WO2007105264A1 - 新規ホスホリパーゼｃ - Google Patents

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WO2007105264A1
WO2007105264A1 PCT/JP2006/304710 JP2006304710W WO2007105264A1 WO 2007105264 A1 WO2007105264 A1 WO 2007105264A1 JP 2006304710 W JP2006304710 W JP 2006304710W WO 2007105264 A1 WO2007105264 A1 WO 2007105264A1
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phospholipase
activity
strain
aspergillus
protein
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PCT/JP2006/304710
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Inventor
Eiko Nagasaki
Tetsuya Fukazawa
Yasunori Ono
Original Assignee
Mitsubishi-Kagaku Foods Corporation
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae

Definitions

  • the present invention relates to a phospholipase, a filamentous fungus that produces the phospholipase C, a method for separating and purifying the phospholipase C from a culture of the fungus, a DNA encoding the phospholipase C, and a method for producing the phospholipase C. Etc.
  • the present invention relates to a phospholipase particularly suitable for use in the food and pharmaceutical industries, in particular the fungus Aspergillus oryzae, or the phospholipase produced by Aspergill us tamarii,
  • the present invention relates to a filamentous fungus producing the phospholipase C, the ability to culture the filamentous fungus, a method of separating and purifying the phospholipase C, a DNA encoding the phospholipase C, a method of producing the phospholipase C, and the like.
  • phospholipase C Traditionally, it is known that animals and microorganisms produce phospholipase C.
  • the animal-derived enzyme is mainly phosphatidylinositol-selective phospholipase c.
  • phospholipase C derived from bacteria, actinomycetes, yeasts and molds is known. Most phospholipases C produced by bacteria, actinomycetes and yeasts are phosphatidyl inositol selective or phosphatidyl choline selective.
  • Examples of phospholipase C derived from bacteria include, for example, Syudu Monas' Surkyllensis.
  • Patent Document 1 JP 50-1017183 A
  • Bullholderia pseudomallei for example, Non-Patent Document 1: Korbsrisate S. et. Al.
  • Bacillus cereus for example, Non-Patent Document 2: Tan C. et. Al., “Protein Expression and Purification” (Protein Expression and Purification) 1997, 10 ⁇ , p. 365-372
  • Staphylococcus' Sauphylo coccus aureus eg, Non-Patent Document 3: Daugherty S.
  • Non-Patent Document 4 Tateval et al. ( Titball R. et. Al.) “Infection and Immunity” (1989, 57 ⁇ , p.367-376) etc. are known.
  • phospholipase C derived from actinomycetes
  • phospholipase C produced by Streptomyces hachijyoensis see, for example, Patent Document 2: Japanese Patent Laid-Open No. 49 55893 is known. .
  • Examples of phospholipase C derived from yeast include, for example, Candida a lbicans (for example, Non-Patent Document 5: Andaluz E. et. Al. “Yeast” 2 001, 18 ⁇ , P.711-721), Saccharomyces cere visiae (eg, Non-Patent Document 6: Payne W. et. Al. “Molecular ⁇ ⁇ and 'Serula ⁇ ⁇ ⁇ Biology ”(Molecular and Cellular Biology) 1993, 13 ⁇ , p.4351- 4364) etc. is known.
  • Candida a lbicans for example, Non-Patent Document 5: Andaluz E. et. Al. “Yeast” 2 001, 18 ⁇ , P.711-721
  • Saccharomyces cere visiae eg, Non-Patent Document 6: Payne W. et. Al. “Molecular ⁇ ⁇ and 'Serula ⁇ ⁇ ⁇ Biology
  • Lecithin is a typical glyceport phospholipid widely distributed in animals, plants and fungi.
  • Glyce mouth phospholipids are compounds in which a phosphoryl base is covalently bonded to position 3 of 1,2 diacylglycerol.
  • Bases include choline, ethanolamine, serine, inositol, glycerol, and the like, and the composition ratio varies depending on the origin.
  • Lecithin is used as a concept contained in glyceport phospholipids.
  • Lecithin has a surface active action, an antioxidant action, a physiologically active action, and the like, and is used in foods, feeds, pharmaceuticals, and the like.
  • egg yolk lecithin and soy lecithin Natural lecithins such as those are used as food additives and are mainly used as emulsifiers, etc. to modify the properties of foods and are supplied in abundance.
  • Phospholipase A selectively hydrolyzes the 1st or 2nd fatty acid of glyceport phospholipids.
  • Non-selective hydrolysis is phospholipase, hydrolyzing to diacylglycerol and phosphoryl base is phospholipase, and phospholipase D is degrading to phosphatidic acid and base.
  • phospholipase A In the field of the food industry, phospholipase A is currently most frequently used. The ability of lecithin to be sparingly soluble in water When phospholipase A is allowed to act on lecithin, the acyl group is partially hydrolyzed to produce water-soluble lysolecithin. When lysolecithin is used as a food additive, the physical properties of the obtained food may be different from those of foods that have been obtained using lecithin.
  • Sphingophospholipids constitute phospholipids together with glyceguchi phospholipids.
  • a typical example of sphingophospholipids is sphingomyelin, which is a mixture of ceramide primary alcohol with phosphoric acid linked to phosphoric acid diester. It is widely contained in animal organs. Since it is also contained in breast milk, it may be blended into infant formula.
  • Ceramide is widely used in cosmetics as a moisturizing ingredient. There is also a report that atopic dermatitis is caused by a lack of ceramide.
  • diacylglycerol can be produced from lecithin in the presence of water as shown in the figure below. ——
  • R and R are each an alkyl group, R is choline, ethanolamine, dari
  • the phospholipase C used here is required to hydrolyze various glyceport phospholipids.
  • soybean lecithin mainly contains phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine, and phosphatidylglycerol or phosphatidylinositol.
  • Egg yolk-derived lecithin mainly contains phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. Therefore, it is desirable that the phospholipase C used is hydrolyzed without discrimination.
  • phospholipase C which does not hydrolyze phospholipids other than phospholipids, is desirable, for example, phospholipase C, which is similar to phospholipids but does not contain a lipid moiety, such as glycerin phosphorylcholine. Is desired.
  • the phospholipase C used is preferably a protein having no phosphatase activity. That is, para-trophe, which is a substrate for phosphatase
  • -Phospholipase C is preferred, which does not have ruphosphate-degrading activity.
  • an enzyme agent containing phospholipase or the like which is preferably subjected to various treatments in a weakly acidic range with a neutral force to prevent the alteration of food, has high activity in this pH range. It is hoped that
  • phospholipase C Use of phospholipase C in the food industry
  • Applications of phospholipase c include, for example, aging that occurs on the surface of frozen frozen dough for baking, mitigating pear skin, and improving edible oil purification processes.
  • Lecithin is a substance that should be removed because soybean rapeseed isotope also causes coloring or deterioration of the taste when producing edible oil.
  • a method has been studied in which lecithin is partially hydrolyzed using phospholipase A to make it soluble in water by using lysolecithin.
  • Phospholipase C used here is required to hydrolyze various phospholipids.
  • soybean oil contains the various phospholipids described above.
  • various phospholipids are contained in cottonseed oil or rapeseed oil.
  • Phospholipase C used is desired to hydrolyze these without distinction U ,.
  • Phospholipase c produced by animals, bacteria, actinomycetes or yeast is mainly selective for phosphatidylinositol or phosphatidylcholine and is not suitable for use in the food industry where various substrates need to be degraded. Furthermore, there are countries and regions where animal-derived enzyme preparations are not accepted religiously, and there is a problem with their versatility. In addition, most of the bacteria that produce phospholipase c are pathogenic and have safety issues.
  • the conventionally known filamentous fungus-derived phospholipase C has a property of hydrolyzing various phospholipids.
  • any filamentous fungus conventionally used for the production of phospholipase C has a characteristic of producing edible enzymes.
  • Aspergillus The temperature and pH properties of the enzymes from both strains of Spergillus and Cytoi are very similar and have the same molecular weight. Each of them has a strong activity on the acidic side, but has a feature that there is no activity at all in the vicinity of neutrality. Therefore, in the refinery industry where these enzymes may be used on the acidic side, these enzymes may be usable.
  • phospholipase C produced by Aspergillus gar has a very high degradation activity of phosphatidic acid, which is a phosphatase substrate (see Patent Document 3). Therefore, since the enzyme has the ability to hydrolyze phosphate monoesters, it is presumed that it is a protein that also has phosphatase activity. It is described that phospholipase C produced by Sarakuko and Aspergillus cytoii has a very high degradation activity of 2-hexadecanylamino 4-trophenylphosphorylcholine (see Non-Patent Document 7). Therefore, it is inferred that the enzyme is a protein that also has the ability to hydrolyze phosphodiesters other than phospholipids. Therefore, food processed using these enzymes may be unnecessarily modified.
  • phospholipase C which has been known in the past, has problems such as insufficient strength or safety as an enzyme characteristic, and is distributed as phospholipase C to the market. So, there is no enzyme agent to date. Desirably, the properties of the enzyme agent are derived from microorganisms that have already produced food enzyme products, and have the ability to efficiently hydrolyze various phospholipids on the acidic side and in the vicinity of neutrality. In other words, it is active in a citrate buffer solution and is thermally stable to some extent. Furthermore, phospholipase C having a property that does not hydrolyze phosphate esters other than phospholipids as typified by glycerin phosphorylcholine.
  • desirable phospholipase C properties include various phospholipids on the acidic side. However, it has the ability to efficiently hydrolyze even in the vicinity of neutrality, has activity in citrate buffer so that it can be used in the oil industry, and is thermally stable to some extent. Furthermore, it can be mentioned that it is a phospholipase c having a property of not hydrolyzing a phosphate ester other than phospholipid, as represented by glyce mouth phosphorylcholine.
  • it is a phospholipase C derived from a microorganism that has already produced a food enzyme preparation.
  • the present inventors are excellent in safety, have the ability to efficiently hydrolyze various phospholipids on the acidic side or near neutrality, have activity in citrate buffer, and are thermally stable to some extent.
  • phospholipase C that does not hydrolyze phosphates other than phospholipids
  • phospholipase derived from Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC 4190 strain, or Aspergillus tamari IAM 13907 strain C was purified and the phospholipase C gene derived from Aspergillus oryzae NBRC 4190 strain was cloned to complete the present invention.
  • the present invention relates to (1) a phospholipase that exhibits activity at an acidic to neutral pH and does not substantially hydrolyze phosphate esters other than phospholipids.
  • the phospholipase according to (6) produced by Aspergillus oryzae or Aspergillus tamarii (8)
  • the host lipase according to (7) produced by Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC 4190 strain, or Aspergillus tamari IAM 13907 strain.
  • Temperature stability is stable at a temperature of 45 ° C or lower at pH 4.5;
  • pH stability is stable in the range of pH 3 to pHIO.
  • Phospholipase which is a protein according to any one of the above.
  • DNA encoding a protein having the amino acid sequence ability described in SEQ ID NO: 5; d) DNA comprising the nucleotide sequence of the coding region (CDS) of SEQ ID NO: 4! The DNA according to any one of the above.
  • a process for producing phospholipase C comprising:
  • FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the activity of purified phospholipase C derived from Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain and pH.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the activity and temperature of purified phospholipase C derived from Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain.
  • FIG. 4 is a view showing the pH stability of purified phospholipase C derived from Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain.
  • FIG. 5 is a diagram showing the relationship between pH and activity of purified phospholipase C derived from Aspergillus tamari IAM 13907 strain.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the activity and temperature of purified phospholipase C derived from Aspergillus tamari IAM 13907 strain.
  • FIG. 7 is a view showing temperature stability of purified phospholipase C derived from Aspergillus tamari IAM 13907 strain.
  • 'It is a figure showing sex.
  • FIG. 9 is a graph showing the relationship between the activity and pH of purified phospholipase C derived from Aspergillus oryzae NBRC 4190 strain.
  • the present invention is phospholipase C that is active at acidic to neutral pH and does not substantially hydrolyze phosphoesters other than phospholipids, or at acidic to neutral pH. It is a phospholipase that exhibits activity and does not have phosphatase activity.
  • the phrase "does not substantially hydrolyze phosphate esters other than phospholipids” preferably means that the hydrolysis activity with respect to phosphatidylcholine (derived from egg yolk) is 100%, 30% or less for phosphatidic acid, more preferably 25% or less, and 15% or less for Z or glycephosphorylcholine, more preferably 10% or less, and Z or It means 10% or less, and more preferably 5% or less, with respect to para-trifluorophosphate.
  • substantially does not hydrolyze glycephoryl phosphorylcholine and noranitrophenol phosphate is substantially does not hydrolyze glycephoryl phosphorylcholine and noranitrophenol phosphate.
  • phosphatidic acid is recognized as a synthetic intermediate of neutral fat and glyceport phospholipid, it is not included in glyceport phospholipid (phospholipid) in the specification of the present application.
  • “No phosphatase activity! /” Means that the degradation activity of phosphatidic acid or para-trophyl phosphate is 50% or less of the degradation activity of phosphatidylcholine.
  • the activity is preferably 40% or less, more preferably 30% or less, and most preferably 25% or less of the phosphatidylcholine degradation activity.
  • the degradation activity of paranitrophenol phosphate is preferably 30% or less, more preferably 20% or less, and most preferably 10% or less of the degradation activity of phosphatidylcholine.
  • the phospholipase C of the present invention has a degrading activity for sphingomyelin, and preferably has a degrading activity for phosphatidylcholine or higher than that. Specifically, assuming that the degradation activity for phosphatidylcholine (derived from egg yolk) is 100%, the degradation activity for phosphatidylcholine is preferably 90% or more, more preferably 105% or more, and most preferably 115% or more. .
  • the phospholipase C of the present invention has a decomposing activity for phosphatidylethanolamine, and preferably its decomposing activity is the same as that for phosphatidylcholine. Specifically, when the degradation activity for phosphatidylcholine (derived from egg yolk) is 100%, the degradation activity for phosphatidylethanolamine is preferably 80% or more, more preferably 85% or more, most preferably 90% or more, Less than 150%.
  • Phospholipase C is not phosphatidylinositol-specific! /, Meaning that the degradation activity of substrates other than phosphatidylinositol is higher than the degradation activity (relative activity) of phosphatidylinositol.
  • the substrate other than phosphatidylinositol is preferably phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol or phosphatidylglycerol.
  • the optimum pH of the phospholipase C of the present invention is preferably in the range of acidic to neutral pH, more preferably in the range of pH 3 to pH 6, and further preferably in the range of pH 3 to pH 5. Range, most preferably in the range of pH 4 to pH 5.
  • the phospholipase C of the present invention has a relative activity at pH 7 of preferably 20% or less. More preferably, it is 40% or more, most preferably 50% or more.
  • the optimum temperature of the phospholipase C of the present invention is preferably in the range of 45 ° C to 70 ° C, and more preferably in the range of 55 ° C to 70 ° C. Most preferably, it is in the range of 60 ° C to 70 ° C.
  • the phospholipase C of the present invention preferably has a relative activity of 50% or more in the range of 55 ° C to 70 ° C, more preferably 50% in the range of 45 ° C to 70 ° C.
  • the relative activity is most preferably 50% in the range of 35 ° C to 70 ° C.
  • the relative activity is preferably 80% or more.
  • stable means having 40% or more residual hydrolysis activity
  • the phospholipase C of the present invention is 45 ° C.
  • the residual activity is preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • the phospholipase C of the present invention has a residual hydrolysis activity of 40% or more at a treatment temperature of preferably 45 ° C., more preferably 50 ° C., and most preferably 60 ° C.
  • stable means that it has a residual hydrolysis activity of 5% or more after storage treatment, and the phospholipase C of the present invention is treated.
  • the residual hydrolytic activity is preferably 0% or more, more preferably 50% or more, and most preferably 60% or more.
