CN112538434B

CN112538434B - 海葵共附生真菌sysu-ms5127及其发酵化合物和应用

Info

Publication number: CN112538434B
Application number: CN202011346223.5A
Authority: CN
Inventors: 陈森华; 刘岚
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112538434A

Abstract

本发明属于真菌提取化合物技术领域，具体涉及海葵共附生真菌SYSU‑MS5127及其发酵化合物和应用。本发明一种海葵共附生真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌菌株SYSU‑MS5127可以代谢合成化合物Fusarielin M，并且经过实验验证，化合物Fusarielin M可以降低炎症巨噬细胞中的炎症因子NO、PGE 2的表达，具有显著的抗炎活性，并且实验证明其没有细胞毒性，安全性高，在制备开发抗炎类药物方面具有很好的应用前景。

Description

海葵共附生真菌SYSU-MS5127及其发酵化合物和应用

技术领域

本发明属于真菌提取化合物技术领域。更具体地，涉及海葵共附生真菌 SYSU-MS5127及其发酵化合物和应用。

背景技术

炎症是许多疾病的主要病理过程，是机体组织对各种损伤因子发生的防御为主的反应，主要是在血管、体液和细胞的参与下，机体组织局部出现一系列变化，包括有利于清除致炎因子的反应，也包括可以引起自身细胞、组织乃至器官的病变反应。如果炎症反应比较剧烈，致炎因子未能得到及时清除，受损组织或器官没有得到很好的修复，那么炎症反应的结果不但会严重地影响人们的正常的生活，甚至会对生命构成威胁，如心包炎引起的纤维粘连、胸膜炎引起的胸腔积液，类风湿性关节炎引起的关节畸形等都会对机体健康构成严重危害。其中由革兰氏阴性菌细胞壁中的内毒素成分脂多糖(LPS)所诱发的细菌感染性炎症是最为常见的炎症类型(例如：急性肺炎、肾盂肾炎、脑膜炎等)。

目前，临床常用的抗炎药有甾族和非甾族两类，如中国专利申请 CN106822151A公开了一种具有抗炎作用的甾体化合物，可以有效抑制炎症介质和细胞因子的产生还有蛋白的表达，能应用于制备具有抗炎作用的药物或制剂中；中国专利申请CN1535961A公开了一种非甾体抗炎化合物，其为COX－2 选择性抑制剂，具有良好的抗炎作用。但是，上述甾族和非甾族两类药物都有较强的副作用，例如，甾族药物长期使用可造成人体物质代谢和水钠代谢紊乱，其强大的抗炎作用会造成机体防御机能下降，甚至产生严重的并发症；而非甾族药物则有胃肠道副作用，长期服用可致胃溃疡。

因此寻找有效的、副作用小的、能够长期使用的抗炎药物具有重要的实际意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有甾族和非甾族类抗炎药存在较强副作用的缺陷和不足，提供一种海葵共附生真菌，由其可以制备得到有效的、副作用小的、能够长期使用的抗炎药物。

本发明的目的是提供一种海葵共附生真菌。

本发明另一目的是提供所述海葵共附生真菌在制备抗炎药物中的应用。

本发明另一目的是提供所述海葵共附生真菌在制备化合物Fusarielin M中的应用。

本发明另一目的是提供所述海葵共附生真菌制备化合物Fusarielin M的方法。

本发明另一目的是提供所述海葵共附生真菌制备得到的化合物Fusarielin M 在制备抗炎药物中的应用

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

发明人经过大量的探索和研究发现，海洋微生物拥有特殊的基因资源和特殊的代谢途径，能产生不同于陆地的、具有特殊新颖结构和生理活性的天然产物。本发明研究显示，海葵共附生真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌菌株SYSU-MS5127可以代谢合成化合物Fusarielin M，并且经过实验验证，化合物Fusarielin M可以降低炎症巨噬细胞中的炎症因子NO、PGE 2的表达，具有显著的抗炎活性，并且实验证明其没有细胞毒性，安全性高，在制备开发抗炎类药物方面具有很好的应用前景。另一方面，微生物还可以利用现代微生物发酵工程技术进行再生产、无原材料后顾之忧，同时有不会破坏生态平衡、易实现产业化等优势，是具开发前景的可再生性药物资源，为研究与开发海洋微生物制品和海洋微生物药物提供了丰富的原料。

