CN102660470B

CN102660470B - 中华根瘤菌及其生物拆分外消旋α-羟酸生产手性α-羟酸

Info

Publication number: CN102660470B
Application number: CN 201210110081
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 薛亚平; 王威; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: CN102660470A

Abstract

本发明提供了一株产(S)-扁桃酸脱氢酶新菌株——中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2011391，保藏日期：2011年11月13日。通过本发明菌株制备高光学纯度的(R)-扁桃酸及其相关衍生物，光学纯度＞99％，得率和相对应的氧化产物酮酸得率均接近于50％；利用本发明提供的菌株来拆分α-羟基酸外消旋体，具有操作简单安全、成本低廉、反应条件温和等优点，更重要的是显著提高了过程的原子经济性，具有很好的工业应用前景。

Description

中华根瘤菌及其生物拆分外消旋α-羟酸生产手性α-羟酸

(一)技术领域

本发明涉及一株产(S)-α-羟酸脱氢酶的新菌株——中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，及其在生物拆分α-羟酸外消旋体制备相应(R)-α-羟酸及其酮酸中的应用。

(二)背景技术

光学活性的α-羟酸是指手性碳上带有羟基同时带有羧基的一类化合物，是重要的手性“砌块”，可用于不对称合成大量生物活性分子。在这类化合物中，光学纯扁桃酸在商业角度上被认为是最重要的代表。扁桃酸又称a-羟基苯乙酸、苯乙醇酸、苦杏仁酸，其R型和S型的结构式如下：

光学活性的扁桃酸及其衍生物是一种极为重要的药物中间体：如R-(-)-扁桃酸广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素，青霉素，抗肿瘤制剂，抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A、氯吡格雷等。S-(+)-扁桃酸则是合成S-(+)-奥昔布宁的前体原料，S-(+)-奥昔布宁临床用于治疗尿急、尿频、尿失禁。研究表明，单一构型的扁桃酸所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；光学活性的扁桃酸还可以用作手性溶剂，用于多种不对称合成反应；光学活性的扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋胺类和氨基酸类以非对映体异构盐形成进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R-扁桃酸拆分。扁桃酸其苯环上不同位置上不同的卤素取代基的衍生物同样具有优良的医药用途，如苯环上单氟或多氟取代的扁桃酸衍生物(如邻氟扁桃酸、间氟扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸等)是一类控制体重的苯乙醇胺类药物的重要中间体，3，5-二氟扁桃酸的酰胺衍生物是一种很好的C-端氨基醇二肽Aβ抑制剂。氯代物方面邻间对位置具有广泛的运用，特别是(R)-邻氯扁桃酸是全球销售额第二药物氯吡格雷合成的关键手性砌块，2009年全球销售额高达99亿美元，单药销售收入排名全球第2位，是目前最畅销的药物之一。

光学活性扁桃酸侧链不同长度的衍生物也非常的有价值，苯基乳酸是一些重要的化学合成物前体，并广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸是抗高血压首选药-普利类药物合成的重要原料。

据不完全统计，目前国际市场上光学活性的α-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；学活性的α-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。

目前，光学活性扁桃酸及其衍生物的制备主要采用外消旋体的化学拆分法：先合成扁桃酸的外消旋体，再采用一定的方法对其进行拆分，拆分的方法主要有以下几种：①非对映体盐结晶拆分法，面临的共同的问题就是价格昂贵，且有一定的毒性，在一定程度上造成了资源浪费和环境污染，目前我国规模化生产的R-扁桃酸均采用该方法生产。②色谱拆分法，该法设备费用太高，消耗大，成本太高，处理量小，因此仅限于检测以及实验室制备，无法用于商业生产。③手性萃取拆分法，手性萃取分离法是近几年才提出的手性分离方法，离商业化生产还有很大的距离。④毛细管电泳拆分法，因具有高效、快速、经济等特点，广泛应用于各种药物对映体的分离，该方法就有成本高等缺点。

立体选择性α-羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋α-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的α-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的α-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。

