CN107794254A - 重组高温裂解酶的快速纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组高温裂解酶的快速纯化方法，该方法利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，重组高温裂解酶在大肠杆菌宿主细胞中经诱导表达后，经过离心收集菌体，通过加热使大肠杆菌破裂进而释放出已表达的高温裂解酶，同时在高温下能够使大肠杆菌宿主蛋白变性、失活、沉淀，有利于纯化不易热变性的高温裂解酶，再通过超滤进行细菌碎片截流和裂解酶蛋白浓缩，快速获得较高纯度的高温裂解酶；该方法操作简单，大肠杆菌蛋白热变性去除率高，纯化浓缩效率高，适于工业化生产和市场推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组高温裂解酶的快速纯化方法。
背景技术
蛋白纯化是生物酶提取中的重要步骤，通常纯化的方法有亲和层析、分子筛、有机溶剂分级分离法、等电点沉淀法等，以上方法涉及的步骤根据蛋白的特性繁简不一，很多时候要通过多种方法的组合才能获得目的蛋白，同时纯化的步骤越多，蛋白的回收效率将受到重大影响，可见提高蛋白的提取效率始终是蛋白质提取中的核心问题，在工业应用中，蛋白的提取工艺甚至会对产品的质量和成本造成重大影响。
大肠杆菌是目前重组蛋白表达的最重要的宿主菌株，在研究和工业生产中被广泛利用。为了将表达的目的蛋白从大肠杆菌中释放出来，常用的方法有超声破碎、高压匀浆、冻融等方法，鉴于许多表达的目的蛋白为热不稳定蛋白，在进行以上操作的时候经常要在低温下进行，而且受到破碎菌体总体积的影响，操作的便利性受到一定的限制。
发明内容
本发明目的在于提供一种重组高温裂解酶的快速纯化方法，该方法利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，通过加热使大肠杆菌破裂进而释放出已表达的高温裂解酶，变性沉淀大肠杆菌蛋白，再通过超滤进行细菌碎片截流和裂解酶蛋白浓缩，快速获得较高纯度的高温裂解酶的方法。
本发明方法具体操作如下：利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，重组高温裂解酶在大肠杆菌宿主细胞中经诱导表达后，经过离心收集菌体，菌体用pH为6.5-8.0的磷酸缓冲液将离心沉淀的菌体重新悬浮起来，于60-80℃热处理10-40min，以达裂解大肠杆菌的目的，获得菌体破碎液；利用0.1-0.45μm的滤膜对破碎液进行超滤，截留大肠杆菌细胞碎片和变性蛋白沉淀，收集滤过液获得裂解酶粗酶液；根据裂解酶的分子量大小，以3K-100K道尔顿的超滤膜包对裂解酶粗酶液进行截留浓缩，从超滤的浓缩液中获得所需的高温裂解酶，实现对重组高温裂解酶的纯化和浓缩。
高温酶最重要的特征在于其在高温下能保持很好的热稳定性和活性，在常温下稳定性高，易于保存；在进行高温酶的分离纯化中可以充分利用其区别于常温蛋白的热稳定性进行分离纯化，大肠杆菌在55℃以上孵育15分钟即可导致其细胞破裂，进一步使其蛋白热变性沉淀，而利用大肠杆菌表达的高温酶因其热稳定在热裂解大肠杆菌时不会受到破坏，热裂解还造成大肠杆菌热不稳定蛋白的大量失活沉淀，在一定程度上提高了高温酶的比活，去除了大量的杂蛋白，这对高温酶的纯化是非常有利的，可见利用大肠杆菌表达高温酶结合热裂解破碎沉淀杂蛋白，结合超滤进行蛋白质的过滤和浓缩，将成为重组高温酶纯化的快速方法。
本发明的有益效果：
本发明充分利用常见的蛋白表达菌株为常温菌大肠杆菌，其菌株和菌体蛋白均在高温下不稳定，而高温酶具有热稳定性的特征，通过热裂解结合超滤浓缩将有利于快速纯化浓缩目的高温酶，在热裂解时，释放的裂解酶也会发挥其裂解功能，参与到细菌的裂解过程，加快细菌的裂解；这种方法操作简单，大肠杆菌蛋白热变性去除率高，纯化浓缩效率高，结合其他纯化方法，将有利于获得更高纯度的高温酶，此种方法易于工业生产放大，为重组高温酶的纯化提供了新的方法。
附图说明
