CN103088076A - S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和r-扁桃酸的方法 - Google Patents

S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和r-扁桃酸的方法 Download PDF

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李大力
王鹏
杨军方
杨成丽
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Abstract

本发明提供一种S-扁桃酸脱氢酶和漆酶偶联催化S-扁桃酸转化成苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，该方法特别之处是通过漆酶不断再生反应媒介，进而不断再生S-扁桃酸脱氢酶的辅酶FMN，从而将S-扁桃酸脱氢酶和漆酶偶联起来进行催化反应，这样，只需要少量的反应媒介，通过充分利用酶催化的高效性，不断催化氧化S-扁桃酸，提高了单一使用S-扁桃酸脱氢酶的转化效率，降低了反应成本。本发明用S-扁桃酸脱氢酶和漆酶两种酶偶联催化S-扁桃酸转化为苯乙酮酸，产物R-扁桃酸的对映体过量值可达99.8％。该法只需少量的亚铁氰化物或铁氰化物作为反应媒介，工艺简单、成本低、环境压力小、纯度高，便于工业化生产，对外消旋扁桃酸的手性拆分具有很大的应用价值。

Description

S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法
技术领域
本发明涉及一种通过铁氰化物或亚铁氰化物作为偶联剂将两种酶偶联催化S-扁桃酸生成苯乙酮酸的方法，同时实现外消旋扁桃酸手性拆分，具体涉及S-扁桃酸脱氢酶和漆酶的偶联反应。
背景技术
S-扁桃酸脱氢酶是一类以黄素FMN为辅酶的氧化还原酶，能专一性催化氧化S-扁桃酸生成苯乙酮酸，其辅酶FMN还原为FMNH2。铁氰化物可以氧化FMNH2生成FMN和亚铁氰化物。漆酶是一类包含铜离子的酚氧化酶，其利用氧气将底物氧化，而氧气被还原成水，而且漆酶具有底物催化范围广的特点，可以催化亚铁氰化物氧化为铁氰化物。国外Dietmar Haltrich 等人曾用纤维二糖脱氢酶和漆酶偶联生产乳糖酸，但缺乏铁氰化物作为化学媒介的实验数据。我们以铁氰化物作为反应媒介，偶联漆酶和S-扁桃酸脱氢酶催化的酶反应，进行苯乙酮酸的制备以及外消旋扁桃酸的手性拆分，生产手性扁桃酸，产物R-扁桃酸的对映体过量值可达99.8％。
发明内容
本发明的目的是以亚铁氰化物或铁氰化物作为反应媒介，通过漆酶再生辅因子，实现S-扁桃酸脱氢酶和漆酶偶联催化S-扁桃酸转化成苯乙酮酸。
其反应历程如下：
Figure BDA0000278996521
本发明的原理是：本发明的特别之处是通过漆酶不断再生反应媒介，进而不断再生S-扁桃酸脱氢酶的辅酶FMN，从而将S-扁桃酸脱氢酶和漆酶偶联起来进行催化反应，这样，只需要少量的反应媒介，通过充分利用酶催化的高效性，不断催化氧化S-扁桃酸，提高了单一使用S-扁桃酸脱氢酶的转化效率，降低了反应成本。
一种S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，步骤如下：
步骤1、将0.1~1 mmol/L亚铁氰化物或0.1~1 mmol/L铁氰化物用pH为3~8的缓冲液溶解后放在容器中；
步骤2、加入1~100 mmol/L外消旋扁桃酸，添加10~500活力单位（U）的S-扁桃酸脱氢酶和10~500活力单位（U）的漆酶后，在10~45℃反应。
步骤1中所述的缓冲液为NaH2PO4-柠檬酸缓冲液或Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
步骤1中所述的亚铁氰化物为亚铁氰化钾或亚铁氰化钠。
步骤1中所述的铁氰化物为铁氰化钾或铁氰化钠。
步骤2中所述的S-扁桃酸脱氢酶的活力单位（U）定义为： 在30℃，pH6.5的缓冲液中一分钟转化1 μmol铁氰化物生成亚铁氰化物所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
步骤2中所述的漆酶的活力单位（U）定义为： 在30℃，pH6.5的缓冲液中一分钟转化1 μmol亚铁氰化物生成铁氰化物所需的酶量为一个酶活力单位（U）。
步骤2中所述的反应时间为6-14小时。
本发明用S-扁桃酸脱氢酶和漆酶两种酶偶联催化S-扁桃酸转化为苯乙酮酸，产物R-扁桃酸的对映体过量值可达99.8％。该法只需少量的亚铁氰化物或铁氰化物作为反应媒介，工艺简单、成本低、环境压力小、纯度高，便于工业化生产，对外消旋扁桃酸的手性拆分具有很大的应用价值。
实施例
实施例1
反应体系：50ml pH6.5的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的亚铁氰化钠，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃140rpm振荡反应10h后，外消旋扁桃酸消耗49.9％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例2
反应体系：50ml pH6.5的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.1mmol/L的亚铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃140rpm振荡反应10h后，外消旋扁桃酸消耗49.3％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例3
反应体系：50ml pH6.5的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含5mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、1mmol/L的亚铁氰化钠，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃反应12h后，外消旋扁桃酸消耗49.5％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃13.33帕斯卡真空蒸馏分离，获得苯乙酮酸和R-扁桃酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例4
