CN113444064B - 一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种式(Ⅰ)所示氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，本发明筛选的曲霉菌WHUF03110培养方便易存活，利用该曲霉菌WHUF03110发酵提取的化合物(I)，结构新颖，且对肿瘤细胞尤其是人红白血病K562细胞具有一定的抑制作用，IC50值为1.8±0.05μM，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗肿瘤药物创造条件。

Description

一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用。
(二)背景技术
海洋真菌是一类生活在海洋中的能形成孢子且有真核结构的微生物。大多数真菌栖于某种基物而生活，真菌在海洋中的分布主要取决于寄主的分布，在潮间带高潮线、河口、浅海沙滩、深海沉积物及众多海洋生物中均有分布。海洋真菌次级代谢产物具有结构丰富多样、生物活性谱广且强度高的特点，是海洋活性天然产物的重要来源。生物活性主要有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、酶抑制活性等。如现已广泛用于临床的抗生素头孢菌素C，是从海洋真菌中分离获得。
Tian等人曾报道1-Hydroxy-6-methyl-8-hydroxymethylxanthone为一氧杂蒽酮类化合物，分离自海洋海绵衍生的真菌Didymellaceae sp.SCSIO F46的发酵液中，该化合物对Hela细胞及HL7702细胞系表现出细胞毒性。从海洋微生物中获得具有酯基的氧杂蒽酮类化合物的文献报道较少。
本发明筛选得到一株菌株-海洋来源的曲霉菌WHUF03110，经发酵培养获得具有酯基的新氧杂蒽酮类化合物，迄今在国内外尚未见有与此雷同的化合物及活性的相关专利或文献报道。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种式(Ⅰ)所示具有酯基的新氧杂蒽酮化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用，该化合物利用曲霉菌WHUF03110发酵培养制备，具有较强的抑制人红白血病K562细胞活性，为治疗人红白血病提供了新的途径。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种式(Ⅰ)所示氧杂蒽酮类化合物：
Figure BDA0003107345400000011
第二方面，本发明提供了一种式(Ⅰ)所示氧杂蒽酮类化合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)发酵培养：曲霉菌(Aspergillus sp.)WHUF03110接种至大米培养基中，室温(25-30℃)静置发酵27-30天(优选30天)，得到发酵物；所述大米培养基是将大米与水以质量比1：1-10混合而成，优选1:1.5；所述大米可以是可食用稻米，优选东北大米；所述曲霉菌(Aspergillus sp.)WHUF03110保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2021年5月11日，保藏编号CCTCC NO：M2021515，地址中国武汉武汉大学，邮编430072；
(2)粗提物：将发酵物搅拌分散，加入等体积乙酸乙酯超声萃取，得到有机相，有机相减压浓缩至无液体流出，得到粗提物；
(3)分离提取：
a、粗提物采用正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比10:1、4:1、1:1石油醚-乙酸乙酯，体积比10:1二氯甲烷-甲醇，纯甲醇作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10-30mL/min，优选20mL/min，洗脱体积均为2-6个(优选5个)柱体积，每瓶接500mL流出液，经薄层层析(TLC，二氯甲烷-甲醇10:1，v/v)点板监测，合并Rf为0.7-1.0的流出液，记为组分A；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分B；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分C；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分E；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分F；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分G；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分H；