图1是不同裂解温度下大肠杆菌制备的裂解液的SDS-PAGE电泳图；M为蛋白maker，1泳道是菌体超声破碎裂解液，超声破碎的功率为140W，超声破碎的时间为20min，在冰浴下进行；2泳道是菌体55℃热处理20min裂解液；3泳道是菌体60℃热处理20min裂解液；4泳道是菌体65℃热处理20min裂解液；5泳道菌体是70℃热处理20min裂解液；6泳道是菌体75℃热处理20min裂解液；7泳道是菌体80℃热处理20min裂解液；
图2是测试菌株TC16菌体正常形态；
图3是大肠杆菌菌体65℃热处理20min的裂解液对测试菌株TC16菌体裂解效果的显微镜观察结果；
图4是两种裂解液经3KDa通过超滤管浓缩后样品的SDS-PAGE电泳图；M为maker，1泳道是菌体超声破碎裂解液，超声破碎的功率为140W，超声破碎的时间为20min，在冰浴下进行；2泳道是通过菌体65℃热处理20min裂解液；
图5是裂解酶抑菌效果检测结果；1是超声破碎裂解液（蛋白浓度为316μg/mL），2是菌体热裂解后浓缩酶液（蛋白浓度为216μg/mL），3是卡那霉素对照（80μg/mL）。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本重组高温裂解酶的快速纯化方法如下：
1、将携带pET28a(含高温裂解酶TSPpgh基因，TSPpgh分子量为19KDa）的重组BL21菌株按质量比1%比例接种到100 mL LB培养液（含卡那霉素终浓度50μg/mL)中，放入37℃摇床培养到其OD600值约为0.6-0.8；
2、加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG（终浓度为1mM），放入28℃，80rpm摇床诱导培养6小时；
3、将诱导表达后的100mL发酵液于4500g离心20min，取菌体沉淀用9mL pH为7.2的0.05mol/L的磷酸缓冲液把菌体悬浮，取1mL菌体悬浮液于3mL的离心管中，取6管用于热裂解，分别在55-80℃水浴中进行热处理，每间隔5℃设置一管，样品热裂解时间为20min，超声破碎处理作为对照管(样品1)，超声破碎的功率为120W，破碎的时间为20min，在冰浴下进行；
4、样品经过热裂解或超声破碎后，通过13000g离心15min，收集上清液，通过考马斯亮蓝法测定各个处理组的蛋白质含量，结果见表1，并通过SDS-PAGE电泳进行分析裂解液中高温裂解酶的比例，结果见图1；
表1不同裂解条件获得的裂解液中蛋白浓度
由表1可知，超声破碎获得的破碎液中含菌体蛋白和裂解酶重组蛋白，蛋白浓度最高，60-70℃热裂解的裂解液中蛋白浓度最高，热裂解时，55℃裂解效率较低，蛋白浓度低，75-80℃温度过高，导致裂解后大量的菌体蛋白和裂解酶蛋白均变性沉淀，造成裂解液中蛋白浓度较低，可见，60-70℃热裂解具有最佳的效果；SDS-PAGE电泳图（图1）检测结果表明，60-70℃热裂解的裂解液中大肠杆菌蛋白很少，但裂解酶含量高，加热对裂解酶的起到较好的释放和纯化作用；
5、将步骤3中60-70℃热处理后获得的破碎液用0.45μm的滤膜对破碎液进行超滤，截留大肠杆菌细胞碎片和变性蛋白沉淀，收集滤过液获得裂解酶粗酶液；
6、因为高温裂解酶TSPpgh分子量为19KDa（选择低于裂解酶分子量1/2倍以下的膜包，防止裂解酶滤过），使用3KDa的超滤膜包对1mL裂解酶粗酶液进行截留浓缩；浓缩后，使用考马斯亮蓝法对浓缩后的裂解酶进行含量测定，结果见表2；
表2
结果表明通过60-70℃加热的裂解液，用0.45μm的滤膜对破碎液进行超滤，再用3KDa的超滤膜包对裂解酶粗酶液进行截留浓缩，能够获得浓度和纯度都较高的裂解酶液。
实施例2：不同加热温度获得的裂解酶的活力检测
1、裂解酶对高温菌菌株TC16生长的影响
（1）宿主菌TC16的培养条件
将高温菌测试菌株TC16按质量百分比1%的接种量转接到DSM88培养基（配方见表3）中，在温度60℃、转速150rpm的恒温摇床中进行培养待TC16生长到OD600为0.6时，取出菌种作为实验备用菌种；
表3 DSM88液体培养基配方表
；
