CN111139185B - 曲霉属真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15‑0‑3)及其应用。其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60476。本发明的曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15‑0‑3)可以制备得到苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物，为稀有天然产物提供一种可再生的生物来源，为其进一步生物活性研究和生物学应用提供了充足的物质基础。

Description

曲霉属真菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及曲霉属真菌及其应用。
背景技术
叶立德类生物碱的结构特征为两分子氨基酸形成的二酮哌嗪类化合物。在此类物质中如果一分子的氨基酸为色氨酸，则构成常见的吲哚二酮哌嗪类生物碱衍生物(Borthwick AD,Chem.Rev.2012,112,3641-3176)。而异戊烯基吲哚二酮哌嗪类生物碱是由吲哚二酮哌嗪类化合物在吲哚异戊烯基转移酶的催化下通过异戊烯基的迁移反应而成，广泛存在于真菌Aspergillus sp.,Penicillium sp., Pestalotiopsis sp.和Chromocleista sp.中(Li SM,Natural Products Reports.,2010, 27,57-78)。与非异戊烯基取代的吲哚二酮哌嗪类生物碱相比，这些异戊烯基取代的吲哚二酮哌嗪生物碱大多具有广泛的生理活性。
Figure BDA0001893450690000011
目前苯甲醛类化合物结构特征为苯环的1位为醛基取代，2位为直链的7碳烷(烯)烃取代基，且与苯环形成1～3个共轭与非共轭双键(A)，或者与2位的烷烃侧链与3位羟基成呋喃(B)或吡喃环(B、C、D)(黄玉玲，海洋真菌Aspergillus sp.中的苯甲醛衍生物研究，中草药，2012，43(5):837-840.)；苯环的 3位和6位羟基取代，而5位为异戊烯基取代。
Figure BDA0001893450690000021
自1976年Gatti教授(Gatti G.,J.C.S.Chem.Comm.,1976,435-436)从Apsergillus amstelodami的菌丝体中分离得到首个苯甲醛叶立德杂合二聚体cryptoechinulin B和cryptoechinulin D，并推测二者分别由auroglaucine和neoechinuline B或neoechinuline C通过D-A反应获得。并分别将auroglaucine和neoechinuline B和neoechinuline C密封在真空管中加热到150℃条件反应制得(未见实验条件报道)。1977年Inoue教授(Inoue S,Yagugaku Zasshi,1977,97, 576-581)将auroglaucine和Cryptoechinulin A(即neoechinuline B)在真空密封真空管120℃反应1.5小时得到cryptoechinulin B(产率37％)和一个12位的立体异构体(产率6％)，并确定其相对立体构型。后来cryptoechinulin D又被中国海洋大学李德海教授(Li DL,Helv.Chim.Acta.,2008,91,1888-1893)从福建红树林根系土壤中分离得到的Eurotiumrubrum中分离得到，并采用CD和ECD的方法确定了绝对构型。到目前为止，仅有另外两对苯甲醛和叶立德杂合二聚体类化合物报道。从中国福建红树根际海泥中分离得到的疏展曲霉菌H1-1 (Aspergillus effuses H1-1)中(Gao HQ,Arch.Pharm.Res.2013,36,952-956；GaoHQ,Org.Biomol.Chem.,2012,10,9501-9506.)分离得到苯甲醛叶立德杂合螺缩酮类二酮哌嗪生物碱Dihydrocryptoechinulin D(式1)和Effusin A(式2)。DihydrocryptoechinulinD和Cryptoechinulin D为同系物，二者差别为26、27位双键的有无。Effusin A则含有氮杂缩酮(N，O)螺环部分，其与 (Dihydro)cryptoechinulin D的生源不同，不能通过简单的Diela-Alder反应形成。研究结果表明没有拆分的cryptoechinulin D外消旋体和(+)cryptoechinulin D的抑制P388肿瘤细胞株的细胞毒活性IC50值分别为3.43μM和2.50μM，而(-) cryptoechinulin D对P388肿瘤细胞的IC50值仅为11.3μM。