  • the treatment pH is in the range of pH 6 to pH 8
  • the residual hydrolysis activity is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and most preferably 80% or more.
  • phospholipase C of the present invention includes any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, preferably two, most preferably all three. And a protein having phospholipase C activity. When the protein contains two or more of these three amino acid sequences, the order of each amino acid sequence may be in any order! /.
  • the protein having the amino acid sequence ability of SEQ ID NO: 5 is characterized by having an amino acid sequence ability in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having phospholipase C activity.
  • Such proteins are also included in the present invention.
  • Substituted amino acid sequence For example, a protein obtained by substituting a nucleotide sequence corresponding to cysteine of the interleukin 2 (IL-2) gene with a nucleotide sequence corresponding to serine. Is known to retain IL-2 activity (Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433).
  • Another example of the phospholipase C of the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is included in the present invention as long as it has phospholipase C activity.
  • phospholipase C of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and modified with a sugar chain.
  • a protein comprising such a protein is also included in the present invention as long as it has phospholipase C activity.
  • the “DNA of the present invention” refers to DNA encoding the phospholipase C of the present invention.
  • the DNA can be in any form as far as it is known, including cDNA, genomic DNA, artificially modified DNA, and chemically synthesized DNA.
  • DNA of the present invention examples include DNA that is the nucleotide sequence of the coding region (CDS) of SEQ ID NO: 4 and encodes a protein having phospholipase C activity.
  • CDS coding region
  • DNA of the present invention includes DNA having a nucleotide sequence homology of 70% or more with the nucleotide sequence of the coding region (CDS) of SEQ ID NO: 4.
  • CDS coding region
  • nucleotide of the present invention is DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4.
  • the codon corresponding to the desired amino acid can be selected arbitrarily and can be determined according to a conventional method in consideration of, for example, the codon usage frequency of the host to be used. (Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 14 3-174) o
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be carried out in accordance with a conventional method from a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification.
  • Site-specific mutagenesis / Mark, DF et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666, etc. can be used.
  • DNA of the present invention includes a DNA consisting of the nucleotide sequence of the coding region (CDS) of SEQ ID NO: 4. Further, DNA containing the nucleotide sequence of the coding region (CDS) of SEQ ID NO: 4 is also included in the present invention as long as it encodes a protein having phospholipase C activity.
  • Examples of the phospholipase C of the present invention include a protein comprising an amino acid sequence encoded by the DNA of the present invention.
  • a method of cutting DNA from the end using exonuclease Bal31 or the like Kerat Toshimitsu et al., "Sequence of Biochemistry Experiment 1, Gene Research Method ⁇ " 335-354), cassette mutation method (Toshimitsu Kishimoto, "New Chemistry Experiment 2, Nucleic Acid III Recombinant DNA Technology” 242-251) .
  • proteins obtained by genetic engineering techniques based on the DNA of the present invention are included in the present invention as long as they have phospholipase C activity.
  • a phospholipase is not necessarily required to have all of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 5, for example, even a protein having a partial sequence ability, as long as the protein exhibits phospholipase C activity.
  • phospholipase C is also included in the present invention.
  • Phospholipase C used in the present invention may be a product obtained by purifying phospholipase C-producing bacteria, a crude product, a cell disruption solution, or a cell culture supernatant as it is.
  • a surfactant in addition to a carbon source and a nitrogen source in the medium.
  • it is preferably cultured in a medium of natural materials such as fish meal, sorghum and cottonseed meal.
  • the surfactant include triton, tween, sucrose fatty acid ester, sodium cholate, sodium deoxycholate and saponin.
  • Phospholipase C-producing bacteria can be cultured using an ordinary culture apparatus and medium.
  • methods such as liquid culture and solid culture can be appropriately selected.
  • liquid culture flask culture or culture using a fermenter can be performed. After the start of culture, the medium is not added.
  • Carbon and nitrogen sources can be added to the medium, and vitamins and trace metals can be added as necessary.
  • the carbon source include monosaccharides such as glucose, mannose, galactose, and phenolate, disaccharides such as manoleose, cellobiose, isomanoleose, ratatose, and sucrose, polysaccharides such as starch, and maltoeduct.
  • inorganic nitrogen such as ammonia, ammonium sulfate and ammonium nitrate
  • organic nitrogen such as first-stratate, malto-stratate, corn steep liquor and peptone
  • the amount of the composition in these media can be appropriately selected.
  • the culture temperature, pH, and aeration amount can be appropriately selected so as to be suitable for phospholipase C production.
  • Centrifugation is carried out after the cultivation of the phospholipase C-producing bacteria to remove the bacterial cells, and the cultured supernatant can be used as it is as a crude enzyme solution.
  • a crude enzyme solution can be roughly purified by ion exchange chromatography or the like, or purified.
  • Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC 4 190 strain or Aspergillus tamari IAM 13907 referred to in the present invention are all mutant strains as long as they can produce phospholipase C of the present invention. Is included. These mutant strains also include those obtained by genetic methods such as recombination, transduction, and transformation. That is, Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 or NBRC 4190 strain or Aspergillus tamari IAM 13907 strain, mutants thereof and strains that are not clearly distinguished from them are those that produce the phospholipase C of the present invention. All Aspergillus oryzae FERM ABP—10200 or NBRC 4190 shares V ⁇ are included in Aspergillus tamari IAM 13907.
  • the phospholipase C of the present invention can also be obtained from a culture product of a transformed cell obtained by transforming a host cell with a recombinant plasmid in which the DNA of the present invention is inserted into a vector.
  • a recombinant plasmid in which the DNA of the present invention is inserted into an appropriate vector is also included in the present invention.
  • a vector used for such a purpose various commonly known vectors can be used. Suitable examples include, but are not limited to, a vector for prokaryotic cells, a vector for eukaryotic cells, a vector for mammalian cells and the like.
  • Such recombinant plasmids can transform other prokaryotic or eukaryotic host cells. Furthermore, the ability to use a vector having an appropriate promoter sequence and Z or a sequence involved in phenotypic expression, or by introducing such a sequence, the gene can be expressed in each host. Is possible.
  • Such an expression vector is a preferred embodiment of the recombinant plasmid of the present invention.
  • Host cells can be obtained by introducing the recombinant plasmid of the present invention into various cells. These cells can be either prokaryotic cells or eukaryotic cells as long as they can introduce plasmids! /.
  • Examples of the prokaryotic host include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • the host cells are transformed with a plasmid vector containing a rebricon derived from a species compatible with the host, ie, an origin of replication, and regulatory sequences.
  • a vector having a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells is preferred.
  • the K12 strain is often used as E. coli, and the vector is generally limited to the ability to use pBR 322 or pUC plasmids.
  • Various known strains and vectors can be used. it can.
  • trp tryptophan
  • lac lactose
  • tac tryptophan 'latatose
  • lipoprotein (1 pp) promoter lipoprotein (1 pp) promoter
  • Tu polypeptide chain elongation factor Tu (tuffi) promoter and the like, and any promoter can be used for production of the phospholipase c of the present invention.
  • pTUB228 (Ohmu ra, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used as a preferred vector for Bacillus subtilis. It is not limited to.
  • Secretion expression outside the cell can also be achieved by linking a DNA sequence encoding the signal peptide sequence of Bacillus subtilis at amylase as the promoter.
  • the host cells of eukaryotic cells include cells of vertebrates, insects, yeasts, etc., and vertebrate cells include cells derived from mammals, for example, COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL— 1650) and Chinese'no, Muster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strains (Urlaub, G. and Chasin, LA) (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) and the like can be used.
  • COS cells Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL— 1650
  • Chinese'no, Muster ovary cells CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strains (Urlaub, G. and Chasin, LA) (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) and
  • an expression promoter for vertebrate cells a promoter that is usually located upstream of a gene to be expressed, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like can be used. In addition, this may have a replication origin if necessary.
  • the expression vector include pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1, 854-864) having the SV40 early promoter. It is not limited to.
  • the expression vector has an SV40 replication origin, and can self-propagate in COS cells. Furthermore, a transcription promoter, transcription termination signal , And those with RNA splice sites can be used.
  • the expression vector is obtained by the following method: Jetylaminoethyl (DEAE) -dextran method (Luth man, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308) (Graham, FL and van der Eb, AJ (1973) Virology 52, 4 56-457), and electric pulse perforation (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J.
  • vectors capable of expressing the neo gene that functions as an antibiotic G418 resistance marker such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): “Molecular Cloning A Laboratory Manual ⁇ Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and pSV2— neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341), etc. are cotransfected to select G418-resistant colonies, whereby the phospholipase of the present invention is selected. A transformed cell that stably produces C can be obtained.
  • an insect cell When an insect cell is used as a host cell, an ovarian cell-derived cell line of Spodoptera frugiperd a (Sf-9 or Sf-21) of Lepidoptera, or a Hygh Five cell derived from an egg cell of Trichoplusia ni (Wickham) , TJ et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391-396) are often used as host cells, and the baculovirus transfer vector is the promoter of the autographer nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) polyhedrin protein. P VL1392Z1393 is used vigorously (Kidd, IM and VC Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors.
  • vectors using baculovirus P10 and promoters of the same basic protein can also be used.
  • a recombinant protein as a secreted protein by linking the secretory signal sequence of the envelope surface protein GP67 of AcNPV to the N-terminal side of the target protein (Zhe-mei Wang, et al. (19 98) Biol. Chem., 379, 167-174).
  • yeast As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known, and among them, Saccharomyces yeasts such as baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable.
  • expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include, for example, the promoter of the anoleconole dehydrogenase gene (Bennetzen, J. and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) and acid.
  • a phosphatase gene promoter (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the phospholipase C of the present invention is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • the medium used for the culture various kinds of commonly used media can be selected depending on the host cells employed.
  • the above-mentioned COS cells can be RPMI 1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter “DMEM”). "T, u)" and other medium supplemented with serum components such as urine fetal serum as needed can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • T, u Dulbecco's modified Eagle medium
  • serum components such as urine fetal serum as needed
  • the CO concentration is in the range of 0 to 50%.
  • the range is preferably 1 to 10%, more preferably 5%.
  • the culture temperature is preferably 0 to 99 ° C, more preferably 20 to 50 ° C, and more preferably 35 to 40 ° C.
  • the phospholipase C of the present invention which is produced as a thread and exchange protein in or outside the transformant by the above-described culture, is obtained from the cultured product from the physical properties, chemical properties, Various separation operations using biochemical properties (enzyme activity, etc.) ("Biochemical Data Book II", 1175-1259, 1st edition, 1st print, June 23, 1980 Tokyo i Issued by the same person; see Biochemistry, vol. 25, No. 25, p8274-8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, p313-321 (1987), etc.).
  • the method include normal reconstitution treatment, treatment with a protein precipitating agent (salting out method), centrifugation, osmotic shock method, freeze-thaw method, ultrasonic disruption, ultrafiltration, gel filtration.
  • a protein precipitating agent salting out method
  • centrifugation osmotic shock method
  • freeze-thaw method ultrasonic disruption
  • ultrafiltration gel filtration.
  • various liquid chromatography such as adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), dialysis method, and combinations thereof.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a desired recombinant protein can be produced on an industrial scale in a high yield.
  • histidine having 6 residues to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified on a nickel-affinity column.
  • the phospholipase C of the present invention can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
  • Phospholipase C produced by the method as described above can also be mentioned as a preferred example of the present invention.
  • the phospholipase C-producing bacterium refers to a microorganism substantially having a phospholipase C-producing ability, and includes a microorganism that accumulates phospholipase C in the microbial cell, a microorganism that secretes it outside the microbial cell, and the like.
  • phospholipase C purified from culture supernatant or culture supernatant of phospholipase C-producing bacteria bacteria that secrete phospholipase C outside the cells can be used.
  • Aspergillus oryzae or Aspergillus' Tamari-derived phospholipase C can be used, and more preferably, Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC Phospholipase C derived from strain 4190 or Aspergillus tamari IAM 13907 can be used.
  • Phospholipase C may be produced by these phospholipase C-producing bacteria themselves, or may be produced by a mutant or a modified product thereof, and a gene encoding phospholipase C of these phospholipase C-producing bacteria. It may be a recombinant protein produced from a transformant obtained by introducing into a host! / ⁇ .
  • Aspergillus oryzae NBRC 4190 is an independent administrative agency, Product Evaluation Technology Infrastructure Organization, Biotechnology Headquarters, Biological Resource Center (NBRC) 292– 0818 Kisarazu Kazusa Kamashisa, Chiba Prefecture, Japan 292— 0818, Home page address (http://www.nite.go.jp/>).
  • IAM 13907 strain is the IAM institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo; 1-1, Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0032, Manpower from the home page address ⁇ htt p: //www.iam.u—tokyo.ac.jp/indexe.html>).
  • Aspergillus oryzae FERM ABP Aspergillus oryzae FERM ABP—according to the clicked literature (Klich, MA (002) Identmcation of common Aspergillus and entraalbureau voor Schimmelcultures, Ut recht, The Netherlands), 4 types of media (CYA media, CY20S media, CZ cultivation Ground, MEA medium) and inoculated mycological properties.
  • composition of the four types of media is as follows.
  • CYA medium Czapek Yeast Extract Agar medium
  • Zapec concentrate (NaNO 30g, KC1 5g, MgSO ⁇ 7 ⁇ O 5g, FeSO-7H O
  • CY20S medium [20% Czapek Yeast Extrac t Agar with 20% Sucrose medium]
  • CZ medium [Czapek Dox Agar medium]
  • Colonies in CYA medium are 36-40 mm in diameter for 1 week of culture at 25 ° C.
  • the mouth is a little thicker wool, fluffy at the center, and forms radial grooves from the center.
  • the mycelium is white.
  • Conidia are sparsely formed in the center, and grayish yellow (4B4) force is also yellowish white (4A2). No exudate or sclerotia is observed.
  • the back side is pale yellow (2A4) to white (2A1), and radial grooves are formed from the center. No soluble pigment is observed.
  • Colonies in CYA medium are 54-58 mm in diameter at 37 ° C for 1 week. One is thick and woolly. The mycelium is white.
  • the conidia are formed in the center and have grayish yellow (4B4) force yellowish white (4A2). No exudate or sclerotia is observed.
  • the back side is pale orange (4A4) to white (4A2), and radial grooves are formed from the center. No soluble pigment is observed.
  • Colonies in CY20S medium have a diameter of 35-41 mm when cultured for 1 week at 25 ° C.
  • the colony properties are similar to those of CYA medium, but there are a little more fluffy hyphae in the center.
  • Colonies in CZ medium have a diameter of 17-21 mm when cultured for 1 week at 25 ° C. Colony properties are the same as CYA medium. Colonies have small formation of conidia.
  • Colonies in MEA medium are 37-4 lmm in diameter at 25 ° C for 1 week. The mouth is thin and fluffy. The mycelium is white. Conidia are sparsely formed in the center, and are dark green (26D4) to grayish green (26D6). No exudate or sclerotia is observed. The back side is gray yellow (4B3) force yellowish white (4A2), and no soluble pigment is observed!
  • the conidia head has a loose cylindrical shape with a radial force.
  • the conidia pattern has a width of 6.7-13.6 / z m, a length of 3 02. 2-1398. O ⁇ m, colorless and rough.
  • the apical sac is a sub-spherical force-flask shape with a width of 14.6-29.3 ⁇ m.
  • Aspergilla is mainly single row (uniseriate) and rarely double row (bi seriate).
  • Metre or phialide also creates the upper half force of the apical sac.
  • the metre is 1 1. 3-28. 3 X 5. 2-9. 9 m.
  • the phialide is in the form of a flask, 8.4—21.3 X 3. 8-7.
  • Conidia are smooth, subspherical to oval, diameter 4.2-6.3 m
  • Phospholipase C produced and purified by Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC 4190 strain or Aspergillus tamari IAM 13907 strain has the following properties.
