JP2021508446A - 食品中のリン脂質の改善された酵素的修飾 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
配列番号1は、トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)由来のホスホリパーゼ変異体の完全長アミノ酸配列(完全長CRC08310)を示す。
NAPE − N−アシルホスファチジルエタノールアミン
NALPE − N−アシルリゾホスファチジルエタノールアミン
NAGPE − N−アシルグリセロホスホエタノールアミン
DGDG − ジガラクトシルジグリセリド
DGMG − ジガラクトシルモノグリセリド
MGDG − モノガラクトシルジグリセリド
MGMG − モノガラクトシルモノグリセリド
PC − ホスファチジルコリン
LPC − リゾホスファチジルコリン
PLA − ホスホリパーゼA1
DATEM − モノ及びジグリセリドのジアセチル酒石酸エステル
ポリペプチドに関して、「野生型」、「親」又は「参照」という用語は、1つ又は複数のアミノ酸位置に人為的な置換、挿入又は欠失を含まない天然に存在するポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関して、「野生型」、「親」又は「参照」といった用語は、人為的なヌクレオシド変化を含まない天然に存在するポリヌクレオチドを指す。しかし、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、野生型、親又は参照ポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドを包含する。
ギャップオープニングペナルティ:10.0
ギャップ伸張ペナルティ:0.05
タンパク質重み付け行列:BLOSUM行列
DNA重み付け行列:IUB
異なる配列の遅延%:40
ギャップ間距離:8
DNA転位の重み:0.50
親水性残基リスト:GPSNDQEKR
負値行列の使用:オフ
残基特異的ペナルティの切り替え(Toggle):オン
親水性ペナルティの切り替え:オン
末端ギャップ分程ペナルティの切り替え:オフ
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、別の性能又は安定性利益を賦与する1つ又は複数の突然変異をさらに含む。例示的な性能利益として、限定されないが、熱安定性の向上、貯蔵安定性の向上、可溶性の増大、pHプロフィールの改変、比活性の増大、基質特異性の修飾、基質結合の修飾、pH依存性活性の修飾、pH依存性安定性の修飾、酸化安定性の向上及び発現の増大が挙げられる。一部の事例では、性能利益は、比較的低い温度で実現される。一部の実施形態では、性能利益は、比較的高い温度で実現される。
本発明のホスホリパーゼは、例えば、分泌又は細胞内発現により、宿主細胞中に産生させることができる。ホスホリパーゼを含む培養細胞材料(例えば、全細胞ブロス)は、細胞培地中へのホスホリパーゼの分泌後に取得することができる。任意選択で、ホスホリパーゼは、最終ホスホリパーゼの要望される純度に応じて、宿主細胞から単離するか、又は細胞ブロスから単離することもできる。当技術分野で公知の方法に従ってホスホリパーゼをコードする遺伝子をクローン化して、発現させることができる。好適な宿主細胞として、細菌、真菌(酵母及び糸状菌を含む)並びに植物細胞(藻を含む)が挙げられる。特に有用な宿主細胞として、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、アスペルギルス・オリゼー(Aspergillus oryzae)又はトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)が挙げられる。他の宿主細胞として、細菌細胞、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)又はB.リケニフォルミス(B.licheniformis)並びにストレプトマイセス属(Streptomyces)、E.Coli(大腸菌)が挙げられる。
ホスホリパーゼをコードする核酸を含むDNA構築物は、宿主細胞に発現されるように構築することができる。遺伝コードの既知の縮重により、常用の技術で、同一のアミノ酸配列をコードする変異体ポリヌクレオチドを設計及び作製することができる。また、特定の宿主細胞についてコドン使用を最適化することも当技術分野で公知である。ホスホリパーゼをコードする核酸をベクターに組み込むことができる。以下に開示するような公知の形質転換技術を用いて、ベクターを宿主細胞に移入することができる。
DNA構築物又は発現ベクターのいずれかを含む単離細胞をホスホリパーゼの組換え産生における宿主細胞として使用するのが有利である。細胞は、好都合には、宿主染色体にDNA構築物を(1つ又は複数のコピーで)組み込むことにより、酵素をコードするDNA構築物で形質転換し得る。この組込みは、DNA配列が細胞内に安定に維持される傾向が高いことから、概して有利であると考えられる。宿主染色体へのDNA構築物の組込みは、従来の方法、例えば相同又は異種組換えに従って実施し得る。代わりに、様々なタイプの宿主細胞に関して上に説明したように、細胞を発現ベクターで形質転換し得る。
ホスホリパーゼを生成する方法は、酵素の生成を促進する条件下で前述のような宿主細胞を培養するステップと、細胞及び/又は培地から酵素を回収するステップとを含み得る。
発酵、分離及び濃縮技術は、当技術分野で周知であり、ホスホリパーゼポリペプチド含有溶液を調製するために従来の方法を用いることができる。