利用α-羟酸脱氢酶拆分外消旋α-羟酸生产手性的α-羟酸，拓宽光学活性化合物的生产方法，具有重要的意义。近年来已有一些研究把目光放在了利用微生物或者酶法来拆分外消旋扁桃酸及其相关衍生物。

1992年，Miyamoto等人利用Alcaligenes bronchisepticus KU1201拆分扁桃酸及其衍生物，经过4天的反应，底物转化率达到47％，由于活性低，因此反应的时间较长(Biotechnol Lett，1992，14：363-366)。1995年Takahashi等人利用菌株Pseudomonas polycolor对外消旋的扁桃酸进行了拆分，最后得到收率为35％(J Ferment Bioeng.1995，79：439-442)。许建和等人筛选得到的产碱杆菌Alcaligenes sp.ECU0401能选择性降解制备(R)-扁桃酸、(R)-邻氯扁桃酸、(S)-间氯扁桃酸和(S)-对氯扁桃酸，光学纯度均超过99.9％e.e.，但当底物浓度增大至(50mmol/L)，e.e值急剧下降(生物加工过程，2009，7：65-71)。该课题组筛到的另一株恶臭假单胞茵Pseudomonas putida CGMCC1388选择性降解制备(S)-扁桃酸、(S)-对羟基扁桃酸、(S)-对氯扁桃酸，但此菌株对邻氯扁桃酸基本没作用(生物加工过程，2005，3：47-51)。江南大学张辉、徐岩等人以外消旋扁桃酸为底物筛选出一株短杆菌Brevibacterium sp.该菌能转化外消旋扁桃酸为(R)-扁桃酸，用全细胞转化法研究发现其转化过程是不对称降解过程，即选择性降解了(S)-扁桃酸进而获得(R)-扁桃酸，考察了温度、pH、底物浓度及细胞量等因素对(S)-扁桃酸降解的影响转化结束后收率为48.7％、对映体过量值(e.e)可达99％(过程工程学报，2006，6：818-821)。

目前已报道的菌株均存在活性低，反应时间长，转化率低等问题，难以工业化。另外，催化反应所获得的α-酮酸是作为微生物代谢的重要中间体，会进一步被降解，难以在反应过程中积累，不能通过拆分同时制备光学活性的扁桃酸及其衍生物和相应的酮酸，导致原子经济性不高。

开展生物催化法制备光学纯的α-羟酸的研究，同时获得α-酮酸，提高生物反应过程的原子经济性，对于手性生物催化具有重要的现实意义和理论价值。

(三)发明内容

本发明目的是提供能够高立体选择性氧化来拆分外消旋α-羟酸生成单一对映体及其相应酮酸的产α-羟酸脱氢酶的新菌株——中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，以及利用该菌株制备(R)-α-羟酸及其酮酸的方法。

一株产(S)-α-羟酸脱氢酶新菌株——中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2011391，保藏日期：2011年11月13日。

该菌株是本申请发明人从全国各地的200多份土壤样品中，经初筛、复筛及分离纯化而得到的一株能产扁桃酸脱氢酶的菌株，该菌株能高立体选择性氧化外消旋α-羟酸底物中的S型底物生成相应酮酸达到拆分外消旋体的目的，根据其16S rDNA分子鉴定和生理生化鉴定结果，该菌株为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)。

