CN110526858B - 细胞松弛素类化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物及其天然产物的应用技术领域，具体涉及一种细胞松弛素类化合物、其制备方法及应用。本发明通过利用马德里毛壳菌为原料进行细胞松弛素类化合物的制备，所采用的方法具有选择性高、环境友好等特点，得到的粗提物浸膏的产率高，且提取方法简单、成本低，制备的细胞松弛素类化合物的纯度可达99.8%，所述细胞松弛素类化合物在制备抗人肝癌HepG2、人非小细胞肺癌A549肿瘤药剂中具有较佳的应用效果，同时还能够诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，具有良好的应用前景。

Description

细胞松弛素类化合物、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于微生物及其天然产物的应用技术领域，具体涉及一种细胞松弛素类化合物、其制备方法及应用。
背景技术
根据世界卫生组织的最新实况报道，肿瘤即癌症是世界第二大死因，恶性肿瘤是威胁人类健康的常见病和多发病，2018年全球新发恶性肿瘤病例约为1800万例，死亡病例高达960万例。
微生物代谢产物由于化学结构多样、活性广泛的等特点，并且在细胞内能与多种特异性靶点相互作用，是发现靶向特定药物或药物先导化合物的重要来源之一。通过挖掘天然产物有效成分或者对其部分结构进行修饰，以寻找疗效更好、更适用的抗肿瘤药物的研发工作具有重大意义。
细胞松弛素是一类具有显著生物学功能的真菌多聚氨基酸杂合次级代谢产物，同时也是一种具有高度取代的异吲哚酮衍生物。其典型的结构特点具有一个三环骨架结构，其中一个大环骈和在异吲哚酮骨架上，根据骈和在聚酮骨架上氨基酸的类型不同，以及大环的类型、碳原子数、大环上取代基的不同决定了细胞松弛素的种类的丰富和结构的多样。研究发现，该类化合物具有广泛的抗肿瘤、抗菌、抗病毒等生物活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用马德里毛壳菌制备细胞松弛素类化合物的方法。
本发明还进一步提供了所述细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药剂中的应用。
为实现上述目的，本发明所用的菌种为分离自新疆和田市地区的荒漠土壤中一株菌，其保藏的分类学名称为马德里毛壳菌Chaetomium madrasense CLC375，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2019年7月3日，保藏号为:CCTCC M2019517。
本发明从马德里毛壳菌中分离提取得到次级代谢产物-细胞松弛素类化合物，其结构式如下：
Figure GDA0002215808100000021
所述细胞松弛素类化合物通过以下步骤制得：
(1)菌种活化：将马德里毛壳菌接种到SDAY平板培养基上，25～30℃下培养5d～7d，得到活化菌种；
(2)发酵培养：将步骤(1)中得到的活化菌种接种到大米固体培养基中，25℃静置培养28d，得发酵物；
(3)乙酸乙酯浸提：将步骤(2)得到的发酵物用乙酸乙酯浸提，浸提液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物浸膏；
(4)粗提物柱层析分离：将步骤(3)得到的粗提物浸膏以二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:1、50:1、10:1、1:1进行梯度洗脱，经薄层层析检测，得到6个流份，并编号为Fr.1-Fr.6，再利用硅胶柱层析法或葡聚糖凝胶柱层析分离得到粗产物，并利用半制备反相高效液相法进行纯化，得到所述细胞松弛素类化合物。
具体的，步骤(2)中所述大米培养基的制备：取50-70g大米，100mL水，在121℃高压灭菌25-30min。
具体的，步骤(3)中所述乙酸乙酯浸提的过程如下：将步骤(2)得到的发酵物中加入300mL乙酸乙酯，使用玻璃棒将发酵物搅拌成颗粒状，使溶剂与发酵物充分接触，放置12～16h过滤，三次浸提后，合并三次的浸提液，将浸提液减压浓缩得粗提物浸膏。
具体的，步骤(4)中流份Fr.4经过正相硅胶柱层析(以体积比为50:1-10:1的石油醚：丙酮为洗脱剂)得到8个组分(Fr.4.1-Fr.4.8)；其中Fr.4.6又经正相硅胶柱层析(以体积比为50:1-10:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂)得到7个组(Fr.4.6.1-Fr.4.6.7)；将得到的组分Fr.4.6.3使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱得到产物，最后再使用半制备反相高效液相法进行纯化，得到化合物1，命名为Chaetomadrasin A。
进一步优选的，所述化合物1半制备反相高效液相纯化方法为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(50:50)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为33.9min。
具体的，步骤(4)中Fr.6使用ODS反相硅胶柱层析(以体积比为20％-100％的甲醇和水进行梯度洗脱)，得到5个组分Fr.6.1-Fr.6.5；将得到的流份Fr.6.2使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱得到产物，最后再使用半制备反相高效液相发进行纯化，得到化合物2，命名为Chaetomadrasin B。
进一步优选的，所述化合物2半制备反相高效液相纯化方法为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(30:70)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为30.7min。
上述细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药剂中的应用。