本発明の一態様によれば、約55/45以上のsn1/sn2特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼA1を含む単離ポリペプチドが提供され、前記ホスホリパーゼA1は、0.02未満のリゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比及び/又は0.12未満のNALPE/NAPE活性比を有する。好ましくは、sn1/sn2特異度比は、65〜85/15〜35、好ましくは65〜80/20〜35、より好ましくは70〜85/15〜30、さらに好ましくは70〜80/20〜30;又は75〜95/5〜25、好ましくは80〜95/5〜20、より好ましくは85〜95/5〜15である。好ましくは、sn1/sn2特異度比は、約60/40、70/30、80/20、90/10、95/5又は99/1である。他の好ましい実施形態では、sn1/sn2特異度比は、約74/26又は89/11である。別の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、本明細書に提供されるホスホリパーゼA1から構成されるか又は実質的に構成され得る。65〜85/15〜35、好ましくは65〜80/20〜35、より好ましくは70〜85/15〜30、さらに好ましくは70〜80/20〜30のsn1/sn2特異度比は、ホスファチジルコリン(PC)基質に対しであり;75〜95/5〜25、好ましくは80〜95/5〜20、より好ましくは85〜95/5〜15のsn1/sn2特異度比は、NAPE基質に対してである。74/26のsn1/sn2特異度比は、ホスファチジルコリン(PC)基質に対してであり;89/11のsn1/sn2特異度比は、NAPE基質に対してである。
酵素特性決定アッセイ − 活性アッセイ及びホスホリパーゼ位置特異性の決定のためのアッセイ
PC−Pアッセイ:
ホスホリパーゼ活性(PC−U)は、以下のアッセイを用いて決定することができる:
基質:1.71%L−α−ホスファチジルコリンダイズ(95%)(Avanti 441601G、Avanti Polare Lipids,USA)、6.25%TRITON(商標)−X100(SigmaX−100)と、5mM CaCl2を0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
試料、較正試料及び対照試料を0.1%TRITON(商標)X−100を含有する10mM HEPES pH7.0に溶解させた。96ウェルマイクロタイタープレート及びThermoMixer C(Eppendorf,Germany)を用いて分析を実施した。アッセイは、30℃で実施した。200μLの基質をサーモスタットで180秒間30℃に維持した後、50μLの酵素試料を添加した。酵素法を600秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、WakoChemicals GmbH,Germany)から入手したNEFAキットを用いて測定した。
NEFA−HR(1):
以下を含む50mMリン酸緩衝液pH7.0:
0.53U/mLのアシル−CoAシンターゼ(ACS)
0.31mM補酵素A(CoA)
4.3mMアデノシン5−三リン酸二ナトリウム塩(ATP)
1.5mM 4−アミノ−アンチピリン(4−AA)
2.6U/mLのアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)
0.062%アジ化ナトリウム
NEFA−HR(2):
2.4mM 3−メチル−N−エチル−N−(E−ヒドロキシエチル)−アニリン(MEHA)
12U/mLのアシル−CoAオキシダーゼ(ACOD)
14U/mLのペルオキシダーゼ(POD)
250μl=基質及び酵素の総体積
50μl=酵素溶液の体積
D=試料の希釈度
S=検量線の傾き(OD(μmol/mL))
10=酵素法の反応時間(分(min))
リゾ−ホスホリパーゼ活性(LPC−U)は、以下のアッセイを用いて決定することができる:
基質:1.18%の1−オレオイル−2−ヒドロキシ−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti845875P,Avanti Polar lipid,USA)、6.25%TRITON(商標)−X100(SigmaX−100)と、5mM CaCl2を0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
試料、較正試料及び対照試料を、0.1%TRITON(商標)X−100を含有する10mM HEPES pH7.0に溶解させた。96ウェルマイクロタイタープレート及びThermoMixer C(Eppendorf,Germany)を用いて分析を実施した。アッセイは、30℃で実施した。200μLの基質をサーモスタットで180秒間30℃に維持した後、50μLの酵素試料を添加した。酵素法を600秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、WakoChemicals GmbH,Germany)から入手したNEFAキットを用いて測定した。
NEFA−HR(1):
以下を含む50mMリン酸緩衝液pH7.0:
0.53U/mLのアシル−CoAシンターゼ(ACS)
0.31mM補酵素A(CoA)
4.3mMアデノシン5−三リン酸二ナトリウム塩(ATP)
1.5mM 4−アミノ−アンチピリン(4−AA)
2.6U/mLのアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)
0.062%アジ化ナトリウム
NEFA−HR(2):
2.4mM 3−メチル−N−エチル−N−(E−ヒドロキシエチル)−アニリン(MEHA)
12U/mLのアシル−CoAオキシダーゼ(ACOD)
14U/mLのペルオキシダーゼ(POD)
250μl=基質及び酵素の総体積
50μl=酵素溶液の体積
D=試料の希釈度
S=検量線の傾き(OD(μmol/mL))
10=酵素法の反応時間(分(min))
NAPEホスホリパーゼ活性(NAPE−U)は、以下のアッセイを用いて決定することができる:
基質:2.25%のパルミトイル−2−リノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−リノレオイル(16:0〜18:2 PE−N18:2)(Avanti792003,Avanti Polar lipid,USA)、6.25%TRITON(商標)−X100(SigmaX−100)と、5mM CaCl2を0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
