CN112159785B - 麦氏交替单胞菌e6及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了麦氏交替单胞菌E6及其应用。本发明所提供的麦氏交替单胞菌E6可用于提高翡翠贻贝幼体附着变态，进而提高该阶段的种苗成活率，其菌体以及固体发酵高盐溶液粗提物、液体发酵粗提物均可以显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。该益生菌可用于制备生物膜于常规的翡翠贻贝人工养殖设施上，如网箱、笼具、养殖池等。且该麦氏交替单胞菌E6可通过细菌发酵工程大量获取，且其诱导活性粗提物制备工艺流程短，操作简便，适合大规模生产，具有较高的开发潜力。

Description

麦氏交替单胞菌E6及其应用
技术领域
本发明涉及贻贝养殖技术领域，具体涉及用于贻贝养殖的微生物。
背景技术
翡翠贻贝(Perna viridis)是世界范围内常见的海洋双壳类，其软体部分具有较高的食用价值及药用价值，是我国东南沿海及印度、马来西亚、菲律宾等国家的重要海产品。据联合国粮农组织(FAO)统计(http://www.fao.org/fishery/species/2691/en)，1950～2016年间全球的翡翠贻贝产量野生海捕产量最高为1971年的165,500吨，而在出现这个峰值之后急剧下跌，到2016年仅有12,020吨。因其较高的商业价值，许多国家尝试进行了翡翠贻贝的人工规模化育种养殖，在2016年翡翠贻贝的世界养殖产量已达146,815吨。但是由于其幼体浮游阶段较长且浮游阶段末期附着变态率较低，翡翠贻贝幼体的培育成本较高。目前翡翠贻贝种苗还是以野生海捕为主要市场来源。因此开发提高翡翠贻贝幼体附着率和变态率的新方法，是翡翠贻贝人工养殖技术成功的关键。近年来，随着海洋环境逐年恶化，野生翡翠贻贝的渔获量逐年下降，为保证其正常供应，翡翠贻贝幼体的人工增殖技术成为了亟待开发的新技术。
在水产养殖技术中，益生菌的开发一直是重要的研发方向。目前已有许多益生菌用于饵料配制或水体处理中，以提高水产养殖生物的成活率和产量。然而诱导翡翠贻贝幼体附着变态的菌株至今没有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了麦氏交替单胞菌E6及其应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
麦氏交替单胞菌E6(Alteromonas macleodii E6)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2020年9月21日，保藏编号为CCTCC M2020529。
麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii E6)(以下简称麦氏交替单胞菌E6)具有以下生物学特征：
菌落形态：菌落呈半透明乳白色、菌落形状扁平、表面有褶皱、边缘呈齿状。
菌种鉴定：对该菌株的16S rRNA全长基因进行扩增，片段长度为1402bp，与已知麦氏交替单胞菌Alteromonas macleodii ATCC 27126(T)(Ezbiocloud数据库)的序列相似性为99.4％。此外基于31个管家基因(dnaG,frr,infC,nusA,pgk,pyrG,rplA,rplB,rplC,rplD,rplE,rplF,rplK,rplL,rplM,rplN,rplP,rplS,rplT,rpmA,rpoB,rpsB,rpsC,rpsE,rpsI,rpsJ,rpsK,rpsM,rpsS,smpB,tsf)与数据库中其他菌株进行比较，与已知麦氏交替单胞菌Alteromonas macleodii(NZ_CP012202.1)综合相似度高达99.3％。鉴定菌株E6为Alteromonas macleodii，即麦氏交替单胞菌，命名为麦氏交替单胞菌E6(Alteromonasmacleodii E6)。
本发明所涉及的菌株麦氏交替单胞菌E6，该菌株已于2020年9月15日在Genbank注册，登录号SUB8141247。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
麦氏交替单胞菌E6或其培养产物在贻贝水产养殖中的应用。
优选地，所述应用尤其包括翡翠贻贝人工苗种培育，麦氏交替单胞菌E6或其培养产物可以诱导翡翠贻贝幼体附着变态。
其中，所述培养产物包括麦氏交替单胞菌E6形成的菌膜(也称生物膜)、麦氏交替单胞菌E6的发酵提取物、所述发酵提取物分离得到的组分、所述发酵提取物中分离得到的诱导活性化合物对苯二甲酸二(2-乙基)己酯、环(脯氨酸-脯氨酸)或2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮(2-methyl-1,5-dioxacycloundecane-6,11-dione)中的至少一种。
