CN102660631A - 立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。所述方法包括：(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物，于20～50℃水浴中进行转化反应；(2)转化反应结束后，取转化液添加FeCl3显色剂溶液进行显色反应5～30min，反应结束后，根据反应液呈现的颜色判断结果；本发明方法不需要对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所筛选的微生物的脱氢酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为以外消旋的扁桃酸及其相关衍生物为底物来进行生物酶法拆分获得光学纯的产品带来了极大的便利。
Description
(一)技术领域
本发明涉及立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。
(二)背景技术
立体选择性α-羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋α-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的α-酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的α-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的α-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。
利用α-羟酸脱氢酶拆分外消旋α-羟酸生产手性的α-羟酸，拓宽光学活性化合物的生产方法，具有重要的意义。近年来已有一些研究把目光放在了利用微生物或者酶法来拆分外消旋α-羟酸及其相关衍生物。
苯基乳酸，即2-羟基3-苯基丙酸，是一种重要的化学合成前体，广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。它的第2个碳原子为手性碳原子，故有两种对映体(见下式)
3-苯基乳酸的两个对映体之间除空间结构方向相反以外，其它物理性质如：熔点、沸点、相对密度以及在非手性溶剂中的溶解度都完全相同。而由于构成生物体的有机物大都是有旋光活性的，两个对映体不仅具有不同的光学性质，而且还具有不同的生物活性，因此，单一对映体的3-苯基乳酸在对生物体的作用及其在医药、化工等方面的应用存在较大的差异。R-苯基乳酸可用于合成降血糖制剂Englitaznoe、新型驱肠虫药PA1002A，并对人体内类固醇的水平有一定的调节作用；S-苯基乳酸可用于合成高血压蛋白酶原肾素抑制剂、非蛋白氨基酸statine的4种立体异构体、抗艾滋病病毒(HIV)制剂等药品；在抑菌效果上，R构型明显强于S构型。Yamamoto等研究表明R-苯基乳酸能提高人体肝内3α-轻基类固醇脱氢酶DD4的活性，1mmol/L R-苯基乳酸能使活力提高2倍(Yamamotoeta.l，JBiochem，2000，128：121)。3α-羟基类固醇脱氢酶分布于人体的组织中，能合成和降解类固醇，所以R-苯基乳酸对人体内的类固醇的水平有一定的调节作用。因此，采用简便快速的方法合成手性3-苯基乳酸具有非常重要的意义。
立体选择性羟酸脱氢酶能够催化羟酸产生相应的酮酸，可用于拆分外消旋的羟酸化合物生产手性羟酸，具有广阔的应用前景，可以用这种羟酸脱氢酶将苯基乳酸进行拆分，得到苯基乳酸的单体，具有很多用途。
据不完全统计，目前国际市场上光学活性的α-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；学活性的α-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。
目前，立体选择性α-羟酸脱氢酶生物催化剂的筛选还是利用传统的GC或HPLC法去对海量的微生物或酶逐一检测，费时又费力，造成工作效率不高；另一方面，随着蛋白质定向进化技术的不断发展，为了更快得到突变子，能够建立对这些催化剂进行快速有效表征的方法就显得尤为迫切。迄今为止，未见有立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选模型的报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。
本发明采用的技术方案是：
一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：
(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；所述待测样品为已知具有α-羟酸脱氢酶活性的样品，可以是酶液，也可以是菌体；
对于未知活性的酶活菌体样品，筛选其是否具有α-羟酸脱氢酶活性的方法如下：取待筛选的样品(酶液或菌体)均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品。
式(I)中，(R)m表示m个R取代基，R为H、羟基或卤素(优选为H或羟基)，m为1或2；
(2)转化反应结束后，取转化液添加FeCl3显色剂溶液进行显色反应5～30min，转化液与FeCl3显色剂溶液体积之比为1∶10～30；反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若现淡黄色，表明待测样品中含有与底物的立体构型相反的α-羟酸脱氢酶；所述FeCl3显色剂溶液组成如下：FeCl3·6H2O 1～2mmol/L，二甲基亚砜200～500ml/L，冰醋酸10～30ml/L，溶剂为水。
步骤(2)中呈现蓝绿色结果时，所述方法可进一步包括步骤(3)和(4)：
