0.005‰、维生素B₁₂0.0001‰，余量为蒸馏水；维生素复合液须经0.2μm滤膜过滤除菌，并在培养基灭菌后以无菌操作加入；

(2)筛菌过程：

吸取0.1mL土壤悬液，加到顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基平板上，涂布均匀；倒置于37℃培养5-7天，每天观察菌落生长状况；

(3)筛选获得菌株的分离纯化并保藏菌种

分离纯化培养基配方如下：按重量百分数计，(NH₄)₂SO₄ 0.3％，KCL0.1％，NaCl 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KH₂PO₄ 0.05％，琼脂粉2％，pH7.2-7.4，维生素复合液0.1％，酵母膏0.1％，顺丙烯磷酸0.3％，余量为蒸馏水；121℃灭菌20分钟；

挑取在顺丙烯磷酸唯一碳源选择性培养基上生长的菌落，划线接种于上述分离纯化培养基斜面上进行纯化，然后再接种于相同培养基斜面上进行保藏；

1)完全液体培养基

按重量百分数计，完全液体培养基有如下配方：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，余量为蒸馏水，将上述组分均匀混合，调pH7.2-7.4，115℃灭菌30分钟，备用；

2)待测菌株的培养

将待测菌株接种于完全液体培养基中进行30℃富集，摇床160rpm，振荡培养3天，然后加入转化底物右旋磷霉素，使其重量比为0.1-0.8％，并加入微量元素NaVO₃和CoCl₂，使重量比分别为0.02％、0.05％，进行30℃转化培养5天，摇床振荡160rpm，得到底物转化后的发酵液；

通过采用生物检定盘及薄层层析相结合的转化产物鉴定方法，筛选磷霉素转化菌株，此转化产物鉴定方法包括：

①指示菌培养与悬液的配制

按重量百分数计，指示菌培养基成分：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl0.5％，琼脂2％，余量为自来水，加热溶解后，调pH7.0-7.2，121℃湿热灭菌20分钟后，摆斜面备用；

指示菌培养：37℃培养24hr，菌苔呈半透明至白色；

指示菌悬液的制备：把灭菌的生理盐水倒入茄型瓶中，用接种环刮洗菌苔，再将刮洗液倒入灭菌的生理盐水中，测定吸光度为0.54-0.57；

②生物检定培养基及其平板的制备

按重量百分数计，培养基I成分：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，余量为自来水，pH7.0-7.2；按重量百分数计，培养基II成分：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，余量为自来水，pH7.0-7.2；培养基I、培养基II均在121℃灭菌20分钟；将融化的培养基I倒入生物鉴定盘，制成下层平板；再将融化的培养基II冷却至55℃，加入指示菌悬液，混匀后倒入生物鉴定盘，制成上层平板；

③发酵产物生物鉴定

将转化发酵液4500rpm，20分钟离心取上清，加10μl于灭好菌的滤纸片上，待1小时干燥后，放于生物鉴定盘上，37℃培养16小时，观察并测量抑菌圈直径，依据抑菌圈的有无和抑菌圈直径的大小来筛选具有磷霉素生物转化能力的菌株；利用薄层层析分析磷霉素，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水按体积比3∶1∶1，将展开后的层析板风干，置于生物鉴定平板上，待浸润后取下，37℃培养16hr，含有磷霉素部分产生抑菌圈；比较样品与磷霉素标准品的Rf，从而验证转化产物。