CN106701706B - 一种氧化酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种来源于摩氏摩根菌摩根亚种(Morganella morganii subsp.morganii)的L‑α‑羟酸氧化酶基因的获得及其克隆表达，属于生物工程领域。公开了其底物特异性，同时该L‑α‑羟酸氧化酶可以氧化(S)‑α‑羟酸酯，可应用于光学纯(R)‑α‑羟酸酯的制备。

Description

一种氧化酶及其应用
技术领域
本发明克隆表达了一种L-α-羟酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术
L-α-羟酸氧化酶(L-α-hydroxyacid oxidase)是一种以FMN(FAD)为辅酶的脱氢酶(Aliphatic l-α-hydroxyacid oxidase from rat livers purification andproperties. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Enzymology 1968,167:9-22)，通常包含有乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase)(Preparation and some properties ofcrystalline glycolic acid oxidase of spinach.J.Biol.Chem.1958,231(1):135–57)、L-乳酸氧化酶(L-lactate oxidase)(Conversion of L-lactate oxidase to a longchain alpha- hydroxyacid oxidase by site-directed mutagenesis of alanine 95toglycine.J Biol Chem. 1996 8；271(45):28300-28305)。可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化L- 乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
目前为止，已经在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，绿色气球菌(Aerococcus viridians)，链球菌属(Streptococcus sp.)，片球菌属(Pediococcus sp.)，乳酸乳球菌(Lactococus lactis)，迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)，耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis),运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis) 和过氧化醋杆菌(Acetobacter peroxidans)等细菌中克隆表达得到了L-乳酸氧化酶。L-乳酸氧化酶也在一些真菌中检测到，例如白地霉(Geotrichum candidum)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)。(Search for Lactate Oxidase Producer Microorganisms，AppliedBiochemistry and Microbiology,2007,43(2) 178-181)
本发明首次从Kerstersia gyiorum DSM 16618中克隆表达出一种新型的L-α- 羟酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(S)-α-羟酸，而且可以氧化(S)-α-羟酸酯，可应用于光学纯(R)-α-羟酸酯和(R)-α-羟酸的制备。
发明内容
本发明从摩氏摩根菌摩根亚种(Morganella morganii subsp.morganii)中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明L-α-羟酸氧化酶基因的来源菌株为：Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297，购自美国ATCC菌种库。
2、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆
提取Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出L-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、L-α-羟酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、L-α-羟酸氧化酶的酶学性质分析
以L-乳酸为底物研究pH对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。
以L-乳酸为底物研究温度对本发明所述L-α-羟酸氧化酶酶活的影响。
L-α-羟酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有L-乳酸、乙醇酸、L-苯乳酸、L-酒石酸、L-苹果酸、L-对羟基苯乳酸、L-丹参素、L-扁桃酸。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from aStrain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry andBiotechnology,56, 1996,278-288。所述方法进行。
5、L-α-羟酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL 三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃， 150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(S)-α-羟酸酯中的α- 羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(R)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(R)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SR-SR)/(SR+SS)]×100％
(R)-α-羟酸酯得率(％)＝(SR/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温 25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发明的有益之处：从Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297 中克隆得到了一种L-α-羟酸氧化酶，该酶可以氧化(S)-α-羟酸和(S)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(R)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297DNA的提取
将Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL 摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约 2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、 4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、L-α-羟酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'AGCCGGGATCCATGATTATTTCCGCTTCAACAGAC 3'
引物2：5'GCCGTCTAGAGGGCAGATTAACCAGCGAG 3'
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以Morganella morganii subsp.morganii ATCC 258297的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl, DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl， T4DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心 (8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20 mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min) 收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path (column position 3)、delta pressure0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适温度。以L-乳酸为底物，将底物与pH为7.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定 L-α-羟酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。