而对HL-60、BEL-7402 和A-549三种细胞株没有抗肿瘤活性(IC50>100μM)。Dihydrocryptoechinulin D 的体外抗肿瘤活性研究表明，Dihydrocryptoechinulin D对P388和HL-60肿瘤细胞株具有明显的细胞毒活性，其IC50值分别为1.83μM、4.80μM。因此，Cryptoechinulin D和Effusin A等苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物表现有潜在的抗肿瘤活性。然而苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的结构复杂，且合成反应条件不明，产率较低。而已报到的提取方法效率低且成本高，因此寻找新的制备方法具有重要意义。
Figure BDA0001893450690000031
海洋微生物独特的生存环境(高压、高盐、缺氧、避光等)，促使海洋微生物产生大量结构新颖的化合物，为稀缺天然产物的制备提供了重要来源。
发明内容
基于此，本发明提供一种曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)。
具体技术方案如下：
曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)，其保藏编号：GDMCC 60476。
本发明的另一目的是提供一种曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)在制备苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的应用。
本发明的再一目的是提供一种苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)先将保藏编号为GDMCC60476的曲霉属真菌(Aspergillus sp. EGF15-0-3)在菌种培养基中进行菌种培养，得菌种；
(2)将菌种在发酵培养基中发酵培养；
(3)将菌株灭活，提取液萃取后，将提取液浓缩，得浸膏；
(4)浸膏依次经LH-20柱层析、ODS柱层析、制备HPLC分离，得苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物。
本发明所述的曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)已于2018年11月 12日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心 (GDMCC，地址：中国广州市先烈中路100号省微生物所实验楼五楼)，保藏日期2018年11月12日，保藏编号GDMCC60476。
本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人从中国南海的软珊瑚中提取分离得到一种曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)，其培养简单，繁殖快，培养成本低。
曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)可以在本发明特定的培养方法以及分离方法下制备得到苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物，为稀有天然产物提供一种可再生的生物来源。尤其地，本发明方法成功的制备得到了具有潜在抗肿瘤活性的稀有天然产物Cryptoechinulin D，为其进一步生物活性研究和生物学应用提供了充足的物质基础。
附图说明
图1菌种分离图；
图2为PDA培养基上生长8天的图片；
图3为PDA培养基上生长8天显微镜下图片(放大30倍)；
图4为实施例2的微生物生长图；
图5为实施例3的微生物生长图；
图6为实施例4的微生物生长图；
图7为实施例5的微生物生长图；
图8为样品E1-2-7进行制备HPLC分离色谱图；
图9为化合物(1)的ESI-MS图；
图10为化合物(1)的1H-NMR图；
图11为化合物(1)的13C-NMR图；
图12为化合物(1)的HPLC手性拆分色谱图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供一种曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)，保藏编号：GDMCC60476
本发明的另一目的是提供一种曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3)在制备苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的应用。
在其中一些实施例中，上述应用包括以下步骤：
