CN100370034C - 一种光学选择性酰胺酶筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种光学选择性酰胺酶的筛选方法。所述的方法按如下：取被测含酰胺酶的样品溶于pH为5～9的缓冲溶液中，添加羟胺，使羟胺终浓度为0.5～1.0M，并添加手性的S-酰胺或R-酰胺为底物，使手性的酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，取反应所得转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型一致或含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型相反。所述方法不需对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所试微生物及其提取物的酰胺酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为光学选择性酰胺酶的筛选带来了极大的便利。

Description

一种光学选择性酰胺酶筛选方法

(一)技术领域

本发明涉及一种光学选择性酰胺酶筛选方法。

(二)背景技术

酰胺酶(EC3.5.1.4)能够催化酰胺水解形成相应的酸和氨，同时在羟胺存在的条件下，也能够催化酰基转移反应，形成氧肟酸。两个反应如下：

RCONH₂+H₂O→RCOOH+NH₃

RCONH₂+NH₂OH→RCONHOH+NH₃

R表示所有可以和酰基(CONH₂)连接，形成酰胺的基团。

酰胺酶最初是在腈类化合物的双酶降解中被发现的。然而，近几年来，由于它能够催化合成许多光学纯的药物中间体，尤其是D-氨基酸，而日益受到关注。尽管已经发现在腈水合酶/酰胺酶体系中，反应的光学选择性主要决定于酰胺水解这一步，但这些酰胺酶基本上属S-选择性。目前报导的R-选择性的酰胺酶很少，表明它在自然界中存在很少。这就使得运用传统的基于手性GC或HPLC的筛选方法很难从“海量”的样品中筛选得到具有合适立体选择性的酰胺酶。

另一方面，随着可供选择的生物催化剂越来越多以及蛋白质定向进化技术的不断发展，为了更快得到合适的突变子，能够建立对这些催化剂进行快速有效表征的方法就显得尤为迫切。过去的几年里，u.T.Borscheuer等报道了针对高活力和高选择性水解酶如酯酶、脂肪酶的高通量筛选模型(Eng.Life.Sci.4：539～542)，迄今为止，未见有关酰胺酶的的筛选模型的报道。

(三)发明内容

本发明即是为了提供一种高活力和光学选择性酰胺酶筛选方法。

为达到发明目的，本发明采用的技术方案是：

一种光学选择性酰胺酶筛选方法，所述的方法按如下：取被测含酰胺酶的样品溶于pH为5～9的缓冲溶液中，添加羟胺，使羟胺终浓度为0.5～1.0M，并添加手性的S-酰胺或R-酰胺为底物，使手性的酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，取反应所得转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型一致或含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型相反。

对转化液显红棕色的被测样品，进一步以所添加的手性酰胺立体构型相反的手性酰胺为底物，重复上述操作，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与所此次所添加的底物的立体构型相反。

所述的手性的酰胺通常选自下列之一：①二甲基环丙甲酰胺，②叔丁基亮氨酸酰胺，③3，3，3-三氟-2-甲基丙酰胺，④哌嗪-2-酰胺。

由于无论酰胺酶催化的酰基转移反应还是水解反应，它们的反应机理是一致的。即酰基供体——酰胺先与酰胺酶形成底物-酶的复合体，酰胺酶再将其传递给酰基的受体——水或者羟胺，最终形成产物氧肟酸。由于发生异构体识别的关键一步即底物-酶复合体的形成过程是一致的，因此酰胺酶在该反应和在水解反应中表现出来的对映体选择性理论上是一致的。

通过氧肟酸与Fe(III)在酸性条件下的显色反应即可快速鉴定所示微生物或酶的酰胺酶活性及选择性。主要涉及的反应如下：

所述的含酰胺酶的样品为微生物或酶。所述微生物来自各种可分离到微生物的样品，如果园、农田、污水处理站等的土样或水样以及现存或保藏的微生物菌种。也可将待筛选的微生物经培养得到菌体后，再进行筛选操作。

所述的含酰胺酶的样品的筛选方法如下：待筛选的微生物或酶样品溶于pH为5～9的缓冲溶液中，添加酰胺和羟胺，使酰胺终浓度为5～30mM、羟胺终浓度为0.5～1.0M，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，显红棕色则表明待筛选样品具有酰胺酶活性，显淡黄色则表明待筛选样品不具有酰胺酶活性。