实施例4
本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶的最适pH值。以L-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 7.0条件下 L-α-羟酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述L-α-羟酸氧化酶与不同底物的反应特性列于表1 。
表1 L -α-羟酸氧化酶对不同底物的活性
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表2 拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(R)-α- 羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1143
<212> DNA
<213> Morganella morganii subsp. morganii ATCC 258297
<400> 1
atgattattt ccgcttcaac agactaccgg gcggccgccg aatccagact gccacccttc 60
ctgtttcact atattgacgg cggggcgtat gccgagcata ccctgaagcg caatacggcg 120
gatctggcgg atatcgccct gcgtcagcgg gtgctgcgcg atatgtcgtc tctcagtctg 180
gaaactgaac tgttcgggga aaaactggcg atgccggttg ccctggcgcc ggtcgggctg 240
accggcatgt acgcgcggcg cggtgaagtg caggcggcga aggcagcggc caataaaggc 300
gtgccgttta ccctgtccac cgtctccgta tgcccgattg aggaagttgc cccggcgatt 360
gagcgcccga tgtggttcca gctctatgtg ctgcgcgatc gcggttttat gaaaaatgcc 420
cttgagcgcg ccaaagccgc cggggtcaaa acgctggtct ttaccgttga tatgccggta 480
ccgggagcgc gttaccgtga tgctcattcc gggatgagcg gcccgaatgc cgccattcgc 540
cgcgtgttac aggcgatggt tcacccgcgc tgggcgctgg atgtcggcgt actcggtaaa 600
ccgcatgatc tgggtaatat ctcggtctat cgcggcgcac cgaccaaact ggaagattat 660
atcggctggc tgggggcaaa cttcgatccg tccatttcct ggaaagatct ggaatggatc 720
cgcgagttct gggaaggccc gatgattatc aaaggaattc tggacccgga agatgcgaaa 780
gatgcagtgc gtttcggcgc tgacggtatt gtagtgtcaa accacggcgg ccgtcagctc 840
gacggtgtgc tctccaccgc ccgcgccctg cctgctattg ccgatgcggt gaaatcggat 900
atcactattc tgagtgattc cgggatccgc aacggccttg atgtggtgcg gatgctggcg 960
ctgggggcgg attctgtcct gctgggtcgt gcttttgtct acgccctcgc ggcacaggga 1020
caggcgggtg tcgaaaatct gctggatctg attgataaag agatgcgcgt ggcaatgaca 1080
ctgaccggtg caaaaaccat ccgtgatatc acccgcgact cgctggttaa tctgcccggc 1140
tga 1143
<210> 2
<211> 380
<212> PRT
<213> Morganella morganii subsp. morganii ATCC 258297
<400> 2
Met Ile Ile Ser Ala Ser Thr Asp Tyr Arg Ala Ala Ala Glu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Pro Phe Leu Phe His Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Tyr Ala Glu
20 25 30
His Thr Leu Lys Arg Asn Thr Ala Asp Leu Ala Asp Ile Ala Leu Arg
35 40 45
Gln Arg Val Leu Arg Asp Met Ser Ser Leu Ser Leu Glu Thr Glu Leu
50 55 60
Phe Gly Glu Lys Leu Ala Met Pro Val Ala Leu Ala Pro Val Gly Leu
65 70 75 80
Thr Gly Met Tyr Ala Arg Arg Gly Glu Val Gln Ala Ala Lys Ala Ala
85 90 95
Ala Asn Lys Gly Val Pro Phe Thr Leu Ser Thr Val Ser Val Cys Pro
100 105 110
Ile Glu Glu Val Ala Pro Ala Ile Glu Arg Pro Met Trp Phe Gln Leu
115 120 125
Tyr Val Leu Arg Asp Arg Gly Phe Met Lys Asn Ala Leu Glu Arg Ala
130 135 140
Lys Ala Ala Gly Val Lys Thr Leu Val Phe Thr Val Asp Met Pro Val
145 150 155 160
Pro Gly Ala Arg Tyr Arg Asp Ala His Ser Gly Met Ser Gly Pro Asn
165 170 175
Ala Ala Ile Arg Arg Val Leu Gln Ala Met Val His Pro Arg Trp Ala
180 185 190
Leu Asp Val Gly Val Leu Gly Lys Pro His Asp Leu Gly Asn Ile Ser
195 200 205
Val Tyr Arg Gly Ala Pro Thr Lys Leu Glu Asp Tyr Ile Gly Trp Leu
210 215 220
Gly Ala Asn Phe Asp Pro Ser Ile Ser Trp Lys Asp Leu Glu Trp Ile
225 230 235 240
Arg Glu Phe Trp Glu Gly Pro Met Ile Ile Lys Gly Ile Leu Asp Pro
245 250 255
Glu Asp Ala Lys Asp Ala Val Arg Phe Gly Ala Asp Gly Ile Val Val
260 265 270
Ser Asn His Gly Gly Arg Gln Leu Asp Gly Val Leu Ser Thr Ala Arg
275 280 285
Ala Leu Pro Ala Ile Ala Asp Ala Val Lys Ser Asp Ile Thr Ile Leu
290 295 300
Ser Asp Ser Gly Ile Arg Asn Gly Leu Asp Val Val Arg Met Leu Ala
305 310 315 320
Leu Gly Ala Asp Ser Val Leu Leu Gly Arg Ala Phe Val Tyr Ala Leu
325 330 335
Ala Ala Gln Gly Gln Ala Gly Val Glu Asn Leu Leu Asp Leu Ile Asp
340 345 350
Lys Glu Met Arg Val Ala Met Thr Leu Thr Gly Ala Lys Thr Ile Arg
355 360 365
Asp Ile Thr Arg Asp Ser Leu Val Asn Leu Pro Gly
370 375 380

Claims (2)

1.一种拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法，其特征在于，所述方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液；所述酶为来源于摩氏摩根菌摩根亚种(Morganella morganii subsp.morganii)的L-α-羟酸氧化酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO:2所示；所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、乳酸冰片酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-α-羟酸氧化酶的核苷酸序列为SEQID NO:1所示。
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