CN106701702B

CN106701702B - 一种氧化酶及其应用

Info

Publication number: CN106701702B
Application number: CN201710006564.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡宇杰; 卢欢; 曹憬; 白亚军; 郑晓晖
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Zhuohong Chaoyuan Biotechnology Zhengzhou Co ltd
Priority date: 2017-01-05
Filing date: 2017-01-05
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2037-01-05
Also published as: CN106701702A

Abstract

本发明涉及一种来源于奈氏西地西菌(Cedecea neteri)的D‑乳酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该D‑乳酸氧化酶可以氧化(R)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(S)‑α‑羟酸酯的制备。

Description

一种氧化酶及其应用

技术领域

本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。

背景技术

D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)

目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N, Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis: evidence for abranched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998, 168(1):91-97)

本发明首次从奈氏西地西菌(Cedecea neteri)中克隆表达出一种新型的D- 乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。

发明内容

本发明从奈氏西地西菌(Cedecea neteri)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。

本发明的技术方案如下：

1、菌株

本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Cedecea neteri ATCC 33855，购自美国ATCC菌种库。

2、D-乳酸氧化酶基因的克隆

提取Cedecea neteri ATCC 33855菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。

3、D-乳酸氧化酶表达与纯化

将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。

4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析

以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。

D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。

酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56, 1996,278-288。所述方法进行。

5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯

拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50 mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃， 150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。

产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_S+S_R)]×100％

(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_S/S₀)×100％

式中S_R为反应后(R)-对映体的峰面积，S_S为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。

产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温 25℃，检测波长210nm，进样量20μL。

所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。

本发表明的有益之处：从Cedecea neteri ATCC 33855中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。

具体实施方式

实施例1

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。

1、Cedecea neteri ATCC 33855 DNA的提取

将Cedecea neteri ATCC 33855菌株在LB培养基中培养12h，12,000 rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。

2、大肠杆菌感受态制备

(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL 摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。

(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀约0.6(约 2～3h)。

(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、 4℃离心5min。

(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。

(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl₂溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。

3、D-乳酸氧化酶基因的克隆

(1)引物设计

设计引物序列为：

引物1：5' GCCGGGATCCATGTCTGTTTTGATGAATTCCGATA 3'

引物2：5' GCCGTCTAGAGCGAGCCGTGCTCCTGA 3'

(2)PCR扩增

用以上合成的两条引物，以Cedecea neteri ATCC 33855的基因组DNA为模板进行PCR扩增。

本步骤中扩增体系为：

扩增程序为：

98℃，10min

98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环

72℃，10min

PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

(3)双酶切和连接

将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl, DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl， T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。

(4)转化

步骤：

1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。

2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。

3立即冰浴2min。

4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。

5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。

6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。

实施例2

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。

1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液 (20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10 min)收集上清得到粗酶液。

2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path (column position 3)、delta pressure0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。

实施例3

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为8.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定 D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为45℃。

实施例4

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH3-9，45℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 8.0条件下D- 乳酸氧化酶酶活最高。

实施例5

本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表1 中。

表1 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性

实施例6

根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：

表2 拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果

由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α- 羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种氧化酶及其应用