b、组分D再进行正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比15:1、8:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10-30mL/min，优选20mL/min，洗脱体积均为2-6个(优选5个)柱体积，每瓶接500mL流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇9:1，v/v)点板监测，合并Rf为0.7-1.0的流出液，记为组分D1；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分D2；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D3；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D4；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D5；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D6；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分D7；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分D8；
c、组分D2经正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比15:1、12:1、8:1、0:1石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为5-15mL/min，优选10mL/min，洗脱体积均为2-6个(优选5个)柱体积，每瓶接500mL流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇9:1，v/v)点板，合并Rf为0.6-1.0的流出液，记为组分D2-A；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D2-B；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D2-C；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D2-D；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D2-E；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-F；
d、D2-C经正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比9:1、8:1石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为5-15mL/min，优选10mL/min，洗脱体积均为2-6个(优选5个)柱体积，每瓶接100mL流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇8:1，v/v)点板，合并Rf为0.8-1.0的流出液，记为组分D2-C1；合并Rf为0.6-0.8的流出液，记为组分D2-C2；合并Rf为0.4-0.6的流出液，记为组分D2-C3；合并Rf为0.2-0.4的流出液，记为组分D2-C4；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-C5；
e、步骤d收集的D2-C1组分再经半制备型高效液相色谱分离，以体积比65：35的甲醇-水等度洗脱，收集18min处的馏分，浓缩蒸干，得到式(I)所示氧杂蒽酮类化合物。
进一步，步骤(1)中曲霉菌WHUF03110发酵前先进行活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至大米培养基中，所述活化和种子扩大培养为：将曲霉菌WHUF03110接种到平板培养基中，于28℃培养箱培养3-5d，优选3d天，至菌落长至成熟；取孢子接种于ISP4液体培养基中，于28-30℃、180-220rpm摇床振荡培养3-5d(优选28℃、200rpm、3d)，作为种子液；平板培养基终浓度组成为土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、溶剂为水，自然pH；ISP4液体培养基终浓度组成为：可溶性淀粉15g/L、葡萄糖5g/L、蛋白胨(肉胨)5g/L、酵母粉5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCO3 1g/L，溶剂为水，pH 7.2。
进一步，步骤(2)中，发酵物用玻璃棒搅拌分散；所述超声提取条件为70KHz频率常温15min，提取次数为1-3次。
进一步，步骤(3)的a到d中，硅胶柱色谱的硅胶均为青岛海洋化工硅胶，型号为200～300目，柱高均为30cm，内径均为3cm。
进一步，步骤(3)的e中半制备高效液相色谱条件为色谱柱型号为Agilent ZORBAXSB-C18(5μm，9.6×150mm)，高效液相色谱系统为Agilent 1260，检测波长为220nm、254nm，进样量为50μL，以体积比65：35的甲醇-水等度洗脱。
第三方面，本发明提供了式(I)所示氧杂蒽酮类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步，所述的抗肿瘤药物为抑制人红系白血病K562细胞增殖的药物。
第四方面，本发明还提供用于制备式(I)所示氧杂蒽酮类化合物的曲霉菌(Aspergillus sp.)WHUF03110，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2021年5月11日，保藏编号CCTCC NO：M2021515，地址中国武汉，武汉大学，邮编430072。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明筛选的曲霉菌WHUF03110培养方便易存活，利用该曲霉菌WHUF03110发酵提取的化合物(I)，结构新颖，且对肿瘤细胞尤其是人红白血病K562细胞具有一定的抑制作用，IC50值为1.8±0.05μM，其提取分离方法简易，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗肿瘤药物创造条件。
