CN114606134A - 一种海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用,特点是该菌株为FLB3‑18菌株,于2021年01月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:61477,该该株中光层海绵共附生真菌(Pleosporales sp.)发酵培养来获取氧杂蒽醌类化合物的发酵物,然后将发酵物用乙酸乙酯提取,得粗浸膏,将该粗浸膏经减压硅胶柱层析,凝胶柱层析,中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到氧杂蒽醌类化合物,优点是分离纯化得到氧杂蒽醌类化合物,可能会为药物开发提供生物活性分子发现的线索。
Description
本申请是对申请日为2021年03月10日、申请号为202110258916.7、发明名称为:一种氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和用途的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种真菌,尤其是涉及一种海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用。
背景技术
海绵共附生微生物蕴含着许多结构新颖的次级代谢产物,主要包括大环内酯类、聚酮类、环肽类、生物碱类等,这些化合物往往具有强的抗菌、抗肿瘤等药理活性,近年来已成为海洋天然产物研究的热点之一。海绵来源的微生物主是真菌和细菌,尤以真菌中次级代谢产物种类繁多、活性独特而备受重视。据报道,海洋中光层(30 m〜150 m水下)在海洋中拥有超过80%的生物多样性。但是,到目前为止有关海绵共附生真菌次级代谢产物的研究鲜有报导,本发明人研究获知从海洋中光层海绵共附生真菌(Pleosporalessp. FLB3-18)次级代谢产物中分离获得的一种氧杂蒽醌类化合物,通过18S rRNA测序发现该株真菌Pleosporales sp.疑似新种,进一步对其次级代谢产物进行分离纯化及活性评价。目前尚未见该化合物的化学结构及活性的报道,因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能分离得到氧杂蒽酮类化合物的海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:
1、一种海绵共附生真菌,该菌株为FLB3-18菌株,于2021年01月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No: 61477。
2、上述海绵共附生真菌在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用,从海绵共附生真菌Pleosporalessp. 次级代谢产物中分离得到氧杂蒽醌类化合物,其结构式如下所示:
上述氧杂蒽醌类化合物的制备方法如下:
(1)发酵培养
将保藏号为GDMCC No: 61477的海绵共附生真菌Pleosporalessp.在马铃薯葡萄糖固体培养基上活化3~4天后,用灭过菌的小铲子在平板上挑取真菌菌落到马铃薯葡萄糖肉汤培养基中,然后置于摇床上培养, 于28℃和120 rpm条件下培养14天,将发酵产物过滤,分离得到发酵液和菌体沉淀,其中所述的马铃薯葡萄糖固体培养基配制方法如下:去皮马铃薯200 g,白砂糖20.0 g,海盐35.0 g,水1 L;
(2)浸膏提取
将发酵液用与发酵液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏;将菌体沉淀用由甲醇和二氯甲烷等体积混合而成的混合液浸泡过液,然后抽滤,将滤过液减压浓缩得到浓缩液,将浓缩液用与浓缩液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏,合并两次所得粗浸膏,得到总粗浸膏;
(3)化合物的分离制备
将总粗浸膏用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后,加200~300目硅胶拌样进行VLC减压柱层析,采用体积比为(1:0)~(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到6个组分;将第3个组分进行LH-20凝胶柱层析,采用体积比为1:4的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到5个组分;将收集的第3个组分采用半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化,洗脱剂为乙腈与水按体积比40:60的比例混合,流速为2.0 mL/min,得到氧杂蒽醌类化合物,其结构式如下所示:
步骤(3)中所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为1:0,10:1,5:1,2.5:1,1:1,0:1。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明一种海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用。本发明目标菌株是来自菲律宾阿波岛水域中光层水域 62 m 海绵 Chalinidae sp.分离出的共附生真菌菌株 FLB3-18,该菌种能在 PDB 培养基中产生丰富的次级代谢产物,并从中分离获得一种新型氧杂蒽醌类化合物。