(1)先将保藏编号为GDMCC 60476的曲霉属真菌(Aspergillus sp. EGF15-0-3)在菌种培养基中进行菌种培养，得菌种；优选地，所述菌种培养基含有葡萄糖(0.3±0.1)％、土豆(100～300)g/L、土豆汁用陈海水作溶剂配制。
(2)将菌种在发酵培养基中发酵培养；具体地，所述发酵培养基为液体培养基、固体培养基或生物转化培养基；优选地，所述发酵培养基为固体培养基；
(3)将菌株灭活，提取液萃取后，将提取液浓缩，得浸膏；
(4)浸膏依次经LH-20柱层析、ODS柱层析、制备HPLC分离，得苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物；优选地，所述LH-20柱层析的洗脱液为甲醇；所述ODS柱层析的流动相为甲醇和水，采用梯度洗脱，V甲醇:V水＝(60:40)～ (100:0)；所述HPLC的流动相为V乙腈:V水＝(60:40)～(80:30)，优选为V乙腈:V 水＝70:30；上述LH-20柱层析、ODS柱层析分离过程中，对洗脱后的洗脱液或流动相用LC-MS和TLC追踪，以确定目标化合物所在的洗脱部位。
在其中一些实施例中，步骤(2)中，所述发酵培养基优选为固体培养基，该固体培养基选自以下任意一种培养基：
大米培养基：每80ml陈海水含有(55±5)g东北大米和体积分数为(0.3 ±0.05)％的蛋白胨；
玉米培养基：每80ml陈海水含有(50±5)g东北大米、(5±1)g玉米渣和体积分数为(0.3±0.05)％的蛋白胨；
糯米培养基：每80ml陈海水含有(45±5)g糯米和体积分数为(0.3±0.05)％的蛋白胨；
丝苗培养基：每80ml陈海水含有(4±1)g丝苗米和体积分数为(0.3±0.05)％的蛋白胨。
进一步优选地，步骤(3)中，所述提取液为乙酸乙酯或丙酮，所述萃取的次数为2～4次，每次萃取的时间为20小时～28小时。
在其中一些实施例中，所述苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物为Cryptoechinulin D和Effusin A。
进一步地，本发明的发明人经过大量的实验研究发现，曲霉属真菌 (Aspergillussp.EGF15-0-3)在不同的培养基中产生苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的能力不同，其在固体培养基中产生苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的能力最强。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本实施例中所用的微生物菌种培养基、微生物发酵培养基均为发明人自身配制，所用材料若无特别注明，均为普通市售商品。
实施例1菌株的分离纯化
样品来源：软珊瑚采自中国南海三亚东锣岛附近海域的软珊瑚。
(一)软珊瑚样品的处理：将采集到的珊瑚样品用无菌海水处理后，放于无菌袋内密封外置冰块保存，并尽快进行微生物的分离。
(二)软珊瑚共附生微生物的获取：在超净工作台内用少量无菌海水冲洗珊瑚样品表面3-5次，获取含有珊瑚共附生微生物的溶液。
(三)软珊瑚内生微生物的获取：用消毒酒精擦拭上述无菌海水冲洗过的珊瑚样品的表面，以杀死表面微生物防止污染；用手术刀剖开珊瑚，取其内部组织，用研钵捣碎组织后加入少量无菌海水，得含有珊瑚内生微生物的溶液。
(四)软珊瑚微生物的分离与纯化：整个涂布过程于超净工作台内完成。将处理得到的珊瑚共附生和内生微生物溶液分别用无菌海水稀释成8个浓度 (10-0、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，用移液枪定量量取200μL各浓度稀释液分别移入已加入抗生素的PDA固体培养基(真菌固体培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖2.0％、琼脂1.5％、土豆汁用陈海水作溶剂配制，pH自然。) 和LB固体培养基(细菌固体培养基)中，并涂布。每个样品的不同浓度均液分别进行三次平行培养皿；用封口膜将培养皿封住并置于28℃恒温箱(用前杀菌处理)中培养，并观察其生长状况，记录保存。随后将菌落生长良好的培养皿取出，用接种环将菌落挑起于PDA固体培养基上，并划之字纯化，使菌落在培养皿上逐步稀释，直至得到单菌落。每个菌落于培养皿上进行三次平行实验。整个过程于超净工作台上完成后，将培养皿置于28℃恒温箱中培养，并观察其生长状况，记录保存。
(五)菌株的保存：将纯化完毕的菌株用接种环挑单菌落于含有750μL液体培养基(甘油与PDA液体培养基体积比1:1)的冷冻管中(液体培养基与冷冻管均须高压灭菌)，在其上方加入750μL的50％甘油封存，置于-80℃超低温冰箱保存(如图1所示)。
