CN110272839B - 一株不动杆菌及其在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用 - Google Patents

一株不动杆菌及其在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株不动杆菌及其在生产手性3‑环己烯‑1‑甲酸中的应用。本发明的不动杆菌的其分类学命名为不动杆菌Acinetobacter sp，于2019年01月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17220。采用本发明的不动杆菌生产手性3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯，所得产物(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸甲酯的光学纯度在99％以上，而且催化剂的稳定性好，能耐受较高浓度的底物和产物，反应条件温和。使用本发明的拆分工艺能简单、高效地获得高光学纯度和高浓度的(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸，且该法节能、环保，高浓度的产物有利于产物的回收，是一种高效的(S)‑3‑环己烯‑1‑甲酸的生产方法，具有很好的工业应用前景。

Description

一株不动杆菌及其在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用
技术领域
本发明涉及一株不动杆菌及其在生产手性3-环己烯-1-甲酸中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
3-环己烯-1-甲酸作为手性化合物是一种重要的化学试剂和有机中间体，广泛应用于医药、化工等多个领域。(S)-3-环己烯-1-甲酸是凝血因子Xa的抑制剂—依度沙班中间体3,4-二氨基环己烷羧酸衍生物的重要起始原料。而(R)-3-环己烯-1-甲酸也可以用于合成多种药物中间体，如抗肿瘤药物(+)-Phyllanthocin的中间体、FK 506(普乐可复)的C24-C34片段、磷酸奥司他韦(特敏福)的初始原料。
目前，仅有少数关于手性3-环己烯-1-甲酸拆分制备的文献报道，例如CihangirTanyeli等(Tetrahedron Asymmetry,2004,15,2057-2060)描述了一种利用商品化的猪肝酯酶(PLE)，马肝酯酶(HLE)和猪胰脂肪酶(PPL)水解(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯制备手性3-环己烯-1-甲酸，PLE催化反应得到(S)-构型的羧酸转化率为49％，e.e.>99％，HLE催化底物水解后也生成(S)-构型的羧酸，转化率达到48％，e.e.值为97％，与此相反，PPL产生(R)-构型羧酸的e.e.值为91％，转化率为49％。徐春秀等(现代药物与临床,2013,28(2):126-128)在2013年报道了通过化学拆分法以手性苯乙胺为手性拆分剂，(R,S)-3-环己烯-1-甲酸在丙酮中形成非对映异构体，并利用它们的溶解度差别来拆分为(R)-(+)-3-环己烯-1-甲酸(收率28.3％)和(S)-(-)-3-环己烯-1-甲酸(收率28.7％)，光学纯度均大于99％。Sheng Wu等人(Applied and Environmental Microbiology,2016,AEM.01817-16)利用Mhg酯酶对3-环己烯-1-甲酸甲酯进行水解得到手性3-环己烯-1-甲酸，底物的转化率为53％，e.e.值为25％。王钊等人在专利中描述了一种商品化的蛋白酶拆分制备手性3-环己烯-1-甲酸的方法，收率为32.8％，e.e。值为99.5％。
然而这些研究存在一定的局限性，如：商品酶价格昂贵，且催化的水解反应底物浓度较低，利用微生物酶催化过程又存在立体选择性不高的问题，化学法的手性拆分试剂价格非常昂贵。因此，目前仍然缺乏可高立体选择性催化3-环己烯-1-甲酸甲酯制备手性3-环己烯-1-甲酸的微生物酶。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一株能够生产对映选择性地催化水解高浓度底物的产酯酶的不动杆菌，并提供利用该菌株或其产生的粗酶催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯对映选择性水解生产高浓度产物(S)-3-环己烯-1-甲酸的方法。
本发明的第一个目的是提供一株不动杆菌，其分类学命名为不动杆菌Acinetobacter sp.，已于2019年01月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17220。
本发明的第二个目的是提供所述的不动杆菌在生产(S)-3-环己烯-1-甲酸的中应用。
进一步地，应用所述的不动杆菌发酵生产的酯酶为催化剂，催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯生产(S)-3-环己烯-1-甲酸。
进一步地，所述催化具体是在含有助溶剂的缓冲溶液中，催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性水解，然后从水解反应生成的混合物中收集(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，在碱性条件下加热水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
进一步地，所述的助溶剂为与水互溶的有机溶剂。
进一步地，所述的助溶剂的添加量为反应液总体积的5～35％。
进一步地，所述的缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述缓冲溶液的pH为5.0～9.5。
进一步地，所述的碱性条件为0.5～1.5M氢氧化钠溶液。
本发明的第三个目的是提供一种酯酶，由所述的不动杆菌发酵生产得到。
本发明的第四个目的是提供一种微生物菌剂，包含所述的不动杆菌。
本发明的有益效果是：
采用本发明的不动杆菌生产手性3-环己烯-1-甲酸甲酯，具有显著的优点，所得产物(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的光学纯度在99％以上，而且催化剂的稳定性好，能耐受较高浓度的底物和产物，反应条件温和。使用本发明的拆分工艺能简单、高效地获得高光学纯度和高浓度的(S)-3-环己烯-1-甲酸，且该法节能、环保，高浓度的产物有利于产物的回收，是一种高效的(S)-3-环己烯-1-甲酸的生产方法，具有很好的工业应用前景。
生物材料保藏