因此，本发明要求保护一种海葵共附生真菌，所述海葵共附生真菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌菌株SYSU-MS5127，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年01月17日，保藏号：GDMCC NO：60964。保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

另外的，本发明还提供了所述海葵共附生真菌在制备抗炎药物中的应用。

另外的，本发明还提供了所述海葵共附生真菌在制备化合物Fusarielin M中的应用，所述化合物Fusarielin M具有以下结构式：

另外的，本发明还提供了所述海葵共附生真菌制备化合物Fusarielin M的方法，将海葵共附生真菌扩大培养得到菌体，菌体用甲醇浸泡后依次经硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析、硅胶柱层析、正相高效液相色谱仪纯化，即可制备得到化合物Fusarielin M；

所述化合物Fusarielin M具有以下结构式：

进一步地，所述海葵共附生真菌制备化合物Fusarielin M的方法包括以下步骤：

S1、海葵共附生真菌扩大培养，将扩大培养所得海葵共附生真菌菌体用甲醇浸泡，过滤、浓缩得到浸膏，浸膏用乙酸乙酯体积比为20～100％的乙酸乙酯-石油醚溶液经硅胶柱层析梯度洗脱分离，收集洗脱液，浓缩得粗提物；

S2、将步骤S1所得粗提物用体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷溶液经葡聚糖凝胶柱层析分离，收集洗脱液，浓缩得粗产物A；

S3、将步骤S2所得粗产物A用体积比99:1的二氯甲烷-甲醇溶液经硅胶柱层析纯化，收集洗脱液，浓缩得粗产物B；

S4、将步骤S3所得粗产物B用体积比90:10的正己烷-异丙醇溶液经正相高效液相色谱仪纯化，收集洗脱液，浓缩，即得。

进一步地，步骤S1中，所述梯度洗脱为依次用等体积的乙酸乙酯体积比为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的乙酸乙酯-石油醚溶液进行洗脱。

更进一步地，步骤S1中，所述收集洗脱液为乙酸乙酯体积比为30％的洗脱液。

进一步地，步骤S1中，所述海葵共附生真菌扩大培养具体包括以下步骤：

将海葵共附生真菌接入种子培养基中，接种量为5mL，28℃培养72h，得到种子培养液；将种子培养液接种至发酵培养基中，接种量为15mL，25℃培养28 天，即得。

更进一步地，所述种子培养基原料包括以下组分及其重量份数：马铃薯300 份、葡萄糖30份、水1500份。

进一步地，所述发酵培养基原料包括以下组分及其重量份数：大米6000份、海盐180份、水6000份。

优选地，步骤S2中，所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex LH-20。

优选地，步骤S4中，所述正相高效液相色谱仪为半制备型半制备型正相高效液相色谱仪。

优选地，步骤S4中，所述正相高效液相色谱仪的半制备柱为Ultimate SiO₂column 10×250mm,5μm。

优选地，步骤S4中，所述正相高效液相色谱仪的流速为1ml/min，按照双波长λ₁＝220nm，λ₂＝240nm作为检测指标。

另外的，本发明还提供了所述海葵共附生真菌制备得到的化合物Fusarielin M在制备抗炎药物中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明一种海葵共附生真菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌菌株SYSU-MS5127可以代谢合成化合物Fusarielin M，并且经过实验验证，化合物Fusarielin M可以降低炎症巨噬细胞中的炎症因子NO、PGE 2的表达，具有显著的抗炎活性，并且实验证明其没有细胞毒性，安全性高，在制备开发抗炎类药物方面具有很好的应用前景。

附图说明

图1为实施例4中不同浓度化合物Fusarielin M对炎症介质NO表达水平的影响统计图。

图2为实施例4中不同浓度化合物Fusarielin M对炎症介质PGE 2表达水平的影响统计图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