具体的，所述肿瘤是指人肝癌HepG2或人非小细胞肺癌A549，所述细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药剂的同时，还能够诱导人非小细胞肺癌细胞凋亡。
本发明产生的有益效果是：
本发明以马德里毛壳菌为原料进行细胞松弛素类化合物的制备，所采用的方法具有选择性高、环境友好等特点，得到的粗提物浸膏的产率高，且提取方法简单、成本低，制备的细胞松弛素类化合物的纯度可达99.8％，所述细胞松弛素类化合物在制备抗肿瘤药剂方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的化合物1(Chaetomadrasin A)的实验ECD和计算ECD对比图；
图2为实施例1制备的化合物2(Chaetomadrasin B)的实验ECD和计算ECD对比图；
图3为实施例1制备的化合物1(Chaetomadrasin A)的诱导细胞凋亡图；
图4为MTT法检测RAW264.7细胞的活力图；
图5为一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞释放的NO含量图；
图6为所述马德里毛壳菌Chaetomium madrasense的菌落形态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中的所用马德里毛壳菌分离自新疆和田地区的荒漠土壤中，其保藏的分类学名称为马德里毛壳菌Chaetomium madrasense CLC375，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2019年7月3日，保藏号为:CCTCC M 2019517。
具体的分离筛选方法如下：采用稀释平板法：取约1g已风干的土样与10mL灭菌的0.1％灭菌琼脂水中，震荡5min后，静止，取上部无杂质的悬浮液依次稀释10倍、100倍后，各取适量涂布于含有30μg/mL链霉素的马丁培养基(蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g,琼脂20g，蒸馏水1000mL 1％虎红钠盐母液3mL)平板上，室温下倒置培养，待长出菌落后(3～5d)，挑取可能的子囊菌单菌落于PDA培养基平板上培养，至子实体形成后，镜检挑取所需菌株，将获得的菌株接种于玉米粉培养基(CMA：玉米粉30g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL)平板中，平板表面可加入适量灭过菌的麦秸和滤纸条，室温下培养，定期观察，并按照各形态学研究性状指标(培养形状、子囊果形态结构，附属丝形态结构、子囊形态结构、子囊孢子形态结构，芽孔的有无及着生位置)逐项进行观察、测量和记录。
形态特征：在CMA培养基上无气生菌丝或部分区域有稀疏浅黄色气生菌丝；无有色渗出物，子囊果表生，反射光下初期为橄绿色，孢子角形成后为黑色，卵形、椭球形或近椭球形，具孔口，直径约149-198μm，高约198-273μm，子囊果壁由褐色的交错丝组织构成；顶生附属丝波浪状弯曲或稍螺旋状卷曲，浅褐色，具不明显的分隔，表面具密集疣状突，近基部宽2—3.5μm；子囊棍棒状，具柄，68-90×11-16μm，内生8个子囊孢子，子囊壁易消解；子囊孢子柠檬形，两侧扁，一侧常有一凸起，成熟时橄褐色或褐色，内有数个油滴，9-11.5(-14)×7.5-9(-10)×6-7.5μm，具单个顶生芽孔。菌落形态如图6所示。
生理生化鉴定：采用拟糊精状反应：将未成熟的子囊孢子加入Melzer's reagent梅尔策试剂中，子囊孢子由无色或浅色变为黄褐或红褐色。
该菌的18sDNA序列如序列表所示：
GTATAGACCTACCTGATCCGAGGTCACCTGGTTAAGATTGATGGTGTTCGCCGGCGGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCGGGTGACGAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGCCCCCCGGAAGCGGGGGGCGAGAGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTTAGTCAAGTACTCAGACTGCAATCTTCAGACAAGAGTTCGTTTGTGTGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGGATGCCCCCCGGCGGCCGTGAGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAAACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTT。
实施例1
所述细胞松弛素类化合物通过以下步骤制得：
(1)菌种活化：将马德里毛壳菌(Chaetomium madrasense)接种到SDAY平板培养基上，30℃下培养5d，得到活化菌种；
(2)发酵培养：将步骤(1)中得到的活化菌种接种到大米固体培养基(60g大米，100mL水，121℃高压灭菌30min)中，25℃静置培养28d得发酵物；
(3)乙酸乙酯浸提：将步骤(2)得到的发酵物中加入300mL乙酸乙酯，使用玻璃棒将发酵物搅拌成颗粒状，使乙酸乙酯溶剂与发酵物充分接触，放置12h后过滤，重复以上浸提方法三次后，合并三次的浸提液，浸提液减压浓缩并回收乙酸乙酯，得粗提物浸膏200g；
(4)粗提物柱层析分离：将步骤(3)得到的粗提物浸膏以二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:1、50:1、10:1、1:1进行梯度洗脱，经薄层层析检测，得到6个流份，并编号为Fr.1-Fr.6。
其中流份Fr.4再经过正相硅胶柱层析(以体积比为50:1-10:1的石油醚：丙酮为洗脱剂)得到8个组分(Fr.4.1-Fr.4.8)。
其中Fr.4.5经葡聚糖凝胶柱层析Sephadex LH-20得到5个组分(Fr.4.5.1-Fr.4.5.5)；将得到的组分Fr.4.5.3利用半制备反相高效液相法进行纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(50:50)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为15.02min；纯化后得到39.5mg化合物6(纯度99.8％)，命名为Chaetoglobosin Vb。