(3)另取呈现蓝绿色的待测样品溶于pH为6～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；
(4)转化反应结束后，取转化液按照步骤(2)方法进行显色反应，显色反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若呈现淡黄色，表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶；
所述α-羟酸优选为苯基乳酸或对羟基苯基乳酸。
所述pH 6～9的缓冲液为常规适用于微生物的缓冲液，例如柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液等，本发明中优选为pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
本发明显色的原理如下：在冰醋酸和二甲亚砜的水溶液中，苯丙酮酸可以和3价铁离子生成一种蓝绿色的配合物，利用此原理可以快速分析混合物中苯丙酮酸的含量，PPA具有酮式和烯醇式互变的分子构型，当PPA与Fe3+配合时，会形成[Fe(H2O)2(PPA)2]3+结构的化合物，用这种显色法可以快速的检测出PPA含量，从而判断脱氢酶的立体选择性。所涉及的反应式如下：
本发明方法可用于未知样品中脱氢酶的筛选，待测样品为微生物或酶液，所述微生物来自各种可分离得到的微生物样品，如污水、化工厂、农田等的土样或水样以及现存或保藏的微生物菌种，也可将待筛选的微生物经培养得到菌体后，再进行筛选操作。
本发明方法也可用于已知酶样品的立体选择性的鉴定，待测样品可为已知产脱氢酶微生物经发酵分离获得的菌体。
所述待测样品为微生物菌体时，所述方法可如下：
(A)取微生物菌体均匀分散于pH6.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，制成OD600值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl3显色剂溶液进行反应5～30min，反应结束后，呈现蓝绿色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，呈淡黄色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；
(B)另取脱氢酶阳性样品两份，溶于pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体作为底物至底物终浓度为1～100mM进行对照，于20～50℃水浴中进行转化反应，转化反应结束后，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl3显色剂溶液进行反应5～30min，显色反应结束后，若仅有一份呈现蓝绿色，则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈蓝绿色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，若两份转化液均呈现蓝绿色则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性。
步骤(A)和(B)中，所述FeCl3显色剂溶液组成如下：FeCl3·6H2O2mmol/L，二甲基亚砜400ml/L，冰醋酸20ml/L，溶剂为水。
如果样品中的脱氢酶具有光学手性选择性，则在相同时间内生成的酮酸含量不同，可以通过显色法来简单测定。如以S-α-羟酸为底物时转化液显色后呈蓝绿色，以R-α-羟酸为底物时转化液显色后呈淡黄色，表明该微生物含有S型脱氢酶。具体结果可以参考表1。
表1：显色法鉴定微生物或微生物细胞提取物脱氢酶活性和手性选择性
上述步骤(B)对照组间底物浓度、催化剂用量及其它反应条件相同。对转化液进行定时取样，离心去除菌体或细胞提取物，测定生成的酮酸的含量，通常采用分光光度计或酶标仪测定。如果被测的微生物或酶没有选择性，则在相同时间内由于底物浓度、催化剂用量及其它反应条件相同，则生成的酮酸的量相同；如果具有光学选择性，则在相同时间内生成的酮酸含量相同。两组添加相反构型底物的反应同时进行，每隔一定时间取样，检测生成的酮酸的含量，可以分别计算反应的初始反应速率r1、r2，r1/r2值的大小相当于脱氢酶选择性的严格性。
本发明的有益效果主要体现在：本发明方法能够较好的克服传统的基于手性GC或HPLC法带来的费时费力、设备要求高、通用性差的缺点，不需要对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所筛选的微生物的脱氢酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为以外消旋的扁桃酸及其相关衍生物为底物来进行生物酶法拆分获得光学纯的产品带来了极大的便利。
(四)附图说明
图1为利用显色法以外消旋苯基乳酸为底物进行产α-羟酸脱氢酶菌株筛选的结果；
图2为用两种单体进行有产α-羟酸脱氢酶活性菌株选择性筛选的结果。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：含R-扁桃酸脱氢酶的微生物的筛选
将待筛选的微生物库的各微生物培养后，离心，经生理盐水洗涤后，均匀分散于pH＝8.0的磷酸盐缓冲液中，制备成OD600＝10.0的菌悬液，反应温度为30℃，在具塞三角瓶(50mL)中进行。