种子培养基：将马铃薯300g、葡萄糖30g和自来水1.5L按照常规的方法制备成为培养基，121℃灭30分钟，冷却备用。

发酵培养基：将大米6000g、海盐180g、去离子水6L按照常规的方法制备成为培养基，121℃灭30分钟，冷却备用。

除非特别说明，以下实施例所用其余试剂和材料均为市购。

实施例1海葵共附生真菌Fusarium graminearum SYSU-MS5127的分离

1、实验样品：深圳市赖氏洲的海葵。

2、实验方法：

对新鲜的海葵表面进行消毒，稍晾干后将海葵研磨，无菌条件下接种到PDA 培养基中，28℃以下培养5～7天，得到单菌株SYSU-MS5127；将得到的菌株 SYSU-MS5127采用PDA培养基斜面4℃保藏。

实施例2海葵共附生真菌SYSU-MS5127的鉴定

1、形态和生理生化鉴定：

实施例1所得菌株SYSU-MS5127在PDA培养基28℃恒温培养时，菌落表面为白色偏橘红色毛状菌丝，背面为暗红色，有橘红色孢子生成；其菌丝中心凸起形成菌核，团状向四边生长；生长初期为白色菌丝，越到后期菌丝颜色变深为橘红色，菌丝上附有粉色粉末状东西，平板较湿润。

2、分子鉴定：

采用CTAB法提取海葵共附生真菌SYSU-MS5127的纯培养的DNA，采用 ITS间隔区的一对引物ITS1F和ITS4通过PCR扩增仪扩增ITS-rRNA基因片段，反应体系为50μL，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸1min，重复变性、退火和延伸三个步骤30个循环，最后72℃延伸补齐10min；通过葡聚糖凝胶电泳检测确定目标片段在600bp左右，通过测序得出该菌株的ITS-rRNA基因片段序列。在GenBank上通过BLAST在线比对搜索引擎对序列进行相似性分析，得到最大相似度为99％的菌株，确定该菌株为Fusarium graminearum SYSU-MS5127的真菌。

实施例3化合物Fusarielin M的分离和鉴定

1、所述化合物Fusarielin M的分离具体包括以下步骤：

S1、海葵共附生真菌扩大培养：将海葵共附生真菌接入种子培养基中，接种量为5mL，28℃，180rpm摇床培养72h，得到种子培养液；将种子培养液接种至发酵培养基中，接种量为15ml，25℃静置培养28天，过滤，滤渣即为海葵共附生真菌菌体；

将扩大培养所得海葵共附生真菌菌体用甲醇浸泡，过滤、浓缩得到浸膏，浸膏依次用2L乙酸乙酯体积比为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、 100％的乙酸乙酯-石油醚溶液经硅胶柱层析梯度洗脱分离，收集30％乙酸乙酯- 石油醚洗脱液，浓缩得粗提物；

S2、将步骤S1所得粗提物用体积比为1:1的甲醇-二氯甲烷溶液经葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集20瓶(10mL/瓶)甲醇-二氯甲烷洗脱液，取第7～15瓶洗脱液浓缩，得粗产物A；

S3、将步骤S2所得粗产物A用体积比99:1的二氯甲烷-甲醇溶液经硅胶柱层析纯化，收集15瓶(10mL/瓶)甲醇-二氯甲烷洗脱液，取第5～10瓶洗脱液浓缩，得粗产物B；

S4、将步骤S3所得粗产物B用体积比90:10的正己烷-异丙醇溶液经半制备型正相高效液相色谱仪纯化，正相半制备柱为Ultimate SiO₂ column 10×250mm,5 μm流速为1ml/min，按照双波长λ₁＝220nm，λ₂＝240nm作为检测指标，按照每 17min/针开始收集，收集5min的洗脱液，浓缩，得淡黄色油状产物，干燥后得化合物Fusarielin M。

2、化合物Fusarielin M的鉴定

化合物Fusarielin M：为淡黄色油状物；UV(MeOH)λmax(logε)215，242nm； IR(neat)ν_max：3385，2961，2922，2856，2832，1706，1455，1378，1297，1259， 1047，1011，973，841和756cm^-1；¹H和¹³C NMR谱图数据参见表1；HR-ESI-MS 384.2595[M-H]^-(calcdfor384.2595 C₂₅H₃₆O₃).