所述的曲霉属真菌(Aspergillus sp.EGF15-0-3，保藏号为GDMCC 60476) 菌株的形态特征为：在PDA培养基上28℃生长3天，菌落直径2～3mm，4天菌落直径6mm，8天菌落之间交叉覆盖直径20mm以上的团状。单菌落初期白色簇状圆片形菌丝体，中心为白色聚集团状，四周为丝状向外延伸。菌落生长4 天后中间出现灰绿色丝状菌丝。显微镜观察菌丝有隔菌丝，菌丝多分支，主菌丝和分枝菌丝顶端产生分生孢子梗，梗顶产圆形或椭圆形分生孢子。菌丝呈团团状，分散大量菌丝团(见图2和图3)。
(六)菌株鉴定
本发明所述曲霉属真菌的内转录间隔区序列(ITS)如下：
ITS PCR扩增引物序列如下：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(SEQIDNO.1)
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQIDNO.2)
曲霉属真菌EGF15-0-3经ITS1和ITS4引物扩增、测序、鉴定后获得了527bp 的扩增产物，序列结果如下(SEQIDNO.3)：
GGTCTTGGACTCGGACTCTGGGTCACCTCCCATCCGTGTCTATCTGTA CCCTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCCGAAGACTAACATTTGAACA CTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACAATAATTAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATAATTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAC ATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTG CCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCTTCCGTCCCTGGTAACGGGGACG GGCCCAAAAGGCAGTGGCGGCACCATGTCTGGTCCTCGAGCGTATGGGGC TTTGTCACCCGCTCCCGTAGGTCCAGCTGGCAGCTAGCCTCGCAACCAATC TTTTTAACCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCCGGAGGAAA。
实施例2曲霉属真菌EGF15-0-3制备Cryptoechinulin D
(1)菌种活化：用接种环从曲霉属EGF15-0-3菌种保存管中取适量的种液，接种到装有50ml菌种培养基(土豆200g/L、葡萄糖2.0％、土豆汁用陈海水作溶剂配制，自然pH)的100ml三角瓶中，在28℃的摇床中165r/min培养2天，获得曲霉属EGF15-0-3的种子培养液。
(2)发酵：吸取EGF15-0-3种子培养液1.5ml加入400ml糯米固体培养基 (糯米45～55g、陈海水80～100ml、蛋白胨0.25～0.35％)的1000ml三角烧瓶中，在28℃下静置培养60天，与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，菌株生长图如图4所示(A为空白培养基，B为菌株生长的培养基)，成长完毕加入5～10ml乙酸乙酯停止发酵。分离实验共发酵固体培养基100L。
(3)提取：每1L培养瓶中加入300ml乙酸乙酯，放在摇床上振摇24～36 小时(160～200rpm)进行，抽滤。培养基中继续加入乙酸乙酯重复3～5次，滤液合并减压浓缩，得提取物(E1：100g)。
(4)分离：将乙酸乙酯提取物E1分10次进行开放LH-20柱层析(40μm～ 60μm、500g、柱子φ＝13cm～16cm，L＝90cm～110cm)，每次10g，甲醇洗脱，共得到13体积流份((160～200ml)/体积)，LC-MS追踪(分子量在550-800 间为目标物)，将5～8体积流份合并，得到分子量为550～800的洗脱部位(E1-2， 30～40g)。将E1-2((8.5～10g)/次)进行第二次开放ODS柱层析(40μ～60μm、 400～500g、柱子φ＝13～16cm，柱长＝40～60cm)，甲醇水梯度洗脱(V甲醇:V水＝ (60:40)～(100:0))，250ml/体积，TLC追踪合并，收集NMR和LC-MS验证分子量为550～800的洗脱部位(E1-2-7，10～13g)。将E1-2-7进行制备HPLC 分离：色谱柱为Kromasil 100-5-C18；5μm；21.2×250mm(瑞士Kromasil公司)， V乙腈:V水＝70:30洗脱，色谱图见附图8，得到14个流份E1-2-7-1～E1-2-7-14。其中E1-2-7-6～E1-2-7-9合并(1.60～1.80g)，甲醇重结晶得Cryptoechinulin D (1)(200～300mg)。
