CN110590769B - 一对喹唑啉酮生物碱对映体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一对喹唑啉酮生物碱对映体及其制备方法和应用。所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU‑MS4829于2018年7月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60402，其可发酵产生结构如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示的化合物。本发明所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU‑MS4829自深圳大澳湾海鞘中分离得到，其可代谢产生具有抗炎活性的化合物喹唑啉酮生物碱对映体(±)‑penicamide A，其拆分后分得的光学纯化合物(+)‑penicamide A和(‑)‑penicamide A同样具有良好的抗炎效果，均能有效抑制LPS诱导的炎症细胞RAW264.7产生NO，其IC50分别为35.1μM、47.5和27.2μM；且同时所有化合物对RAW264.7细胞均无细胞毒；因此消旋体化合物(±)‑penicamide A，及光学纯化合物(+)‑penicamide A和(‑)‑penicamide A具有良好的作为抗炎药物潜力，可制备抗炎药物进行应用。
Figure DDA0002093692860000011

Description

一对喹唑啉酮生物碱对映体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵及药物化合物技术领域，更具体地，涉及一对喹唑啉酮生物碱对映体及其制备方法和应用。
背景技术
炎症，是机体对于刺激发生的生理和病理性反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。一般情况下，炎症作为有益的防御反应对机体抵抗外界刺激具有重要的作用，但是过度和持续的炎症反应则可造成机体组织的损伤和功能性的障碍。许多常见疾病 (例如：肿瘤、哮喘、高血压、阿尔兹海默病、动脉粥样硬化等)的发生和发展与炎症反应有着密切的关系。由革兰氏阴性菌细胞壁中内毒素成分脂多糖(LPS)所诱发的细菌感染性炎症是最为常见的炎症类型(例如：急性肺炎、肾盂肾炎、脑膜炎等)。
目前治疗炎症的药物可分为甾体类抗炎药和非甾体类抗炎药两大类。这些药物的使用会产生一些毒副作用和不良反应，如非甾体类抗炎药物的胃肠道不良反应，COX-2 抑制剂的心血管毒性。因此，对抗炎药物的研究与开发仍然是药学领域的热点问题，发现寻找高效、低毒、低成瘾性的新型抗炎药物具有重要的意义。
海洋天然产物具有结构新颖、活性显著的特点，而其中海洋微生物来源的天然产物可以利用现代微生物发酵工程技术进行再生产获得，具有不破坏生态平衡、易实现产业化等优势，从海洋微生物来源的天然产物中寻找新型抗炎药也是目前药物研究的重要方向之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一对喹唑啉酮生物碱对映体。本发明所述喹唑啉酮生物碱对映体具有良好的抗炎效果，可有效抑制LPS诱导的炎症细胞RAW264.7产生 NO，其IC50为35.1μM，且同时对RAW264.7细胞无细胞毒性，具有作为抗炎药物的良好潜力，可制备抗炎药物进行应用。
本发明的第二目的在于提供所述喹唑啉酮生物碱对映体的制备过程。
本发明的第三目的在于提供所述喹唑啉酮生物碱对映体的拆分方法。
本发明的第四目的在于提供所述喹唑啉酮生物碱对映体的应用。
本发明的第五目的在于提供海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829 在制备喹唑啉酮生物碱对映体中的应用。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种喹唑啉酮生物碱对映体，其结构如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示：
Figure BDA0002093692840000021
本发明同时还保护所述喹唑啉酮生物碱对映体的制备方法，过程为所述喹唑啉酮生物碱对映体分离自保藏编号为GDMCC 60402的海鞘共附生真菌Penicillium canescensSYSU-MS4829的菌体。
优选地，包括如下步骤：
S1.所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的扩大培养，并得到海鞘共附生真菌菌体；
S2.将海鞘共附生真菌菌体采用甲醇浸泡提取，得到浸膏，并将浸膏经硅胶柱层析进行梯度洗脱分离；洗脱液为乙酸乙酯体积比为10％～100％的乙酸乙酯-石油醚，并收集乙酸乙酯-石油醚体积比为60:40的洗脱液，浓缩得粗提物；
S3.将步骤S2得到的粗提物经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，洗脱液为体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷，洗脱液浓缩后即可得到粗目标产物；
S4.将步骤S3得到的粗目标产物再经硅胶柱层析洗脱，洗脱液为体积比为97:3 的CH2Cl2/MeOH，浓缩洗脱液后，即可得到目标产物。
优选地，步骤S1中所述海鞘共附生真菌的扩大培养的具体过程为：先将海鞘共附生真菌接入灭菌后的种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；然后再将种子培养液接种至灭菌后的发酵培养基中，于25℃静置培养28天。
优选地，所述种子培养基的原料为：马铃薯200份，葡萄糖20份，水1000份；所述发酵培养基的原料为：大米3000份，海盐90份，水3000份；所述种子培养基和发酵培养基均在121℃条件下保温30分钟进行灭菌处理；所述摇床培养的条件为：转速180rpm，温度28℃，培养时间120h。