进一步地，所述麦氏交替单胞菌E6形成的菌膜通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中培养，获得菌液；菌液通过血球计数板定量后以膜滤海水重悬，浸泡菌膜制备容器基底表面，静置培养，去除悬浮菌，获得菌膜。
具体地，包括：
1)种子培养：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；
2)扩大培养：挑取单菌落于液体培养基中于摇床培养，获得菌液；
3)在96孔板每孔中加入约200μL活化后的菌液，用酶标仪测量其OD600值并用血球计数板来计算细菌浓度，然后用灭菌膜滤海水(FSW)对菌株进行稀释，控制细菌浓度约为104cell/mL，以此来统一用于制备菌膜的初始细菌浓度；
4)步骤3)获得的稀释后菌液离心去上清，获得菌体后再用FSW重悬后，在菌膜制备容器中加入重悬菌液，静置培养后使容器表面形成菌膜，然后弃去上清液，用无菌海水清除悬浮细菌，获得菌膜。
其中，步骤4)中所述离心条件是在4000～8000rpm的条件下离心5～15min。
其中，步骤2)中细菌接种后摇床培养条件为：26～30℃、转速为120～180rpm，培养18～36h；步骤4)中菌膜形成条件是在26～30℃的条件下静置培养12～36h。
上述条件下制备的菌膜可显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。
进一步地，所述麦氏交替单胞菌E6的发酵提取物包括液体发酵粗提物或固体发酵粗提物中的至少一种，通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后扩大培养，获得发酵液；用乙酸乙酯萃取发酵液，浓缩，获得麦氏交替单胞菌E6的液体发酵粗提物；或者，将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后涂布于固体培养基上，培养后刮取菌体，加入高盐提取液混匀，去除不溶杂质，浓缩，获得麦氏交替单胞菌E6的固体发酵粗提物。
具体地，包括：
1)种子培养：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上，获得单菌落；
2)液体发酵粗提物提取：挑取单菌落后于液体培养基(即海水2216E培养基)活化培养，然后扩大培养体积于摇床培养，获得含有菌体的细菌液体发酵液；用乙酸乙酯萃取获得提取液，经减压浓缩后获得麦氏交替单胞菌E6的液体发酵粗提物；
3)固体发酵粗提物提取：挑取单菌落后于液体培养基活化培养，然后将菌液涂布于固体培养基上，培养后刮取菌体，然后加入高盐提取液振荡充分并超声处理，最后离心去除不溶杂质，合并上清液经旋转蒸发减压浓缩，获得麦氏交替单胞菌E6的固体发酵粗提物。
其中，步骤2)中所述摇床培养条件为120～180rpm、26～30℃的条件下培养1～5天。
其中，步骤2)中所述萃取方法为乙酸乙酯与菌液按照1:0.8～1.2的体积比萃取2～4次；所述减压浓缩方法可在30～40℃条件下进行。
其中，在步骤3)中所述在固体培养基上的培养条件为26～30℃条件下培养24～72h。
其中，在步骤3)中所述高盐提取液为1.4～1.6M NaCl溶液，用量为4～6倍固体发酵产物体积；发酵产物与高盐提取液混合后，超声清洗仪处理5～10min，然后以5000～8000rpm离心5～15min去除不溶杂质，提取方法重复2～4次；所述减压浓缩方法可在30～40℃下进行。
上述条件下制备的麦氏交替单胞菌E6的固体发酵粗提物及液体发酵粗提物均可显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。
进一步地，麦氏交替单胞菌E6的发酵提取物分离得到的组分包括石油醚相(PE)或二氯甲烷相(DCM)中的至少一种，通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后扩大培养，获得发酵液；用乙酸乙酯萃取发酵液，获得麦氏交替单胞菌E6的粗提物；所述粗提物溶于85～95％的甲醇后，用石油醚萃取获得石油醚相(PE)；石油醚萃取的剩余溶液浓缩后，用纯水：二氯甲烷＝1:0.8～1.2(v/v)萃取获得二氯甲烷相(DCM)。