将得到的Fr.4.6再次经正相硅胶柱层析，以体积比为50:1-10:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂得到7个组分(Fr.4.6.1-Fr.4.6.7)；将得到的组分Fr.4.6.2使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱，再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(50:50)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为23.62min；纯化后得到16.5mg化合物3(纯度99.8％)，命名为Chaetoglobosin G。
将得到的组分Fr.4.6.3使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱，再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(50:50)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为22.9min，33.9min；纯化后分别得到4.5mg化合物4(纯度99.8％)，命名为Isochaetoglobosin D和8.6mg化合物1(纯度99.8％)，命名为Chaetomadrasin A。
将得到的组分Fr.4.6.4经过葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱得到，最后再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(45:55)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为27.80min；纯化后得到2.0mg化合物7(纯度99.8％)，命名为Cytoglobosin A。
将得到的流份Fr.5使用正相硅胶柱层析，以体积比为10:1的二氯甲烷：甲醇为洗脱剂进行等度洗脱，然后使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱，再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(35:65)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为37.50min；纯化后得到1.6mg化合物8(纯度99.8％)，命名为Cytoglobosin Ab。
将得到的流份Fr.6使用ODS反相硅胶柱层析，以体积比为20％-100％的甲醇和水进行梯度洗脱，得到5个组分Fr.6.1-Fr.6.5。
将得到的Fr.6.1使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱，再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(45:55)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为27.02min；纯化后得到3.5mg化合物5(纯度99.8％)，命名为Armochaetoglobin U。
将得到的Fr.6.2使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱，再使用半制备反相高效液相纯化，具体步骤为：选用YMC(10mm×250mm，5μm)为色谱柱，流动相为乙腈：水体积比(30:70)，流速为2mL/min检测波长为220,254保留时间为30.7min；纯化后得到5.2mg化合物2(纯度99.8％)，命名为Chaetomadrasin B。
所述化合物1-8的结构式如下：
Figure GDA0002215808100000071
本发明还对其中两个具有较高抗肿瘤活性的化合物1(Chaetomadrasin A)和化合物2(Chaetomadrasin B)的结构进行了鉴定：
化合物1:白色粉末；比旋光度[α]25 D＝-8.5(c 0.2,MeOH)；紫外光谱(MeOH)λmax(logε)253(0.83),221(2.82),216(2.81)nm；红外光谱(KBr)υmax 3370,2926,1714,1458,746cm-1；电子圆二色谱(MeOH)λmax(Δε/M-1cm-1)＝298(-1.2),267(+0.8),243(-0.6),207(+4.1)nm；核磁共振氢谱、碳谱见表1；高分辨质谱m/z 551.2518[M+Na]+(计算值C32H36N2O5,551.2522[M+Na]+)，其绝对构型是通过比较实验ECD与计算ECD曲线确定的如图1所示。
化合物2:白色粉末；比旋光度[α]25 D＝-12.5(c 0.2,MeOH)；紫外光谱(MeOH)λmax(logε)254(2.68),229(3.22),213(3.08)nm；红外光谱(KBr)υmax 3392,3261,2956,1701,1647,1470cm-1；电子圆二色谱(MeOH)λmax(Δε)＝305(+2.0),271(-9.2),244(-16.3),212(38.3)nm；核磁共振氢谱、碳谱见表1；高分辨质谱m/z 561.2590[M+H]+(计算值C32H36N2O7,561.2523[M+H]+)其绝对构型是通过比较实验ECD与计算ECD曲线确定的如图2所示。
化合物1(Chaetomadrasin A)和化合物2(Chaetomadrasin B)的氢谱、碳谱数据如下表1所示。
表1.化合物1和化合物2氢谱、碳谱数据。
Figure GDA0002215808100000081
Figure GDA0002215808100000091
aMeasured in CDCl3.bMeasured in DMSO-d6.