  • the hydrolytic activity described in 4) is in the range of 0 ° C to 80 ° C.
  • Table 1 shows the relative activity when the activity against egg yolk-derived phosphatidylcholine is defined as 100%.
  • the egg yolk-derived substrate and soybean-derived substrate are described as such.
  • egg yolk-derived lecithin was purchased from Nacalai Testa Co., Ltd.
  • soybean-derived lecithin was purchased from Sakai Oil Co., Ltd.
  • other substrates were purchased from Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.
  • Phosphatidylhetanoylamine (from egg yolk) 1 0 1
  • Lecithin (derived from egg yolk) 8 8
  • Lysophosphatidylcholine (derived from egg yolk) 4 1
  • Phosphatidylcholine (derived from soybean) 9 4
  • Phosphatidylhetanoylamine (derived from soybean) 9 0
  • Lecithin (derived from soybean) 8 2
  • Sphingomyelin (derived from bovine brain) 1 2 1
  • Sphingomyelin (derived from egg yolk) 1 2 5
  • the protein is modified with a sugar chain.
  • the properties of the phospholipase C of the present invention include the following, but are not limited thereto.
  • the hydrolytic activity described in 4) is in the range of 0 ° C to 80 ° C.
  • the present invention also includes a method for producing the phospholipase C of the present invention.
  • Phospholipase C can be produced by culturing phospholipase C-producing microorganisms such as Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain, NBRC 4190 strain or Aspergillus tamari IAM 13907 strain in a medium.
  • the hydrolysis activity of phospholipase C was measured as follows.
  • Egg yolk lecithin (Nacalai Testa Co., Ltd.) 1.5% of 4% (wt / v) TritonX—100
  • 60 ⁇ l of 200 mM acetate buffer (pH 5.5) to 60 ⁇ l of substrate solution dissolved in 50 ml
  • the temperature was kept at 37 ° C.
  • the mixture solution was stirred uniformly with the enzyme solution 601, and incubated at 37 ° C for 3 hours to carry out the enzyme reaction.
  • the phosphoryl base resulting from the enzymatic reaction was hydrolyzed with alkaline phosphatase.
  • ⁇ 1> Add 200 mM Tris' hydrochloric acid buffer (pH 8.0) 50 1 and alkaline phosphatase (Sigma Aldrich Japan) 1 ⁇ 1 to the enzyme reaction solution 1 prepared in ⁇ 1> for 40 minutes at 37 ° C. I did it. At this time, a sample was prepared at the same time without using alkaline phosphatase as a blank.
  • 1,200 ml of the crude enzyme solution obtained in 1) was dialyzed 8 times for 12 hours against 10 mM Tris' hydrochloric acid buffer (pH 7.5) 8, OOOml. This was added to a DEAE Toyopearl (Tosohichi Co., Ltd.) column (diameter 2.2 cm X length 20 cm) previously equilibrated with 10 mM Tris' hydrochloric acid buffer (pH 7.5) and adsorbed. After thoroughly washing the column with 10 mM Tris 'hydrochloric acid buffer (pH 7.5), create a linear concentration gradient of 0 to 0.2 M sodium chloride in 600 ml of 10 mM Tris' hydrochloric acid buffer (pH 7.5).
  • the egg yolk-derived lecithin-degrading activity was eluted in the fraction (90 ml) having a sodium chloride concentration of 0.05M to 0.08M. This was used as a crudely purified enzyme fraction.
  • This fraction was used as a purified enzyme solution.
  • the molecular weight of the purified enzyme was determined by SDS-PAGE electrophoresis using 5% polyacrylamide gel (see Laemmli, UK, Nature, 227, 680 (1970)). The following were used as standard proteins: a. Phosphorylase, molecular weight 94, 000: b. Albumin, molecular weight 67, 000: c. Ovalbumin, molecular weight 43, 000: d .Carbonic 'carbonic anhydrase, molecular weight 30,000: e. Trypsin' Inhibitor (trypsin inhibitor), molecular weight 20, 100: f. ⁇ -Latatalbumin (a-lactalbumin), molecular weight 14,400.
  • the purified enzyme showed a single band with a molecular weight of about 87,000.
  • a 500 ml Erlenmeyer flask (seed flask) containing 100 ml of the medium shown in Table 2 is inoculated with 1 ml of filter-sterilized 5% sodium deoxycholate solution and Aspergillus tamari IAM 13907 strain at 26 ° C. Incubated at 170 rpm for 5 days. After completion of the culture, centrifugation was performed at 4 ° C, 10,000 X G for 10 minutes. The obtained supernatant was used as a crude enzyme solution.
  • Example 1 Purification was carried out in the same manner as in 3) to obtain a purified enzyme solution.
  • Example 1.4 Measurement was performed in the same manner as in 4).
  • the purified enzyme showed a single band with a molecular weight of about 87,000.
  • HiLoad Sephadex200pg (Amersham Bioscience Co., Ltd.) obtained by concentrating 35 ml of the obtained active fraction and equilibrating in advance with 10 mM Tris' hydrochloric acid buffer (PH7.5) containing 0.15 M sodium chloride After loading on a column (diameter 16 mm ⁇ 60 cm), elution was performed with 1 OmM Tris' hydrochloric acid buffer (pH 7.5) containing 0.15 M sodium chloride. Egg yolk-derived lecithin-degrading activity was eluted in fractions with an elution volume of 60 to 70 ml.
  • This fraction was used as a purified enzyme solution.
  • the purified enzyme showed a single band with a molecular weight of about 87,000.
  • Example 4 Determination of partial amino acid sequence of phospholipase C from Aspergillus oryzae NBRC 4190 strain
  • the purified enzyme solution was concentrated to about 1 mg / ml using an ultrafiltration membrane (Sartorius VIVASPIN2, molecular weight fraction 10,000).
  • RNA Aspergillus oryzae NBRC 4190 strain was precultured in liquid medium (2% polypeptone, 0.5% yeast estratate, 0.02% hydrogen phosphate 2 potassium, 0.05% magnesium sulfate) 2 Oml at 26 ° C for 1 day . Thereafter, 1% inoculation was carried out in a liquid medium (5% fish meal) and cultured at 26 ° C for 4 days. The cultured cells were collected by aspiration and transferred to a mortar (autoclaved) at -80 ° C. While adding liquid nitrogen, the cells were crushed with a pestle to form a powder. The whole ribonucleic acid was purified from the completely powdered cells using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Co., Ltd.). A solution force of 50 1 with a concentration of 905 ng / 1 was obtained.
  • the gene sequence was decoded by 5'RACE method and 3'RACE method. Specifically, PCR was performed using Ex Taq TM (Takara Bio Inc.) as a polymerase using 5'RACE System and 3'RACE System (both Invitrogen Corp.). The PCR primers used at this time were 5'-GGCCACGCGTCGAC TAGTAC-3 'and 5'-GACAGTGTAGTCGAGCACAGCGAA-3' for 5 'gene sequence amplification, and 5'-GACTCTGCCACCGCAATCGGCTA- for 3' gene sequence amplification. 3 'and 5'- GGCCACGCGTC GACTAGTAC-3' were used.
  • the PCR cycle was amplified at 94 ° C for 5 minutes, (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C-30 seconds, 72 'for 2 minutes 30 seconds), 30 ° C for 10 minutes at 4 ° C.
  • a DNA having a length of about 12 OOb.p. on the 5 ′ side and about 800 b.p. on the 3 ′ side was amplified.
  • Each PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis and then purified with a QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen Co., Ltd.).
  • the purified product was ligated to a vector using TOPO TM TA Cloning Kit (Invitrogen Corp.) and transformed. After culturing the transformed E. coli on an agar medium (LB / Agar (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) overnight at 37 ° C, the grown colonies were grown at 37 ° C overnight in a liquid medium (LBbroth ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)).
  • LBbroth Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • coli plasmid was purified using QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Co., Ltd.) and subjected to DNA sequence analysis.
  • the result of DNA sequence analysis is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence deduced from the DNA sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • Example 6 Glycopeptidase treatment of phospholipase C from Aspergillus oryzae NBRC 4190 strain
  • Test Example 1 Aspergillus oryzae FERM ABP— Properties of purified enzyme solution of phospholipase C derived from 10200 strain
  • the activity of the purified enzyme solution obtained in 3) of Example 1 was measured.
  • Example 2 The method shown in 2) of Example 1 was used. However, the enzyme reaction time was set at 37 ° C for 10 minutes.
  • the following buffers were used: pH 2.3 to pH 3.7, glycine monohydrochloride buffer: pH 3.3 to pH 6.2, citrate monosodium citrate buffer: pH 6.1 NO To pH8.0, MOPS buffer: At pH 8.2 to pH 9.2, Atkins—Pantin buffer.
  • the hydrolytic activity under the pH condition with the highest activity is defined as 100%, and the hydrolytic activity of the enzyme at each pH is shown as a relative value in FIG. The optimum pH was around pH 4.5 in citrate buffer.
  • the temperature activity in citrate buffer PH4.5 was measured.
  • the measurement method was based on the method shown in 2) of Example 1. However, the enzyme reaction time was set at 37 ° C for 20 minutes.
  • the hydrolysis activity under the temperature condition with the highest activity was taken as 100%, and the hydrolysis activity of the enzyme at each temperature is shown as a relative value in FIG.
  • the optimum temperature was around 65 ° C.
  • the purified enzyme solution was treated at various temperatures for 30 minutes, and the residual hydrolysis activity was measured.
  • 25 mM citrate buffer (pH 4.5) 90 / zl previously maintained at the treatment temperature
  • Enzyme solution 10 was added and stirred until uniform, and kept warm for 30 minutes.
  • 60 ⁇ l of egg yolk lecithin solution prepared in Example 1 60 ⁇ l of 200 mM citrate buffer solution (pH 4.5) was kept at 37 ° C., and the enzyme solution 60 / zl heated was added.
  • the enzyme reaction was performed at 37 ° C for 30 minutes.
  • the free phosphoryl base was quantified according to 2) of Example 1.
  • the highest residual hydrolysis activity was taken as 100%, and the hydrolysis activity at each temperature was summarized as a relative value in FIG. It was stable at a temperature of at least 60 ° C at pH 4.5.
  • Example 1 60 1 of the solution was added and stirred to homogenize, and the enzyme reaction was performed at 37 ° C for 10 minutes.
  • the quantification of the free phosphoryl base was in accordance with 2) of Example 1.
  • the highest residual hydrolysis activity is taken as 100%, and the hydrolysis activity at each pH is shown as a relative value in FIG. It was stable in the range of pH 3 to pHIO.
  • Phosphatidylhetanoylamine (from egg yolk) 1 0 1
  • Lecithin (derived from egg yolk) 8 8
  • Lysophosphatidylcholine (derived from egg yolk) 4 1
  • Phosphatidylcholine (derived from soybean) 9 4
  • Phosphatidylhetanoylamine (derived from soybean) 9 0
  • Lecithin (derived from soybean) 8 2
  • Sphingomyelin (derived from bovine brain) 1 2 1
  • Sphingomyelin (derived from egg yolk) 1 2 5
  • the activity was measured using the purified enzyme solution obtained in 2) of Example 2.
  • Test Example According to the method shown in 1.
  • the hydrolysis activity under the pH conditions with the highest activity was defined as 100%, and the enzyme hydrolysis activity at each pH is shown in FIG. 5 as relative values.
  • the optimum pH was around pH 4.5.
  • FIG. 6 shows the hydrolysis activity under the temperature conditions with the highest activity as 100% and the hydrolysis activity of the enzyme at each temperature as a relative value.
  • the optimum temperature was around 65 ° C. [0148] 3) Temperature stability
  • Test Example According to the method shown in 1. The highest residual hydrolysis activity is taken as 100%, and the hydrolysis activity at each temperature is shown as a relative value in FIG. It was stable at a temperature below 45 ° C at pH 4.5.
  • Test Example According to the method shown in 1. The highest residual hydrolysis activity is taken as 100%, and the hydrolysis activity at each pH is shown as a relative value in FIG. It was stable in the range of pH 3 to pHIO.
  • Table 5 shows the relative activities when the hydrolysis activity for egg yolk-derived phosphatidylcholine is defined as 100%.
  • Phosphatidic acid (derived from egg yolk) 1 6
  • Lecithin (derived from egg yolk) 9 1
  • Lysophosphatidylcholine (derived from egg yolk) 5 3
  • Glyce mouth phosphorylcholine (derived from soybean) 8
  • Phosphatidylcholine (derived from soybean) 9 1
  • Lecithin (derived from soybean) 7 5
  • Test Example 3 Aspergillus oryzae Purified phospholipase C from NBRC4190 strain Activity was measured using the purified enzyme solution obtained in 2) of Example 3.
  • Test Example According to the method shown in 1.
  • the hydrolysis activity under the pH condition with the highest activity was defined as 100%, and the hydrolysis activity of the enzyme at each pH is shown as a relative value in FIG.
  • the optimum pH was around pH 4.5.
  • Test Example According to the method shown in 1. Table 6 shows the relative activity when the hydrolysis activity for egg yolk-derived phosphatidylcholine is defined as 100%. Relative activity (%) Substrate Phosphatidylcholine (derived from egg yolk) 1 0 0
  • Phosphatidic acid (derived from egg yolk) 2 2
  • Lecithin (derived from egg yolk) 8 9
  • Lysophosphatidylcholine (derived from egg yolk) 4 6
  • Lecithin (derived from soybean) 8 1
  • the phospholipase C of the present invention is derived from Aspergillus oryzae FERM ABP-10200 strain or NBRC 4190 strain or Aspergillus tamari IAM 139 07 strain, which is excellent in safety and has various glyceport phospholipids on the acidic side. Has the ability to hydrolyze efficiently even in the vicinity of neutrality and has activity in citrate buffer. It is an enzyme that is thermally stable to the extent that it does not hydrolyze phosphate esters other than phospholipids, and has excellent effects in both the food industry and the oil industry.