进一步地，所述发酵提取物中分离得到的诱导活性化合物对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)、环(脯氨酸-脯氨酸)和2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后扩大培养，获得发酵液；用乙酸乙酯萃取发酵液，获得麦氏交替单胞菌E6的粗提物；所述粗提物溶于85～95％的甲醇后，用石油醚萃取，获得石油醚相，对石油醚相以丙酮与水进行重结晶后得到P1、P2和P3三个组分，对P2组分经过正相硅胶柱层析，得到化合物对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)；石油醚萃取后的剩余部分，用纯水：二氯甲烷＝1:0.8～1.2(v/v)萃取获得二氯甲烷相(DCM)；对二氯甲烷相进行正向硅胶柱层析，以二氯甲烷与甲醇进行梯度洗脱，得到D1～D15共15个组分；对D6组分进行RP-18中压反相硅胶柱层析，以水和甲醇进行梯度洗脱，得到D6-1～D6-10共10个组分；对D6-1组分进行制备薄层色谱纯化获得化合物环(脯氨酸-脯氨酸)，对D6-9组分以甲醇为洗脱剂经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析和正相硅胶柱纯化，得到化合物2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮。
具体地，所述麦氏交替单胞菌E6的所述发酵提取物分离得到的组分(包括石油醚相(PE)或二氯甲烷相(DCM))、所述发酵提取物中分离得到的诱导活性化合物2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮通过以下方法制备得到：
1)种子培养：将麦氏交替单胞菌接种于固体培养基上培养，获得单菌落；
2)扩大培养：挑取单菌落后于液体培养基活化培养，然后扩大培养体积于摇床培养，获得含有菌体的细菌液体发酵液；
所述步骤2)中，摇床培养条件为：26～30℃、转速为120～180rpm，培养18～36h。
3)发酵液粗提物制备：将步骤2)中扩大培养后的液体发酵液，直接用乙酸乙酯按照1:0.8～1.2的体积比萃取2～4次，萃取后的提取液经减压浓缩后获得麦氏交替单胞菌E6粗提物；
4)分相萃取：在步骤3)中得到的粗提物溶于85～95％的甲醇后，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水进行分相萃取，分别获得石油醚相(PE)和二氯甲烷相(DCM)具有较好的诱导活性。
5)石油醚相分离纯化：对于石油醚相，首先用常压重结晶的方法将该组分分成P1、P2和P3组分。然后对P2组分按照石油醚：丙酮(v/v)＝28～32:1、18～22:1、9～11:1、8～10:1、7～9:1、6～8:1、5～7:1、3～5:1、1～3:1、0.8～1.2:1和0:0.8～1.2的次序依次进行正向硅胶柱层析梯度洗脱，通过检测合并得到了P2-1～P2-7共7个组分，其中P2-2为对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)。
6)二氯甲烷相分离纯化：对于二氯甲烷相，采用正向硅胶柱层析的方式，按照二氯甲烷与甲醇的体积比28～32:1、18～22:1、9～11:1、4～6:1、1～3:1、0.8～1.2:1和100％甲醇的次序梯度洗脱，得到D1～D15共15个组分，其中D2、D5、D6、D7和D8具有较好的诱导活性。对D6组分进行RP-18中压反相硅胶柱层析，按照100％纯水至100％甲醇均匀梯度洗脱，得到D6-1～D6-10共10个组分。其中D6-6和D6-9有显著诱导活性，D6-1由制备TLC的方法得到一个纯化合物，经鉴定为环(脯氨酸-脯氨酸)；D6-9组分以甲醇为洗脱剂经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析和正相硅胶柱进一步纯化后，得到化合物2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮。
化合物DEHT、环(脯氨酸-脯氨酸)和2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮(125μM)对翡翠贻贝幼体附着有诱导活性。
进一步地，所述培养采用的固体培养基(即2216E固体培养基)配方为：每升海水添加4.8～5.2g蛋白胨、0.8～1.2g酵母浸出物、0.008～0.015g FePO4和15.0～20.0g琼脂。
进一步地，所述培养采用的液体培养基(即2216E液体培养基)配方为：每升海水添加4.8～5.2g蛋白胨、0.8～1.2g酵母浸出物和0.008～0.015g FePO4。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：