实施例2化合物1-8对人癌细胞株的抑制作用
采用MTT比色法进行抗肿瘤活性评价：
分别选取对数生长期的人非小细胞肺癌细胞A549、人体肝癌细胞HepG2分别铺于96孔板(3×105/cm2)，待其贴壁后，分别加入0-20μM化合物样品或阳性对照(顺铂)处理细胞48小时，同时设置溶剂空白对照组。48小时后，每孔加入10μl MTT溶液(浓度为5μg/mL)后继续培养4小时，然后小心弃去培养液，每孔加100μL DMSO，震荡10min以充分溶解甲瓒结晶。然后以630nm为参考波长，使用酶标仪测定570nm处的吸光值(OD)，并使用Reed&Muench法计算半数抑制浓度(Median Inhibition Concentration，IC50)，其中，细胞存活率(％)＝(OD570-OD630)样品/(OD570-OD630)对照。
所有统计数据都x±SD的形式表示，至少进行3次重复独立实验。运用GraphPrism5.0处理数据，均值的显著性差异用one-way ANOVA Newman-keuls检验。
结果显示化合物1-8对人非小细胞肺癌A549细胞、人体肝癌细胞HepG2均具有一定的抑制活性。
表2.化合物1-8对2株肿瘤细胞系细胞毒活性(IC50,μM)。
化合物 A549 HepG2
1 3.79±0.80 8.67±0.61
2 4.65±0.55 19.40±1.32
3 8.26±1.06 ＞20
4 10.25±1.68 6.25±0.21
5 7.33±2.23 5.32±0.56
6 ＞20 15.29±2.65
7 6.35±0.94 12.35±1.78
8 12.54±0.85 8.23±0.15
顺铂 2.48±0.74 3.14±0.06
实施例3化合物1(Chaetomadrasin A)对人非小细胞肺癌A549细胞的诱导凋亡作用
使用Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒检测肿瘤细胞凋亡率，采用流式细胞仪分析进行检测。
结果如图3所示，化合物1(Chaetomadrasin A)可以诱导A549细胞凋亡，并呈剂量正相关，在20μM时，凋亡率为11.27。
实施例4体外抗炎实验：LPS(脂多糖)诱导巨噬细胞模型的建立
1.MTT法检测RAW264.7细胞的活力
原理：MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
实验方法：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板中(1×104个/孔)，在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，将化合物样品分别从200-25μmol/L等梯度稀释4个浓度，空白对照组给予DMEM培养基，每个浓度组设6个复孔。然后在培养箱内孵育24小时后，每孔加入10μL MTT溶液，继续孵育4小时，用移液枪吸弃上清，再加入DMSO溶液进行溶解，避光反应数分钟后，设定酶标仪波长为490nm，测定其吸光度值。
试验结果：
如图4所示，当化合物6(Chaetoglobosin Vb，简称Cha Vb)浓度达到200μmol/L时，对RAW264.7细胞产生了细胞毒性，细胞活力明显下降。因此，选用25-100μmol/L作为化合物6的实验剂量组。
2.一氧化氮试剂盒检测RAW264.7细胞释放的NO含量(硝酸还原酶法)
原理：NO化学性质活泼，在体内代谢很快转化为NO2-和NO3-，本法利用硝酸还原酶特异性将NO3-还原为NO2-，通过显色深浅测定其浓度的高低。
实验方法：将对数生长期的RAW264.7细胞接种于24孔板中(1×105个/孔)，在培养箱中孵育24小时，移液枪吸弃上清，分别加入25、50、100μmol/L的化合物样品溶液，空白对照组给予DMEM培养基，药物预处理1h后，给予1μg/mL LPS，空白组除外，每组设4个复孔。培养箱内孵育24小时后，收集培养液上清，按照试剂盒说明书中下列公式计算NO含量。
试验结果：
如图5所示，正常细胞中NO含量较低，但经LPS刺激后其含量明显增加。与LPS组相比，化合物6(Cha Vb)各剂量均明显降低了LPS诱导的RAW264.7细胞内NO含量(P＜0.001)。下表3显示了化合物6(Cha Vb)抗炎测试结果中NO释放量抑制率，从表3中可以看出，化合物6对NO抑制效果明显，随着化合物浓度的增加化合物6对NO的抑制效果逐渐增加，说明化合物6具有较好的抗炎效果。
表3.化合物6(Cha Vb)抗炎测试结果。
组别 NO释放量(μmol/L) NO释放量抑制率(％)
0 59.2
LPS 146.1
化合物6(25μM)+LPS 113.7 22
化合物6(50μM)+LPS 110.6 24
化合物6(100μM)+LPS 86.2 41