(四)附图说明
图1：式(I)化合物的制备流程。
图2：式(I)化合物的高分辨ESI质谱。
图3：式(I)化合物的氢谱。
图4：式(I)化合物的碳谱。
图5：式(I)化合物的HSQC谱。
图6：式(I)化合物的HMBC谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株WHUF03110的筛选及鉴定
1、菌株筛选
将2018年12月采集自中国海南三亚市亚龙湾的红树林土壤样品分别用无菌水逐级稀释为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同梯度，每个稀释度再进行下一步稀释前，涡旋震荡3-5分钟；将不同稀释梯度的样品分别用涂布棒均匀涂布在GPY培养基，放入30℃恒温培养箱倒置培养。每个样品设3个平行试验。随后的l至7天，观察并挑取不同类型的单菌落用于进一步划线分离，直到确定为纯单一菌落时，挑取单菌落至ISP4固体培养基斜面上，将分离得到的菌株进行生物活性筛选，生物活性模型包括抗菌活性和抗肿瘤活性，指示菌株为(屎肠球菌E.Faecium ATCC19434、枯草芽孢杆菌B.subtilis 168、金黄色葡萄球菌S.aureusATCC25923、粪肠杆菌E.faecalis FA2-2)，细胞系为(人红系白血病K562细胞、乳腺癌细胞MCF-7)，采用纸片法进行抗菌活性筛选，采用MTT法进行抗肿瘤筛选，筛选得到一株真菌发酵液具有很强的抗人红系白血病K562细胞活性，抑制率为78.3％，记为菌株WHUF03110，保存于-80℃冰箱。
GPY培养基组成：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，海盐15g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 7.5。
ISP4固体培养基组成：可溶性淀粉15g/L、葡萄糖5g/L、蛋白胨(肉胨)5g/L、酵母粉5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCO3 1g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 7.2。
2、菌株F03110鉴定
(1)菌落形态特征
将菌株WHUF03110接种至平板培养基中，于28℃培养箱培3天，至菌落长至成熟。菌落形态为菌落呈白色菌丝，绒状，菌落紧密，反面呈现浅黄色。平板培养基终浓度组成为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L、溶剂为水，自然pH。
(2)16S rDNA测定
基因组DNA的提取：在EP管中加入25mM NaOH水溶液50μL，再用接种环从步骤1长好单菌落的平板上挑取适量的孢子于200μL EP管中。于PCR仪中加热98℃10min。随后在离心机中8000rpm离心3s，取沉淀即为基因组DNA。
16S rDNA区域的扩增选择通用扩增引物为上游引物(F)ITS1和下游引物(R)ITS4。PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变形30s，50℃退火45s，72℃延伸100s，共35个循环，最后72℃延伸7min。PCR采用50μL的反应体系，包括ddH2O 19μL、DNA聚合酶MIX 25μL、上游引物(F)ITS1 2μL、下游引物(R)ITS4 2μL、模板DNA2μL。称取0.3g的琼脂糖加入到30mL PBE缓冲液(1包PBE(1包/L)加入到1L蒸馏水中)中，于微波加热(40s)使其完全溶解。然后，加入3μL染料(Gel Red)。倒入制胶板。待胶凝固后，将制好的胶倒入电泳槽，倒入电泳液没过胶，再加入PCR扩增产物与marker各5μL。电压150v，时间20min的条件下进行电泳分析结果。将含有目的DNA序列的菌液交由通用生物系统有限公司进行测序。获得16SrDNA(SEQ ID NO.1所示)。
基于ITS序列，与棘孢曲霉NRRL 5034(NCBI参考序列：NR_137489.1)有99.65％的相似性，菌株WHUF03110被鉴定为曲霉菌(Aspergillus neoglaber)，命名为曲霉菌(Aspergillus sp.)WHUF03110，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2021年5月11日，保藏编号CCTCC NO：M2021515。
16S rDNA(SEQ ID NO.1所示)序列：
AAAGTTTGGGGGCTTTCCTCCGGCTTTTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTAGAAATAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCGGGGGGAGGGGACGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTATGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCGAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCGGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTCCACCCTACGGGAAGCCTCCCCCCTCTG。
上游引物(F)ITS1序列：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