一种可以诱导翡翠贻贝幼体附着变态化合物，其为2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮，其结构式如下式所示：
Figure GDA0003618589900000061
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：
来源于麦氏交替单胞菌E6的培养产物的化合物在诱导翡翠贻贝幼体附着变态上的用途，所述化合物包括对苯二甲酸二(2-乙基)己酯或环(脯氨酸-脯氨酸)，所述用途进一步地可为在制备诱导翡翠贻贝幼体附着变态的诱导剂上的用途。其中：
所述对苯二甲酸二(2-乙基)己酯的结构式如下式所示：
Figure GDA0003618589900000071
所述环(脯氨酸-脯氨酸)的结构式如下式所示：
Figure GDA0003618589900000072
本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
本发明所述“大约”、“约”或“左右”等指的是所述范围或数值的±10％范围内。
本发明中，除有特别说明外，涉及溶液的％均为体积百分比。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1、本发明所提供的麦氏交替单胞菌E6可用于提高翡翠贻贝幼体附着变态，进而提高该阶段的种苗成活率，其菌体以及固体发酵高盐溶液粗提物、液体发酵粗提物均可以显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。该益生菌可用于制备生物膜于常规的翡翠贻贝人工养殖设施上，如网箱、笼具、养殖池等。
2、本发明所提供的麦氏交替单胞菌E6可通过细菌发酵工程大量获取，且其诱导活性粗提物制备工艺流程短，操作简便，适合大规模生产。此外，本发明还提供了该菌株产生的诱导活性化合物，可以通过生物工程的手段来大量制备或通过化学合成的方法来获取，具有较高的开发潜力。
附图说明
图1是根据麦氏交替单胞菌E6基因组中的管家基因与数据库中19株相似性最高的细菌构建的系统发育进化树。
图2用于说明麦氏交替单胞菌E6菌膜诱导翡翠贻贝幼体附着变态的活性，为诱导48h的结果。图中：纵轴为百分率；FSW为膜滤海水空白对照；BF-E6为麦氏交替单胞菌E6菌膜；settlement为附着；metamorphose为变态；mortality为死亡。
图3用于说明麦氏交替单胞菌E6发酵粗提物诱导翡翠贻贝幼体附着变态的活性，为诱导48h的结果。图中：纵轴为百分率；FSW为膜滤海水空白对照；E6-NaCl为E6菌株固体发酵物的1.5M NaCl溶液粗提物；E6-EAC为E6菌株液体发酵物的乙酸乙酯粗提物；settlement为附着；metamorphose为变态；mortality为死亡。
图4为麦氏交替单胞菌E6菌株发酵液中的翡翠贻贝诱导活性物质的分离纯化流程图。
图5用于说明麦氏交替单胞菌E6菌株发酵液中提取分离的化合物诱导翡翠贻贝幼体附着变态的活性，其中：A.对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)；B.环(脯氨酸-脯氨酸)；C.2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮。图中：FSW：膜滤海水空白对照；DMSO：0.5％二甲基亚砜溶剂对照组。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1麦氏交替单胞菌E6(Alteromonas macleodii E6)的分离鉴定
培养翡翠贻贝幼体至足面盘幼体阶段，在无菌6孔板中每孔加入10mL无菌海水以及30只左右发育状况良好的翡翠贻贝足面盘幼体，28℃避光培养48h，获得翡翠贻贝幼体浸泡液。取幼体浸泡液加入适量无菌海水梯度稀释，并均匀涂布于2216E固体培养基，28℃培养24h，根据不同菌落形态结构挑取单菌落，于2216E液体培养基中扩大培养，获得单菌株菌液。通过结晶紫染色法测定细菌成膜能力，对制备成膜能力较强的单菌株细菌生物膜筛选得到E6菌株。
通过测序，获得E6菌株的16S rRNA基因全长序列共1402bp，如SEQ ID No.1所示。所得序列经EzbioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)数据库16S-based ID比对后与菌株Alteromonas macleodii ATCC 27126(T)的相似度高达99.4％。此外基于E6菌株的基因组测序分析结果，其31个管家基因(dnaG,frr,infC,nusA,pgk,pyrG,rplA,rplB,rplC,rplD,rplE,rplF,rplK,rplL,rplM,rplN,rplP,rplS,rplT,rpmA,rpoB,rpsB,rpsC,rpsE,rpsI,rpsJ,rpsK,rpsM,rpsS,smpB,tsf)与数据库中已知麦氏交替单胞菌Alteromonasmacleodii(NZ_CP012202.1)综合相似度高达99.3％，基于这些管家基因构建系统发育树，结果如附图1所示，E6菌株与麦氏交替单胞菌聚为一支，结合以上结果，将E6菌株鉴定为麦氏交替单胞菌，并命名为麦氏交替单胞菌E6(Alteromonas macleodii E6)。