该菌株菌落形态：于30℃牛肉膏蛋白胨平板上培养24h，菌落呈圆形隆起状，边缘光滑，乳白色，湿润，不易挑取；革兰氏染色阴性，杆状。

所述中华根瘤菌ZJB1101的16S rDNA扩增产物的实际长度为1477bp，序列如下：

1 AAGGAGGTGA TCCAGCCGCA GGTTCCCCTA CGGCTACCTT GTTACGACTT CACCCCAGTC

61 GCTGACCCTA CCGTGGTTAG CTGCCTCCTT GCGGTTAGCG CACTACCTTC GGGTAGAACC

121 AACTCCCATG GTGTGACGGG CGGTGTGTAC AAGGCCCGGG AACGTATTCA CCGCAGCATG

181 CTGATCTGCG ATTACTAGCG ATTCCAACTT CATGCACTCG AGTTGCAGAG TGCAATCCGA

241 ACTGAGATGG CTTTTGGAGA TTAGCTCGAC CTCGCGGTCT CGCTGCCCAC TGTCACCACC

301 ATTGTAGCAC GTGTGTAGCC CAGCCCGTAA GGGCCATGAG GACTTGACGT CATCCCCACC

361 TTCCTCTCGG CTTATCACCG GCAGTCCCCT TAGAGTGCCC AACTAAATGC TGGCAACTAA

421 GGGCGAGGGT TGCGCTCGTT GCGGGACTTA ACCCAACATC TCACGACACG AGCTGACGAC

481 AGCCATGCAG CACCTGTCTC CGATCCAGCC GAACTGAAGG AAAACGTCTC CGTAATCCGC

541 GATCGGGATG TCAAGGGCTG GTAAGGTTCT GCGCGTTGCT TCGAATTAAA CCACATGCTC

601 CACCGCTTGT GCGGGACCCC GTCAATTCCT TTGAGTTTTA ATCTTGCGAC CGTACTCCCC

661 AGGCGGAATG TTTAATGCGT TAGCTGCGCC ACCGAACAGT AAACTGCCCG ACGGCTAACA

721 TTCATCGTTT ACGGCGTGGA CTACCAGGGT ATCTAATCCT GTTTGCTCCC CACGCTTTCG

781 CACCTCAGCG TCAGTAATGG ACCAGTGAGC CGCCTTCGCC ACTGGTGTTC CTCCGAATAT

841 CTACGAATTT CACCTCTACA CTCGGAATTC CACTCACCTC TTCCATACTC TAGACACCCA

901 GTATCAAAGG CAGTTCCGGG GTTGAGCCCC GGGATTTCAC CCCTGACTTA AATGTCCGCC

961 TACGTGCGCT TTACGCCCAG TAATTCCGAA CAACGCTAGC CCCCTTCGTA TTACCGCGGC

1021 TGCTGGCACG AAGTTAGCCG GGGCTTCTTC TCCGGTTACC GTCATTATCT TCACCGGTGA

1081 AAGAGCTTTA CAACCCTAGG GCCTTCATCA CTCACGCGGC ATGGCTGGAT CAGGCTTGCG

1141 CCCATTGTCC AATATTCCCC ACTGCTGCCT CCCGTAGGAG TTTGGGCCGT GTCTCAGTCC

1201 CAATGTGGCT GATCATCCTC TCAGACCAGC TATGGATCGT CGCCTTGGTA GGCCTTTACC

1261 CCACCAACTA GCTAATCCAA CGCGGGCTCA TCCTTTCCCG ATAAATCTTT CCCCCGAAGG

1321 GCTTATACGG TATTAGCACA AGTTTCCCTG CGTTATTCCG TAGAAAAGGG TAGATTCCCA

1381 CGCGTTACTC ACCCGTCTGC CGCTCCCCTT GCGGGGCGCT CGACTTGCAT GTGTTAAGCC

1441 TGCCGCCAGC GTTCGTTCTG AGCCAGGATC AAACTCT

获得的序列与GenBank中保存的数据进行相似性分析发现，本发明微生物与Sinorhizobium sp.(DQ911548.1)同源性最高(homology，99％/1477bp，based on 16S rDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于16S rDNA序列的同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，本实验鉴定的微生物属于Sinorhizobium属的Sinorhizobium sp.种，中文名称为中华根瘤菌。

该菌株的一个显著的特点是α-羟酸脱氢酶的活性高，反应时间短，反应产物α-酮酸不作为菌种代谢的中间体，在反应过程中不会被降解，能够大量积累，提高了原子经济性。而现有已报道的菌株均难以积累酮酸。

本发明还涉及所述的中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101在生物拆分式(I)所示的α-羟酸外消旋体制备相应(R)-α-羟酸(III)及其酮酸(II)中的应用；