下游引物(R)ITS4序列：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
实施例2、式(I)化合物的制备
1、发酵培养
挑取保存在冻存管中的曲霉菌WHUF03110菌株，接种到平板培养基中，于28℃培养箱培3天，至菌落长至成熟。取孢子接种于ISP4液体培养基中，于28℃、200rpm摇床振荡培养4天，作为种子液。将种子液以体积浓度5％的接种量分别接入灭菌后的含有200g大米培养基的1L锥形瓶中，共计80瓶。室温静置培养30d，获得发酵物。
平板培养基终浓度组成为：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂18g/L、溶剂为水，自然pH。
ISP4液体培养基终浓度组成为：可溶性淀粉15g/L、葡萄糖5g/L、蛋白胨(肉胨)5g/L、酵母粉5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCO31g/L，溶剂为水，pH 7.2。
每200g大米培养基终浓度组成为：80g大米、120g水。
2、分离提取
(1)将每瓶发酵物用玻璃棒搅拌至大米分散，加入等体积乙酸乙酯，在70KHz条件下超声辅助萃取15min，重复三次。将80瓶发酵物中的乙酸乙酯层合并，减压浓缩至无液体流出，得到粗提物7.9g。
(2)7.9g粗提物用100mL乙酸乙酯溶解后，采用干法上样经硅胶柱色谱分离(硅胶选用200～300目，硅胶柱高30cm、内径3cm)，依次用体积比10:1、4:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯，体积比10:1的二氯甲烷-甲醇，纯甲醇作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为20mL/min，每个洗脱剂洗脱量均为5个柱体积，每500ml收集一瓶流出液，经薄层色谱法(TLC，二氯甲烷-甲醇9:1，v/v)点板监测，合并Rf为0.7-1.0的流出液，记为组分A；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分B；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分C；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分E；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分F；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分G；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分H；
(3)组分D再经正相硅胶柱色谱分离(硅胶选用200～300，硅胶柱高30cm、内径3cm)，依次用体积比15:1、8:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为20mL/min，每个浓度洗脱剂洗脱量均为5个柱体积，每500ml收集流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇9:1，v/v)点板监测，合并Rf为0.7-1的流出液，记为组分D1；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分D2；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D3；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D4；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D5；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D6；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分D7；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分D8；
(4)组分D2经正相硅胶柱色谱分离(硅胶选用200～300，硅胶柱高30cm、内径3cm)，依次用体积比15:1、12:1、8:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10mL/min，每个浓度洗脱量均为5个柱体积，每500ml收集流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇9:1，v/v)点板，合并Rf为0.6-1的流出液，记为组分D2-A；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D2-B；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D2-C；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D2-D；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D2-E；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-F；
