CN106701701B - 一种氧化酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)的D‑乳酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该D‑乳酸氧化酶可以氧化(R)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(S)‑α‑羟酸酯的制备。

Description

一种氧化酶及其应用
技术领域
本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)。
目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,BringerMeyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for abranched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)。
本发明首次从斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
发明内容
本发明从斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Providencia stuartii ATCC 49809，购自美国ATCC菌种库。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Providencia stuartii ATCC 49809菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、D-乳酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析
以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发表明的有益之处：从Providencia stuartii ATCC 49809中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Providencia stuartii ATCC 49809DNA的提取
将Providencia stuartii ATCC 49809菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAATGCAGTAAACAGCCCTGAAA3'
引物2：5'GCCGTCTAGATTAGTGATCGTGATGGCAACCACAA 3'
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以Providencia stuartii ATCC 49809的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
Figure GDA0002290936260000031
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligasebuffer2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1、在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2、放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3、立即冰浴2min。
4、加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5、将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6、培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、deltapressure0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为6.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为45℃。
实施例4
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH3-9，45℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 6.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表1中。
表1 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性
Figure GDA0002290936260000051
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表2拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
Figure GDA0002290936260000061
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1734
<212> DNA
<213> Providencia stuartii ATCC49809
<400> 1
atgaatgcag taaacagccc tgaaaatcaa cgattattac tgacactcac caatattgtt 60
ggtaaaaaaa atatcctgac taagcctcat aaaaccgaac gttaccgcaa agggtttcgc 120
tcaggtattg gtaatgctat agcggtcgtc ttccctacca cgttgttaga gcaatggtat 180
gtttttaaag cctgtgtcga ggcggataaa atagtgatta tgcaagccgc gaacacaggg 240
ctgacagaag gttcgacgcc aagcggttat gattatgatc gtgatatcgt tattattagc 300
acattaaaat taaatcaaat tcaagtatta cctgaattta atcaagttgt tgctatgcca 360
ggcagtacgc tgtatgacct cgagaaatta ctaaaaccat taggtcgtga accgcattcc 420
ctcattggct cctcttgcat cggggcgtca gtggttggcg ggatctgtaa tagttcaggt 480
ggctccctag tgcgccgagg cccggcttat acggagctag ccttatatgg gcgagtaaat 540
gaagatggaa aagtggagtt agtaaaccac ctagggatta acttagggga tacacctgaa 600
gaaattttaa cgaacttgca aaatcgacgt tatcgaacag aagatgttga acacagtgaa 660
aagctggcgt cagaccatga atatgctcag cgagttcgtg atgtgaatgc ggatacacca 720
tcacgcttta acgcagatga gcgccgcttg tttgaagcat ctggttgtgc gggtaaatta 780
gccgtatttg ctgtccgcct tgatactttc cctgccgata cctcaacaca agtgttttat 840
attggcacaa acaatccgga tgttctggaa gacattcgcc gtcatattct tagtgaattt 900
aaaaacttac cagtagcagg tgagtatatg caccgcggtt gttttgatat cgctgaagta 960
tacggaaaag ataccttttt aatgatagat aaatttggca ctgacaaaat gccactattt 1020
tttactatca aaggccgtat tgatgccgta ttaaataaag taccgttgtt accgtcaaac 1080
cttgttgacc gcactatgca gctactcagt aaattatggc ctgcacattt acctccacgc 1140
atgaagcaat ttcgtgataa gtatgagcat catctgatgt taaaaatggc gggtgaaggt 1200
attgatgagg cgaaagtttg gctgaaatcc ttctttgcaa cggcggatgg ggggtatttt 1260
gagtgtacac cagaggaagg ggcaaaagca tttttacacc gctttgccgc agcgggatcg 1320