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Abstract

　様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、クエン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であり、脂質部分を含有しないリン酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼＣを提供すること。酸性から中性のｐＨにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼＣ。

Description

明 細 書
新規ホスホリパーゼ C
技術分野
[0001] 本発明は、ホスホリパーゼじ、該ホスホリパーゼ Cを生産する糸状菌、糸状菌の培 養物から該ホスホリパーゼ Cを分離精製する方法、該ホスホリパーゼ Cをコードする D NAおよび該ホスホリパーゼ Cの製造方法等に関する。具体的には、本発明は、食品 工業および医薬品工業における使用に特に適するホスホリパーゼじ、特に糸状菌ァ スペルギルス ·オリザェ（Aspergillus oryzae)ある 、はァスペルギルス ·タマリ（Aspergill us tamarii)が生産するホスホリパーゼじ、該ホスホリパーゼ Cを生産する糸状菌、糸 状菌の培養物力 該ホスホリパーゼ Cを分離精製する方法、該ホスホリパーゼ Cをコ ードする DNAおよび該ホスホリパーゼ Cの製造方法等に関する。
背景技術
[0002] 〔1〕ホスホリパーゼ C
従来、動物および微生物がホスホリパーゼ Cを生産することが知られている。動物 由来の酵素は主としてホスファチジルイノシトール選択的なホスホリパーゼ cである。 また、微生物のなかでは細菌、放線菌、酵母およびカビ由来のホスホリパーゼ Cが知 られている。細菌、放線菌および酵母が生産するホスホリパーゼ Cは、ホスファチジル イノシトール選択的あるいはホスファチジルコリン選択的なものがほとんどである。
[0003] 細菌由来のホスホリパーゼ Cとしては、例えばシユードモーナス'シュルキリェンシス
(Psudomonus schuylkilliensis) (例えば、特許文献 1：特開昭 50— 1017183号公報 参照）、ブルコールデリア'シユードマレイ（Bulkholderia pseudomallei) (例えば、非特 許文献 1 :コルブスリサテら（Korbsrisate S. et. al.)「ジャーナル'ォブ'タリ-カル 'マイ クロバイオロジー」 (Jounal of Clinical Microbiology) 1999年、 37卷、 p.3742- 3745参照） 、バチラス 'セレウス（Bacillus cereus) (例えば、非特許文献 2 :タンら（Tan C. et. al.)「 プロテイン.エクスプレッション.アンド.ピューリフィケイシヨン」（Protein Expression and Purification) 1997年、 10卷、 p.365- 372参照）、スタフイロコッカス 'ァウレウス（Staphylo coccus aureus) (例えば、非特許文献 3：ダウガーティーら（Daugherty S. et. al.)「イン フエクシヨン 'アンド'イミュ-ティー」（Infection and Immunity) 1993年、 61卷、 p.5078- 5 089参照）およびクロストリディウム 'ペルフリンゲンス（Clostridium perfringens) (例え ば、非特許文献 4 :テイットバールら（Titball R. et. al.)「インフエクシヨン 'アンド'イミュ ユティー」（Infection and Immunity) 1989年、 57卷、 p.367- 376参照）等が生産するホス ホリパーゼ Cが知られて 、る。
[0004] 放線菌由来のホスホリパーゼ Cとしては、例えばストレプトマイセス 'ノヽチジヨウェン シス（Streptomyces hachijyoensis) (例えば、特許文献 2 :特開昭 49 55893号公報 参照）が生産するホスホリパーゼ Cが知られている。
[0005] 酵母由来のホスホリパーゼ Cとしては、例えばキャンディダ 'アルビカンス (Candida a lbicans) (例えば、非特許文献 5 :アンダルツら（Andaluz E. et. al.)「イースト」 (Yeast)2 001年、 18卷、 P.711- 721参照）、サッカロマイセス 'セレビシァェ（Saccharomyces cere visiae) (例えば、非特許文献 6：パイネら（Payne W. et. al.)「モレキュラ^ ~ ·アンド'セ ルラ^ ~ ·バイオロジー」 (Molecular and Cellular Biology) 1993年、 13卷、 p.4351- 4364 参照）等が生産するホスホリパーゼ Cが知られて 、る。
[0006] カビ由来のホスホリパーゼ Cは、従来 2例知られている。一つはァスペルギルス '二 ガー（Aspergillus niger) (例えば、特許文献 3 :特開 2000— 166543号公報参照）、 もうひとつはァスペルギルス'サイトイ (Aspergillus saitoi) (例えば、非特許文献 7 :マ ッォ力ら（Matsuoka S. et. al.)「バイオテクノロジ一 ·アンド'アプライドバイオケミストリ 一」（Biotechnology and Applied Biochemistry) 1987年、 9卷、 p.401- 409参照）が生産 するホスホリパーゼ Cである。
[0007] 〔2〕レシチン
レシチンは、動物、植物、菌類に広く分布している代表的なグリセ口リン脂質である 。グリセ口リン脂質とは、 1, 2 ジァシルグリセロールの 3位にホスホリル塩基が共有 結合している化合物である。塩基としては、コリン、エタノールァミン、セリン、イノシト ールおよびグリセロール等が含まれており、その組成割合は由来により異なる。レシ チンはグリセ口リン脂質に含有される概念として用いるものとする。
[0008] レシチンは、界面活性作用、酸化防止作用、生理活性作用等を有し、食品、飼料、 医薬品等に利用されている。食品工業においては、卵黄レシチンや大豆レシチンな どに代表される天然レシチンが食品添加物として使用されており、食品の性質を改変 するために主に乳化剤等として使用され、豊富に供給されている。
[0009] 〔3〕レシチンの酵素処理
レシチンを酵素により部分的に加水分解し、新たな性質を付与する検討も行われて いる。この際に用いられる酵素がホスホリパーゼ類であり、ホスホリパーゼ A, B, C, D が知られている。グリセ口リン脂質の 1位あるいは 2位の脂肪酸を選択的に加水分解 するのがホスホリパーゼ Aである。非選択的に加水分解するのがホスホリパーゼ 、ジ ァシルグリセロールとホスホリル塩基に加水分解するのがホスホリパーゼじ、ホスファ チジン酸と塩基に分解するのがホスホリパーゼ Dである。
[0010] 食品工業の分野において、現在最も比較的多く使用されているのはホスホリパーゼ Aである。レシチンは水に難溶性である力 レシチンにホスホリパーゼ Aを作用させる とァシル基が部分的に加水分解され、水溶性のリゾレシチンが生成する。リゾレシチ ンを食品添加物として使用した場合には、得られる食品の物性がこれまでレシチンを 用いて得られて 、た食品の物性とは異なる可能性がある。
[0011] 〔4〕スフインゴリン脂質
スフインゴリン脂質は、グリセ口リン脂質とともに、リン脂質を構成している。 スフインゴリン脂質の代表はスフインゴミエリンであり、セラミドの 1級アルコールにコリ ンリン酸がリン酸ジエステル結合したィ匕合物である。動物の臓器に広く含まれて 、る。 母乳にも含有されることから、乳児用粉ミルクに配合されることもある。
スフインゴミエリンにホスホリパーゼ cを作用させるとコリンリン酸がはずれ、セラミドが 生成する。セラミドは保湿成分として、化粧品に広く使用されている。また、アトピー性 皮膚炎はセラミドが不足することにより惹起されるという報告がある。
[0012] 〔5〕食品中でのホスホリパーゼ Cの使用
ホスホリパーゼ Cを用いることにより、下図に示すように水の存在下でレシチンから ジァシルグリセロールを生産することができる。 ——
— R2 + R3—— P04
Figure imgf000005_0001
レシチン ジァシルグリセロール
[0014] (式中、 Rおよび Rは、それぞれアルキル基を、 Rは、コリン、エタノールァミン、ダリ
1 2 3
セロール、イノシトール等の基を意味する。 )
[0015] 食品素材中でこのような反応を起こさせることにより、ホスホリパーゼ Aとは本質的に 異なった性質を付加した商品が提供できる可能性がある。
ここで用いられるホスホリパーゼ Cには、様々なグリセ口リン脂質を加水分解すること が求められる。たとえば大豆レシチンにはホスファチジルコリンおよびホスファチジル エタノールアミンを主として、ホスファチジルグリセロールあるいはホスファチジルイノ シトール等も含まれていることが知られている。また、卵黄由来レシチンにはホスファ チジルコリンおよびホスファチジルエタノールァミンが主として含まれて 、る。したがつ て、用いられるホスホリパーゼ Cは、これらを区別無く加水分解することが望ましい。
[0016] しかし、食品中にはリン脂質以外にもリン酸エステルが多く含有されており、それら を加水分解してリン酸を遊離させることは、当該食品の性質をさらに変質させてしまう ことにつながるので、好ましいものではない。したがって、リン脂質以外のリン酸エステ ルは加水分解しないホスホリパーゼ Cが望ましぐ例えばグリセ口ホスホリルコリンのよ うに、リン脂質に類似するが脂質部分を含有しないリン酸エステルに対する酵素活性 は無 、ホスホリパーゼ Cが望まし 、。
[0017] 同様の観点から、用いられるホスホリパーゼ Cは、ホスファターゼ活性を有さないタ ンパク質であることが望ましい。すなわち、ホスファタ一ゼの基質となるパラ-トロフエ
-ルリン酸分解活性を有しな 、ホスホリパーゼ Cが望まし 、。
[0018] また、食品工業においては、食品の変質を防ぐため中性力も弱酸性域でさまざまな 処理を行うことが好ましぐホスホリパーゼ等を含む酵素剤はこの pH域に高い活性を 有していることが望まれる。
[0019] 〔6〕食品工業におけるホスホリパーゼ Cの使用 ホスホリパーゼ cの用途には、例えば、パンの冷凍保存生地焼成時に、その表面で 発生する老化、梨肌の緩和や食用油精製工程の改善がある。
大豆'菜種等力も食用油を製造する際には、着色あるいは食味の劣化の原因とな るため、レシチンは除去されるべき物質である。この目的のために、従来ホスホリパー ゼ Aを用いてレシチンを部分的に加水分解し、リゾレシチンとすることで水溶性にして 除去する方法が検討されてきた。
[0020] し力し、ここでホスホリパーゼ Cを用いてレシチンをジァシルグリセロールとすること により、トリァシルグリセロールと共に油の一成分にすることができる。すなわち、食用 油の製造工程において、歩留まりを向上させる効果が期待される。
[0021] ここで用いられるホスホリパーゼ Cには、様々なリン脂質を加水分解することが求め られる。たとえば大豆油中には先述した様々なリン脂質が含まれている。また、綿実 油あるいは菜種油中にも同様にさまざまなリン脂質が含まれて 、る。用いられるホス ホリパーゼ Cは、これらを区別なく加水分解することが望ま U、。
[0022] また、製油工業においては油以外の不純物を酸性加温条件下で除去するので、酸 性域での活性が高ぐある程度温度安定性を有する酵素剤の使用が望まれる。処理 される粗油を酸性にするためにクェン酸が使用されることがあるので、用いられるホス ホリパーゼ Cにはクェン酸存在下での活性およびある程度の温度安定性が望まれる
[0023] 〔7〕既知のホスホリパーゼ Cの問題点
動物、細菌、放線菌あるいは酵母が生産するホスホリパーゼ cは、主としてホスファ チジルイノシトールあるいはホスファチジルコリン選択的であり、様々な基質を分解す る必要がある食品工業における使用には向かない。さらに、動物起源の酵素剤は、 宗教的に受け入れられない国および地域があり、汎用性にも問題がある。さらに、ホ スホリパーゼ cを生産する細菌は、病原性を示すものがほとんどであり、安全性に問 題がある。
[0024] 従来知られている糸状菌由来のホスホリパーゼ Cは、様々なリン脂質を加水分解す る性質を有している。また、従来ホスホリパーゼ Cの産生に用いられているいずれの 糸状菌も食用酵素生産に実績がある特徴を有している。ァスペルギルス ·-ガーとァ スペルギルス ·サイトイの両菌株由来の酵素の、温度あるいは pHに関する性質は極 めて類似しており、分子量も同一である。いずれも酸性側で強い活性を有しているが 、中性付近では全く活性がないという特徴を有している。したがって、酸性側でこれら の酵素を使用する可能性がある製油工業においては、これらの酵素は使用できる可 能性がある。し力 クェン酸中での性質については記載がなぐ実際に製油工業で 使用できるかどうかは不明である（特許文献 3および非特許文献 7参照)。また、 pH6 での活性がほぼ 0であることが示されており、中性付近で酵素反応を行うことが多いと 考えられる食品工業にお 、ては、使用しづら 、酵素である（特許文献 3参照)。
[0025] さらに、ァスペルギルス ·-ガーが生産するホスホリパーゼ Cは、ホスファタ一ゼの基 質であるホスファチジン酸の分解活性が非常に高いことが記載されている (特許文献 3参照)。したがって、該酵素は、リン酸モノエステルを加水分解する能力を有するこ とから、ホスファターゼ活性をも併せ持つタンパク質であることが推察される。さら〖こ、 ァスペルギルス ·サイトイが生産するホスホリパーゼ Cは、 2—へキサデカノィルァミノ 4 -トロフエ-ルホスホリルコリンの分解活性が非常に高いことが記載されている (非特許文献 7参照)。したがって、該酵素は、リン脂質以外のリン酸ジエステルをカロ 水分解する能力をも併せもつタンパク質であることが推察される。したがって、これら の酵素を用いて加工される食品は、不必要に改質されてしまう可能性がある。
[0026] このように、従来知られて!/、るホスホリパーゼ Cは、酵素の特性として不十分である 力 あるいは安全性に問題がある等の問題点が挙げられ、ホスホリパーゼ Cとして巿 場に流通して 、る酵素剤は現在までに存在しな 、。望ま 、酵素剤の性質としては、 既に食品用酵素剤の生産実績がある微生物由来であり、様々なリン脂質を酸性側で も中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、製油工業においても使用可能な ようにクェン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的に安定であることが 挙げられる。さらには、グリセ口ホスホリルコリンに代表されるようなリン脂質以外のリン 酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼ Cが挙げられる。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0027] 上述のように、望ましいホスホリパーゼ Cの性質としては、様々なリン脂質を酸性側 でも中性付近でも効率よく加水分解する能力を有し、製油工業においても使用可能 なようにクェン酸緩衝液中でも活性を有するとともに、ある程度熱的に安定であること が挙げられる。さらには、グリセ口ホスホリルコリンに代表されるような、リン脂質以外の リン酸エステルを加水分解しない性質を有するホスホリパーゼ cであることが挙げられ
、さらに好ましくは、既に食品用酵素剤の生産実績がある微生物由来のホスホリパー ゼ Cであることが挙げられる。
このようなホスホリパーゼ Cを提供することは、この技術分野において非常に関心の いことでめった。
課題を解決するための手段
[0028] 本発明者らは、安全性に優れ、様々なリン脂質を酸性側でも中性付近でも効率よく 加水分解する能力を有し、クェン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある程度熱的 に安定であり、リン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しないホスホリパーゼ Cを見 出すべく鋭意検討を行ったところ、ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP- 10200 株または NBRC 4190株、あるいはァスペルギルス'タマリ IAM 13907株由来の ホスホリパーゼ Cを精製し、ァスペルギルス'オリザェ NBRC 4190株に由来するホ スホリパーゼ C遺伝子をクローユングし、本発明を完成するに至った。
[0029] すなわち本発明は、（1) 酸性から中性の pHにおいて活性を示し、かつ、リン脂質 以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しないホスホリパーゼ
(2) ホスファチジルイノシトール特異的ではない、（1)記載のホスホリパーゼ C。
(3) 至適 pHが pH3乃至 pH6の範囲にある、（1)または（2)記載のホスホリパーゼ C。
(4) pH7における相対活性が 20%以上である、（1)〜（3)のいずれか 1つ記載の ホスホリパーゼじ。
[0030] (5) 糸状菌によって産生される、（1)〜（4)のいずれか 1つ記載のホスホリパーゼ C。
(6) 糸状菌がァスペルギルス属である、 (5)に記載のホスホリパーゼ
(7) ァスペルギルス'オリザェ（Aspergillus oryzae)あるいはァスペルギルス'タマリ (Aspergillus tamarii)によって産生される、（6)に記載のホスホリパーゼ (8)ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株、 あるいはァスペルギルス'タマリ IAM 13907株によって産生される、（7)に記載のホ スホリパーゼじ。
[0031] (9) 以下の性質：
1) SDS— PAGE電気泳動法にて分子量約 87, 000を示す；
2)ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール およびホスファチジルグリセロールをカ卩水分解する；
3)グリセ口ホスホリルコリンおよびパラ-トロフエニルリン酸を実質的に加水分解しな い；
4)卵黄由来レシチンを pH3乃至 pH9の範囲で加水分解する；
5) 0°C乃至 80°Cの範囲にぉ 、て 4)記載の加水分解活性を有する；
6)温度安定性について、 pH4. 5において 45°C以下の温度で安定である；
7) pH安定性につ!、て、 pH3乃至 pHIOの範囲で安定である。
を示す（1)〜（8)の!、ずれ力 1つに記載のホスホリパーゼじ。
[0032] (10) 下記の a)〜d) :
a)配列番号 5に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質；