进一步的，发明人又按照上述硝酸还原酶法对化合物6(Cha Vb)和化合物3(ChaG)的抗炎性能做了比较。结果显示随着化合浓度的增加，化合物对NO的抑制率在逐步增加，同等浓度条件下，化合物6对NO释放量抑制率比化合物3高出13％至30％，表明化合物6具有更好应用价值。
上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所作的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 黄河科技学院
<120> 细胞松弛素类化合物、其制备方法及应用
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 539
<212> DNA
<213> Chaetomium madrasense
<400> 1
gtatagacct acctgatccg aggtcacctg gttaagattg atggtgttcg ccggcgggcg 60
ccggccgggc ctacagagcg ggtgacgaag ccccatacgc tcgaggaccg gacgcggtgc 120
cgccgctgcc tttcgggccc gccccccgga agcggggggc gagagcccaa cacacaagcc 180
gtgcttgagg gcagcaatga cgctcggaca ggcatgcccc ccggaatacc agggggcgca 240
atgtgcgttc aaagactcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300
tcgctgcgtt cttcatcgat gccggaacca agagatccgt tgttgaaagt tttaactgat 360
ttagtcaagt actcagactg caatcttcag acaagagttc gtttgtgtgt cttcggcggg 420
cgcgggcccg ggggcggatg ccccccggcg gccgtgaggc gggcccgccg aagcaacaag 480
gtacgataaa cacgggtggg aggttggacc cagagggccc tcactcggta atgatcctt 539

Claims (2)

1.一种利用马德里毛壳菌制备细胞松弛素类化合物的方法，其特征在于，所述细胞松弛素类化合物结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
；
所述细胞松弛素类化合物用于制备抗肿瘤药剂，所述肿瘤为人肝癌细胞HepG2；
所述方法包括以下步骤：
（1）菌种活化：将马德里毛壳菌接种到SDAY平板培养基上，25~30℃下培养5d~7d，得到活化菌种；
（2）发酵培养：将步骤（1）中得到的活化菌种接种到大米固体培养基中，25~30℃静置培养24~28d，得发酵物；
（3）乙酸乙酯浸提：将步骤（2）得到的发酵物用乙酸乙酯浸提，浸提液浓缩得粗提物浸膏；
（4）粗提物柱层析分离：将步骤（3）得到的粗提物浸膏以二氯甲烷：甲醇体积比分别为100:1、50:1、10:1、1:1进行梯度洗脱，经薄层层析检测，得到6个流份，并编号为Fr.1 -Fr.6，再利用硅胶柱层析法或葡聚糖凝胶柱层析分离得到粗产物，并利用半制备反相高效液相法进行纯化，得到所述细胞松弛素类化合物；
所述马德里毛壳菌保藏的分类学名称为马德里毛壳菌Chaetomium madrasenseCLC375，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2019年7月3日，保藏号为：CCTCC M 2019517；
步骤（3）中所述乙酸乙酯浸提的过程如下：将步骤（2）得到的发酵物中加入300mL乙酸乙酯，搅拌，放置12~16h后过滤，重复以上浸提方法三次后，合并三次的浸提液，将浸提液减压浓缩得粗提物浸膏；
步骤（4）中Fr. 6使用ODS反相硅胶柱层析，得到5个组分Fr. 6.1 - Fr. 6.5；将得到的流份Fr.6.2使用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇为溶剂进行洗脱得到产物，最后再使用半制备反相高效液相法进行纯化，得到化合物2；
所述化合物2半制备反相高效液相纯化方法为：选用YMC为色谱柱，色谱柱规格为10 mm× 250 mm，5 μm；流动相为乙腈和水，乙腈与水的体积比为30:70；流速为2mL/min；检测波长为220, 254；保留时间为 30.7 min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述大米培养基的制备：取50-70g大米，100m L水，在121℃高压灭菌25-30min。
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