所述的酰胺可为下列之一：①脂肪族酰胺；②芳香族酰胺；③杂环族的酰胺。通常选择下列之一：①乙酰胺；②正丁酰胺；③对羟基苯乙酰胺；④烟酰胺。

所述缓冲液可选择pH5～9的缓冲液，通常选择pH＝7.0的磷酸缓冲液。

所述的含Fe³⁺的溶液通常选用FeCl₃的盐酸溶液。

具体的，所述的方法如下：

(1)取待筛选微生物菌体均匀分散于pH＝7.0～9.0的磷酸缓冲液中，制成OD₆₀₀值为5～10的菌悬液，添加酰胺和羟胺，使酰胺终浓度为5～30mM、羟胺终浓度为0.5～1.0M，于30℃水浴中进行反应，取转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，显红棕色则为酰胺酶阳性样品，显淡黄色为酰胺酶阴性样品；

(2)另取酰胺酶阳性样品2份，溶于缓冲液中，各添加羟胺至终浓度为0.5～1.0M，并各自添加手性的R-酰胺和S-酰胺进行对照，所添加手性酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，分别取转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光学选择性与显红棕色样品所添加的手性酰胺的立体构型一致，2份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择性。

进一步，所述的方法如下：

(1)取待筛选微生物菌体均匀分散于pH＝7.0的磷酸缓冲液中，制成OD₆₀₀＝10.0的菌悬液，添加乙酰胺和羟胺，使乙酰胺终浓度为5～30mM、羟胺终浓度为0.5～1.0M，于30℃水浴中进行反应，取转化液添加2倍于取样转化液体积的FeCl₃的HCl溶液进行显色，显红棕色则为酰胺酶阳性样品，显淡黄色为酰胺酶阴性样品；

(2)另取酰胺酶阳性样品2份，溶于缓冲液中，各添加羟胺至终浓度为0.5～1.0M，并各自添加R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺和S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺进行对照，所添加手性酰胺终浓度为20mM，于30℃水浴中进行反应，分别取转化液添加2倍于取样转化液体积的FeCl₃的HCl溶液进行显色，若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光学选择性与显红棕色样品所添加的酰胺的立体构型一致，2份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择性。

如果样品所含酰胺酶具有手性选择性，则在相同时间内生成的氧肟酸的量不同，可以通过比色法简单确定。如以R-酰胺为底物的转化液经显色后呈红棕色；而以S-酰胺为底物的转化液显色后呈淡黄色；则表明该微生物含有R-酰胺酶。其余结果可参考表1。

表1酰基转移酶活性法鉴别微生物及细胞提取物的酰胺酶的手性选择性

上述步骤(2)中通常使对照组间底物浓度、催化剂量及其它反应条件相同。对转化液进行定时取样，离心去除菌体或细胞提取物后，测定生成的氧肟酸含量，通常采用分光光度法测定生成的氧肟酸的含量。如果被反应条件相同，则生成的氧肟酸的量也相同。如果具有手性选择性，则在相同时间内生成的氧肟酸的量不同。这两个催化反应同时进行，每隔一定取样，检测生成的氧肟酸的含量，可以分别计算得到初始反应速率r₁，r₂，r₁/r₂值的大小反应酰胺酶选择性的严格性。

本发明所述的这种基于酰基转移活性的光学选择性酰胺酶的筛选方法，能够较好地克服传统的基于手性GC或HPLC法带来的费时费力、设备要求高、通用性差的缺点，不需对拟筛选的底物进行衍生化，能够利用简单的比色法快速鉴定所试微生物及其提取物的酰胺酶活性及光学选择性，具有筛选流程简单、速度快、设备要求低、通用性强等优点，为光学选择性酰胺酶的筛选带来了极大的便利。

(四)说明书附图

图1为实施例3中两组样品转化液氧肟酸的生成变化曲线图；

图2为实施例4中两组样品转化液氧肟酸的生成变化曲线图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：含乙酰胺水解能力酰胺酶活力微生物的筛选

将待筛选的微生物库的各微生物培养后，离心，经生理盐水洗涤后，均匀分散于pH＝7.0的磷酸缓冲溶液中，制备成OD₆₀₀＝10.0的菌悬液。酶催化反应在具塞三角烧瓶(50ml)中进行，反应温度为30℃。

反应液的组成：(1)新鲜制备的盐酸羟胺溶液，使用前用10N NaOH调pH7(5ml，1M)；(2)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(5ml，100mM)；(3)pH7(5ml，1M)；(2)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(5ml，100mM)；(3)分散于缓冲溶液的菌体(5ml，OD₆₀₀＝10.0)；(4)乙酰胺溶液(5ml，100mM)。每隔5分钟取样2ml，加入4ml FeCl₃的HCl溶液(355mM FeCl₃溶于0.65MHCl)。离心除去菌体，立即测定滤液的吸光度值。所用的分光光度计为Backman DU800紫外/可见光分光光度计，检测波长为500nm。由于乙酰氧肟酸/Fe(III)复合物呈红棕色，而空白呈淡黄色，所以初筛过程凭色差即可判断样品是否具有乙酰胺水解能力的酰胺酶。通过测定吸光值的大小，则可比较样品间酰胺酶活力的高低。