式(I)中：

(R)m表示m个R基团，R为羟基、卤素或C1～C4烷基，m为0～2；n为0～5。

涉及的反应式如下：

所述α-羟酸优选为下列之一：扁桃酸、2-氟扁桃酸、2-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、4-氟扁桃酸、4-氯扁桃酸、4-溴扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸、3，5-二氟扁桃酸、4-甲基扁桃酸、4-羟基扁桃酸、苯基乳酸或2-羟基-4-苯基丁酸。更优选为扁桃酸、2-氯扁桃酸、4-氟扁桃酸、4-氯扁桃酸、4-溴扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸或3，5-二氟扁桃酸。

具体的，所述应用为：以式(I)所示的α-羟酸外消旋体为底物，以中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101含酶菌体细胞为催化剂，在20～50℃、pH6.0～9.0缓冲液中进行不对称选择性氧化反应2～24小时，制得相应(R)-α-羟酸及其酮酸。所述催化剂可以是中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101经培养离心后的湿菌体或冷冻保藏的菌体，也可以是菌体经细胞破碎后，通过无机盐、有机溶剂或聚合物进行沉淀所得的粗酶。

所述缓冲液为常规适用于菌体细胞的，本发明优选为下列之一：pH6.0～6.6的柠檬酸缓冲液、pH 6.5～7.8的磷酸盐缓冲液或pH 7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液。

优选的，所述缓冲液中，底物初始浓度为1～10g/L，含酶菌体细胞添加量以湿重计为10～50g/L。

具体的，所述含酶菌体细胞可由如下方法获得：将中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB 1101接种至发酵培养基，在25～40℃、100～300rpm下培养24～72小时，得到的发酵液离心分离，即得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖2～20g/L，酵母膏5～20g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5～5g/L，KH₂PO₄0.5～5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05g/L，NaCl 0.1～1g/L，诱导剂式(I)所示α-羟酸(优选为扁桃酸)0.5～3g/L，溶剂为水，pH5～9。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一种产(S)-扁桃酸脱氢酶新菌株，通过该菌株能制备高光学纯度的(R)-扁桃酸及其相关衍生物，光学纯度＞99％，得率和相对应的氧化产物酮酸得率均接近于50％；利用本发明提供的菌株来拆分α-羟酸外消旋体，具有操作简单安全、成本低廉、反应条件温和等优点，更重要的是显著提高了过程的原子经济性，具有很好的工业应用前景。

(四)附图说明

图1为实施例4中外消旋扁桃酸经酶法拆分的变化进程图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：筛选具有拆分外消旋α-羟酸制备单一对映体的菌株

采集全国各地化工厂周边的土样，取1g土样溶于10ml 0.9％的生理盐水中，玻璃珠打碎并静置10分钟，移取1～2ml悬浊液至装有50mL富集培养基(配制：扁桃酸10g、(NH₄)₂SO₄10g、KH₂P0₄ 2.5g、K₂HP0₄ 2.5g、MgS0₄.7H₂O 0.2g、FeS0₄.7H₂0 0.03g、NaCl 1g，用水补至1L，调pH至7.0)的250mL的三角瓶中，摇床培养2～3天(30℃，150r/min)至培养液浑浊，将浑浊的富集培养液按2％的接种量转接至新鲜的富集培养液中培养，重复2～3次，可相应的提高外消旋扁桃酸的浓度来增大选择压力，继而将培养液稀释10^-4～10^-10倍，涂平板(平板培养基成分配方同富集培养基，只是其中加入了20g/L的琼脂做为凝固剂)，将涂布好的平板放在30℃的恒温培养箱中培养，待长出单菌落后，将单菌落挑至无菌的牛肉膏蛋白胨试管斜面，置于4℃冰箱待用。