gcggttcgtt accatgcggt acacaataaa gatgttgagg atgtattgcc gctggatatc 1380
gctttgcgtc gaaatgatcg tgattggttt gaaaaattgc cgccagaaat tgaaaaattg 1440
ttagttcata aactgtattg tgggcatttt atgtgtcatg tgatgcacca agattatgta 1500
ttgaaaaaag gcgtcgatcc aaaagaattg aaagagaaaa tgttagcgct gttagatgaa 1560
cgaggtgcac aataccccgc agagcataac gtaggccact tatataaagc tcagccacag 1620
ctaaaatctt tctataaaaa agccgatccg actaacacca tgaaccccgg tttaggcaaa 1680
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<210> 2
<211> 577
<212> PRT
<213> Providencia stuartii ATCC49809
<400> 2
Met Asn Ala Val Asn Ser Pro Glu Asn Gln Arg Leu Leu Leu Thr Leu
1 5 10 15
Thr Asn Ile Val Gly Lys Lys Asn Ile Leu Thr Lys Pro His Lys Thr
20 25 30
Glu Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Ile Gly Asn Ala Ile Ala
35 40 45
Val Val Phe Pro Thr Thr Leu Leu Glu Gln Trp Tyr Val Phe Lys Ala
50 55 60
Cys Val Glu Ala Asp Lys Ile Val Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly
65 70 75 80
Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Arg Asp Ile
85 90 95
Val Ile Ile Ser Thr Leu Lys Leu Asn Gln Ile Gln Val Leu Pro Glu
100 105 110
Phe Asn Gln Val Val Ala Met Pro Gly Ser Thr Leu Tyr Asp Leu Glu
115 120 125
Lys Leu Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Leu Ile Gly Ser
130 135 140
Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Val Gly Gly Ile Cys Asn Ser Ser Gly
145 150 155 160
Gly Ser Leu Val Arg Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Leu Ala Leu Tyr
165 170 175
Gly Arg Val Asn Glu Asp Gly Lys Val Glu Leu Val Asn His Leu Gly
180 185 190
Ile Asn Leu Gly Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Thr Asn Leu Gln Asn
195 200 205
Arg Arg Tyr Arg Thr Glu Asp Val Glu His Ser Glu Lys Leu Ala Ser
210 215 220
Asp His Glu Tyr Ala Gln Arg Val Arg Asp Val Asn Ala Asp Thr Pro
225 230 235 240
Ser Arg Phe Asn Ala Asp Glu Arg Arg Leu Phe Glu Ala Ser Gly Cys
245 250 255
Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala
260 265 270
Asp Thr Ser Thr Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Asn Pro Asp Val
275 280 285
Leu Glu Asp Ile Arg Arg His Ile Leu Ser Glu Phe Lys Asn Leu Pro
290 295 300
Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Gly Cys Phe Asp Ile Ala Glu Val
305 310 315 320
Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met Ile Asp Lys Phe Gly Thr Asp Lys
325 330 335
Met Pro Leu Phe Phe Thr Ile Lys Gly Arg Ile Asp Ala Val Leu Asn
340 345 350
Lys Val Pro Leu Leu Pro Ser Asn Leu Val Asp Arg Thr Met Gln Leu
355 360 365
Leu Ser Lys Leu Trp Pro Ala His Leu Pro Pro Arg Met Lys Gln Phe
370 375 380
Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu Met Leu Lys Met Ala Gly Glu Gly
385 390 395 400
Ile Asp Glu Ala Lys Val Trp Leu Lys Ser Phe Phe Ala Thr Ala Asp
405 410 415
Gly Gly Tyr Phe Glu Cys Thr Pro Glu Glu Gly Ala Lys Ala Phe Leu
420 425 430
His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ser Ala Val Arg Tyr His Ala Val His
435 440 445
Asn Lys Asp Val Glu Asp Val Leu Pro Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg
450 455 460
Asn Asp Arg Asp Trp Phe Glu Lys Leu Pro Pro Glu Ile Glu Lys Leu
465 470 475 480
Leu Val His Lys Leu Tyr Cys Gly His Phe Met Cys His Val Met His
485 490 495
Gln Asp Tyr Val Leu Lys Lys Gly Val Asp Pro Lys Glu Leu Lys Glu
500 505 510
Lys Met Leu Ala Leu Leu Asp Glu Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu
515 520 525
His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys Ala Gln Pro Gln Leu Lys Ser Phe
530 535 540
Tyr Lys Lys Ala Asp Pro Thr Asn Thr Met Asn Pro Gly Leu Gly Lys
545 550 555 560
Thr Thr Lys Arg Lys Asn Trp Glu Gly Asp Cys Gly Cys His His Asp
565 570 575
His

Claims (1)

1.一种拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法，其特征在于，所述方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h；所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、乳酸冰片酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
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