(5)D2-C经正相硅胶柱色谱分离(硅胶选用200～300，硅胶柱高30cm、内径3cm)，依次用体积比9:1、8:1石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10mL/min，每个浓度洗脱量均为5个柱体积，每100ml收集流出液，经TLC(二氯甲烷-甲醇8:1，v/v)点板，合并Rf为0.8-1的流出液，记为组分D2-C1；合并Rf为0.6-0.8的流出液，记为组分D2-C2；合并Rf为0.4-0.6的流出液，记为组分D2-C3；合并Rf为0.2-0.4的流出液，记为组分D2-C4；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-C5；
(6)步骤(5)组分D2-C1再经半制备型高效液相色谱，色谱柱型号为Agilent ZORBAXSB-C18(5μm，9.6×150mm)，高效液相色谱系统为Agilent 1260，检测波长为220nm、254nm，进样量为50μL，以体积比65：35的甲醇-水等度洗脱，收集18min处的馏分，浓缩蒸干(40-60℃)，得到式(I)所示的具有酯基的新氧杂蒽酮类化合物(5mg)。
3、化合物结构鉴定
所得化合物利用高分辨质谱(HRESIMS)、核磁共振谱(1H NMR、13C NMR、2D NMR)进行结构鉴定，结果见图2-图6所示。
(1)HRESIMS
高分辨质谱(HRESIMS)检测条件：仪器型号：Agilent 6210TOF MS离子源参数ESI-：VCap:3000V Gas Temp:325℃Drying Gas:7L/min Nebulizer:45psig
化合物I为棕黄色粉末，HRESIMS(图2)给出准分子离子峰m/z：314.0861[M-H]-，确定化合物分子式为C17H14O6。
(2)1H NMR
1H NMR(CD3OD，600MHz)谱(图3)给出一个羟基质子信号δ12.28(s,1H)，三个苯环质子信号δ7.36(s,1H)，6.89(d,J＝8.5Hz,1H)，7.57(t,J＝8.3Hz,1H)，6.78(d,J＝8.2Hz,1H)，一个独立的烯氢质子信号7.36(s,1H)，三组甲氧基单峰信号δ4.06(s,3H)，3.86(s,3H)，2.46(s,3H)。
(3)13C NMR、2D NMR、HMBC
13C NMR(CD3OD，150MHz)谱(图4)并结合HSQC谱(图5)给出16个碳信号，包括两个羰基碳信号δ180.9、167.7，一组羟基取代苯环碳信号δ152.5、152.0、142.1、126.2、121.0、116.4，一组五取代苯环碳信号δ161.7、156.0、137.0、110.8、108.7、106.9，两个甲氧基碳信号δ62.6、53.2，一个甲基碳信号δ17.1。分析式I化合物的NMR谱图表明，除苯环、甲氧基和乙酯基外，式I化合物与已知化合物1-hydroxy-6-methyl-11-methoxy-8-hydroxymethylxanthone的氢谱和碳谱数据相似。在HMBC谱(图6)中，甲氧基质子信号δ3.86与C-11(δ167.7)存在相关，说明苯环上C-8位被取代的是甲酯基。将式I化合物的1H和13CNMR信号进行了归属(表1)。
通过上述解析，最终确定化合物结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003107345400000091
表1.式(I)化合物1H和13C NMR化学位移值(溶剂为CD3OD)
Figure BDA0003107345400000092
实施例3：式(I)化合物在体外对人红系白血病K562细胞、乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制实验：
1、MTT法：MTT全称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)，是一种黄色染料。在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原生成水不溶性蓝紫色结晶甲瓒(formazan)，而死细胞中无这种脱氢酶，因此不具备这种功能。在一定细胞数范围内，formazan结晶生成的量与活细胞数成正比，以酶联免疫检测仪在此570nm处测定该结晶DMSO溶液的光吸收值，可反映出活细胞数量。因此，可通过检测formazan结晶的量来评价药物对细胞增殖的影响。
2、各溶液的配制
细胞培养液：按标示量(Net wt 10.4g.pkg-1)向RPMI Medium 1640中加入双蒸水1L，在磁力搅拌器搅拌下使其完全溶解，后用高压灭菌后的蔡氏滤器经0.22μm滤膜除菌。保存滤液于事先高压灭菌的玻璃瓶中(每450ml滤液存入500ml瓶中)，以锡箔纸封口置于4℃冰箱中保存。在使用前加入胎牛血清FBS 50ml、质量浓度8％NaHCO3水溶液12ml摇匀即可。
PBS(Phosphate-Buffer Saline,pH＝7.2)溶液：NaCl 8g，KH2PO4 0.02g，Na2HP-O41.15 g，KCl 0.2g，溶于1L水中，后用0.22μm滤膜除菌，4℃冰箱中保存。
PI溶液：PI 5mg，Triton X-100 200mg和柠檬酸钠100mg溶于100ml水中，于4℃冰箱中避光保存。
0.5％MTT溶液:往50ml无菌PBS中加入250mg MTT粉，轻轻摇匀，使MTT粉充分溶解，后用直径为0.22μm微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置，4℃冰箱中临时保存。
测试样品溶液：准确称取一定量的化合物(I)样品，以DMSO为溶剂配制成浓度为50μg/mL溶液，测试时将该溶液按浓度梯度进行稀释，该部分样品需现用现配。
阳性对照溶液：精确称取顺铂适量用DMSO为溶剂配制成50μg/mL的溶液，待测试时稀释，该部分样品现用现配。
3、测试方法：