对保藏在试管斜面的菌株逐一实施活力检测，将斜面上的保藏菌挑取一接种环至装有50mL发酵培养基(配制：葡萄糖10g、酵母膏10g、KH₂P0₄2.5g、K₂HP0₄ 2.5g、MgS0₄.7H₂O 0.2g、FeS0₄.7H₂0 0.03g、NaCl 1g、扁桃酸2g，用水补至1L，调pH至7.0)的250mL的三角瓶中，置于30℃，150r/min的摇床培养2～3天，离心收集菌体，0.85％生理盐水洗涤菌体2～3次，将离心得到的菌体用pH8.0的磷酸盐缓冲液溶解后，加入20mM的底物扁桃酸，置于30℃、150r/min的水浴摇床进行转化反应，待反应结束后，取样离心，取上清液滤膜后，进行手性液相分析，其检测条件为反相手性柱(型号Chirobiotic^TM R 250×4.6mm，Sigma，USA)，流动相为0.5％AcOH-CH₃CN(20∶80，v/v)，检测波长为215nm，进样量3μL。各物质在上述条件下的保留时间为：(S)-扁桃酸3.51min、(R)-扁桃酸3.83min、苯乙酮酸6.02min。

经液相检测分析，中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391对拆分外消旋扁桃酸的效果很好，转化反应结束后，底物中已无S-扁桃酸只剩余R-扁桃酸和S-扁桃酸脱氢产物苯乙酮酸，底物e.e值为99.9％，R-扁桃酸和苯乙酮酸的收率分别为46.8％和45.7％。

实施例2：中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391的发酵培养

发酵培养基：葡萄糖10g/L、酵母膏10g/L、K₂HPO₄ 2.5g/L、KH₂PO₄2.5g/L、MgSO₄ 0.2g/L、FeSO₄ 0.03g/L、NaCl 1g/L、诱导剂扁桃酸2g/L，自来水配制，pH 7.0，121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却，接种。250mL三角摇瓶装液量20％，接种一环中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391，于30℃，150rpm振荡培养48h，培养结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，离心后收集湿菌体细胞。

通过实验研究发现中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391的最大比生长速率μ_m＝0.2825h^-1，生物量倍增时间为t_d＝2.45h。

实施例3：中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391的发酵培养

培养基：葡萄糖10g/L、酵母膏10g/L、K₂HPO₄ 2.5g/L、KH₂PO₄ 2.5g/L、MgSO₄ 0.2g/L、FeSO₄ 0.03g/L、NaCl 1g/L、诱导剂扁桃酸2g/L，自来水配制，pH 7.0，121℃高温灭菌20min。灭菌后冷却，接种。250mL三角摇瓶装液量20％，接种一环中华根瘤菌CCTCC No：M 2011391，于30℃，150rpm振荡培养24h作为种子液，以2％的接种量接到灭过菌的新鲜培养基中作为发酵液，于30℃，150rpm振荡培养48h，结束后发酵液离心并用生理盐水洗涤两次，离心后收集湿菌体细胞，菌体干重达到2.9g/L。

实施例4：拆分外消旋扁桃酸生产(R)-扁桃酸和苯乙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物扁桃酸20mM的pH 8.0的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化5h，转化液离心去除菌体，对上清液进行经分析检测，(S)-扁桃酸完全转化为苯乙酮酸，而(R)-扁桃酸得到保留，其中苯乙酮酸收率为48.7％，(R)-扁桃酸收率为49.8％，底物(R)-扁桃酸e.e值＞99.9％。

底物的对映体过量值(e.e)和转化率及产物苯乙酮酸的检测采用高效液相法分析检测，具体如下：反相手性柱(型号Chirobiotic^TM R250×4.6mm，Sigma，USA)，流动相为0.5％AcOH-CH₃CN(20∶80，v/v)，检测波长为215nm，进样量3μL。各物质在上述条件下的保留时间为：(S)-扁桃酸3.51min、(R)-扁桃酸3.83min、苯乙酮酸6.02min(见图1)。