試料、較正試料及び対照試料を、0.1%TRITON(商標)X−100を含有する10mM HEPES pH7.0に溶解させた。96ウェルマイクロタイタープレート及びThermoMixer C(Eppendorf,Germany)を用いて分析を実施した。アッセイは、30℃で実施した。200μLの基質をサーモスタットで180秒間30℃に維持した後、50μLの酵素試料を添加した。酵素法を600秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、WakoChemicals GmbH,Germany)から入手したNEFAキットを用いて測定した。
NEFA−HR(1):
以下を含む50mMリン酸緩衝液pH7.0:
0.53U/mLのアシル−CoAシンターゼ(ACS)
0.31mM補酵素A(CoA)
4.3mMアデノシン5−三リン酸二ナトリウム塩(ATP)
1.5mM 4−アミノ−アンチピリン(4−AA)
2.6U/mLのアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)
0.062%アジ化ナトリウム
NEFA−HR(2):
2.4mM 3−メチル−N−エチル−N−(E−ヒドロキシエチル)−アニリン(MEHA)
12U/mLのアシル−CoAオキシダーゼ(ACOD)
14U/mLのペルオキシダーゼ(POD)
250μl=基質及び酵素の総体積
50μl=酵素溶液の体積
D=試料の希釈度
S=検量線の傾き(OD(μmol/mL))
10=酵素法の反応時間(分(min))
NALPEホスホリパーゼ活性(NALPE−U)は、以下のアッセイを用いて決定することができる:
基質:1.68%の1−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−リノレオイル(16:0−NALPE−N18:2)、(Avanti791759,Avanti Polar Lipids,USA)、6.25%TRITON(商標)−X100(SigmaX−100)と、5mM CaCl2を0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
試料、較正試料及び対照試料を、0.1%TRITON(商標)X−100を含有する10mM HEPES pH7.0に溶解させた。96ウェルマイクロタイタープレート及びThermoMixer C(Eppendorf,Germany)を用いて分析を実施した。アッセイは、30℃で実施した。200μLの基質をサーモスタットで180秒間30℃に維持した後、50μLの酵素試料を添加した。酵素法を600秒継続した。酵素法の工程中に遊離された遊離脂肪酸の量を、WakoChemicals GmbH,Germany)から入手したNEFAキットを用いて測定した。
NEFA−HR(1):
以下を含む50mMリン酸緩衝液pH7.0:
0.53U/mLのアシル−CoAシンターゼ(ACS)
0.31mM補酵素A(CoA)
4.3mMアデノシン5−三リン酸二ナトリウム塩(ATP)
1.5mM 4−アミノ−アンチピリン(4−AA)
2.6U/mLのアスコルビン酸オキシダーゼ(AOD)
0.062%アジ化ナトリウム
NEFA−HR(2):
2.4mM 3−メチル−N−エチル−N−(E−ヒドロキシエチル)−アニリン(MEHA)
12U/mLのアシル−CoAオキシダーゼ(ACOD)
14U/mLのペルオキシダーゼ(POD)
250μl=基質及び酵素の総体積
50μl=酵素溶液の体積
D=試料の希釈度
S=検量線の傾き(OD(μmol/mL))
10=酵素法の反応時間(分(min))
基質:0.6% 16:0〜18:1 PC、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(Avanti850457,Avanti Polar Lipids,USA)、0.4%TRITON(商標)−X100(Sigma,X−100)と、5mM CaCl2とを0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
2mLの基質を30℃でインキュベートし、0.05M HEPESバッファー中で10分の反応(磁気攪拌)後に消費された2〜10%基質に相当する0.1mlの酵素希釈物を添加した。
1.画分 8mLの溶媒A:MTBE:2−プロパノール(2:1)
2.画分 8mLの溶媒B:アセトン:ギ酸(100:2)
A=%C16:0脂肪酸+%C18:1脂肪酸
2=mL基質
1000000=molのμmolへの変換
D=酵素希釈率
MW=産生されたC16:0脂肪酸及びC18:1脂肪酸の平均モル重量
10=反応時間(分)
0.1=アッセイに添加された酵素(mL))
sn1/sn2特異度比=相対PLA1活性/相対PLA2活性
基質:0.79% 16:0〜18:2(PE−N18:2)NAPE、パルミトイル−2−リノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−リノレオイル(Avanti792003,Avanti Polar lipid,USA)、0.4%TRITON(商標)−X100(Sigma,X−100)と、5mM CaCl2とを0.05M HEPESバッファーpH7に溶解させた。
2mLの基質を30℃でインキュベートし、0.05M HEPESバッファー中で10分の反応(磁気攪拌)後に消費された2〜10%基質に相当する0.1mlの酵素希釈物を添加した。
1.画分 8mLの溶媒A:MTBE:2−プロパノール(2:1)
2.画分 8mLの溶媒B:アセトン:ギ酸(100:2)
A=%C16:0脂肪酸+%C18:2脂肪酸
2=mL基質
1000000=molのμmolへの変換
D=酵素希釈率
MW=産生されたC16:0脂肪酸及びC18:1脂肪酸の平均モル重量
10=反応時間(分)
0.1=アッセイに添加された酵素(mL))
sn1/sn2特異度比=相対PLA1活性/相対PLA2活性
遊離脂肪酸は、トリメチルシリル誘導体(TMS)としてGLCにより分析した。