优选地，步骤S2中，梯度洗脱分离过程中，洗脱液中乙酸乙酯的体积比分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和100％。
优选地，步骤S3中，洗脱液的收集量超过120mL，按照每20mL/组进行分组，并将收集到的第5组洗脱液进行浓缩，即可得到粗目标产物。
优选地，步骤S4中，洗脱液的收集量超过120mL，按照每20mL/组进行分组，并将收集到的第5组和6组洗脱液进行浓缩，即可得到目标产物。
所述喹唑啉酮生物碱对映体的拆分方法也在本发明的保护范围之类，具体的过程为：采用高效液相色谱分离技术，选择正相手性柱，流动相位体积比90:10的正己烷/ 异丙醇，流速为1mL/min，即可分离得到两组光学纯的(+)-penicamide A和 (-)-penicamide A。
优选地，所述正相手性柱为Ultimate Cellu-D column 4.6×250mm,5μm。
本发明还保护所述喹唑啉酮生物碱对映体在制备抗炎药物中的应用。
优选地，所述(+)-penicamide A和/或(-)-penicamide A在制备抗炎药物中的应用。
本发明还保护海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829在制备结构如式(Ⅰ)和/或式(Ⅱ)所示喹唑啉酮生物碱对映体中的应用。
优选地，所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829在制备喹唑啉酮生物碱对映体中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述喹唑啉酮生物碱对映体(±)-penicamide A分离自海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829中，其对映体(±)-penicamide A及其光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A均具有良好的抗炎效果，均能有效抑制LPS诱导的炎症细胞RAW264.7产生NO，其中消旋体化合物(±)-penicamide A的IC50为 35.1μM，而光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A.的IC50分别为47.5 和27.2μM；且同时所有化合物对RAW264.7细胞均无细胞毒性；因此消旋体化合物 (±)-penicamide A，及光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A具有良好的作为抗炎药物潜力，可制备抗炎药物进行应用。
所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829自深圳大澳湾海鞘中分离得到，其可代谢产生具有抗炎活性的化合物喹唑啉酮生物碱对映体(±)-penicamideA，可用于培养发酵制备化合物喹唑啉酮生物碱对映体(±)-penicamide A。
附图说明
图1为为(±)-penicamide A的X-ray单晶衍射图。
图2为(±)-penicamide A的单晶堆积图。
图3为光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A的实验和计算ECD谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的分离
1、菌株分离：
样品：深圳市大澳湾的邹瘤海鞘(Styela plicata)。
分离方法：通过对新鲜的邹瘤海鞘表面消毒，稍晾干后研磨，无菌条件下接种到PDA培养基、Martin培养基或查氏培养基，28℃以下培养5～7d，得到单菌株Penicilliumcanescens SYSU-MS4829；所得到的菌株Penicillium canescens SYSU-MS4829采用普通PDA培养基斜面4℃保藏。
实施例2海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的鉴定
1、形态和生理生化鉴定：
该菌株生物学特性，在PDA培养基上，28℃恒温培养时，菌落表面为白色毛状菌丝，背面为暗红色，有绿色孢子生成。
2、分子鉴定：
采用CTAB法提取海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的纯培养的DNA，采用ITS间隔区的一对引物ITS1F和ITS4通过PCR扩增仪扩增ITS-rRNA 基因片段，反应体系为50uL，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸1min，重复变性、退火和延伸三个步骤30个循环，最后72℃延伸补齐10min。
通过葡聚糖凝胶电泳检测确定目标片段在600bp左右，通过测序得出该菌株的ITS-rRNA基因片段序列，其序列如SEQ ID No.：1。然后，在GenBank上通过BLAST 在线比对搜索引擎对序列进行相似性分析，得到最大相似度为99％的菌株，确定该菌株为Penicillium canescens的真菌。
上述Penicillium canescens SYSU-MS4829菌体的分类学名称为Penicilliumcanescens，其保藏编号为GDMCC 60402，于2018年6月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，菌体于 2018年7月3日检测为存活状态，
实施例3喹唑啉酮生物碱对映体(±)-penicamide A的分离和鉴定
1、喹唑啉酮生物碱对映体(±)-penicamide A的分离，具体的过程如下：
S1.所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的扩大培养，并得到海鞘共附生真菌菌体；
具体的扩大培养过程为：