实施例5：分别转化(S)-扁桃酸和(R)-扁桃酸生产苯乙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，各自分别加入溶有底物单体(S)-扁桃酸和(R)-扁桃酸20mM的pH 8.0的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，结果发现以(S)-扁桃酸为底物的转化液中底物转化为苯乙酮酸，转化率＞99％，以(R)-扁桃酸为底物的转化液中底物完全没有转化。

实施例6：拆分外消旋邻氯扁桃酸生产(R)-邻氯扁桃酸和邻氯苯乙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物邻氯扁桃酸20mM的pH 8.0的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化24h，转化液离心去除菌体，上清液经过分析检测，(S)-邻氯扁桃酸完全转化为邻氯苯乙酮酸，而(R)-邻氯扁桃酸得到保留，其中邻氯苯乙酮酸收率为47.5％，(R)-邻氯扁桃酸收率为49.5％，底物(R)-邻氯扁桃酸e.e值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-邻氯扁桃酸3.48min、(R)-邻氯扁桃酸3.71min、邻氯苯乙酮酸5.98min。

实施例7：拆分外消旋间氯扁桃酸生产(R)-间氯扁桃酸和间氯苯乙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物间氯扁桃酸20mM的pH 8.0的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化24h，转化液离心去除菌体，上清液经过分析检测，(S)-间氯扁桃酸完全转化为间氯苯乙酮酸，而(R)-间氯扁桃酸得到保留，其中间氯苯乙酮酸收率为49.5％，(R)-间氯扁桃酸收率为47.8％，底物(R)-间氯扁桃酸e.e值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-间氯扁桃酸3.49min、(R)-间氯扁桃酸3.59min、间氯苯乙酮酸5.97min。

实施例8：拆分外消旋对氯扁桃酸生产(R)-对氯扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物对氯扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经过分析检测，(S)-对氯扁桃酸完全转化为对氯苯乙酮酸，而(R)-对氯扁桃酸得到保留，其中(R)-对氟扁桃酸收率为47.8％，底物(R)-对氟扁桃酸e.e值98.7％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-对氟扁桃酸3.43min、(R)-对氟扁桃酸3.62min、对氟苯乙酮酸5.89min。

实施例9：拆分外消旋对氟扁桃酸生产(R)-对氟扁桃酸和对氟苯乙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物对氟扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经过分析检测，(S)-对氟扁桃酸完全转化为对氟苯乙酮酸，而(R)-对氟扁桃酸得到保留，其中对氟苯乙酮酸收率为40.8％，(R)-对氟扁桃酸收率为49.1％，底物(R)-对氟扁桃酸e.e值91.6％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-对氟扁桃酸3.43min、(S)-对氟扁桃酸3.62min、对氟苯乙酮酸5.89min。

实施例10：拆分外消旋苯基乳酸生产(R)-苯基乳酸和苯丙酮酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物苯基乳酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化12h，转化液离心去除菌体，上清液经过分析检测，(S)-苯基乳酸完全转化为苯丙酮酸，苯丙酮酸收率为49.9％。(R)-苯基乳酸得到保留，其中苯丙酮酸收率为40.8％，(R)-苯基乳酸收率为49.1％，底物(R)-苯基乳酸的e.e值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-苯基乳酸3.43min、(R)-苯基乳酸3.59min、苯丙酮酸5.71min。

实施例11：拆分外消旋邻氟扁桃酸生产(R)-邻氟扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物邻氟扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化10h，转化液离心去除菌体，上清液经分析发现，(S)-邻氟扁桃酸完全转化为邻氟苯乙酮酸，邻氟苯乙酮酸收率为49.9％。(R)-邻氟扁桃酸得到保留，(R)-邻氟扁桃酸收率为48.9％，底物的e.e.值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-邻氟扁桃酸3.52min、(R)-邻氟扁桃酸3.75min，邻氟苯乙酮酸6.05min。

实施例12：拆分外消旋对溴扁桃酸生产(R)-对溴扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物对溴扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经分析发现，(S)-对溴扁桃酸完全转化为对氟苯乙酮酸，对溴苯乙酮酸收率为49.9％。(R)-对溴扁桃酸得到保留，(R)-对溴扁桃酸收率为49.9％，底物的e.e.值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-对溴扁桃酸3.45min、(R)-对溴扁桃酸3.58min，对溴苯乙酮酸5.69min。