・WCOTフューズドシリカカラム12.5m×0.25mm ID×0.1μ膜厚の5%フェニル−メチル−シリコーン(Chrompack製のCP Sil 8 CB)を備えたPerkin Elmer Clarus 600毛管ガスクロマトグラフ
・キャリアガス:ヘリウム
・インジェクタ:PSSIコールドスプリット噴射(初期温度90℃、395℃まで加熱)、容積1.0μl
・検出器FID:395℃。
蒸発させた試料を1.5mlのヘプタン:ピリジン、2:1に溶解させる。500μlの試料溶液をクリンプバイアルに移す。100μlのMSTFA(N−メチル−N−トリメチルシリル−トリフルオロアセトアミド)を添加し、60℃で15分間反応させる。
ボウル内で全ての材料を低速で1分混合した後、水を添加して、低速で2分、次に高速で6.5分混錬する。生地の温度は、約26℃でなければならない。1350gの生地を計量して、手で丸く成型する。温蔵庫内で生地を30℃で10分寝かせる。
手順
スポンジ:ボウル内で全ての材料を速度1で1分混合し、速度2で3分混合する。スポンジ温度は、約25.5℃でなければならない。蓋のないボウル内で、スポンジを30℃、85%RHで3時間発酵させる。
実施 −16
ドラムプレス 3
プレッシャーボード前 4.0(衝撃の場合3.5)
プレッシャーボード後ろ 3.5(衝撃の場合3.1)
前方幅 330、後方幅 290。
十分に発酵した生地の試料を冷凍し、凍結乾燥させた。乾燥生地を粉砕し、篩にかけた。粉砕し、篩い分けた試料1.5gを1.5gの担体(珪藻土、Thermo Scientific,P/N:60−033854)と混合し、ASE10ml試料管に移した。40℃でDionex ASE350(Thermo Scientific)を用い、溶媒としての水飽和ブタノール及び10分の静的ランタイムで、抽出を実施した。抽出後、60℃及び1000rpmのScan Speed 40(Scanvac,Labogene APS)を用いて、溶媒を蒸発させた。乾燥した脂質を3.75mlのヘプタン:イソプロパノール(3:2)に溶解させた。
荷電化粒子検出器(Charged Aerosol Detector)を用いた液体クロマトグラフィーにより、生地脂質試料を分析した。カラムは、順相カラム(DIOL)であり、移動相は、1mMギ酸アンモニウムの添加を含むA:アセトン/メタノール 96/4及び1mMギ酸アンモニウムの添加を含むB:アセトン/メタノール/H2O 60/34/6の傾きであった。
Dionex Ultimate 3000 UHPLC,Thermo Scientific
VANQOISH Detector,Thermo Scientific
カラム:Fortis HILIC Diol,1.7μm、50×2.1mm。
注入される前、「生地脂質の抽出」に記載した通りに、生地から脂質を抽出し、0.45μMフィルターを通して濾過した。
Cromeleonソフトウェアを用いて、クロマトグラムを統合し、NALPE標準曲線に基づいてNAPE、NALPE及びNAGPEのモル濃度を計算した。
初めに、全ての生地についての「平均総モル脂質(NAPE+NALPE+NAGPE)」に対して各成分それぞれのモルレベルを正規化することにより、NAPE、NALPE及びNAGPEそれぞれの脂質レベルを取得した。以下のそれぞれの脂質レベルは、陰性対照(酵素を添加していない)中のNAPEレベルに対して表示する。従って、NAPEは、1(陰性対照)で開始する。NALPE及びNAGPEは、NAPE開始レベルに対して得られるレベルとして表示する。
以下の構造において、R1、R2及びR3は、C12〜C24炭化水素である。C12〜24炭化水素は、飽和又は不飽和のいずれかである。R1、R2及びR3は、同じ又は異なる炭化水素であり得る。
トリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)ホスホリパーゼThaPla1(CRC08310)のクローニング
CRC08310と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がトリコデルマ・ハルジアナム(Trichoderma harzianum)において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KKO98756.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08310のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号19に記載される。完全長CRC08310遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号1に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に16アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08310が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08310の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号2に記載される。
完全長CRC08310タンパク質(配列番号19)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08310を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08310は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
ペスタロチオプシス・フィシ(Pestalotiopsis fici)W106−1ホスホリパーゼPfiPla1(CRC08316)のクローニング