S11.配制种子培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1L，按照常规的方法制备成为培养基，平均分装于5个500mL锥形瓶，121℃灭30分钟；
S12.种子的培养：将海洋真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以180rpm的转速，培养120小时得种子培养液；
S13.配制发酵培养基：大米3000g，海盐90g，去离子水3L，按照常规的方法制备成为培养基，121℃灭30分钟；
S14.无菌操作将种子液5mL接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于25℃静置培养 28天，然后将发酵产物过滤，得到海鞘共附生真菌菌体；
S2.将海鞘共附生真菌菌体采用甲醇浸泡提取，得到浸膏，并将浸膏经硅胶柱层析进行梯度洗脱分离；洗脱液分别用乙酸乙酯体积比10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、100％的乙酸乙酯-石油醚，并收集60％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，浓缩得粗提物；
S3.将步骤S2得到的粗提物经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，洗脱液为体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷，并收集6瓶(20mL/瓶)甲醇-二氯甲烷(体积比为1:1)的洗脱液，浓缩第5瓶洗脱液得到粗目标产物；
S4.将步骤S3得到的粗目标产物再经硅胶柱层析洗脱，洗脱液为CH2Cl2/MeOH (体积比为97:3)，收集10瓶(20mL/瓶)洗脱液，浓缩5和6瓶的洗脱液后，即可得到目标产物。
白色粉末消旋体的喹唑啉酮生物碱(±)-penicamide A，再将目标产物通过溶剂挥发法获得消旋体的单晶。
对目标产物进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
Penicamide A(1):白色粉末；UV(MeOH)λmax(logε)225(4.12),266(3.78),349(3.23)nm；IR(neat)νmax:3234,2929,1658,1610,1488,1290,1150,1108,and 755cm-1；1H和13C NMR谱图数据,见表1；HR-ESI-MS 309.1227[M+H]+(calcd for 309.1233,C18H17N2O3).(+)-(1):[α]2D0+28.5(c 0.02,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε):209(-1.8), 228(+6.3),257(+5.6)nm.(-)-(1):[α]2D0-30.1(c 0.02,MeOH)；ECD(MeOH)λmax(Δε): 210(+1.0),227(-7.7),257(-6.1)nm.
目标产物(±)-penicamide A的NMR数据见表1，单晶数据见表2。
表1目标产物(±)-penicamide A的NMR数据(100MHz/400MHz，TMS，ppm)
Figure BDA0002093692840000061
表2目标产物(±)-penicamide A的单晶数据
Figure BDA0002093692840000062
Figure BDA0002093692840000071
目标产物(±)-penicamide A的单晶衍射图见图1和图2所示。从图1可知， (±)-penicamide A是由独特的6/6/6/6四环体系，构成4-喹唑啉酮并四氢异喹啉酮的骨架；图2的单晶堆积图可知，(±)-penicamide A的晶体中由对映体构成的。
2、(±)-penicamide A对映异构体的拆分
具体的拆分过程如下：采用高效液相色谱分离技术，选择正相手性柱(UltimateCellu-D column 4.6×250mm,5μm)，用90％的正己烷/异丙醇为流动相，流速1mL/min，保留时间28.7min和31.5min处出现一对等面积的对称峰，测定浓缩后的两组光学纯物质的旋光和ECD后，用量子化学方法计算理论ECD(如图3所示)，确定28.7min 和31.5min处分别获得光学纯光学纯的(+)-penicamide A和(-)-penicamide A，其结构如下所示：
Figure BDA0002093692840000081
实施例4活性试验
测试实施例3中制备的(±)-penicamide A、拆分后获得的光学纯的(+)-penicamide A 和(-)-penicamide A的抗炎活性实验，具体过程如下：
1.材料
1.1脂多糖(LPS)，吲哚美辛(Indomethacin),小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)，DMSO,四氮唑(MTT，5mg/mL)，NO试剂盒(碧云天公司)。
1.2 RAW264.7细胞的制备：
RAW264.7细胞的复苏与培养：
a.取出RAW264.7细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；
b.向RAW264.7细胞加入DMEM完全培养液至10mL，1000rmp离心5min，弃上清；
c.重复以上操作一次；
d.RAW264.7细胞以DMEM完全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％ CO2，37℃培养；
e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。
1.3细胞计数
a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，培养基终止，移入离心管中，加培养基至10mL；