实施例2麦氏交替单胞菌E6菌膜及发酵粗提物诱导翡翠贻贝幼体附着变态的活性
菌膜诱导翡翠贻贝幼体附着变态的诱导活性检测实验在6孔板中进行，菌膜的具体制备方法如下：
1)首先按照0.1％的接种比例在超净台中接种30μL种子液于30mL 2216E液体培养基中，在50mL离心管中混合均匀，并在28℃、150rpm的条件下活化并培养24h。
2)在96孔板每孔中加入200μL活化后的菌液，用酶标仪测量其OD600值并用血球计数板来计算细菌浓度，然后用FSW(膜滤海水)对菌株进行稀释，控制细菌浓度约为104cell/mL，以此来统一用于制备菌膜的初始细菌浓度。
3)稀释后取30mL菌液，在6000rpm的条件下离心10min弃去上清液，再用30mL FSW重悬后，在6孔板中每孔加入5mL重悬菌液，在28℃的条件下静置培养24h，然后弃去上清液，用无菌海水清洗3次除去悬浮细菌，得到菌膜。
在含有菌膜的孔中加入30只左右的翡翠贻贝足面盘幼体，诱导活性如图2所示，48h可显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。
实施例3麦氏交替单胞菌发酵粗提物诱导翡翠贻贝幼体附着变态的活性
种子液制备：用移液枪吸取2mL菌液，接种于100mL海水2216E液体培养基中，在150rpm 28℃的条件下培养24h，获得种子液。
固体发酵粗提物制备方法：用移液枪取80μL种子液均匀涂布于无菌2216E固体培养基平板上，在28℃的条件下倒置于恒温培养箱中培养48h，每株菌涂布20个平板。经过培养得到的菌体及代谢产物用载玻片刮取至锥形瓶中得到约40mL发酵产物。得到的固体发酵产物分成各20mL分装到50mL离心管中，分别加入5倍体积的高盐溶液(1.5M NaCl高盐水溶液)，充分混匀并用超声清洗仪超声处理5min促进待测物质溶解，并用离心机6000rpm离心5min以去除可能混入的菌体及不溶杂质，重复三次后合并离心后的上清液，通过旋转蒸发获得高盐溶液粗提物。
液体发酵粗提物制备方法：接种5％的A.macleodii E6种子液至150mL无菌海水2216E培养基中，用锥形瓶在28℃，150rpm的条件培养下48h，将发酵得到的细菌发酵液采用乙酸乙酯按等体积比进行萃取，萃取3次后旋转蒸发得到液体发酵粗提物。
如图3所示，E6菌株的1.5M NaCl溶液粗提物(50μg/mL)及液体发酵乙酸乙酯粗提物(10μg/mL、50μg/mL)均可在48h显著诱导翡翠贻贝幼体附着变态。
实施例4麦氏交替单胞菌诱导活性物质提取
A.macleodii E6菌株发酵液以其对翡翠贻贝诱导活性为导向，分离纯化活性物质的流程如图4。
A.macleodii E6菌株75L发酵液经萃取后合并后最终共得到18.74g发酵液粗提物浸膏。粗提物浸膏用1L 90％甲醇水溶液溶解后，与1L石油醚(PE)在2L分液漏斗中充分摇匀后静置30min，收集上层石油醚相，如此萃取3次后，合并得到的石油醚相进行旋转蒸发浓缩，最后共得到9.69g石油醚相(PE)；剩余溶液旋蒸浓缩后，采用纯水(H2O)：二氯甲烷(DCM)＝1:1(v/v)2L体积萃取3次，旋蒸浓缩后得到4.29g二氯甲烷相(DCM)；剩余部分用等体积的乙酸乙酯(EA)萃取3次，旋蒸浓缩后得到0.54g乙酸乙酯相(EA)；最后剩余部分用正丁醇(BA)等体积萃取3次，分别旋蒸浓缩后得到1.03g正丁醇相(BA)，和2.54g水相组分(W)。经诱导活性检测后，石油醚相(PE)和二氯甲烷相(DCM)对翡翠贻贝幼体附着变态具有较显著的诱导活性，继续对这两个组分进一步的进行分离纯化。
对于石油醚相，首先用常压重结晶的方法利用不同成分的溶解度将其用少量石油醚和丙酮溶解，然后再贴壁缓缓加入等体积的纯水，静置于通风橱中，利用溶剂自然蒸发后化合物过饱和析出的先后顺序将该组分分成P1、P2和P3组分，分别得到0.5g、1.05g和7.56g。然后对P2组分以石油醚和丙酮配制洗脱剂，按照石油醚：丙酮(v/v)＝30:1、20:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、4:1、2:1、1:1和0:1的次序依次进行正向硅胶柱层析梯度洗脱，通过检测合并得到了P2-1～P2-7，共7个组分。其中P2-2、P2-5与P2-7对翡翠贻贝幼体附着变态具有显著诱导活性。其中P2-2纯度较高，命名为化合物1；而P2-5通过丙酮与乙醇常压重结晶的方法纯化后得到2.0mg纯度较高的晶体化合物，命名为化合物2。