反应体系：50ml pH3.0的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的亚铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃反应12h后，外消旋扁桃酸消耗47.2％，消耗的外消旋扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例5
反应体系：50ml pH8.0的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的亚铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃反应12h后，外消旋扁桃酸消耗46％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例6
反应体系：50ml pH3.0的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含5mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.1mmol/L的铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃磁子搅拌反应14h后，外消旋扁桃酸消耗48.3％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例7
反应体系：50ml pH8.0的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含5mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、1mmol/L的铁氰化钠，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃磁子搅拌反应14h后，外消旋扁桃酸消耗47.9％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例8
反应体系：50ml pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4（NaH2PO4和Na2HPO4混合）缓冲液中含1mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.1mmol/L的铁氰化钾，10U S-扁桃酸脱氢酶、10U漆酶。30℃反应6h后，外消旋扁桃酸消耗49.5％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例9
反应体系：50ml pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4（NaH2PO4和Na2HPO4混合）缓冲液中含100mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、1mmol/L的亚铁氰化钾，500US-扁桃酸脱氢酶、500U漆酶。30℃反应8h后，外消旋扁桃酸消耗49.8％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例10
反应体系：50ml pH6.5的Na2HPO4-NaH2PO4（NaH2PO4和Na2HPO4混合）缓冲液中含100mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的铁氰化钠，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。30℃反应12h后，外消旋扁桃酸消耗47.9％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例11
反应体系：50ml pH6.5的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。45℃反应12h后，外消旋扁桃酸消耗45.9％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。
实施例12
反应体系：50ml pH6.5的NaH2PO4-柠檬酸（NaH2PO4和柠檬酸混合）缓冲液中含10mmol/L的外消旋扁桃酸（市售）、0.3mmol/L的铁氰化钾，50U S-扁桃酸脱氢酶、25U漆酶。10℃反应14h后，外消旋扁桃酸消耗47.6％，消耗的S-扁桃酸全部转化为苯乙酮酸，调反应液的pH至2.0以下，乙醚萃取出苯乙酮酸和R-扁桃酸，蒸馏除去乙醚，苯乙酮酸和R-扁桃酸的混合物在85℃、13.33帕斯卡真空蒸馏分离，分别获得苯乙酮酸和R-扁桃酸。

Claims (7)

1.一种S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于所述制备步骤如下：
步骤1、将0.1~1 mmol/L亚铁氰化物或铁氰化物用pH为3~8的缓冲液溶解后放在容器中；
步骤2、加入1~100 mmol/L外消旋扁桃酸，添加10~500活力单位的S-扁桃酸脱氢酶和10~500活力单位的漆酶后，在10~45℃反应。
2.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤1中所述的缓冲液为NaH2PO4-柠檬酸缓冲液或Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液。
3.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤1中所述的亚铁氰化物为亚铁氰化钾或亚铁氰化钠。
4.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤1中所述的铁氰化物为铁氰化钾或铁氰化钠。
5.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤2中所述的S-扁桃酸脱氢酶的活力单位为在30℃，pH6.5的缓冲液中一分钟转化1 μmol铁氰化物生成亚铁氰化物所需的酶量。
6.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤2中所述的漆酶的活力单位为在30℃，pH6.5的缓冲液中一分钟转化1 μmol亚铁氰化物生成铁氰化物所需的酶量。
7.根据权利要求1所述的S-扁桃酸脱氢酶与漆酶偶联反应制备苯乙酮酸和R-扁桃酸的方法，其特征在于步骤2中所述的反应时间为6-14小时。
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