b)配列番号 4のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列力もなるタンパク質； c) a)または b)に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつ、ホスホリパーゼ C活性を有すること を特徴とするタンパク質；
d) a)または b)に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質、
の！、ずれか一つに記載のタンパク質であるホスホリパーゼじ。
[0033] (11) (1)〜（4)、（9)および（10)のいずれ力 1つに記載のホスホリパーゼ Cを生 産する能力を有する、単離されたァスペルギルス ·オリザェある!/、はァスペルギルス · タマリに属する糸状菌。ただし、ァスペルギルス'タマリ IAM 13907株を除く。
(12)ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株 である、（11)に記載の糸状菌。
[0034] (13) 下記の a)〜d) : a)配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド配列からなる DNA; b)上記 a)に記載の DNAと 70%以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチ ド配列からなり、かつ、ホスホリパーゼ C活性を有するタンパク質をコードすることを特 徴とする DNA;
c)配列番号 5に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA； d)配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド配列を含むことからなる DNA、 の！、ずれか一つに記載の DNA。
(14) (11)に記載の DNAにコードされるタンパク質であるホスホリパーゼじ。
[0035] (15)
1) (9)に記載のァスペルギルス'オリザェあるいはァスペルギルス'タマリを培養する 工程、および、
2) 1)の培養産物力もホスホリパーゼ Cを分離'精製する工程、
を含む、ホスホリパーゼ Cの製造方法。
[0036] (16) ァスペルギルス ·オリザェがァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 1020 0株または NBRC 4190株、ァスペルギルス'タマリがァスペルギルス'タマリ IAM 13907株である（ 15)記載の方法。
に関する。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株由来の精製ホスホリパーゼ Cの活'性と pHとの関係を表した図である。
[図 2]ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株由来の精製ホスホリパーゼ Cの活性と温度との関係を表した図である。
[図 3]ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株由来の精製ホスホリパーゼ
Cの温度安定性を表した図である。
[図 4]ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株由来の精製ホスホリパーゼ Cの pH安定性を表した図である。
[図 5]ァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株由来の精製ホスホリパーゼ Cの活性と p Hとの関係を表した図である。 [図 6]ァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株由来の精製ホスホリパーゼ Cの活性と温 度との関係を表した図である。
[図 7]ァスペルギルス.タマリ IAM 13907株由来の精製ホスホリパーゼ Cの温度安 定性を表した図である。
[図 8]ァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株由来の精製ホスホリパーゼ Cの pH安定
'性を表した図である。
[図 9]ァスペルギルス ·オリザェ NBRC 4190株由来の精製ホスホリパーゼ Cの活性 と pHとの関係を表した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0038] 以下、本発明を詳細に説明する。なお、特に指定しない限り、以下に示す各特性の 測定方法は、後述する実施例または試験例に記載の測定方法による。
本発明は、酸性から中性の pHにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸ェ ステルを実質的に加水分解しな 、ホスホリパーゼ Cであるか、ある 、は酸性から中性 の pHにおいて活性を示し、かつ、ホスファターゼ活性を有しないホスホリパーゼじで ある。
[0039] 「酸性から中性の pHにおいて活性を示す」とは、 pH約 3乃至約 7の範囲において、 相対活性が 20%以上であることを 、う。（酵素活性の測定法は「試験例 1 1) pH活 性」の記載に従う。）
[0040] また、「リン脂質以外のリン酸エステルを実質的に加水分解しない」とは、好ましくは 、ホスファチジルコリン (卵黄由来）に対する加水分解活性を 100%とした場合におけ る加水分解活性が、ホスファチジン酸に対しては 30%以下、さらに好ましくは 25%以 下であること、および Zまたはグリセ口ホスホリルコリンに対しては 15%以下、さらに好 ましくは 10%以下であること、および Zまたはパラ-トロフエ-ルリン酸に対しては 10 %以下、さらに好ましくは 5%以下であることをいう。「グリセ口ホスホリルコリンおよび ノ ラニトロフエ-ルリン酸を実質的に加水分解しな 、」につ 、ても同様である。
ここで、ホスファチジン酸は、中性脂肪およびグリセ口リン脂質の合成中間体である と認識されるため、本願の明細書等においてはグリセ口リン脂質 (リン脂質）には含ま れないものとする。 [0041] 「ホスファターゼ活性を有しな!/、」とは、ホスファチジン酸またはパラ-トロフエ-ルリ ン酸の分解活性がホスファチジルコリンの分解活性の 50%以下であることをいい、ホ スファチジン酸の分解活性については、好ましくはホスファチジルコリンの分解活性 の 40%以下、さらに好ましくは 30%以下、最も好ましくは 25%以下である。また、パ ラニトロフエ-ルリン酸の分解活性については、好ましくはホスファチジルコリンの分 解活性の 30%以下、さらに好ましくは 20%以下、最も好ましくは 10%以下である。
[0042] 本発明のホスホリパーゼ Cは、スフインゴミエリンに対する分解活性を有し、好ましく はその分解活性力 ホスファチジルコリンに対する分解活性と同等かそれ以上である 。具体的には、ホスファチジルコリン (卵黄由来）に対する分解活性を 100%とした場 合に、ホスファチジルコリンに対する分解活性力 好ましくは 90%以上、さらに好まし くは 105%以上、最も好ましくは 115%以上である。
[0043] また、本発明のホスホリパーゼ Cは、ホスファチジルエタノールァミンに対する分解 活性を有し、好ましくはその分解活性が、ホスファチジルコリンに対する分解活性と同 等である。具体的には、ホスファチジルコリン (卵黄由来）に対する分解活性を 100% とした場合にホスファチジルエタノールァミンに対する分解活性力 好ましくは 80% 以上、さらに好ましくは 85%以上、最も好ましくは 90%以上であり、 150%以下であ る。
[0044] ホスホリパーゼ Cが、「ホスファチジルイノシトール特異的ではな!/、」とは、ホスファチ ジルイノシトールの分解活性 (相対活性）に比べて、ホスファチジルイノシトール以外 の基質の分解活性の方が高いことを意味する。ここで、ホスファチジルイノシトール以 外の基質としては、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジルイノシトールまたはホスファチジルグリセロールである。
[0045] 本発明のホスホリパーゼ Cの至適 pHは、酸性から中性の pHの範囲にあることが好 ましぐさらに pH3乃至 pH6の範囲にあることが好ましぐさらに好ましくは pH3乃至 p H5の範囲であり、最も好ましくは pH4乃至 pH5の範囲である。
[0046] また、「PH7における相対活性」とは、最も活性が高 、PHでの加水分解活性を 100 %とし、 pH7における酵素の加水分解活性を相対値として百分率（％)で表したもの をいう。本発明のホスホリパーゼ Cは、 pH7における相対活性力 好ましくは 20%以 上であり、さらに好ましくは 40%以上、最も好ましくは 50%以上である。
[0047] 温度活性について、本発明のホスホリパーゼ Cは、至適温度が、 45°C乃至 70°Cの 範囲にあることが好ましぐさらには 55°C乃至 70°Cの範囲にあることが好ましぐ最も 好ましくは 60°C乃至 70°Cの範囲である。また、本発明のホスホリパーゼ Cは、 55°C 乃至 70°Cの範囲において相対活性が 50%以上であることが好ましぐさらに好ましく は 45°C乃至 70°Cの範囲において相対活性が 50%以上であり、最も好ましくは 35°C 乃至 70°Cの範囲において相対活性が 50%である。また、 55°C乃至 65°Cの範囲に お!、ては、相対活性が 80%以上であることが好まし 、。
[0048] また、温度安定性につ!、て、「安定である」とは、 40%以上の残存加水分解活性を 有していることを意味し、本発明のホスホリパーゼ Cは、 45°C以下の処理温度におい て、残存活性が好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 70%以上、最も好ましくは 80 %以上である。また、本発明のホスホリパーゼ Cは、処理温度が、好ましくは 45°C、さ らに好ましくは 50°C、最も好ましくは 60°Cにおいて、残存加水分解活性が 40%以上 である。
[0049] また、 pH安定性について、「安定である」とは、保存処理後において、 5%以上の残 存加水分解活性を有していることを意味し、本発明のホスホリパーゼ Cは、処理 pHが pH5乃至 pH9の範囲において、好ましくは残存加水分解活性力 0%以上であり、さ らに好ましくは 50%以上であり、最も好ましくは 60%以上である。また、処理 pHが p H6乃至 pH8の範囲において、好ましくは残存加水分解活性が 60%以上であり、さ らに好ましくは 70%以上であり、最も好ましくは 80%以上である。
[0050] また、本発明のホスホリパーゼ Cの別の例としては、配列番号 1, 2および 3に示され るアミノ酸配列のいずれか 1つ、好ましくはいずれ力 2つ、最も好ましくは 3つ全てを含 み、且つ、ホスホリパーゼ C活性を有するタンパク質が挙げられる。該タンパク質は、 これら 3つのうちの 2つ以上のアミノ酸配列を含む場合には、各々のアミノ酸配列の順 序は 、かなる順序であってもよ!/、。
[0051] また、配列番号 5のアミノ酸配列力 なるタンパク質において、 1若しくは数個のアミ ノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力 なり、かつ、ホスホリパーゼ C活 性を有することを特徴とするタンパク質も本発明に含まれる。置換したアミノ酸配列を 有するタンパク質が、天然型タンパク質と同等の活性を有する例として、例えば、イン ターロイキン 2 (IL— 2)遺伝子のシスティンに相当するヌクレオチド配列をセリンに相 当するヌクレオチド配列に置換して得られたタンパク質が、 IL— 2活性を保持すること が知られている（Wang, A. et al. (1984) Science 224, 1431-1433)。
[0052] また、本発明のホスホリパーゼ Cの別の例としては、配列番号 5に記載のアミノ酸配 列からなるタンパク質を挙げる事ができる。また、配列番号 5に記載のアミノ酸配列を 含むことからなるタンパク質であっても、ホスホリパーゼ C活性を有する限り本発明に 含まれる。
[0053] また、本発明のホスホリパーゼ Cの別の例としては配列番号 5に記載のアミノ酸配列 からなり、糖鎖によって修飾されているタンパク質が挙げられる。また、このようなタン ノ ク質を含むことからなるタンパク質も、ホスホリパーゼ C活性を有する限り本発明に 含まれる。
[0054] 本発明のホスホリパーゼ Cとして好適なものは、ァスペルギルス ·オリザェ FERM
ABP— 10200株または NBRC 4190株あるいはァスペルギルス'タマリ IAM 139 07株由来のホスホリパーゼじ、配列番号 5に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質 および配列番号 5に記載のアミノ酸配列力 なり、糖鎖によって修飾されているタンパ ク質が挙げられる力 より好適なものは、ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP- 1 0200株または NBRC 4190株あるいはァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株由 来のホスホリパーゼ Cおよび配列番号 5に記載のアミノ酸配列からなり、且つ糖鎖に よって修飾されて 、るタンパク質である。
[0055] 本発明において、「本発明の DNA」とは、本発明のホスホリパーゼ Cをコードする D NAをいう。 DNAとしては、 cDNA、ゲノム DNA、人工的に改変された DNA、化学 的に合成された DNAなど、現在知られる限りどのような形態であっても良!、。
[0056] 本発明の DN Aの例としては、配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド配列 であり、且つ、ホスホリパーゼ C活性を有するタンパク質をコードする DNAが挙げら れる。
[0057] 本発明の DNAの別の例としては、配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド 配列と 70%以上のヌクレオチド配列相同性を有する DNAを挙げることができる。この ような DNAとしては、自然界で発見される変異型 DNA、人為的に改変した変異型 D NA、異種生物由来の相同 DNAなどが含まれる。
[0058] また、本発明のヌクレオチドのさらに他の例としては、配列番号 4に記載のアミノ酸 配列からなるタンパク質をコードする DNAが挙げられる。なお、所望のアミノ酸に対 応するコドンは、その選択も任意でよぐ例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考 慮して常法に従い決定できる。（Grantham, R. et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 14 3-174) oさらに、これらヌクレオチド配列のコドンの一部改変は、常法に従い、所望の 改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した、部位特異的 変異導入 (site specific mutagenesis/ Mark, D. F. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666)などに従うことができる。
[0059] 本発明の DNAのまた別の例としては、配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオ チド配列からなる DNAが挙げられる。また、配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレ ォチド配列を含む DNAも、ホスホリパーゼ C活性を有するタンパク質をコードして ヽ る限り、本発明に含まれるものである。
[0060] また、本発明のホスホリパーゼ Cには、本発明の DNAによりコードされるアミノ酸配 列からなるタンパク質を挙げることができる。また、本発明のホスホリパーゼ Cにおい て、任意の一つもしくは二つ以上のアミノ酸を欠失させた改変体を作製するためには 、ェキソヌクレアーゼ Bal31等を用いて DNAを末端から削る方法 (岸本 利光ら"続 生化学実験講座 1 ·遺伝子研究法 Π"335-354)、カセット変異法 (岸本 利光、 "新生 化学実験講座 2·核酸 III 組換え DNA技術" 242-251)などに従うことができる。この ように、本発明の DNAを元に遺伝子工学的手法により得られるタンパク質であっても 、ホスホリパーゼ C活性を有する限り本発明に含まれる。このようなホスホリパーゼ ま 、必ずしも配列番号 5に記載のアミノ酸配列の全てを有するものである必要はなぐ例 えばその部分配列力もなるタンパク質であっても、該タンパク質がホスホリパーゼ C活 性を示す限り本発明のホスホリパーゼ Cに包含される。また、このようなホスホリパー ゼ Cをコードする DNAも本発明に含まれる。
[0061] 本発明に用いるホスホリパーゼ Cはホスホリパーゼ C生産菌カも精製したもの、粗精 製したもの、菌体の破砕液の他、菌体の培養上清をそのまま用いたものでも良い。ホ スホリパーゼ c生産菌を培養する際には、培地中に炭素源、窒素源の他に界面活性 剤を添加して培養するのが好ましい。あるいは魚粉、スリゴマ、綿実粕等天然素材の 培地で培養するのが好ましい。界面活性剤としては、トライトン、トウィーン、ショ糖脂 肪酸エステル、コール酸ナトリウム、デォキシコール酸ナトリウムおよびサポニン等を 挙げることができる。
[0062] ホスホリパーゼ C生産菌の培養は通常の培養装置、培地を用いて行なうことができ る。培養は液体培養、固体培養等の方法を適宜選択することができる。液体培養の 場合はフラスコ培養や発酵槽を用いた培養を行なうことができ、培養開始後は培地 の追加のな 、バッチ培養法や培養中に適宜培地を添加して 、く流加培養法を用い ることができる。培地には炭素源、窒素源を添加し、必要に応じてビタミン、微量金属 等を添加することができる。炭素源としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フ ノレクトース等の単糖類、マノレトース、セロビオース、イソマノレトース、ラタトース、スクロ ース等の二糖類、デンプン等の多糖類、マルトエタストラクト等を挙げることができる。 窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム等の無機窒素、ィ 一ストェクストラタト、マルトェクストラタト、コーンスティープリカ一、ペプトン等の有機 窒素を用いることができる。これらの培地中の組成物量は適宜選択することができる。 培養温度、 pH、通気攪拌量はホスホリパーゼ C生産に適するように適宜選択すること ができる。
[0063] ホスホリパーゼ C生産菌の培養終了後に遠心分離を行な、、菌体を除!、た培養上 清をそのまま粗酵素液として用いることができる。また、粗酵素液をイオン交換クロマ トグラフィ一等によって粗精製したり、精製したりしたものを用いることもできる。