对于二氯甲烷相，采用正向硅胶柱层析的方式，以二氯甲烷与甲醇配制洗脱剂，按照二氯甲烷与甲醇的体积比30:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1和100％甲醇的次序梯度洗脱，将分离得到的组分进行检测合并得到D1～D15共15个组分，其中D2、D5、D6、D7和D8具有较好的诱导活性，而组分D6的重量最高为998.1mg。对D6组分进行RP-18中压反相硅胶柱层析，以纯水和甲醇为洗脱剂，按照100％纯水至100％甲醇均匀梯度洗脱，得到D6-1～D6-10共10个组分。其中D6-6和D6-9有显著诱导活性，D6-1由制备TLC的方法得到一个纯化合物，命名为化合物3；D6-9组分(651.7mg)以甲醇为洗脱剂经Sephadex LH-20葡聚糖凝胶柱层析得到D6-9-1～D6-9-9共9个组分，其中D6-9-1经制备薄层层析法刮板得到2.0mg的一个纯化合物，命名为化合物4；D6-9-9经正相硅胶柱进一步纯化后，得到一个纯度较高的化合物，命名为化合物5。
经鉴定，化合物1为对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)、化合物2为2,2-双(二叔丁基苯酚)、化合物3为环(脯氨酸-脯氨酸)、化合物4为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、化合物5为2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮。
实施例5麦氏交替单胞菌E6来源化合物结构及其诱导活性
以活性为导向分离纯化得到的化合物中有3个对翡翠贻贝幼体具有诱导活性的化合物，其中化合物1为对苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHT)，在10μM和50μM的浓度下对翡翠贻贝幼体附着变态有诱导作用，化合物3环(脯氨酸-脯氨酸)在50μM的浓度下对翡翠贻贝幼体附着变态有诱导作用，化合物5为2-甲基-1,5-二氧杂环十一烷-6,11-二酮在125μM的浓度下对翡翠贻贝幼体附着变态有诱导作用。如图5。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门大学
<120> 麦氏交替单胞菌E6及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1402
<212> DNA
<213> 麦氏交替单胞菌(Alteromonas macleodii)
<400> 1
ggtaatcgtc ctcccgaagg ttagactaac tacttctttt gcatcccact cccatggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc agtattctga cctgcgatta 120
ctagcgattc cgacttcatg gagtcgagtt gcagactcca atccggacta cgacattctt 180
taaggggtcc gctccacatc actgtctcgc ttccctctgt aaatgccatt gtagcacgtg 240
tgtagcccta cacgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccggtttg 300
tcaccggcag tctccttaga gtgcccaact taaggctggc aactaaggac aagggttgcg 360
ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc 420
tgtgtctgag ttcccgaagg caccaaacta tctctagaaa cttctcagca tgtcaagtgt 480
aggtaaggtt cttcgcgttg catcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc atttgagttt taaccttgcg gccgtactcc ccaggcggtc tacttagcgc 600
gttagcttcg ctacgcacgc cttaaagaca cacacagcta gtagacagcg tttacggtgt 660
ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccacactt tcgcacatga gcgtcagtct 720
ttggccaggg agtcgccttc gccactgatg ttcctccaga tatctacgca tttcaccgct 780
acacctggaa ttccactccc ctctccaaga ctctagtctg ccagttctaa atgaccatcc 840
caggttgagc ccggggcttt cacatctagc ttaacaaacc gcctgcgtgc gctttacgcc 900
cagtaattcc gattaacgct cgcaccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag 960
ccggtgcttc ttctgttgtt aacgtcacgg ctagcaggta ttaactacta acttttcctc 1020
acaactgaaa gtgctttaca acccgaaggc cttcttcaca cacgcggcat ggctgcatca 1080
gggtttcccc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc tgggccgtgt 1140
ctcagtccca gtgtggctga tcttcctctc agaacagcta gagatcgtcg ccttggtaag 1200
ccgttacctt accaactagc taatctcact tgggcctctc tttgcgccgg agccgaagcc 1260
ccgtttggtc cgaagacatt atgcggtatt agcagtcgtt tccaactgtt atccccctcg 1320
caaaggcaag ttcccaagca ttactcaccc gtccgccact cgtcatcttc tagcaagctc 1380
gaaatgttac cgttcgactg ca 1402

Claims (7)

1.麦氏交替单胞菌E6(Alteromonas macleodii E6)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，保藏日期为2020年9月21日，保藏编号为CCTCCM2020529。
2.根据权利要求1所述的麦氏交替单胞菌E6或其培养产物在翡翠贻贝水产养殖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述培养产物包括麦氏交替单胞菌E6形成的菌膜、麦氏交替单胞菌E6的发酵提取物或所述发酵提取物分离得到的组分中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述麦氏交替单胞菌E6形成的菌膜通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中培养，获得菌液；菌液定量后以膜滤海水重悬，浸泡菌膜制备容器基底表面，静置培养，去除悬浮菌，获得菌膜。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述麦氏交替单胞菌E6的发酵提取物包括液体发酵粗提物或固体发酵粗提物中的至少一种，通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后扩大培养，获得发酵液；用乙酸乙酯萃取发酵液，浓缩，获得麦氏交替单胞菌E6的液体发酵粗提物；或者，将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后涂布于固体培养基上，培养后刮取菌体，加入高盐提取液混匀，去除不溶杂质，浓缩，获得麦氏交替单胞菌E6的固体发酵粗提物。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵提取物分离得到的组分包括石油醚相或二氯甲烷相中的至少一种，通过以下方法制备得到：将麦氏交替单胞菌E6接种于固体培养基上培养；挑取单菌落于液体培养基中活化培养，然后扩大培养，获得发酵液；用乙酸乙酯萃取发酵液，获得麦氏交替单胞菌E6的粗提物；所述粗提物溶于甲醇后，用石油醚萃取获得石油醚相；石油醚萃取后的剩余部分，用二氯甲烷萃取获得二氯甲烷相。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用包括翡翠贻贝人工苗种培育。
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