(1)人红系白血病K562细胞(购自上海极威生物科技有限公司)接种在细胞培养液中，37℃培养18-24h至对数生长期。取适量细胞，用PBS溶液配成细胞密度为2×105个/mL的细胞悬液，后以200μl每孔添加于96孔平底板中，置于37℃通入5％CO2的培养箱中培养4h。将96孔平底板分为样品孔和对照孔，每组设置3个平行，后于各孔加样品溶液或对照溶液各2μl，继续培养72h后向各孔加入10μl的0.5％MTT液，后继续培养4h，然后37℃、2000r/min离心8min，吸去上清。后各孔中加入100μlDMSO，于ZW-A微量振荡器振荡15min，使结晶完全溶解后，用酶标仪于570nm处测定各孔的OD值。取3孔平均OD值，按公式(1)计算出样品对细胞增殖抑制率，并采用bliss法计算出半数抑制率IC50。
同样条件下，用乳腺癌细胞MCF-7(购自上海极威生物科技有限公司)代替人红系白血病K562细胞进行实验。
肿瘤细胞生长抑制率＝(1-实验孔测定值/对照孔测定值)×100％公式(1)
式(I)化合物作为样品，粗筛时进行了2个浓度，50μg/mL和10μg/mL，每个浓度设3个平行，同样条件下以顺铂代替式(I)化合物作为阳性对照，结果显示式(I)化合物对人红系白血病K562细胞抑制率分别为98.2％和95.6％；对乳腺癌细胞MCF-7细胞抑制率分别为45.2％和21.8％。顺铂对人红白血病K562的细胞抑制率分别为96.5％和93.7％，对乳腺癌细胞MCF-7细胞抑制率分别为93.6％和91.8％。
(2)同步骤(1)方法，对人红系白血病K562细胞进行复筛，分别对式(I)化合物设定3个浓度梯度1μg/mL、2ug/mL、3ug/mL，每个浓度设3个平行，同样条件下以顺铂代替式(I)化合物作为阳性对照，通过MTT法测定并通过bliss法计算出各化合物的IC50值，结果如表2所示。
表2
Figure BDA0003107345400000111
体外实验结果表明式(I)化合物在体外对人红系白血病K562细胞有生长抑制作用，其IC50为1.8±0.05μM，有望开发其在制备人红系白血病K562细胞抑制剂中的用途。
序列表
<110> 浙江工业大学、武汉大学
<120> 一种氧杂蒽酮类化合物、菌株、制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 626
<212> DNA
<213> 曲霉菌(Aspergillus neoglaber)
<400> 1
aaagtttggg ggctttcctc cggctttttg atatgcttaa gttcagcggg tatccctacc 60
tgatccgagg tcaaccttag aaataaagtt gggtgtcggc tggcgccggc cgggcctaca 120
gagcgggtga caaagcccca tacgctcgag gaccggacgc ggtgccgccg ctgcctttcg 180
ggcccgtccc cggggggagg ggacggggcc caacacacaa gccgtgcttg agggcagcaa 240
tgacgctcgg acaggcatgc cccccggaat accagggggc gcaatgtgcg ttcaaagact 300
cgatgattca ctgaattctg caattcacat tacttatcgc atttcgctgc gttcttcatc 360
gatgccggaa ccaagagatc cgttgttgaa agttttaact gattatgata atcaactcag 420
actgcatact ttcagaacag cgttcatgtt ggggtcttcg gcgggcgcgg gcccgggggc 480
gcgaggcctc cccggcggcc gtcgaaacgg cgggcccgcc gaagcaacaa ggtacgatag 540
acacgggtgg gaggttggac ccggagggcc ctcactcggt aatgatcctt ccgcaggtcc 600
accctacggg aagcctcccc cctctg 626

Claims (5)

1.一种式(Ⅰ)所示氧杂蒽酮类化合物的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)发酵培养：曲霉菌(Aspergillus sp.)WHUF03110接种至大米培养基中，室温静置发酵27-30天，得到发酵物；所述大米培养基是将大米与水以质量比1：1-10混合而成；所述曲霉菌WHUF03110保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2021年5月11日，保藏编号CCTCCNO：M2021515，地址中国武汉，武汉大学，邮编430072；
(2)粗提物：将发酵物搅拌分散，加入等体积乙酸乙酯超声萃取，得到有机相，有机相减压浓缩至无液体流出，得到粗提物；
(3)分离提取：
a、粗提物采用正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比10:1、4:1、1:1石油醚-乙酸乙酯，体积比10:1二氯甲烷-甲醇，纯甲醇作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10-30mL/min，洗脱体积均为2-6个柱体积，每瓶接500mL流出液，以体积比9:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，经薄层层析点板监测，合并Rf为0.7-1.0的流出液，记为组分A；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分B；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分C；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分E；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分F；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分G；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分H；