[0064] 本発明にいうァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4 190株あるいはァスペルギルス'タマリ IAM 13907株は、本発明のホスホリパーゼ Cを産生することができるものである限り、その全ての変異株を包含する。また、これら の変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組み換え、形質導入、形質転換等により えられたものも含有される。即ち、本発明のホスホリパーゼ Cを生産するァスペルギル ス.オリザェ FERM ABP— 10200または NBRC 4190株あるいはァスペルギルス •タマリ IAM 13907株、それらの変異株およびそれらと明確に区別されない菌株は 全てァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株ある Vヽはァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株に包含される。
[0065] また、本発明のホスホリパーゼ Cは、ベクターに本発明の DNAが挿入された組換え プラスミドで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された細胞の培養産物から得る事も できる。このように適当なベクターに本発明の DNAが挿入された組換えプラスミドも 本発明に含まれる。このような目的に用いるベクターとしては、一般に知られているさ まざまなベクターを用いることができる。好適なものとしては、原核細胞用ベクター、 真核細胞用ベクター、哺乳動物由来の細胞用ベクターなどが挙げられる力 これに 限定されない。このような組換えプラスミドにより、他の原核生物、または真核生物の 宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、適当なプロモーター配列および Z または形質発現に関わる配列を有するベクターを用いる力、もしくはそのような配列を 導入することにより、発現ベクターとすることで、それぞれの宿主において遺伝子を発 現させることが可能である。このような発現ベクターは、本発明の組換えプラスミドの 好適な態様である。
[0066] 本発明の組換えプラスミドを、各種細胞に導入することにより、宿主細胞を得ること ができる。このような細胞は、プラスミドを導入することができる細胞であれば原核細 胞であっても真核細胞であってもよ！/、。
[0067] 原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli)や枯草菌（Bacillus su btilis)などが挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるに は、宿主と適合し得る種由来のレブリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでい るプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転 換細胞に表現形質 (表現型)の選択性を付与することができる配列を有するものが好 ましい。
[0068] 例えば、大腸菌としては K12株などがよく用いられ、ベクターとしては、一般に pBR 322や pUC系のプラスミドが用いられる力 これらに限定されず、公知の各種菌株、 およびベクターを使用することができる。
[0069] プロモーターとしては、大腸菌においては、トリプトファン (trp)プロモーター、ラクト ース（lac)プロモーター、トリプトファン 'ラタトース（tac)プロモーター、リポプロテイン（1 pp)プロモーター、ポリペプチド鎖伸張因子 Tu (tuffi)プロモーター等が挙げられ、ど のプロモーターも本発明のホスホリパーゼ cの産生に使用することができる。
[0070] 枯草菌としては、例えば 207— 25株が好ましぐベクターとしては pTUB228 (Ohmu ra, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93)などが用いられるが、これに限定されるも のではない。
[0071] プロモーターとしては、枯草菌の at アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードす る DNA配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。
[0072] 真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物 細胞としては、哺乳動物由来の細胞、例えば、サルの細胞である COS細胞（Gluzma n, Y. (1981) Cell 23, 175-182、 ATCC CRL— 1650)やチャイニーズ'ノ、ムスター 卵巣細胞（CHO細胞、 ATCC CCL - 61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126- 4220)等を用いる ことができる。
[0073] 脊椎動物細胞の発現プロモーターとしては、通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、ポリアデニルイ匕部位、および転写終 結配列等を有するものを使用することができ、さらにこれは必要により複製起点を有 していてもよい。該発現べクタ一の例としては、 SV40の初期プロモーターを有する p SV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1 , 854- 864)等を挙げることが できるが、これに限定されない。
[0074] 宿主細胞として、 COS細胞を用いる場合を例に挙げると、発現ベクターとしては、 S V40複製起点を有し、 COS細胞において自立増殖が可能であり、さらに、転写プロ モーター、転写終結シグナル、および RNAスプライス部位を具えたものを用いること ができる。該発現べクタ一は、ジェチルアミノエチル（DEAE)—デキストラン法（Luth man, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11 , 1295—1308)、リン酸力ノレ シゥム DNA共沈殿法（Graham, F. L. and van der Eb, A. J. (1973) Virology 52, 4 56-457)、および電気パルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1 , 841-845 )などにより COS細胞に取り込ませることができ、力べして所望の形質転換細胞を得る ことができる。また、宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、発現ベクターと共 に、抗生物質 G418耐性マーカーとして機能する neo遺伝子を発現し得るベクター、 例えば pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): "Molecular Cloning A Laboratory Ma nual〃 Cold Spring Harbor Laboratory, NY)や pSV2—neo (Southern, P. J. and Berg , P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327- 341)などをコ 'トランスフエタトし、 G418耐性 のコロニーを選択することにより、本発明のホスホリパーゼ Cを安定に産生する形質 転換細胞を得ることができる。
[0075] 昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、鱗翅類ャガ科の Spodoptera frugiperd aの卵巣細胞由来株化細胞（Sf— 9または Sf— 21)や Trichoplusia niの卵細胞由来 H igh Five細胞（Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog. I: 391- 396)などが宿主 細胞としてよく用いられ、バキュロウィルストランスファーベクターとしてはオートグラフ ァ核多角体ウィルス (AcNPV)のポリヘドリンタンパク質のプロモーターを利用した p VL1392Z1393力よく用いられる（Kidd, I. M. and V.C. Emery (1993) The use of b aculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 42, 137 -159)。この他にも、バキュロウィルスの P10や同塩基性タンパク質のプロモーターを 利用したベクターも使用できる。さらに、 AcNPVのエンベロープ表面タンパク質 GP6 7の分泌シグナル配列を目的タンパク質の N末端側に繋げることにより、組換えタン パク質を分泌タンパク質として発現させることも可能である（Zhe-mei Wang, et al. (19 98) Biol. Chem., 379, 167—174)。
[0076] 真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、酵母が一般によく知られており、そ の中でもサッカロミセス属酵母、例えばパン酵母 Saccharomyces cerevisiaeや石油酵 母 Pichia pastorisが好ましい。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例 えば、ァノレコーノレ脱水素酵素遺伝子のプロモーター（Bennetzen, J.し and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018- 3025)や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモー ター（Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1—5)などを好まし く利用できる。また、分泌型タンパク質として発現させる場合には、分泌シグナル配列 と宿主細胞の持つ内在性プロテアーゼあるいは既知のプロテアーゼの切断部位を N 末端側に持つ組換え体として発現することも可能である。例えば、トリプシン型セリン プロテア一ゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、 N末端側 に酵母の aファクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つ KEX2プロテアーゼの 切断部位をつなぎ発現させることにより、活性型トリプターゼが培地中に分泌されるこ とが知られている（Andrew, L. Niles.et al. (1998) Biotechnol.Appl. Biochem. 28, 125 -131)。
[0077] 上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従!、培養することができ、該培養 により細胞内、または細胞外に本発明のホスホリパーゼ Cが産生される。該培養に用 いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択 でき、例えば、上記 COS細胞であれば、 RPMI 1640培地やダルベッコ改変ィーグ ル培地（以下「DMEM」 t 、う）などの培地に、必要に応じゥシ胎児血清などの血清 成分を添加したものを使用できる。培養条件としては、 CO濃度は 0乃至 50%の範
2
囲であればよぐ好適には 1乃至 10%でありより好適には 5%である。培養温度は 0 乃至 99°Cであればよぐ好適には 20乃至 50°Cであり、より好適には 35乃至 40°Cで ある。
[0078] 上記培養により形質転換体の細胞内または細胞外に糸且換えタンパク質として産生 される本発明のホスホリパーゼ Cは、培養産物中から、そのタンパク質の物理ィ匕学的 性質、化学的性質、生化学的性質 (酵素活性など)等を利用した各種の分離操作（「 生化学データブック II」、 1175-1259項、第 1版第 1刷、 1980年 6月 23日株式会社東京 ィ匕学同人発行; Biochemistry, vol. 25, No.25, p8274- 8277 (1986); Eur. J. Biochem., 163, p313-321 (1987)等参照）により分離、精製することができる。該方法としては、具 体的には例えば通常の再構成処理、タンパク質沈殿剤による処理 (塩析法）、遠心 分離、浸透圧ショック法、凍結融解法、超音波破砕、限外ろ過、ゲル濾過、吸着クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティークロマトグラフィー、高速 液体クロマトグラフィー (HPLC)等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、それらの 組み合わせ等を例示することができる。上記により、高収率で所望の組換えタンパク 質を工業的規模で製造することができる。また、発現させる組換えタンパク質に 6残基 力 なるヒスチジンを繋げることにより、ニッケルァフィユティーカラムで効率的に精製 することができる。上記方法を組み合わせることにより容易に高収率、高純度で本発 明のホスホリパーゼ Cを大量に製造することができる。 [0079] 以上のような方法により製造されたホスホリパーゼ Cも本発明の好適な例としてあげ ることがでさる。
[0080] ホスホリパーゼ C生産菌とは、実質的にホスホリパーゼ C生産能を有する微生物を いい、ホスホリパーゼ Cを菌体内に蓄積する微生物や、菌体外に分泌する微生物等 を含む。ホスホリパーゼ C生産菌の培養上清または培養上清カゝら精製したホスホリパ ーゼ Cを用いる場合には菌体外にホスホリパーゼ Cを分泌する菌を用いることができ る。
[0081] 本発明に用いるホスホリパーゼ Cとしては、ァスペルギルス ·オリザェまたはァスぺ ルギルス'タマリ由来のホスホリパーゼ Cを用いることができ、より好適なものは、ァス ペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株あるいはァス ペルギルス ·タマリ IAM 13907株由来のホスホリパーゼ Cを用いることができる。ホ スホリパーゼ Cは、これらホスホリパーゼ C生産菌自身が生産するものでもよいし、そ の変異体または修飾体が生産するものであってもよぐ更に、これらホスホリパーゼ C 生産菌のホスホリパーゼ Cをコードする遺伝子を宿主に導入して得られた形質転換 体から生産される組換えタンパク質であってもよ!/ヽ。
[0082] ホスホリパーゼ C生産菌の入手
ァスペルギルス ·オリザェ NBRC 4190株は独立行政法人製品評価技術基盤機 構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NBRC : NITE Biological Resource Center；〒 292— 0818 日本国千葉県木更津巿かずさ鎌足 2— 5— 8、ホームべ一 ジアドレス く http://www.nite.go.jp/〉）より入手することができる。
ァスペルギルス ·タマリ IAM 13907 ( =IAM 13907)株は東京大学分子細胞生 物 研究所 (I AM institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo；〒 113— 0032 東京都文京区弥生 1— 1— 1、ホームページアドレス 〈htt p://www.iam.u— tokyo.ac.jp/indexe. html〉)より人手すること力 sでさる。
[0083] ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株の菌学的性質を以下に示す。
ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株をクリックの文献（Klich, M. A. (2 002) Identmcation of common Aspergillus し entraalbureau voor Schimmelcultures , Ut recht, The Netherlands)に従 ヽ、 4種類の培地（CYA培地， CY20S培地， CZ培 地， MEA培地）に接種して、菌学的性状を観察した。
[0084] 色調の表示は「メチューン'ノヽンドブック'ォブ 'カラー」（Kornerup, A. and Wanscher , J. H. (1978) Methuen handbook of colour (3rd. edition). Erye Methuen, London.) に従った。
[0085] 4種類の培地（CYA培地， CY20S培地， CZ培地， MEA培地）の組成は以下 の通りである。
[0086] CYA培地 [ザペック イースト ァガー（Czapek Yeast Extract Agar)培地]
(K HPO 1. Og, *ザペック濃縮液 10ml,イーストエキス 5g,シユークロース 3
2 4
Og,寒天 15g,蒸留水 1000ml)
*ザペック濃縮液（NaNO 30g, KC1 5g, MgSO · 7Η O 5g, FeSO - 7H O
3 4 2 4 2
0. lg, ZnSO - 7H O 0. lg, CuSO - 5H O 0. 05g,蒸留水 100ml)
4 2 4 2
[0087] CY20S培地 [20% シユークロース ザペック イーストァガー（Czapek Yeast Extrac tAgar with 20% Sucrose)培地]
(K HPO 1. Og, *ザペック濃縮液 10ml,イーストエキス 5g,シユークロース 2
2 4
00g,寒天 15g,蒸留水 1000ml)
[0088] CZ培地 [ザペック ドックス ァガー（Czapek Dox Agar)培地]
(K HPO 1. 0 g, *ザペック濃縮液 10 ml, シユークロース 30 g, 寒天
2 4
17. 5 g, 蒸留水 1000 ml)
[0089] MEA培地 [モルト エキス ァガー（Malt Extract Agar)培地]
(モルトエキス 20g,ペプトン lg,グルコース 20g,寒天 20g,蒸留水 1000ml )
[0090] 1)菌学的性状
ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株の菌学的性状