通过该株中光层海绵共附生真菌(Pleosporales sp.)发酵培养来获取氧杂蒽醌类化合物的发酵物,然后将发酵物用乙酸乙酯提取,得粗浸膏,将该粗浸膏经减压硅胶柱层析,凝胶柱层析,中压柱层析和反相半制备高效液相色谱分离纯化得到氧杂蒽醌类化合物,可能会为药物开发提供生物活性分子发现的线索。从目标菌株 Pleosporales sp. FLB3-18的次级代谢产物中分离得到多个个单体化合物,其中新化合物对人白血病细胞株CCRF-CEM 具有良好的细胞毒活性,通过进一步研究其构效关系,有望成为先导化合物的候选药物分子。
上述一株中光层海绵共附生真菌(Pleosporales sp.),该菌为FLB3-18菌株,保藏编号为GDMCC No: 61477,于2021年01月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,广东省微生物研究所。
附图说明
图1为本发明化合物的核磁共振氢谱;
图2为本发明化合物的核磁共振氢谱。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本发明目标菌株的分离纯化及形态鉴定方法如下:
(1)本发明目标菌株的分离纯化
开启超净工作台紫外灯,对操作环境杀菌约30min后关闭,打开照明灯。将经高压灭菌锅处理灭菌的察氏培养基(C),马铃薯葡萄糖肉汤(PDB),改良马丁(MD)三种培养基每一升加入100mg 青霉素,分别倒入培养皿中,等冷却后再使用。每株海棉取 1g加入9mL无菌海水洗去表面杂质,洗涤三次并用无菌滤纸吸干表面水分。将海绵分为两部分,一部分剪切为0.5cmx0.5 cmx0.5 cm大小块状贴放于到培养基上,另一部分研磨成液体涂布在培养基表面,置于28℃培养箱培养。隔日观察上述平板中真菌的生长情况,若有真菌菌落长出,则立即划线进行纯化。若菌种不纯,则反复挑取单菌落划线纯化,直至得到单一菌株;
(2)本发明目标菌株的鉴定纯化和形态分析
挑取已纯化完成的真菌菌落接入液体培养基(PDB)培养3天。收集菌体并干燥后放入已灭过菌的研钵中,加入适量的液氮快速研磨,将菌体研磨成至粉末状,转移到无菌的离心管(1.5mL)中,按照DNA试剂盒的操作步骤,提取真菌DNA,对提取的基因组DNA以通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增。等到PCR扩增完成以后,运用Bio-Rad系统观察PCR产物,由SangonBiotech进行测序。其基因测序结果如下:GGGGGATACGGTACGCGGCGGTTCAGTAGCCCAAAAAACTGCTGGCCGCCACACGCGTTTATCACCCTTGAATTTGAGTACTTCTGTTTCCTCGGCGGGTTCGCCCGCCAACGAGGACCCCATGAACTCTTTGTAGTAGCAGTATTTGTCTGAAAATAAATTTTAATTAATTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTCGGTATTCCGTGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTAAACCTTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGTGCTTGTCCCGCCTCCGCGCGGCGACTCACCTCAAAGTCATTGGCAGCCCGCATCCGCCGGCCGTGAGCGCAGCACATTTGCACTCTAGGTATTGGCAGGTCGGCTCTCCAGAAGCACTTCTTTTATTATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA。
基因测序结果分析,菌株FLB3-18的ITS1-4rDNA测序结果与Pleosporales sp.相似度为 97.4%,并经形态和分子生物学鉴定,确定该目标菌株为 Pleosporales sp.。
实施例2
一种从实施例1的海绵共附生真菌Pleosporalessp. 次级代谢产物中分离得到的氧杂蒽醌类化合物,其结构式如下所示:
上述氧杂蒽醌类化合物的制备方法如下:
(1)发酵培养
将保藏号为GDMCC No: 61477的海绵共附生真菌Pleosporalessp.在马铃薯葡萄糖固体培养基上活化3~4天后,用灭过菌的小铲子在平板上挑取真菌菌落到马铃薯葡萄糖肉汤培养基中,然后置于摇床上培养, 于28℃和120 rpm条件下培养14天,将发酵产物过滤,分离得到发酵液和菌体沉淀,其中所述的马铃薯葡萄糖固体培养基配制方法如下:去皮马铃薯200 g,白砂糖20.0 g,海盐35.0 g,水1 L;
(2)浸膏提取
将发酵液用与发酵液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏;将菌体沉淀用由甲醇和二氯甲烷等体积混合而成的混合液浸泡过液,然后抽滤,将滤过液减压浓缩得到浓缩液,将浓缩液用与浓缩液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏,合并两次所得粗浸膏,得到总粗浸膏;
(3)化合物的分离制备