CRC08316と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がペスタロチオプシス・フィシ(Pestalotiopsis fici)W106−1において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:ETS81250.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08316のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号20に記載される。完全長CRC08316遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号3に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に18アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08316が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08316の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号4に記載される。
完全長CRC08316タンパク質(配列番号20)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08316を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08316は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。次に、プロトプラスト形質転換(Te’o et al.(2002)J.Microbiol.Methods 51:393−99)を用いて、pGXT−CRC08316プラスミドを好適なトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)株に形質転換した(公開PCT出願国際公開第05/001036号パンフレットに記載の方法)。唯一の窒素源としてアセトアミドを含有する固形培地(アセトアミド0.6g/L;塩化セシウム1.68g/L;グルコース20g/L;リン酸二水素カリウム15g/L;硫酸マグネシウム七水和物0.6g/L;塩化カルシウム二水和物0.6g/L;硫酸鉄(II)5mg/L;硫酸亜鉛1.4mg/L;塩化コバルト(II)1mg/L;硫酸マンガン(II)1.6mg/L;寒天20g/L;pH4.25)上で形質転換体を選択した。形質転換コロニーは、約1週間で出現した。アセトアミドプレートでの増殖後、形質転換体を採取し、個別にアセトアミド寒天プレートに移した。アセトアミドプレートで5日の増殖後、安定な形質を呈示する形質転換体を96ウェルマイクロタイタープレート内の200μLグルコース/ソホロース合成培地に接種した。マイクロタイタープレートを28℃の酸素グロースチャンバー内で5日間インキュベートした。これらの培養物からの上清を用いて、SDS−PAGE分析によりタンパク質発現を確認した。最も高いタンパク質発現を有する安定な株を選択し、グルコース/ソホロース合成培地を含む250mL振盪フラスコ内での発酵に付した。
メタリジウム・グイズホウエンス(Metarhizium guizhouense)ARSEF 977ホスホリパーゼMguPla1(CRC08319)のクローニング
CRC08319と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がメタリジウム・グイズホウエンス(Metarhizium guizhouense)ARSEF 977において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KID92477.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08319のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号21に記載される。完全長CRC08319遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号5に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に16アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08319が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08319の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号6に記載される。
完全長CRC08319タンパク質(配列番号21)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08319を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08319は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
ディアポルテ・アンペリナ(Diaporthe ampelina)ホスホリパーゼDamPla1(CRC08405)のクローニング
CRC08405と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がディアポルテ・アンペリナ(Diaporthe ampelina)において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KKY36548.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08405のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号22に記載される。完全長CRC08405遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号7に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に18アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08405が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08405の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号8に記載される。