b.取10μL细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘104，即为每毫升培养液所含细胞数；
c.调整细胞数至1×105/mL。
1.4化合物的配制：将(±)-penicamide A，光学纯的(+)-penicamide A和 (-)-penicamide A用DMSO溶解，调整初浓度为10Mm，之后通过稀释配置成相应浓度。
2.试验方法
a.96孔板各孔加入RAW264.7细胞，100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培养 12h。
b.将不同浓度受试对象加入到DMEM稀释成相应浓度(DMSO含量低于2％)，将培养了12h的细胞上清液小心吸去，加入100μL稀释好的药液，继续培养24h。
c.小心吸取50μL上清液到另一96孔板，分别加入NO I和NO II试剂；酶标仪Multiskan GO(Thermo Scientific)540nm下测定每孔OD值。
d.含细胞的96孔板用于MTT测试。小心吸去剩余的50μL培养液，加入100μL DMEM稀释10倍后的MTT溶液，放入培养箱中培养4h。
e.小心吸去上清液，加入110μL DMSO溶液，酶标仪Multiskan GO(ThermoScientific)490nm下测定每孔OD值。
f.计算抑制率：
NO抑制率％＝[1-加药组OD值/模型组OD值]×100％。
细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值－加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％。
3.试验结果
消旋体化合物(±)-penicamide A，及光学纯化合物(+)-penicamide A和 (-)-penicamide A均能有效抑制LPS诱导的炎症细胞RAW264.7产生NO，表明所有化合物均具有良好的抗炎效果。其中消旋体化合物(±)-penicamide A(1)的IC50为 35.1μM，而光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A.的IC50分别为 47.5μM和27.2μM。
在MTT测试显示，所有化合物对RAW264.7细胞均无细胞毒。因此消旋体化合物(±)-penicamide A(1)，及光学纯化合物(+)-penicamide A和(-)-penicamide A具有良好的作为抗炎药物潜力，其中光学纯(-)-penicamide A更具潜力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种喹唑啉酮生物碱对映体，其特征在于，其结构如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示：
Figure FDA0003081736420000011
2.权利要求1所述喹唑啉酮生物碱对映体的制备方法，其特征在于，所述喹唑啉酮生物碱对映体分离自保藏编号为GDMCC 60402的海鞘共附生真菌Penicillium canescensSYSU-MS4829的菌体；
包括如下步骤：
S1.所述海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829的扩大培养，并得到海鞘共附生真菌菌体；
S2.将海鞘共附生真菌菌体采用甲醇浸泡提取，得到浸膏，并将浸膏经硅胶柱层析进行梯度洗脱分离；洗脱液为乙酸乙酯体积比为10％～100％的乙酸乙酯-石油醚，并收集乙酸乙酯-石油醚体积比为60:40的洗脱液，浓缩得粗提物；
S3.将步骤S2得到的粗提物经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，洗脱液为体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷，洗脱液浓缩后即可得到粗目标产物；
S4.将步骤S3得到的粗目标产物再经硅胶柱层析洗脱，洗脱液为体积比为97:3的CH2Cl2/MeOH，浓缩洗脱液后，即可得到目标产物。
3.根据权利要求2所述喹唑啉酮生物碱对映体的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述海鞘共附生真菌的扩大培养的具体过程为：先将海鞘共附生真菌接入灭菌后的种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；然后再将种子培养液接种至灭菌后的发酵培养基中，于25℃静置培养28天。
4.根据权利要求2所述喹唑啉酮生物碱对映体的制备方法，其特征在于，所述种子培养基的原料为：马铃薯200份，葡萄糖20份，水1000份；所述发酵培养基的原料为：大米3000份，海盐90份，水3000份；所述种子培养基和发酵培养基均在121℃条件下保温30分钟进行灭菌处理；所述摇床培养的条件为：转速180rpm，温度28℃，培养时间120h。
5.权利要求1所述喹唑啉酮生物碱对映体的拆分方法，其特征在于，采用高效液相色谱分离技术，选择正相手性柱，流动相为体积比90:10的正己烷/异丙醇，流速为1mL/min，即可分离得到两组光学纯的(+)-penicamide A和(-)-penicamide A。
6.根据权利要求5所述喹唑啉酮生物碱对映体的拆分方法，其特征在于，所述正相手性柱为Ultimate Cellu-D column 4.6×250mm,5μm。
7.权利要求1所述喹唑啉酮生物碱对映体在制备抗炎药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述(+)-penicamide A和/或(-)-penicamide A在制备抗炎药物中的应用。
9.海鞘共附生真菌Penicillium canescens SYSU-MS4829在制备结构如式(Ⅰ)和/或式(Ⅱ)所示喹唑啉酮生物碱对映体中的应用 。
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