将总粗浸膏用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后,加200~300目硅胶拌样进行VLC减压柱层析,采用体积比为(1:0)~(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到6个组分;将第3个组分进行LH-20凝胶柱层析,采用体积比为1:4的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到5个组分;将收集的第3个组分采用半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化,洗脱剂为乙腈与水按体积比40:60的比例混合,流速为2.0 mL/min,得到氧杂蒽醌类化合物,其结构式如下所示:
实施例3
化合物的结构鉴定及核磁信号归属
上述实施例2制备得到的化合物为无色棱柱。根据HRESIMS m/z=369.0587(C17H14O8Na,369.0581)的钠加成峰,确定其分子式为C17H14O8。表明饱和度为11。该化合物的1H和13C NMR数据见图1、图2和表1。
表3 化合物3的1H和13C的核磁共振数据(600, 150 MHz, CDCl3)
注 :表中信号归属基于DEPT、1H-1H COSY、HSQC及HMBC图谱解析结果。氢信号多重度分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和 m(多重峰)表。
上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内,做出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
序 列 表
<110> 宁波大学
<120> 一种海绵共附生真菌及其在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 546
<212> DNA
<213>菌株FLB3-18基因序列(GGGGGATACGGTACGCGGCGGTTCAGTAGCCCAAAAAACTGCTGGCCGCCACACGCGTTTATCACCCTTGAATTTGAGTACTTCTGTTTCCTCGGCGGGTTCGCCCGCCAACGAGGACCCCATGAACTCTTTGTAGTAGCAGTATTTGTCTGAAAATAAATTTTAATTAATTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTCGGTATTCCGTGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTAAACCTTCAAGCTCTGCTTGGTATTGGGTGCTTGTCCCGCCTCCGCGCGGCGACTCACCTCAAAGTCATTGGCAGCCCGCATCCGCCGGCCGTGAGCGCAGCACATTTGCACTCTAGGTATTGGCAGGTCGGCTCTCCAGAAGCACTTCTTTTATTATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA)
<400> 1
Claims (4)
1.一种海绵共附生真菌,其特征在于:该菌株为FLB3-18菌株,于2021年01月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No: 61477。
3.根据权利要求2所述的海绵共附生真菌在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用,其特征在于所述的氧杂蒽醌类化合物的制备方法具体步骤如下:
(1)发酵培养
将保藏号为GDMCC No: 61477的海绵共附生真菌Pleosporalessp.在马铃薯葡萄糖固体培养基上活化3~4天后,用灭过菌的小铲子在平板上挑取真菌菌落到马铃薯葡萄糖肉汤培养基中,然后置于摇床上培养, 于28℃和120 rpm条件下培养14天,将发酵产物过滤,分离得到发酵液和菌体沉淀,其中所述的马铃薯葡萄糖固体培养基配制方法如下:去皮马铃薯200 g,白砂糖20.0 g,海盐35.0 g,水1 L;
(2)浸膏提取
将发酵液用与发酵液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏;将菌体沉淀用由甲醇和二氯甲烷等体积混合而成的混合液浸泡过液,然后抽滤,将滤过液减压浓缩得到浓缩液,将浓缩液用与浓缩液等体积的乙酸乙酯重复萃取3次,合并三次萃取所得萃取液,旋转蒸发至干后,获得粗浸膏,合并两次所得粗浸膏,得到总粗浸膏;
(3)化合物的分离制备
将总粗浸膏用体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂溶解后,加200~300目硅胶拌样进行VLC减压柱层析,采用体积比为(1:0)~(0:1)的石油醚-乙酸乙酯溶液为流动相进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到6个组分;将第3个组分进行LH-20凝胶柱层析,采用体积比为1:4的二氯甲烷-甲醇溶液为洗脱剂进行梯度洗脱,按序合并相似流分,得到5个组分;将收集的第3个组分采用半制备反相高效液相色谱对化合物进行分离纯化,洗脱剂为乙腈与水按体积比40:60的比例混合,流速为2.0 mL/min,得到氧杂蒽醌类化合物,其结构式如下所示:
4.根据权利要求3所述的一种海绵共附生真菌在制备氧杂蒽醌类化合物中的应用,其特征在于:步骤(3)中所述的石油醚-乙酸乙酯溶液的洗脱梯度体积比依次为1:0,10:1,5:1,2.5:1,1:1,0:1。
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