实施例13：拆分外消旋对甲基扁桃酸生产(R)-对甲基扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物对甲基扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经分析发现，(S)-对甲基扁桃酸完全转化为对甲基苯乙酮酸，对甲基苯乙酮酸收率为49.9％。(R)-对甲基扁桃酸得到保留，(R)-对甲基扁桃酸收率为45.5％，底物的e.e.值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-对甲基扁桃酸3.23min、(R)-对甲基扁桃酸3.79min，对甲基苯乙酮酸6.06min。

实施例14：拆分外消旋2，4-二氟扁桃酸生产(R)-2，4-二氟扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物2，4-二氟扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经分析发现，(S)-2，4-二氟扁桃酸完全转化为2，4-二氟苯乙酮酸，2，4-二氟苯乙酮酸收率为49.8％。(R)-2，4-二氟扁桃酸得到保留，(R)-2，4-二氟扁桃酸收率为49.9％，底物的e.e值值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-2，4-二氟扁桃酸3.40min、(R)-2，4-二氟扁桃酸3.51min，2，4-二氟苯乙酮酸5.89min。

实施例15：拆分外消旋3，5-二氟扁桃酸生产(R)-3，5-二氟扁桃酸

称取实施例2获得的湿菌体0.5克于50mL三角形转化瓶中，加入溶有底物外消旋底物3，5-二氟扁桃酸20mM的pH 7.5的100mM的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化3h，转化液离心去除菌体，上清液经分析发现，(S)-3，5-二氟扁桃酸完全转化为3，5-二氟苯乙酮酸，3，5-二氟苯乙酮酸收率为50％。(R)-3，5-二氟扁桃酸得到保留，(R)-2，4-二氟扁桃酸收率为49.9％，底物的e.e值值＞99.9％。

上清液采用实施例3中的检测方法进行检测分析，其中各物质的保留时间分别为：(S)-3，5-二氟扁桃酸3.38min、(R)-3，5-二氟扁桃酸3.51min，3，5-二氟苯乙酮酸5.31min。

Claims

1.一株产（S）-α-羟酸脱氢酶菌株——中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）ZJB1101，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No:M2011391，保藏日期：2011年11月13日。

2.如权利要求1所述的中华根瘤菌ZJB1101在生物拆分α-羟酸外消旋体制备相应（R）-α-羟酸及其酮酸中的应用；所述α-羟酸为下列之一：扁桃酸、2-氟扁桃酸、2-氯扁桃酸、3-氯扁桃酸、4-氟扁桃酸、4-氯扁桃酸、4-溴扁桃酸、2,4-二氟扁桃酸、3,5-二氟扁桃酸、4-甲基扁桃酸、苯基乳酸。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：以所述α-羟酸外消旋体为底物，以中华根瘤菌ZJB1101含酶菌体细胞为催化剂，在20～50℃、pH6.0～9.0缓冲液中进行不对称选择性氧化反应2～24小时，制得相应（R）-α-羟酸及其酮酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液为下列之一：pH6.0～6.6的柠檬酸缓冲液、pH6.5～7.8的磷酸盐缓冲液或pH7.4～9.0的Tris-HCl缓冲液。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述缓冲液中，底物初始浓度为1～10g/L，含酶菌体细胞添加量以湿重计为10～50g/L。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法获得：将中华根瘤菌CCTCC No:M2011391接种至发酵培养基，在25～40℃、100～300rpm下培养24～72小时，得到的发酵液离心分离，即得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖2～20g/L，酵母膏5～20g/L，K₂HPO₄·3H₂O0.5～5g/L，KH₂PO₄0.5～5g/L，MgSO₄·7H₂O0.1～0.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.01～0.05g/L，NaCl0.1～1g/L，诱导剂扁桃酸0.5～3g/L，溶剂为水，pH5～9。