CYA培地でのコロニーは、 25°C、 1週間の培養で直径 36— 40mmである。コ口- 一はやや厚ぐ羊毛状で、中心部では綿毛状となり、中心部から放射状の溝を形成 する。菌糸は白色である。分生子は中心部に疎に形成され、灰黄色 (4B4)力も黄白 色 (4A2)を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は淡黄色（2A4)から白色（ 2A1)で、中心部から放射状の溝を形成する。可溶性色素は観察されない。 CYA培地でのコロニーは、 37°C、 1週間の培養で直径 54— 58mmである。コ口- 一は厚ぐ羊毛状である。菌糸は白色である。分生子は、中心部に形成され、灰黄色 (4B4)力 黄白色 (4A2)を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は薄橙色（ 4A4)から白色 (4A2)で、中心部から放射状の溝を形成する。可溶性色素は観察さ れない。
[0091] CY20S培地でのコロニーは、 25°C、 1週間の培養で直径 35— 41mmである。コロ ニー性状は CYA培地と同様となるが、中心部の綿毛状の菌糸がやや多い。
[0092] CZ培地でのコロニーは、 25°C、 1週間の培養で直径 17— 21mmである。コロニー 性状は CYA培地と同様となる力 コロニーは小さぐ分生子の形成が疎となる。
[0093] MEA培地でのコロニーは、 25°C、 1週間の培養で直径 37— 4 lmmである。コ口- 一は薄ぐ綿毛状である。菌糸は白色である。分生子は中心部に疎に形成され、暗 緑色（26D4)から灰緑色（26D6)を呈する。浸出液、菌核は観察されない。裏面は 灰黄色 (4B3)力 黄白色 (4A2)で、可溶性色素は観察されな!、。
14°Cから 42°Cまで生育し、 18°Cから 38°Cまで分生子形成が観察された。
[0094] 分生子頭は放射状力 緩い円柱状である。分生子柄は幅 6. 7 - 13. 6 /z m、長さ 3 02. 2 - 1398. O ^ m,無色、粗面である。頂嚢は亜球形力らフラスコ形、幅は 14. 6 - 29. 3 μ mである。ァスぺノレギラ（aspergilla)は主に単列（uniseriate)、まれに 2列 (bi seriate)である。メトレまたはフィアライドは頂嚢の上部半分力も形成される。メトレは 1 1. 3 - 28. 3 X 5. 2 - 9. 9 mである。フィアライドはフラスコ形で、 8. 4— 21. 3 X 3 . 8 - 7. である。分生子は滑面、亜球形から卵形、直径 4. 2 - 6. 3 mである
[0095] 以上の菌学的性状より、本菌に該当する菌を検索したところ、クリックの文献に記載 されているァスペルギルス オリザェ（アールブルク）コーン（Aspergillus oryzae(Ahlbu rg)Chon)の性状とほぼ一致した。よって、 FERM ABP— 10200株をァスペルギル ス.オリザェ（アールブルク）コーン（Aspergillus oryzae (Ahlburg)Chon)と同定し、独 立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
[0096] ホスホリパーゼ C生産菌力 得られたホスホリパーゼ Cの具体的な性質にっ 、て以 下に示す力 本発明のホスホリパーゼ Cの有する性質は必ずしもこれらに限定される ものではない。
[0097] ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株あるい はァスペルギルス'タマリ IAM 13907株により生産され、精製されたホスホリパーゼ Cは、以下の性質を有する。
1) SDS— PAGE電気泳動法にて分子量約 87, 000を示す。
2)卵黄由来レシチンけ力ライ 'テスタ (株)製)を pH3乃至 pH9の範囲で加水分解す る。
3) 0°C乃至 80°Cの範囲で 4)記載の加水分解活性を有する。
4) pH4. 5にお!/、て 45°C以下の温度で安定である。
5) pH3乃至 pHIOの範囲で安定である。
6) 2)記載の加水分解活性の最適 pHは pH4. 5である。
7) 3)記載の加水分解活性の最適温度は pH4. 5では 65°Cである。
8)ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール およびホスファチジルグリセロールを加水分解する力 グリセ口ホスホリルコリンおよび ノ ラニトロフエ-ルリン酸を実質的に加水分解しない。
[0098] 一例として、卵黄由来ホスファチジルコリンに対する活性を 100%としたときの相対 活性を表 1に示した。なお、表中卵黄由来基質および大豆由来基質はその旨を記載 した。また、卵黄由来レシチンはナカライテスタ (株）、大豆由来レシチンは辻製油 (株 )から購入し、それ以外の基質はシグマアルドリッチジャパン (株)から購入した。
[0099]
相対活性 (%) 基質 ホスファチジルコリン （卵黄由来） 1 0 0
ホスファチジルェタノ一ルァミン （卵黄由来） 1 0 1
ホスファチジルグリセロール （卵黄由来） 1 6 2
ホスファチジン酸 （卵黄由来） 1 7
レシチン （卵黄由来） 8 8
リゾホスファチジルコリン （卵黄由来） 4 1
グリセ口ホスホリルコリン （大豆由来） 5
パラニトロフエニルリン酸 0
ホスファチジルコリン （大豆由来） 9 4
ホスファチジルェタノ一ルァミン （大豆由来） 9 0
ホスファチジルイノシトール （大豆由来） 5 9
レシチン （大豆由来） 8 2
スフインゴミエリン （牛脳由来） 1 2 1
スフインゴミエリン（卵黄由来） 1 2 5
[0100] 9)下記に示す部分アミノ酸配列を有する。配列は N末端から記す。
Thr - Ala - Asp— Ser— Ala— Thr - Ala - lie - Gly -
Tyr - Val - Thr -Pro -Ser- Met (配列番号 1 )。
[0101] Glu - Ala - Tyr -Gly -Ser -Leu -Leu -Thr- Pro -
Pro (配列番号 2)。
[0102] Val— Pro— Pro— Ser— His— Asn— Pro - Gin - Trp -
Ala (配列番号 3)。
[0103] 10)タンパク質が糖鎖で修飾されている。
[0104] 以上のことから、本発明のホスホリパーゼ Cの有する性質としては以下のようなもの が挙げられるが、これに限定されるものではない。
1) SDS— PAGE電気泳動法にて分子量約 87, 000を示す。 2)卵黄由来レシチン (ナカライテスタ (株)）を pH3乃至 pH9の範囲で加水分解する。
3) 0°C乃至 80°Cの範囲で 4)記載の加水分解活性を有する。
4) pH4. 5にお!/、て 45°C以下の温度で安定である。
5) pH3乃至 pHIOの範囲で安定である。
[0105] また、本発明のホスホリパーゼ Cを製造する方法も本発明に含まれる。
ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株あるい はァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株を初めとするホスホリパーゼ C産生微生物 を培地で培養することにより、ホスホリパーゼ Cを生産することができる。例えば、 0. 1 乃至 5. 0%ポリペプトン (和光純薬工業 (株)）、 0. 1乃至 1. 0%イーストエタストラクト (日本べタトン 'ディッキンソン (株））に 0. 05乃至 1. 0%デォキシコール酸ナトリウム を添カ卩した培地または 0. 1乃至 4. 0%ファーマメディア（TRANDERS PROTEIN (株） )に 0. 05から 1. 0%トライトン X— 100 (シグマアルドリッチジャパン (株））もしくは 0. 0 5乃至 0. 3%卵黄レシチンを添カ卩した培地あるいは 1乃至 10%魚粉 (池口喜一郎商 店）の培地で、 16乃至 45°Cで 1乃至 15日間、 100乃至 250rpmで振とう培養する。 実施例
[0106] 以下に、実施例および試験例を挙げるが、本発明の範囲はこれらに限定されるもの ではない。
[0107] 実施例 1 ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株からのホスホリパー ゼ Cの精製
1)粗酵素液の調製
滅菌した表 2の組成の培地 100mlが入っている 500ml容の三角フラスコ（種フラスコ )にフィルター滅菌した 5 %デォキシコール酸ナトリウム溶液 lmlおよびァスペルギル ス.オリザェ FERM ABP— 10200株の菌体を接種し、 26°Cにて 7日間、 170rpmの 振とう培養を行った。 [0108] 培地 ポリべプ卜ン 4 0 g
ィーストェクストラクト 5 g
リン酸水素 2カリウム 0 . 2 g
硫酸マグネシウム 0. 5 g
純水で 1 , 0 0 O mlとした。
[0109] 培養終了後、 4°C、 10, 000 X Gにて 10分間の遠心分離を行った。得られた上清 を粗酵素液とした。
[0110] 2)酵素活性測定法
ホスホリパーゼ Cの加水分解活性は以下のようにして測定した。
〈1〉レシチンの加水分解反応
卵黄レシチン（ナカライテスタ（株）） 1. 5gを 4% (wt/v)TritonX— 100 50mlに溶 解した基質溶液 60 μ 1に 200mM酢酸緩衝液 (pH5. 5) 60 μ 1をカ卩えて 37°Cで保温し た。この混合液に酵素液 60 1をカ卩ぇ撹拌して均一にし、 37°Cで保温して 3時間酵 素反応を行った。
[0111] く 2〉遊離ホスホリル塩基の加水分解反応
酵素反応の結果生じるホスホリル塩基をアルカリホスファターゼで加水分解した。く 1 〉で調整した酵素反応液 1に 200mMトリス'塩酸緩衝液 (pH8. 0) 50 1およびァ ルカリホスファターゼ（シグマアルドリッチジャパン (株）） 1 μ 1をカ卩えて 37°Cで 40分反 応を行った。なおこのときブランクとしてアルカリホスファターゼをカ卩えな 、サンプルも 同時に調整した。
[0112] 〈3〉無機リン酸の定量
く 2〉の結果生じた無機リン酸をホスファ Cテストヮコー（和光純薬工業 (株)）で定量し た。〈2〉で得られた反応液 100 1にホスファ Cテストヮコ一の A液および B液を各 lml 添加し、 37°Cで 20分間反応した。この混合液の 750應における吸光度を測定した。 ブランクとの差がホスホリパーゼ C活性になる。酵素反応 1分間当たり l /z molのホスホ リル塩基を生成する酵素活性を 1単位とした。 [0113] 3)精製酵素液の調製
1)で得られた粗酵素液 1, 200mlを 10mMトリス '塩酸緩衝液（pH7. 5) 8, OOOml に対して 12時間ずつ 8回透析した。これを、予め 10mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5) で平衡化した DEAEトヨパール (東ソ一（株））カラム（直径 2. 2cm X長さ 20cm)に添 加し、吸着させた。 10mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で該カラムを十分洗浄した後 、 10mMトリス '塩酸緩衝液（pH7. 5) 600ml中に 0乃至 0. 2Mの塩化ナトリウムの直 線的濃度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン 分解活性は塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 05M乃至 0. 08Mの画分（90ml)に溶出された。 これを粗精製酵素画分とした。
[0114] 得られた活性画分 90mlを 20mMトリス.塩酸緩衝液（pH7. 5) 4, OOOmlに対して 12 時間ずつ 3回透析した後、予め 20mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で平衡化した Mo noQ (アマシャムバイオサイエンス（株） )カラム（直径 10mm X長さ 10cm)に添加し、 吸着させた。該カラムを 20mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で十分洗浄した後、 20m Mトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5) 250ml中に 0乃至 0. 2Mの塩化ナトリウムの直線的濃 度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活 性は塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 1M乃至 0. 12Mの画分（25ml)に溶出された。
[0115] 得られた活性画分 25mlを濃縮し、予め 0. 15M塩ィ匕ナトリウムを含む 10mMトリス' 塩酸緩衝液（PH7. 5)で平衡化した HiLoad Sephadex200pg (アマシャムバイオサイエ ンス (株））カラム（直径 16mm X 60cm)に添カ卩した後、 0. 15M塩化ナトリウムを含む 1 OmMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)にて溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は、 溶出量が 60ml乃至 70mlの画分に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
[0116] 4)精製酵素の分子量測定
12. 5%ポリアクリルアミドゲルを用いた SDS— PAGE電気泳動法（Laemmli, U.K., Nature, 227, 680(1970)参照）により、精製酵素の分子量を求めた。標準タンパク質と して次のものを用いた： a.ホスホリラーゼ（phosphorylase)、分子量 94, 000 :b.アル ブミン（albumin)、分子量 67, 000 : c.ォバルブミン（ovalbumin)、分子量 43, 000 : d .カルボニック 'アンヒドラーゼ（carbonic anhydrase)、分子量 30, 000 : e.トリプシン' インヒビター（trypsin inhibitor)、分子量 20, 100 :f. α—ラタタルブミン（ a - lactalbu min)、分子量 14, 400。
精製酵素は分子量約 87, 000の単一バンドを示した。
[0117] 実施例 2 ァスペルギルス'タマリ IAM 13907株からのホスホリパーゼ Cの精製 1)粗酵素液の調製
表 2に示した組成の培地 100mlが入っている 500ml容の三角フラスコ（種フラスコ） にフィルター滅菌した 5 %デォキシコール酸ナトリウム溶液 lmlおよびァスペルギルス 'タマリ IAM 13907株の菌体を接種し、 26°Cにて 5日間、 170rpmの振とう培養を行 つた。培養終了後、 4°C、 10, 000 X Gにて 10分間の遠心分離を行った。得られた上 清を粗酵素液とした。
[0118] 2)精製酵素液の調製
実施例 1. 3)と同様に精製を行い、精製酵素溶液を得た。
[0119] 3)精製酵素の分子量測定
実施例 1. 4)と同じ方法で測定した。
精製酵素は分子量約 87, 000の単一バンドを示した。
[0120] 実施例 3 ァスペルギルス'オリザェ NBRC 4190株からのホスホリパーゼ Cの精製 1)粗酵素液の調製
滅菌した表 3の組成の培地 100mlが入っている 500ml容の三角フラスコ（種フラスコ ) ίこ スぺノレギノレス '才リザェ NBRC 4190株の菌体を接種し、 260G【こて 7日 [¾、 17 Orpmの振とう培養を行った。
[0121] 培地 魚粉 5 0 g
純水で 1， 0 0 O mlとした。
[0122] 培養終了後、 4°C、 10, 000 X Gにて 10分間の遠心分離を行った。得られた上清 を粗酵素液とした。
[0123] 2)精製酵素液の調製 1)で得られた粗酵素液 600mlを 10mMトリス '塩酸緩衝液（pH7. 5) 8, OOOmlに対 して 12時間ずつ 5回透析した。これを、予め 10mMトリス '塩酸緩衝液 (pH7. 5)で平 衡化した DEAEトヨパール (東ソ一（株））カラム（直径 2. 2cm X長さ 20cm)に添加し、 吸着させた。 10mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で該カラムを十分洗浄した後、 10m Mトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5) 600ml中〖こ 0乃至 0. 6Mの塩化ナトリウムの直線的濃 度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活 性は塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 30M乃至 0. 35Mの画分（50ml)に溶出された。これを 粗精製酵素画分とした。
[0124] 得られた活性画分 50mlを 20mMトリス.塩酸緩衝液（pH7. 5) 4, OOOmlに対して 12 時間ずつ 3回透析した後、予め 20mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で平衡化した Mo noQ (アマシャムバイオサイエンス（株） )カラム（直径 10mm X長さ 10cm)に添加し、 吸着させた。該カラムを 20mMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)で十分洗浄した後、 20m Mトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5) 250ml中に 0乃至 0. 6Mの塩化ナトリウムの直線的濃 度勾配を作製して該カラムに吸着した成分を溶出させた。卵黄由来レシチン分解活 性は塩ィ匕ナトリウム濃度が 0. 12M乃至 0. 20Mの画分（35ml)に溶出された。
[0125] 得られた活性画分 35mlを濃縮し、予め 0. 15M塩ィ匕ナトリウムを含む 10mMトリス' 塩酸緩衝液（PH7. 5)で平衡化した HiLoad Sephadex200pg (アマシャムバイオサイエ ンス (株））カラム（直径 16mm X 60cm)に添カ卩した後、 0. 15M塩化ナトリウムを含む 1 OmMトリス'塩酸緩衝液 (pH7. 5)にて溶出させた。卵黄由来レシチン分解活性は、 溶出量が 60ml乃至 70mlの画分に溶出された。
この画分を精製酵素溶液とした。
[0126] 3)精製酵素の分子量測定
実施例 1の 4)と同じ方法で測定した。
精製酵素は分子量約 87, 000の単一バンドを示した。
[0127] 実施例 4 ァスペルギルス'オリザェ NBRC 4190株からのホスホリパーゼ Cの部分 アミノ酸配列の決定