<130> No

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> Cedecea neteri ATCC 33855

<400> 1

atgtctgttt tgatgaattc cgataataaa acgctgataa acgaactctc tcgccacgtt 60

ggctcgcacc atgttttaac cgatccggcc aaaacggccc gctaccgtaa gggctttcgt 120

tccggccagg gggaagcgct ggcggtggtg ttccccggct ccctgctgga gctgtggcgc 180

gtgttaagcg cctgcgtcgc cgccgataaa atcattatta tgcaggccgc caataccggc 240

ctgaccgaag gctcgacgcc aagcggcagc gactacgatc gcgatatcgt gatcatcagt 300

acgctgcgtc tcgacaagct gcacctgctg gataaaggcg agcaggtact ggcctacccc 360

ggcaccacgc tttactcgct ggaaaaagcg cttaaaccgc tgggccgcga accgcattcg 420

gtgatcggct cctcctgtat tggcgcgtcg gttgtcggcg gtatttgtaa taactccggc 480

ggttcgctgg tgcagcgcgg cccggcctat accgagatgt cgcttttcgc ccgcattgat 540

gaaagcggca agctacagtt ggtgaaccat ctgggcatta acctgggcac cacgccggag 600

caaattctca gcacgctgga cgacgaacgc gtgaaagaca gcgacgtgca gcacgacggc 660

cgtcacgcgc acgatcacga ttacgtgacc cgagtgcgcg acgttgaggc cgacacgcct 720

gcgcgctaca acgctgatcc ggatcgcctg tttgaatctt ccggctgcgc gggcaagctg 780

gctgtctttg cggtacgcct cgacaccttc ccggcggaaa agcgccagca ggtgttttac 840

atcggcacaa accagcctga tgtgctgacc gaaattcgtc gccatattct ggccaacttc 900

gaaaacctgc cggtcgccgg ggagtacatg caccgcgaca tttacgacat cgctgaaaaa 960

tacggcaaag atacgttcct gatgatcgac aagctcggca ccgacaaaat gccgttcttc 1020

ttcaccatga aggggcgcac cgacgcgatg ctggacaagg tgccgctgtt taagccgcac 1080

tttaccgacc gctttatgca gaagctcggc ggcgttttcc cggctcacct cccggagcgg 1140

atgaaaacct ggcgcgataa atatcctcac catctgttgc tgaaaatggc cggagatggc 1200

atcgacgagg ccaaagcctg gctgagcgag tactttaaaa ccgccgaggg tgatttcttc 1260

gtctgcaccg cagaagaagg cagcaaagcc ttcctgcacc gctttgccgc cgccggagcc 1320

gcgattcgct atcacgccgt gcatgcggat gaggtagaag acattctggc gctggatatc 1380

gccctgcgcc gcaacgacgg cgactggttc gaagagctgc cgccggaaat cggcgataag 1440

cttatccatc gcctctatta cggccacttt atgtgccatg ttttccacca ggattacatc 1500

gtcaaaaaag gcgtggacgt gcatgagctg aaagagcaga tgctggcgct gctgcatgaa 1560

cgcggcgcgc agtacccggc tgagcataac gtcggccatc tctacaaagc gccggacacg 1620

ctgaagcagt tctacaaggc caacgacccg accaacagca tgaatccggg gattggtaaa 1680

acgacccggc gtaaaggctg ggccgaagac gacggcgctc aggagcacgg ctcgcagaga 1740

taa 1743

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> Cedecea neteri ATCC 33855

<400> 2

Met Ser Val Leu Met Asn Ser Asp Asn Lys Thr Leu Ile Asn Glu Leu

1 5 10 15

Ser Arg His Val Gly Ser His His Val Leu Thr Asp Pro Ala Lys Thr

20 25 30

Ala Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg Ser Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala

35 40 45

Val Val Phe Pro Gly Ser Leu Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Ser Ala

50 55 60

Cys Val Ala Ala Asp Lys Ile Ile Ile Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly

65 70 75 80

Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Ser Asp Tyr Asp Arg Asp Ile

85 90 95

Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Leu Asp Lys Leu His Leu Leu Asp Lys

100 105 110

Gly Glu Gln Val Leu Ala Tyr Pro Gly Thr Thr Leu Tyr Ser Leu Glu

115 120 125

Lys Ala Leu Lys Pro Leu Gly Arg Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser

130 135 140

Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Val Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Val Gln Arg Gly Pro Ala Tyr Thr Glu Met Ser Leu Phe

165 170 175

Ala Arg Ile Asp Glu Ser Gly Lys Leu Gln Leu Val Asn His Leu Gly

180 185 190

Ile Asn Leu Gly Thr Thr Pro Glu Gln Ile Leu Ser Thr Leu Asp Asp

195 200 205

Glu Arg Val Lys Asp Ser Asp Val Gln His Asp Gly Arg His Ala His

210 215 220

Asp His Asp Tyr Val Thr Arg Val Arg Asp Val Glu Ala Asp Thr Pro

225 230 235 240

Ala Arg Tyr Asn Ala Asp Pro Asp Arg Leu Phe Glu Ser Ser Gly Cys

245 250 255

Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Ala Val Arg Leu Asp Thr Phe Pro Ala

260 265 270

Glu Lys Arg Gln Gln Val Phe Tyr Ile Gly Thr Asn Gln Pro Asp Val

275 280 285

Leu Thr Glu Ile Arg Arg His Ile Leu Ala Asn Phe Glu Asn Leu Pro

290 295 300

Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg Asp Ile Tyr Asp Ile Ala Glu Lys

305 310 315 320

Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys

325 330 335

Met Pro Phe Phe Phe Thr Met Lys Gly Arg Thr Asp Ala Met Leu Asp

340 345 350

Lys Val Pro Leu Phe Lys Pro His Phe Thr Asp Arg Phe Met Gln Lys

355 360 365

Leu Gly Gly Val Phe Pro Ala His Leu Pro Glu Arg Met Lys Thr Trp

370 375 380

Arg Asp Lys Tyr Pro His His Leu Leu Leu Lys Met Ala Gly Asp Gly

385 390 395 400

Ile Asp Glu Ala Lys Ala Trp Leu Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Ala Glu

405 410 415

Gly Asp Phe Phe Val Cys Thr Ala Glu Glu Gly Ser Lys Ala Phe Leu

420 425 430

His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ile Arg Tyr His Ala Val His

435 440 445

Ala Asp Glu Val Glu Asp Ile Leu Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg

450 455 460

Asn Asp Gly Asp Trp Phe Glu Glu Leu Pro Pro Glu Ile Gly Asp Lys

465 470 475 480

Leu Ile His Arg Leu Tyr Tyr Gly His Phe Met Cys His Val Phe His

485 490 495

Gln Asp Tyr Ile Val Lys Lys Gly Val Asp Val His Glu Leu Lys Glu

500 505 510

Gln Met Leu Ala Leu Leu His Glu Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu

515 520 525

His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys Ala Pro Asp Thr Leu Lys Gln Phe

530 535 540

Tyr Lys Ala Asn Asp Pro Thr Asn Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys

545 550 555 560

Thr Thr Arg Arg Lys Gly Trp Ala Glu Asp Asp Gly Ala Gln Glu His

565 570 575

Gly Ser Gln Arg

580

Claims

1.一种拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法，其特征在于，所述方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液；所述酶为来源于奈氏西地西菌(Cedecea neteri)的D-乳酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示；所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、乳酸冰片酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述D-乳酸氧化酶的核苷酸序列为SEQ IDNO:1所示。