经筛选得到，代尔夫特菌属(Delftia sp.)与红球菌属(Rhodocococcus sp.)具有酰胺酶活性。

实施例2：

实验室保藏的菌种Rhodococcus erythropolis A21是已知的一株与文献(Appl Microbiol Biotechnol.(1997)47：668-674)报道一致的含S-选择性的酰胺酶菌株。该菌种经培养后，制成菌悬液。反应液的组成和检测方法同实施例1。底物为R-2-苯基丙酰胺和S-2-苯基丙酰胺(10mM)。这两个催化反应同时进行。反应1h，取样，加入FeCl₃的HCl溶液显色后，发现以R-2-苯基丙酰胺为底物的转化液呈淡黄色，而以S-2-苯基丙酰胺为底物的转化液呈红棕色，表明该酰胺酶的手性选择性为S型。

实施例3：含R-酰胺酶活力微生物的筛选

反应液的组成和检测方法同实施例1。只是将其中的底物替换为α碳原子为手性中心的酰胺如，R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺和S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺(20mM)。这两个催化反应同时进行，每隔10分钟取样，检测生成的氧肟酸的含量，可以分别计算得到初始反应速率r₁，r₂，r₁/r₂值的大小反应酰胺酶选择性的严格性。Delftia sp.分别以上述这两种对映体为底物，反应液中氧肟酸的生成变化曲线如图1；

从图1中可以看出，生成的R-氧肟酸的量远大于S-氧肟酸的量，表明该菌种对R-酰胺的酰基转移活性远大于S-酰胺，即含R-酰胺酶，且r₁/r₂＝35，表明选择性较为严格。

实施例4：含S-酰胺酶活力微生物的筛选

反应液的组成和检测方法同实施例2。Rhodocococcus sp.分别以上述这两种对映体为底物，反应液中氧肟酸的生成变化曲线如图2：

从图中可以看出，生成的S-氧肟酸的量远大于R-氧肟酸的量，表明该菌种对S-酰胺的酰基转移活性远大于R-酰胺，即含S-酰胺酶，且r₁/r₂＝24，表明选择性较为严格。

Claims (7)

1.一种光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于所述的方法如下：

取被测含酰胺酶的样品溶于pH为5～9的缓冲溶液中，添加羟胺，使羟胺终浓度为0.5～1.0M，并添加手性的S-酰胺或R-酰胺为底物，使手性的酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，取反应所得转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型一致或含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与底物的立体构型相反。

2.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于对转化液显红棕色的被测样品，进一步以所添加的手性酰胺立体构型相反的手性酰胺为底物，重复如权利要求1所述的操作，若显红棕色则表明被测样品含有的酰胺酶没有光学选择性，若显淡黄色则表明被测样品含有的酰胺酶的光学选择性与所添加的底物的立体构型相反。

3.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于所述的手性的酰胺为下列之一：①二甲基环丙甲酰胺，②叔丁基亮氨酸酰胺，③3，3，3-三氟-2-甲基丙酰胺，④哌嗪-2-酰胺。

4.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于所述的方法如下：取酰胺酶阳性样品2份，溶于缓冲液中，各添加羟胺至终浓度为0.5～1.0M，并各自添加手性的R-酰胺和S-酰胺进行对照，所添加手性酰胺终浓度为5～30mM，于20～50℃水浴中进行反应，分别取转化液添加含Fe³⁺的溶液进行显色，若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光学选择性与显红棕色样品所添加的手性酰胺的立体构型一致，2份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择性。

5.如权利要求1所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于所述的方法如下：取酰胺酶阳性样品2份，溶于缓冲液中，各添加羟胺至终浓度为0.5～1.0M，并各自添加R-(-)-2，2-二甲基环丙甲酰胺和S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺进行对照，所添加手性酰胺终浓度为20mM，于30℃水浴中进行反应，分别取转化液添加2倍于取样转化液体积的FeCl₃的HCl溶液进行显色，若仅有1份转化液显红棕色表示样品所含酰胺酶的光学选择性与显红棕色样品所添加的酰胺的立体构型一致，2份转化液均显红棕色则表示样品所含酰胺酶没有光学选择性。

6.如权利要求4或5所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于对照组间底物浓度、催化剂量及其它反应条件相同。

7.如权利要求5所述的光学选择性酰胺酶筛选方法，其特征在于对转化液进行定时取样，离心去除菌体或细胞提取物后，测定生成的氧肟酸含量。

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