实施例3曲霉属真菌EGF15-0-3制备Cryptoechinulin D
(1)菌种活化：与实施例2一致。
(2)发酵：吸取EGF15-0-3种子液1.5ml加入400ml玉米固体培养基(东北大米50g、玉米渣5g、陈海水80ml、0.3％蛋白胨)的1000ml三角烧瓶中，在28℃下静置培养60d，与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，菌株生长图如图5所示(A为空白培养基，B为菌株生长的培养基)，成长完毕加入 5～10ml乙酸乙酯停止发酵。分离实验共发酵固体培养基100L。
(3)提取：提取过程与实施例2一致，得提取物(E1，80g)。
(4)分离：与实施例2一致，得Cryptoechinulin D(1)(160～280mg)。
实施例4EGF15-0-3菌制备Cryptoechinulin D
(1)菌种活化：与实施例2一致。
(2)发酵：吸取EGF15-0-3种子液1.5ml加入400ml大米固体培养基(东北大米50g、陈海水80ml、0.3％蛋白胨)的1000ml三角烧瓶中，在28℃下静置培养60d，与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，菌株生长图如图6 所示(A为空白培养基，B为菌株生长的培养基)，成长完毕加入5～10ml乙酸乙酯停止发酵；分离实验共发酵固体培养基100L。
(3)提取：提取过程与实施例2一致，得提取物(E1，85g)。
(4)分离：与实施例2一致，得Cryptoechinulin D(1)(160～280mg)。
实施例5EGF15-0-3菌制备Cryptoechinulin D
(1)菌种活化：与实施例2一致。
(2)发酵：吸取EGF15-0-3种子液1.5ml加入400ml丝苗固体培养基(丝苗米4g、玉米渣5g、陈海水80ml、0.3％蛋白胨)的1000ml三角烧瓶中，在 28℃下静置培养60d，与空白培养基对比观察是否有明显的菌株生长，菌株生长图如图7所示(A为空白培养基，B为菌株生长的培养基)，成长完毕加入5～ 10ml乙酸乙酯停止发酵；分离实验共发酵固体培养基100L。
(3)提取：提取过程与实施例2一致，得提取物(E1，84.5g)。
(4)分离：与实施例2一致，得Cryptoechinulin D(1)(220～320mg)。
苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的结构鉴定：
化合物(1)黄色针簇状晶体或黄色片状晶体(甲醇结晶)。紫外灯254nm 和300nm下有暗斑，香草醛-浓硫酸显棕蓝色，说明结构中有饱和醇羟基存在。λmax(logε)＝348(3.75)nm，284(3.83)nm，224(4.33)nm。ESI-MS给出[M+H]+620，结合NMR数据(化合物(1)的NMR数据如表1所示，1H-NMR谱图如附图 10所示，13C-NMR谱图如附图11所示)38种碳：15个季碳、15个CH、3个亚甲基和6个甲基，确定化合物(1)的分子式为C38H41N3O5，不饱和度为20。13C-NMR显示其具有24个多取代双键碳(δC 105.7～155间，见表1 )、两个酮羰基(δC 169.4(s)、162.9(s))和1个醛基信息δH 12.28(s,1H)和δC 197.7(d)，除此外不存在任何其他不饱和度信息，所以提示结构有5个环。1H-NMR中δH 4.30(d,8.0,1H)、6.15(dd,9.2,17.2 1H)、5.97(d,10.0,1H)和δC 145.7(d)、112.4(t)说明结构中存在末端双键，δH 11.9(s,1H)、12.30(s,1H)、10.79(s,1H)、8.72(s,1H)、 10.54(s,1H)重水交换消失，说明结构中存在三个活波氢。根据MS中的N规则，准分子离子峰[M+H]+620，说明化合物分子量为619，含有奇数个N，所以含有三个NH和2个羟基。以上信息说明化合物1可能为具有末端双键的异戊烯基取代的色胺类二酮哌嗪类化合物。同时δH 1.63(s,3H)、1.57(s,3H)和δC 26.0(q)、 17.95(q)说明结构中还存在三取代异戊烯基，同时醛基信号的存在暗示此结构中可能存在苯甲醛片段。将化合物(1)的NMR数据与已公开Cryptoechinulin D (Gao HQ.Arch.Pharm.Res；2013,36,952-956.)的NMR数据对照，二者基本一致，确定化合物(1)为Cryptoechinulin D。此化合物在甲醇溶剂结晶过程中发现，可以结合一分子的甲醇进行结晶，且晶型不同，分别为簇状晶体和片状晶体，此性质也被NMR检测到。在吡啶溶剂中，片状晶体可以检测到甲醇的存在：δH3.61(s,3H)和δC 50.00(q)。