b、组分D再进行正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比15:1、8:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为10-30mL/min，洗脱体积均为2-6个柱体积，每瓶接500mL流出液，以体积比9:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，经薄层层析点板监测，合并Rf为0.7-1.0的流出液，记为组分D1；合并Rf为0.6-0.7的流出液，记为组分D2；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D3；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D4；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D5；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D6；合并Rf为0.1-0.2的流出液，记为组分D7；合并Rf为0-0.1的流出液，记为组分D8；
c、组分D2经正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比15:1、12:1、8:1、0:1石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为5-15mL/min，洗脱体积均为2-6个柱体积，每瓶接500mL流出液，以体积比9:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，经薄层层析点板监测，合并Rf为0.6-1.0的流出液，记为组分D2-A；合并Rf为0.5-0.6的流出液，记为组分D2-B；合并Rf为0.4-0.5的流出液，记为组分D2-C；合并Rf为0.3-0.4的流出液，记为组分D2-D；合并Rf为0.2-0.3的流出液，记为组分D2-E；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-F；
d、D2-C经正相硅胶柱色谱分离，依次用体积比9:1、8:1石油醚-乙酸乙酯作为洗脱剂进行洗脱，洗脱速度均为5-15mL/min，洗脱体积均为2-6个柱体积，每瓶接100mL流出液，以体积比9:1的二氯甲烷-甲醇为展开剂，经薄层层析点板监测，合并Rf为0.8-1.0的流出液，记为组分D2-C1；合并Rf为0.6-0.8的流出液，记为组分D2-C2；合并Rf为0.4-0.6的流出液，记为组分D2-C3；合并Rf为0.2-0.4的流出液，记为组分D2-C4；合并Rf为0-0.2的流出液，记为组分D2-C5；
e、步骤d收集的D2-C1组分再经半制备型高效液相色谱分离，以体积比65：35的甲醇-水等度洗脱，收集18min处的馏分，浓缩蒸干，得到式(I)所示氧杂蒽酮类化合物；
Figure FDA0003608081770000021
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中曲霉菌WHUF03110发酵前先进行活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度5％的接种量接种至大米培养基中，所述活化和种子扩大培养为：将曲霉菌WHUF03110接种到平板培养基中，于28℃培养箱培养3-5d，至菌落长至成熟；取孢子接种于ISP4液体培养基中，于28-30℃、180-220rpm摇床振荡培养3-5d，作为种子液；平板培养基终浓度组成为土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15～20g/L、溶剂为水，自然pH；ISP4液体培养基终浓度组成为：可溶性淀粉15g/L、葡萄糖5g/L、蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、NaCl 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、CaCO31g/L，溶剂为水，pH 7.2。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述超声萃取条件为70KHz频率常温15min，提取次数为1-3次。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)的a到d中，硅胶柱色谱的硅胶均200～300目，柱高均为30cm，内径均为3cm。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)的e中半制备型高效液相色谱条件为：色谱柱型号Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，9.6×150mm，高效液相色谱系统为Agilent1260，检测波长为220nm、254nm，进样量为50μL。
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