表1化合物Fusarielin M的¹H和¹³C NMR数据(400MHz/100MHz，CDCl₃，ppm)

实施例4化合物Fusarielin M的抗炎活性测定

1、实验材料：

(1)小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的制备

RAW264.7细胞的复苏与培养：取出RAW264.7细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴箱中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入已装有4mL DMEM完全培养基的离心管中；于离心机中1000rmp离心3min，弃上清；重复以上操作一次后将RAW264.7细胞用DMEM完全培养液吹打，使细胞混匀后移入培养瓶中，在 5％CO₂，37℃，100％湿度下培养；观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。

(2)细胞计数

选取对数生长期细胞，弃去旧培养基，用预热好的PBS缓冲液洗涤两次，加入4mL新鲜培养基，用移液枪轻轻吹打贴壁的细胞，使其完全脱落，移入离心管中，1000rpm离心3min，弃上清；加入4mL新鲜培养基使细胞重新悬浮；取10μL细胞悬液滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘10⁴，即为每毫升培养液所含细胞数；调整细胞数至1×10⁵/mL。

(3)待测化合物Fusarielin M溶液

将化学纯的化合物Fusarielin M用DMSO溶解，调整初浓度为10Mm，通过稀释配置成1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM，备用。

2、实验方法：

96孔板各孔加入RAW264.7细胞100μL(1×10⁵/mL)，5％CO₂，37℃培养 12h；

将培养了12h的细胞上清液小心吸去，加入100μL不同浓度的待测化合物Fusarielin M溶液，预处理1h后，模型组和给药组再加入含LPS(终浓度为1 μg/mL)刺激细胞共同孵育24h，正常组不做处理继续培养24h；

小心吸取50μL上清液到另一96孔板，分别加入NO I和NO II试剂；酶标仪Multiskan GO(Thermo Scientific)540nm下测定每孔OD值；

含细胞的96孔板用于MTT测试：小心吸去剩余的50μL培养液，加入100 μL DMEM稀释10倍后的MTT溶液，放入培养箱中培养4h。

小心吸去上清液，加入110μL DMSO溶液，酶标仪Multiskan GO(ThermoScientific)490nm下测定每孔OD值。

计算抑制率：

NO抑制率％＝[1-加药组OD值/模型组OD值]×100％。

细胞杀伤率％＝[(对照组测定的平均OD值－加药组测定的平均OD值)/ 对照组测定的平均OD值]×100％。

3、实验结果：参见图1～2。

由图可见，与正常组的RAW 264.7巨噬细胞相比较，采用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞24h后的炎症模型，其NO和PGE2的分泌水平与正常组比较有明显提高，存在显著性差异(P＜0.05)。

使用不同浓度(1.56μM、3.12μM、6.25μM、12.5μM、25μM)新化合物Fusarielin M预处理RAW 264.7巨噬细胞，再与LPS(1μg/mL)共同培养，各实验组的所含炎症因子水平均有所下降，且随着实验浓度的增加而降低，与未经药物处理的模型组比较具有显著性差异(P＜0.001)，具有统计学意义；可以证明新化合物Fusarielin M能够降低炎症巨噬细胞中的炎症因子NO、PGE 2的表达水平。

在MTT测试中显示，该化合物对RAW264.7细胞无细胞毒，可见化合物 FusarielinM具有作为抗炎药物的潜力，具有较好的开发前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.海葵共附生真菌在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述海葵共附生真菌为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）真菌菌株SYSU-MS5127，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年01月17日，保藏号：GDMCC NO：60964。

2.海葵共附生真菌制备得到的化合物Fusarielin M在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，所述化合物Fusarielin M具有以下结构式：

；

所述海葵共附生真菌为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）真菌菌株SYSU-MS5127，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏日：2020年01月17日，保藏号：GDMCC NO：60964。