精製した酵素溶液を約 lmg/ml程度まで限外濾過膜 (ザルトリウス (株) VIVASPIN2, 分子量分画 1万）を用いて濃縮した。濃縮酵素液 150 ^Denature buffer(6M塩酸 グァ-ジン、 10mM EDTA、0. 1M炭酸水素アンモ-ゥム pH7. 8) 150 1および 50 mM ジチオスレィトール 6 1をカ卩え、 95°Cで 10分間反応させた。室温まで冷却後、 反応液に Denature buffer溶液に溶解した 50mMョードアセトアミド 30 μ 1を加え、喑所 室温で 1時間反応させた。この溶液を 20mM炭酸水素アンモ-ゥム (ρΗ8. 0)で予め 平衡化してぉ 、た Hitrap Desalting (アマシャムバイオサイエンス（株） )カラムに添カロ した後、 20mM炭酸水素アンモ-ゥム（pH8. 0)にて溶出させた。溶出量が 1. 5ml乃 至 2. 5mlの画分に溶出した溶液を凍結乾燥し、 20mM炭酸水素アンモ-ゥム (pH8. 0) 100 1に溶解した。得られた溶液にトリプシン (Modified,プロメガ (株）） 60ユニット を加え、 37°Cで 18時間酵素反応させた。反応液を高速液体クロマトグラフィー（日立 製作所 (株)）にかけて分解アミノ酸のピークを分離した。分離条件を以下に示す。
[0128] カラム：東ソー（株） TSKgel ODS- 120T (4. 6mm X 150mm)
A buffer: 0. 1%TFA/Water
B buffer: 0. l%TFA/Acetonitril
グラジェント： 10→70%B 2%/ml
Flow : 1ml/分
[0129] 分離した分解アミノ酸のうち、 3本のピーク (B buffer濃度 30から 38%程度）を分取 し、これについてアミノ酸配列解析装置（Precise cLC、アプライドバイォシステムズジ ャパン (株)）でアミノ酸配列を解析した。その結果得られた部分アミノ酸配列をァミノ 末端側から記す。
[0130] Thr— Ala— Asp -Ser-Ala- Thr - Ala - lie - Gly - Tyr― Val― Thr Pro— Ser— Met (配列番号 1)。
[0131] Glu— Ala— Tyr — u y— Ser— Leu— Leu— Thr— Pro—
Pro (配列番号 2)
[0132] Val -Pro -Pro — Ser— riis— Asn— Pro― Gin― frp—
Ala (配列番号 3)
[0133] 実施例 5 ァスペルギルス'オリザェ NBRC 4190株由来のホスホリパーゼ Cをコー ドする DN Aの同定
1)全 RNAの精製 ァスペルギルス ·オリザェ NBRC 4190株を液体培地（2%ポリペプトン、 0. 5% イースト ェクストラタト、 0. 02%リン酸水素 2カリウム、 0. 05%硫酸マグネシウム） 2 Omlで 26°C、 1日間前培養した。その後、液体培地（5%魚粉）に 1%植菌し、 26°Cで 4日間培養した。培養した菌体を吸引集菌し、—80°Cで冷やした乳鉢 (オートクレー ブ滅菌済）に移した。液体窒素を加えながら、乳棒で菌体を破砕し、粉末状にした。 完全に粉末状になった菌体を RNeasy Plant Mini Kit (キアゲン (株)）を用いて全 RN Aの精製を行った。 905ng/ 1の濃度の溶液力 50 1得られた。
[0134] 2)ホスホリパーゼ C遺伝子の解読
5'RACE法および 3'RACE法にて遺伝子配列の解読をおこなった。具体的には、 5 'RACE Systemおよび 3'RACE System (いずれもインビトロジェン (株））を使用し、 ポリメラーゼとして Ex Taq™ (タカラバイオ (株))を用いて PCRをおこなった。このときに 使用した PCRプライマーは、 5'側の遺伝子配列増幅用に 5'- GGCCACGCGTCGAC TAGTAC-3 'および 5 '- GACAGTGTAGTCGAGCACAGCGAA- 3 '、 3 '側の遺伝子配 列増幅用に 5'- GACTCTGCCACCGCAATCGGCTA- 3'および 5'- GGCCACGCGTC GACTAGTAC- 3'を用いた。 PCRサイクルは、 94°C ' 5分、（94°C ' 30秒、 55°C - 30 秒、 72で' 2分30秒） 30、 72°C ' 10分、 4°Cで増幅した。 5'側の遺伝子配列約 12 OOb.p.、 3'側の遺伝子配列約 800b.p.の長さの DNAが増幅された。
[0135] 各々の PCR産物をァガロースゲル電気泳動をおこなった後、 QIAquick Gel Extarct ion Kit (キアゲン (株)）で精製した。精製物を TOPO™TAクローユングキット (インビト ロジェン (株)）を用いてベクターに連結し、形質転換をおこなった。形質転換した大 腸菌を 37°C、一晩寒天培地 (LB/Agar (和光純薬工業 (株)））上で培養した後、生育 したコロニーを 37°C、一晩液体培地 (LBbroth (和光純薬工業 (株)））で培養した。増 殖した大腸菌力 プラスミドを QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン (株））を用いて精 製し、 DNA配列解析をおこなった。 DNA配列解析の結果を配列番号 4に示した。また 、 DNA配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 5に示した。
[0136] 実施例 6 ァスペルギルス'オリザェ NBRC 4190株由来ホスホリパーゼ Cのグリコ ぺプチダーゼ処理
1)酵素反応 精製した酵素溶液を限外濾過膜 (ザルトリウス (株) VIVASPIN2、分子量分画 1万)を 用いて濃縮した。濃縮酵素液 20 1に、蒸留水 15 1、 0. 25mMリン酸緩衝液 (pH7 . 5) 10 1ぉょび1\1 2-メルカプトエタノール/ 2%ドデシル硫酸ナトリウム溶液 2. 5 μ 1を加え、 95°Cにて 5分間反応した。急冷後、 15%Triton X-100 (シグマアルドリッチ ジャパン (株)） 2. 5 1を加え、グリコべプチダーゼ F (シグマアルドリッチジャパン (株） ) 10ユニットを加えて、 37°Cにて 20時間反応した。
[0137] 2)反応後の分子量測定
実施例 1の 4)と同じ方法で測定した。
酵素反応後の分子量約 63,000の単一バンドを示した。
[0138] 試験例 1 ァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株由来ホスホリパーゼ Cの精製酵素液の諸性質
実施例 1の 3)で得られた精製酵素液について、活性測定を行なった。
[0139] 1) PH活性
実施例 1の 2)に示した方法に拠った。ただし酵素反応時間は 37°C、 10分間とした 。また、緩衝液は次のものを用いた: pH2. 3乃至 pH3. 7の場合、グリシン一塩酸緩 衝液: pH3. 3乃至 pH6. 2の場合、クェン酸一クェン酸ナトリウム緩衝液: pH6. 1乃 至 pH8. 0の場合、 MOPS緩衝液： pH8. 2乃至 pH9. 2の場合、 Atkins— Pantin 緩衝液。最も活性が高カゝつた pH条件での加水分解活性を 100%とし、各 pHにおけ る酵素の加水分解活性を相対値として図 1に記載した。至適 pHはクェン酸緩衝液中 pH4. 5付近であった。
[0140] 2)温度活性
クェン酸緩衝液 PH4. 5における温度活性を測定した。測定法は実施例 1の 2)に 示した方法に拠った。ただし酵素反応時間は 37°C、 20分間とした。最も活性が高か つた温度条件での加水分解活性を 100%とし、各温度における酵素の加水分解活 性を相対値として図 2に記載した。至適温度は 65°C付近であった。
[0141] 3)温度安定性
精製酵素溶液を種々の温度で 30分間処理した後、その残存加水分解活性を測定 した。あらかじめ処理温度に保持した 25mMクェン酸緩衝液 (pH4. 5) 90 /z lに、精 製酵素液 10 を加え撹拌して均一にし、 30分間保温した。実施例 1で作製した卵 黄レシチン溶液 60 μ 1に 200mMクェン酸緩衝液 (pH4. 5) 60 μ 1をカ卩ぇ 37°Cに保持 し、加温処理した酵素液 60 /z lを加え、 37°Cで 30分間酵素反応を行った。遊離ホス ホリル塩基の定量は実施例 1の 2)にしたがった。最も高い残存加水分解活性を 100 %とし、各温度における加水分解活性を相対値として図 3にまとめた。 pH4. 5におい て少なくとも 60°C以下の温度で安定であった。
[0142] 4) pH安定性
精製酵素液 30 1に、以下に述べる各 pHの 200mM緩衝液 30 1を添カ卩し、 37°C にて 30分間保温した。緩衝液は次のものを用いた: pH2. 7乃至 pH3. 2の場合、グ リシン—塩酸緩衝液: pH3. 5乃至 pH6. 1の場合、酢酸—酢酸ナトリウム緩衝液: pH 6. 3乃至 pH7. 9の場合、 MOPS緩衝液： pH8. 3乃至 ρΗΙΟ. 8の場合、 Atkins— Pantin緩衝液。 200mMクェン酸緩衝液 (pH4. 5) 60 /z l、および実施例 1の 2)記載 の卵黄レシチン溶液 60 μ 1の混合液に、加温した酵素混合液 60 μ 1に水 60 μ 1を加え た溶液のうち 60 1を加え撹拌して均一にし、 37°Cで 10分間酵素反応を行った。遊 離ホスホリル塩基の定量は実施例 1の 2)にしたがった。最も高い残存加水分解活性 を 100%とし、各 pHにおける加水分解活性を相対値として図 4にまとめた。 pH3乃至 pHIOの範囲で安定であった。
[0143] 5)精製酵素の基質選択性
次に、基質選択性を測定した。実施例 1の 3)で調製した精製酵素液を用いた。測 定方法は実施例 1の 2)に拠った。ただし、酵素反応は 200mMクェン酸緩衝液 pH4. 5中で 37°Cで保温して 10分間行った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水 分解活性を 100%としたときの、相対活性を表 4に示す。 [0144]
相対活性 (%) 基質 ホスファチジルコリン （卵黄由来） 1 0 0
ホスファチジルェタノ一ルァミン （卵黄由来） 1 0 1
ホスファチジルグリセロール （卵黄由来） 1 6 2
ホスファチジン酸 （卵黄由来） 1 7
レシチン （卵黄由来） 8 8
リゾホスファチジルコリン （卵黄由来） 4 1
グリセ口ホスホリルコリン （大豆由来） 5
パラニトロフエニルリン酸 0
ホスファチジルコリン （大豆由来） 9 4
ホスファチジルェタノ一ルァミン （大豆由来） 9 0
ホスファチジルイノシトール （大豆由来） 5 9
レシチン （大豆由来） 8 2
スフインゴミエリン（牛脳由来） 1 2 1
スフインゴミエリン（卵黄由来） 1 2 5
[0145] 試験例 2.ァスペルギルス'タマリ IAM 13907株由来ホスホリパーゼ Cの精製酵素 液の諸性質
実施例 2の 2)で得られた精製酵素液にっ 、て、活性測定を行なった。
[0146] 1) PH活性
試験例 1.に示した方法に拠った。最も活性が高力つた pH条件での加水分解活性 を 100%とし、各 pHにおける酵素の加水分解活性を相対値として図 5に記載した。 至適 pHは pH4. 5付近であった。
[0147] 2)温度活性
試験例 1.に示した方法に拠った。最も活性が高力つた温度条件での加水分解活 性を 100%とし、各温度における酵素の加水分解活性を相対値として図 6に記載した 。至適温度は 65°C付近であった。 [0148] 3)温度安定性
試験例 1.に示した方法に拠った。最も高い残存加水分解活性を 100%とし、各温 度における加水分解活性を相対値として図 7にまとめた。 pH4. 5において 45°C以下 の温度で安定であった。
[0149] 4) pH安定性
試験例 1.に示した方法に拠った。最も高い残存加水分解活性を 100%とし、各 pH における加水分解活性を相対値として図 8にまとめた。 pH3乃至 pHIOの範囲で安 定であった。
[0150] 2)精製酵素の基質選択性
試験例 1.に示した方法に拠った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水分 解活性を 100%としたときの、相対活性を表 5に示す。
[0151]
相対活性 （％) 基質 ホスファチジルコリン （卵黄由来） 1 0 0
ホスファチジルエタノールァミン （卵黄由来） 9 4
ホスファチジルグリセロール （卵黄由来） 1 9 1
ホスファチジン酸 （卵黄由来） 1 6
レシチン （卵黄由来） 9 1
リゾホスファチジルコリン （卵黄由来） 5 3
グリセ口ホスホリルコリン （大豆由来） 8
パラニトロフエ二ルリン酸 2
ホスファチジルコリン （大豆由来） 9 1
ホスファチジルエタノールァミン （大豆由来） 8 4
ホスファチジルイノシトール （大豆由来） 5 7
レシチン （大豆由来） 7 5
[0152] 試験例 3.ァスペルギルス'オリザェ NBRC4190株由来ホスホリパーゼ Cの精製酵 素液の諸性質 実施例 3の 2)で得られた精製酵素液にっ 、て、活性測定を行なった。
[0153] 1) PH活性
試験例 1.に示した方法に拠った。最も活性が高力つた pH条件での加水分解活性 を 100%とし、各 pHにおける酵素の加水分解活性を相対値として図 9に記載した。 至適 pHは pH4. 5付近であった。
[0154] 2)精製酵素の基質選択性
試験例 1.に示した方法に拠った。卵黄由来ホスファチジルコリンに対する加水分 解活性を 100%としたときの、相対活性を表 6に示す。 相対活性 （％) 基質 ホスファチジルコリン （卵黄由来） 1 0 0
ホスファチジルエタノールァミン （卵黄由来） 1 1 1
ホスファチジルグリセロール （卵黄由来） 2 0 1
ホスファチジン酸 （卵黄由来） 2 2
レシチン （卵黄由来） 8 9
リゾホスファチジルコリン （卵黄由来） 4 6
グリセ口ホスホリルコリン （大豆由来） 3
パラニトロフエ二ルリン酸 1
ホスファチジルコリン （大豆由来） 9 7
ホスファチジルエタノールァミン （大豆由来） 9 9
ホスファチジルイノシ! ル （大豆由来） 6 1
レシチン （大豆由来） 8 1
[0156] 発明の効果
以上述べたように、本発明のホスホリパーゼ Cはァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株あるいはァスペルギルス'タマリ IAM 139 07株由来であり安全性に優れ、様々なグリセ口リン脂質を酸性側でも中性付近でも 効率よく加水分解する能力を有し、クェン酸緩衝液中でも活性を有するとともにある 程度熱的に安定であり、リン脂質以外のリン酸エステルを加水分解しない酵素であり 、食品工業および製油工業いずれの分野においても優れた効果をあげられる酵素 である。

Claims

請求の範囲
[1] 酸性から中性の pHにおいて活性を示し、かつ、リン脂質以外のリン酸エステルを実 質的に加水分解しな 、ホスホリパーゼ
[2] ホスファチジルイノシトール特異的ではない、請求項 1記載のホスホリパーゼ
[3] 至適 pHが pH3乃至 pH6の範囲にある、請求項 1または 2記載のホスホリパーゼ
[4] pH7における相対活性が 20%以上である、請求項 1〜3のいずれか 1項記載のホ スホリパーゼじ。
[5] 糸状菌によって産生される、請求項 1〜4のいずれか 1項記載のホスホリパーゼ
[6] 糸状菌がァスペルギルス属である、請求項 5記載のホスホリパーゼじ。
[7] ァスペルギルス ·オリザェ（Aspergillus oryzae)ある!/、はァスペルギルス ·タマリ（Aspe rgillus tamarii)によって産生される、請求項 6記載のホスホリパーゼ
[8] ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株、ある いはァスペルギルス ·タマリ IAM 13907株によって産生される、請求項 7に記載の ホスホリパーゼじ。
[9] 以下の性質：
1) SDS— PAGE電気泳動法にて分子量約 87, 000を示す；
2)ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール およびホスファチジルグリセロールをカ卩水分解する；
3)グリセ口ホスホリルコリンおよびパラ-トロフエニルリン酸を実質的に加水分解しな い；
4)卵黄由来レシチンを pH3乃至 pH9の範囲で加水分解する；
5) 0°C乃至 80°Cの範囲にぉ 、て 4)記載の加水分解活性を有する；
6)温度安定性について、 pH4. 5において 45°C以下の温度で安定である；
7) pH安定性につ!、て、 pH3乃至 pHIOの範囲で安定である、
を示す請求項 1〜8のいずれ力 1項記載のホスホリパーゼじ。
[10] 下記の a)〜d) :
a)配列番号 5に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質；
b)配列番号 4のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列力もなるタンパク質； c) a)または b)に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加されたアミノ酸配列カゝらなり、かつ、ホスホリパーゼ C活性を有すること を特徴とするタンパク質；
d) a)または b)に記載のアミノ酸配列を含むことからなるタンパク質、
の！、ずれか一つに記載のタンパク質であるホスホリパーゼじ。
[11] 請求項 1〜4、 9および 10のいずれ力 1項記載のホスホリパーゼ Cを生産する能力 を有する、単離されたァスペルギルス ·オリザェある!/、はァスペルギルス 'タマリに属 する糸状菌、ただし、ァスペルギルス'タマリ IAM 13907株を除く。
[12] ァスペルギルス ·オリザェ FERM ABP— 10200株または NBRC 4190株である 、請求項 11記載の糸状菌。
[13] 下記の a)〜d) :
a)配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド配列からなる DNA;
b)上記 a)に記載の DNAと 70%以上のヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチ ド配列からなり、かつ、ホスホリパーゼ C活性を有するタンパク質をコードすることを特 徴とする DNA;
c)配列番号 5に記載のアミノ酸配列力 なるタンパク質をコードする DNA； d)配列番号 4のコード領域（CDS)のヌクレオチド配列を含むことからなる DNA、 の！、ずれか一つに記載の DNA。
[14] 請求項 13に記載の DNAにコードされるタンパク質であるホスホリパーゼ
[15] 1)請求項 9に記載のァスペルギルス ·オリザェある 、はァスペルギルス ·タマリを培 養する工程、および、
2) 1)の培養産物力もホスホリパーゼ Cを分離'精製する工程、
を含む、ホスホリパーゼ Cの製造方法。
[16] ァスペルギルス'オリザェがァスペルギルス'オリザェ FERM ABP— 10200株ま たは NBRC 4190株、ァスペルギルス'タマリがァスペルギルス'タマリ IAM 1390 7株である、請求項 15記載のホスホリパーゼ Cの製造方法。
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