不动杆菌Acinetobacter sp.，已于2019年01月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17220。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明用到的培养基有：
富集培养基(g/L)：环己烯羧酸甲酯1.5，(NH4)2SO4 2，KH2PO4，MgSO40.5，NaCl1，DMSO5％(v/v)，pH7.0，121℃高温灭菌20min。取少量土样悬浮于装有富集培养基的试管中，30℃，180rpm下培养48h，吸取适量培养液，加入到装有第二轮富集培养基的试管中，同样的条件继续培养48h。
平板分离培养基(g/L)：三丁酸甘油酯10，Tween-80 10，蛋白胨16，酵母膏10，NaCl5，琼脂15，KH2PO4 0.5，MgSO4 0.2，pH7.0，121℃高温灭菌20min。将培养液进行梯度稀释涂布平板培养基，产透明圈的单菌落即为目的菌落。
发酵培养基(g/L)：甘油15，蛋白胨5，酵母膏5，NaCl1，KH2PO4 0.5，pH7.0，121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却、接种，接种量5％(v/v)，在30℃，180rpm转速条件下进行发酵，培养12h后菌体湿重可达20g/L，该酶的比活力(U)定义为：每分钟催化1μmol(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯所需要的细胞量，测得JNU9335产酶可达180U/L，比活力为9U/g湿细胞。
对映选择性地催化水解的反应条件：细胞浓度为20～200g/L，底物浓度为50～500mM，反应温度为10～60℃，pH5～9.5，反应时间为0.5～36h。
底物的对映体过量值(e.e.)和转化率采用气相色谱分析，分析条件如下：B-DM手性柱(30m×0.25mm×0.25μm)；以氮气作为载气；进样口温度280℃；空气流量300mL/min，尾吹气流量25mL/min；分流比50:1，进样量1.0μL。柱箱升温程序：初始温度100℃保持2min，2℃/min升温至150℃，保持2min。FID检测器温度：280℃。
实施例1：不动杆菌的筛选
从江苏、陕西、山东、河南、江西等地区的300多份土壤中进行筛选，筛选的具体步骤如下：
从不同的环境中采集土壤样品，利用环己烯甲酸甲酯为唯一碳源进行三轮富集培养，筛选酯酶产生菌。通过反复筛选，分离得到7株具有很高的对映选择性催化活性的菌株，进一步对7株候选菌的性能进行分析筛选：
7株候选菌株对(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性水解性能：
取1.0g各菌株的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.0)中，(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的浓度为50mM，助溶剂DMSO的添加量为5％，反应混合物在30℃，180rpm的恒温摇床上反应，在表1中所示的时间取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和对映体过量值(e.e.s)。各菌株的催化性能如表1所示。
表1候选菌株的催化性能比较
Figure BDA0002053258130000051
表1说明从土壤中筛选的这9株菌均具有很高的对映选择性催化活性，其中JNU9335反应速度最快，转化率最高。
7株候选菌株对不同浓度的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的耐受能力：
取1g各菌株的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲溶液(100mM，pH7.0)中，分别加入不同浓度的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，反应混合物在30℃，180rpm的恒温摇床上反应24h。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率。各菌株对不同浓度底物的耐受情况如表2所示。
表2候选菌株对不同浓度的底物耐受情况的对比
Figure BDA0002053258130000052
表2说明随着底物浓度的增加，多数菌株的活性受到较高底物浓度的抑制，水解产物增加很少，而只有菌株JNU9335在较高的底物浓度下(500mM)，仍能维持较高的转化率，得到较高浓度的产物，说明该菌株具有优异的底物和产物耐受性，所以该菌株被筛选作为最优菌株用于以后的工作。
通过上述筛选得到一株产酶稳定的高活力和高选择性的酯酶产生菌JNU9335，该菌株已于2019年01月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCCNo.17220。
实施例2：不动杆菌Acinetobacter sp.JNU9335的形态及生理学鉴定
菌株JNU9335具有如下的微生物学特征：
1.形态大小
杆状，染色均匀，0.5～0.9×1.5～3μm，不产芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阴性。
2.适宜生长环境
适宜的生长温度为20～35℃，可以在pH5～9环境中生存。
3.平板培养菌落特性
在30℃平板上培养24h可形成小的菌落，36h形成粘稠、湿润的白色菌落，边缘光滑，中间突出。随着时间的延长，在三丁酸甘油酯平板上形成透明圈。
实施例3：不动杆菌Acinetobacter sp.JNU9335的分子生物学鉴定
提取菌株JNU9335的染色体DNA，使用引物(27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R:5'-TACCTTGTTACGACTT-3')酶促扩增16S核糖体DNA(16S rDNA)，热循环仪PCR程序为：在95℃变性5min，在95℃40s，在55℃下1min在72℃下2min的30个循环，最后一步在72℃下10min。16S rDNA测序结果分析，鉴定为不动杆菌Acinetobacter sp.。
实施例4：不动杆菌Acinetobacter sp.JNU9335的发酵培养
发酵培养基(g/L)：甘油15，蛋白胨5，酵母膏5，NaCl1，KH2PO4 0.5，pH7.0。121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却、接种，接种量5％(v/v)，在30℃，180rpm转速条件下进行发酵，培养12h，在8000rpm，10min条件下收集菌体，弃尽上层培养基，用生理盐水洗涤一次，在真空冷冻干燥机(SCIENTZ-10N)中干燥24h，收集酶粉于-20℃保存。该酶的比活力(U)定义为：每分钟催化1μmol(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯所需要的细胞量，测得酶粉的比活力为96U/g。