（2）高温裂解酶对测试菌株TC16的裂解检测
以实施例1步骤4离心收集的大肠杆菌表达的裂解酶对测试菌株TC16的裂解效果作为评价裂解酶在菌体高温裂解时剩余酶活的差异，剩余总酶活多则对测试菌株TC16裂解效果好，其对应的裂解温度为适合的大肠杆菌菌体热裂解温度。
分别取实施例1步骤4的40μL超声破碎液和55-80℃热处理的裂解液与10μL测试菌株TC16菌液（（1×109CFU））于100μlEP管中，在60℃下反应10min，取样并进行光学显微镜镜检，结果表明，65℃热处理20min的裂解液和超声破碎液对测试菌株TC16的裂解效果最好，随着温度升高至80℃，高温裂解酶的活性下降；55℃裂解液中裂解酶较少，其对TC16菌体的裂解效果也较差。可见，65℃热处理20min获得的裂解液还能保持酶有较高的活性，为最优裂解温度。
如图2为测试菌株TC16正常的菌体形态，图3为65℃热处理20min的裂解液对测试菌株TC16菌体的裂解效果。
（3）通过菌体生长情况来检测高温裂解酶裂解活性
在5mL DSM88培养基中分别加入400μL实施例1步骤4中制备的热裂解和超声破碎获得的裂解液，并加入测试菌株TC16的100μL菌液（2×109CFU），在70℃下振荡培养6h，测定培养液的OD600，（以高压灭菌灭活的70℃热处理20min的裂解液为对照），结果如表2；
表4不同裂解液对高温裂解酶的酶活力影响
结果表明，60-70℃热处理20min的裂解液和超声破碎液对测试菌株TC16菌体生长具有较高的抑制作用，可见60-70℃热处理20min的获得的裂解液中高温裂解酶的酶活较高，可见60-70℃热裂解均具有较好的效果。
实施例3：本重组高温裂解酶的快速纯化方法如下：
1、使用BIOFLO415发酵罐发酵重组大肠杆菌菌株BL21（含高温裂解酶TSPpgh基因），发酵液体积为10L，发酵条件为转速150rpm/min，温度37℃，通气量5L/min；采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG（终浓度为1mM）诱导表达结束后，在发酵罐中直接将罐内温度上升到65℃持续20分钟，用于热裂解大肠杆菌，并且使大量的杂蛋白失活、变性和沉淀；加热结束后，获得破碎液，将发酵液通过0.45μm滤膜对破碎液进行超滤，收集滤过液；将1mL滤过液再通过3KDa的超滤膜包进行过滤浓缩，取浓缩液即为经过初步纯化的高温裂解酶酶液；
2、利用考马斯亮蓝法测定裂解酶浓缩液蛋白浓度，其浓度为216μg/mL（未浓缩前热裂解的发酵液蛋白浓度为102μg/mL）；
3、通过SDS-PAGE电泳对酶液进行检测（以超声破碎液为对照），结果如图4所示；经本方法处理，酶液中高温裂解酶的含量达到95%，具有较高的纯度；
4、将以上获得的高温裂解酶进行大肠杆菌抑菌实验，测试菌株为大肠杆菌BL21菌株，利用牛津杯法进行测定，菌液浓度为（1.5×109CFU），每个牛津杯加入50μl样品，在37℃培养12小时后观察结果，以80μg/mL的卡那霉素为对照；结果见图5，通过以上方法获得的高温裂解酶能在平板上形成明显的抑菌圈（样品2），说明本方法获得的高温裂解酶具有裂解活性，同时对本方法酶液具有较高的浓缩效果。
Claims (1)
1.一种重组高温裂解酶的快速纯化方法，其特征在于：利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，重组高温裂解酶在大肠杆菌宿主细胞中经诱导表达后，经过离心收集菌体，用pH 6.5-8.0的磷酸缓冲液将离心沉淀的菌体重新悬浮起来，于60-80℃热处理 10-40min，获得破碎液；然后用0.1-0.45μm的滤膜对破碎液进行超滤，截留大肠杆菌细胞碎片和变性蛋白沉淀，收集滤过液获得裂解酶粗酶液；根据裂解酶的分子量大小，以3K-100K道尔顿的超滤膜包对裂解酶粗酶液进行截留浓缩，从超滤的浓缩液中获得所需的高温裂解酶，实现对重组高温裂解酶的纯化和浓缩。
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