对化合物(1)(Cryptoechinulin D)进行手性拆分，手性柱：Chrial ND(2)， 5u，250×10mm，V正己烷:V异丙醇＝(72:28)洗脱，色谱图如附图12所示。τ10.257为(+)CryptoechinulinD(1)，τ12.057为(-)Cryptoechinulin D(1)。
Figure BDA0001893450690000111
表1化合物1和Cryptoechinulin D的NMR数据
Figure BDA0001893450690000112
Figure BDA0001893450690000121
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州中医药大学（广州中医药研究院）
<120> 曲霉属真菌及其应用
<150> 201811314919.2
<151> 2018-11-06
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 527
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtcttggac tcggactctg ggtcacctcc catccgtgtc tatctgtacc ctgttgcttc 60
ggcgtggcca cggcccgccg aagactaaca tttgaacact gtctgaagtt tgcagtctga 120
gtttttagtt aaacaataat taaaactttc aacaacggat ctcttggttc cggcatcgat 180
gaagaacgca gcgaaatgcg ataattaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgagt 240
ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg 300
ctgccctcaa gcacggcttg tgtgttgggc ttccgtccct ggtaacgggg acgggcccaa 360
aaggcagtgg cggcaccatg tctggtcctc gagcgtatgg ggctttgtca cccgctcccg 420
taggtccagc tggcagctag cctcgcaacc aatcttttta accaggttga cctcggatca 480
ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat caaaagcccg gaggaaa 527

Claims (4)

1.一种苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）先将保藏编号为GDMCC 60476的曲霉属真菌Aspergillus sp. EGF15-0-3在菌种培养基中进行菌种培养，得菌种；
（2）将菌种在发酵培养基中发酵培养；所述培养基为固体培养基；
所述固体培养基选自以下任意一种培养基：
大米培养基：每80ml陈海水含有（55±5）g东北大米和体积分数为（0.3±0.05）%的蛋白胨；
玉米培养基：每80ml陈海水含有（50±5）g东北大米、（5±1）g玉米渣和体积分数为（0.3±0.05）%的蛋白胨；
糯米培养基：每80ml陈海水含有（45±5）g糯米和体积分数为（0.3±0.05）%的蛋白胨；
丝苗培养基：每80ml陈海水含有（4±1）g丝苗米和体积分数为（0.3±0.05）%的蛋白胨；
（3）将菌株灭活，提取液萃取后，将提取液浓缩，得浸膏；所述提取液为乙酸乙酯或丙酮；所述萃取的次数为2～4次，每次萃取的时间为20小时～28小时；
（4）浸膏依次经LH-20柱层析、ODS柱层析、制备HPLC分离，得苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物；
所述苯甲醛叶立德杂合二聚体类化合物为Cryptoechinulin D。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述菌种培养基含有葡萄糖（0.3±0.1）%、土豆（100～300）g/L，用陈海水作溶剂配制。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述ODS柱层析的流动相为甲醇和水，采用梯度洗脱，V甲醇:V水=（60:40）～（100:0）。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述HPLC的流动相为V乙腈:V水=（60:40）～（80:30）；所述LH-20柱层析的洗脱液为甲醇。
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