实施例5：温度对环己烯甲酸甲酯的酶促水解的影响
将70mg的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，0.5mL二甲基亚砜、25mg冻干的粗酶粉加入到10mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)中，混合均匀后分别置于20，30，40和50℃，180rpm的恒温摇床上反应振荡6h。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和对映体过量值(e.e.s)。如表3所示，温度在20～40℃时，该酯酶具有很高的转化率和稳定的e.e.s，说明该温度范围内，该酯酶是比较稳定的，活性没有受到很大的损失。温度超过50℃时，该酯酶的转化能力大大下降，这可能是高温导致该酯酶空间构型发生变化，从而导致酶的活性下降。
表3温度对不动杆菌酯酶催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的酶促水解的影响
Figure BDA0002053258130000071
实施例6：不动杆菌酯酶对不同浓度(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的酶促水解将浓度为100，200和500mM的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯和0.5mL二甲基亚砜加入到10mL磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)中，再分别加入相应量的酶，反应混合物置于30℃，180rpm的恒温摇床上振荡反应。反应后取样，产物和底物经乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥后，再通过手性气相色谱分析底物的转化率和对映体过量值(e.e.s)。结果如表4所示。
表4不动杆菌酯酶对不同浓度的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的酶促水解
Figure BDA0002053258130000072
表4显示，该酯酶催化不同浓度的(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯时，产物浓度随着底物浓度的增加而增加，最高可达215mM，且仍保留较高的产物光学纯度，说明较高浓度的底物和产物对该不动杆菌酯酶的活性没有造成显著的影响，该酯酶可以耐受高浓度的底物和产物。这是至今报道的生物催化法生产手性环己烯甲酸的方法中，生成产物浓度最高的例子，也是唯一一篇微生物酶法转化的报道。本发明的方法具有很广阔的实际工业应用前景。
实施例7：(S)-环己烯-1-甲酸的克级制备
将3.50g(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯与2.5mL二甲基亚砜和47.5mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH7.0)混合均匀后，加入1g酶粉。反应在恒温30℃的250mL圆底烧瓶中进行，400rpm下机械搅拌。通过手性气相色谱监测底物的转化率和产物的对映体过量值。12h后停止反应，过滤除酶后，调节pH至9，加入乙酸乙酯萃取3次，合并有机相后旋转蒸发至无液体流出，获得(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，然后将(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯加入1 M NaOH水溶液50℃加热回流搅拌反应6h，再加入1 M HCl水溶液调节pH至5，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，用无水Na2SO4干燥，过滤，旋转蒸发得到(S)-3-环己烯-1-甲酸，所得产物为具有特殊气味的液体，分离后总得率为40％，光学纯度为99％e.e.。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一株不动杆菌，其特征在于，其分类学命名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)，已于2019年01月21日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17220。
2.权利要求1所述的不动杆菌在生产(S)-3-环己烯-1-甲酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用所述的不动杆菌发酵生产的酯酶为催化剂，催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯生产(S)-3-环己烯-1-甲酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述催化具体是在含有助溶剂的缓冲溶液中，催化(R,S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯的对映选择性水解，然后从水解反应生成的混合物中收集(S)-3-环己烯-1-甲酸甲酯，在碱性条件下加热水解得到(S)-3-环己烯-1-甲酸。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂为与水互溶的有机溶剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的助溶剂的添加量为反应液总体积的5～35％。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的缓冲溶液为柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述缓冲溶液的pH为5.0～9.5。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的碱性条件为0.5～1.5M氢氧化钠溶液。
9.一种微生物菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的不动杆菌。
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