反应液的组成：①磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液(10ml，100mM，pH7.5)；②分散于缓冲液中的菌体(10ml，OD600＝10.0)；③(R)-苯基乳酸或S-苯基乳酸(10ml，10mM)，反应在30℃、150r/min的水浴摇床中进行，每隔30min取样800μL，离心去除菌体，吸取10μL的转化液加入96孔板，加入240μL显色剂(FeCl3·6H2O 2mmol/L，二甲基亚砜400ml/L，冰醋酸20ml/L，溶剂为水)，室温反应30min后，如果有α-羟酸脱氢酶存在，就会有产物苯丙酮酸生成，显色体系就会由淡黄色变成蓝绿色，且颜色越深，说明苯丙酮酸含量越高，α-羟酸脱氢酶的活性就越高。故采用了先用外消旋体底物来筛选有脱氢酶活性的菌株(结果见图1)，再用单体底物来检验菌株立体选择性的方法(结果见图2)。从图1可以看出，所筛选的32株菌种中有12株有脱氢酶活性，其中A2B4和A3B4的活性最高，A3B3，A4B2，A4B3次之，A1B1，A6B3，A8B1，A8B4活性比前面两个更差一些，A2B2，A2B3，A1B4活性最差。
继而对12株显现脱氢酶活性的菌株用单体检验了其选择性情况，从图2可以看出，A2B2，A1B4，A3B3，A6B3，A2B4，A3B4都是具有立体选择性的，其中A2B4，A3B4不仅具有立体选择性，选择性的转化S型的底物却对R型的底物不转化，而且活性也是比较高的，A3B3选择性也是不错的，选择性的转化R型的，像A4B2，A4B3活性是很高的但是到后面两种底物都有颜色反应，说明它对两种单体都有转化，所以基本没有选择性，所以也不是所要的理想的菌种，从选择性和活性的高低两方面考虑菌株A2B4，A3B4是最理想的菌株，经鉴定菌株A2B4和A3B4分别是菌株Sinorhizobium sp.CCTCC No：M 2011391(中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)ZJB1101，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2011391，保藏日期：2011年11月13日)和Pseudomonas aeruginosa.CCTCC No：M2011394(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ZJB1125，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 2011394，保藏日期：2011年11月13日)，其R-扁桃酸脱氢酶活性已得到证实，已提交另案申请。
Claims (5)
1.一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：
(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；
式(I)中，(R)m表示m个R取代基，R为H、羟基或卤素，m为1或2；
(2)转化反应结束后，取转化液添加FeCl3显色剂溶液进行显色反应5～30min，转化液与FeCl3显色剂溶液体积之比为1∶10～30；反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若现淡黄色，表明待测样品中含有与底物的立体构型相反的α-羟酸脱氢酶；所述FeCl3显色剂溶液组成如下：FeCl3·6H2O 1～2mmol/L，二甲基亚砜200～500ml/L，冰醋酸10～30ml/L，溶剂为水。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中呈现蓝绿色时，所述方法进一步包括步骤(3)和(4)：
(3)另取呈现蓝绿色的待测样品溶于pH为6～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；
(4)转化反应结束后，取转化液按照步骤(2)方法进行显色反应，显色反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若呈现淡黄色，表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述α-羟酸为苯基乳酸或对羟基苯基乳酸。
4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述pH 6～9的缓冲液为pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下：
(A)取微生物菌体均匀分散于pH6.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，制成OD600值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl3显色剂溶液进行反应5～30min，反应结束后，呈现蓝绿色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，呈淡黄色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；
(B)另取脱氢酶阳性样品两份，溶于pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应，转化反应结束后，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl3显色剂溶液进行反应5～30min，显色反应结束后，若仅有一份呈现蓝绿色，则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈蓝绿色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，若两 份转化液均呈现蓝绿色则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；
所述FeCl3显色剂溶液组成如下：FeCl3·6H2O 2mmol/L，二甲基亚砜400ml/L，冰醋酸20ml/L，溶剂为水。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120912 |