完全長CRC08405タンパク質(配列番号22)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08405を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08405は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
イネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)Y34ホスホリパーゼMorPla3(CRC08418)のクローニング
CRC08418と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)Y34において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:ELQ41978.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08418のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号23に記載される。完全長CRC08418遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号9に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に25アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08418が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08418の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号10に記載される。
完全長CRC08418タンパク質(配列番号23)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC0418を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08418は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
ネオネクトリア・ジチシマ(Neonectria ditissima)ホスホリパーゼNdiPla1(CRC08826)のクローニング
CRC08826と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がネオネクトリア・ジチシマ(Neonectria ditissima)において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KPM45012.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08826のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号24に記載される。完全長CRC08826遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号11に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に16アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08826が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08826の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号12に記載される。
完全長CRC08826タンパク質(配列番号24)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08826を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08826は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
トリコデルマ・ガムシ(Trichoderma gamsii)ホスホリパーゼTgaPla1(CRC08833)のクローニング
CRC08833と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がトリコデルマ・ガムシ(Trichoderma gamsii)において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KUF04745.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08833のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号25に記載される。完全長CRC08833遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号13に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に16アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08833が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08826の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号14に記載される。
完全長CRC08833タンパク質(配列番号25)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08833を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08833は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
メタリジウム・アニソプリエ(Metarhizium anisopliae)BRIP 53293ホスホリパーゼManPla1(CRC08845)のクローニング
CRC08845と称する推定ホスホリパーゼ遺伝子がメタリジウム・アニソプリエ(Metarhizium anisopliae)BRIP 53293において同定されたが、これは、BLAST検索(Altschul et al.,J Mol Biol,215:403−410,1990)から決定される通り、NCBIデータベースから入手可能な配列(NCBIアクセッション番号:KJK84204.1)と100%の相同性を有するタンパク質をコードする。完全長CRC08845のコドン最適化合成核酸配列は、配列番号26に記載される。完全長CRC08845遺伝子によりコードされる対応するタンパク質を配列番号15に示す。SignalPバージョン4.0(Nordahl Petersen et al.(2011)Nature Methods,8:785−786)により予測されるように、このタンパク質は、N末端に17アミノ酸長のシグナルペプチドを有する。シグナル配列の存在は、CRC08845が、分泌された酵素であることを示唆している。CRC08845の予測成熟型タンパク質配列は、配列番号16に記載される。
完全長CRC08845タンパク質(配列番号26)をコードするコドン最適化合成DNA配列を合成し、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)発現ベクターpGXT(参照により本明細書に組み込まれる公開PCT出願国際公開第2015/017256号パンフレットに記載のpTTTpyr2ベクターと同じ)に挿入して、プラスミドpGXT−CRC08845を取得した。pGXTベクターでは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)pyrG遺伝子がトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)pyr2遺伝子で置換されている。アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS及びpyr2選択マーカは、唯一の窒素源としてのアセトアミド上で形質転換体の増殖をもたらし、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)テロメア領域は、真菌細胞における非染色体プラスミド維持を可能にする。pGXT−CRC08845は、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)cbhI由来のプロモータ(cbhI)及びcbhIターミネータ領域を含有しており、これらは、目的の遺伝子の強力な誘導性発現を可能にする。
酵素特性決定は、「アッセイ及び方法」に記載した活性法に従い、様々な脂質基質を用いた比活性の決定により実施する。Powerbake 4080は、DuPontの商品である。Powerbake 4080は、sn1位置の極性脂質に作用する。Powerbake 4080の活性酵素成分は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,012,732号明細書に配列番号6として記載されている(本明細書では配列番号17としても記載される)。この酵素は、ガラクトリパーゼ及びホスホリパーゼ活性の両方を有することがわかっている。Lipopan Fは、Novozymesの商品である。Lipopan Fの活性酵素は、sn1位置の極性脂質に作用し、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第0869167B号明細書の配列番号2に記載されている(本明細書では配列番号18としても記載される)。この酵素は、ガラクトリパーゼ活性を有することもわかっている。
特定設計のPC及びNAPE基質からの遊離脂肪酸(FFA)の遊離の測定により、酵素位置特異性について特性決定した。FFA測定は、「アッセイ及び方法」において、「ホスホリパーゼ活性並びにPC(ホスファチジルコリン)に対するsn1及びsn2位置特異性の決定のためのアッセイ」及び「ホスホリパーゼ活性並びにNAPE(N−アシルホスファチジルエタノールアミン)に対するsn1及びsn2位置特異性の決定のためのアッセイ」後の「ガスクロマトグラフィー(GLC)」に記載されている通り、GLC分析により実施した。
この実験では、用量を増加することによる適用効果及び生地マトリックスの相関脂質プロファイリングを示すために、既存の市販ホスホリパーゼ製品Lipopan Fをクラスティロール(Crusty Roll)実験計画で試験した。さらに、「非リゾ−ホスホリパーゼ」CRC08319の適用効果及び生地脂質プロファイリングを比較試験した。
用量は、全てLipopan Fの最適用量に対する用量として(mgタンパク質/kg小麦粉の基準で比較して)表される。Lipopan Fの最適用量は、記載される焼成計画で最も高い比体積をもたらす用量として定義される。最適Lipopan F用量は、「1」として表される。負の対照は、「0」により表される。
非リゾ−ホスホリパーゼは、例えば、卵黄及び全卵、加工肉、植物油の精錬、チーズなどの乳製品、並びにパンなどの焼成製品、並びにケーキ及びクッキーをはじめとする焼き菓子製品などの焼成製品に使用することができる。
卵黄は、その乳化特性のために食品産業での使用がよく知られている。卵黄中の脂質の約30%は、リン脂質であり、これが卵黄の乳化特性に寄与している。マヨネーズ、ソース、ドレッシング及びケーキを含む多くの商品において、卵黄の乳化特性が活用されている。しかし、一部の食品用途では、卵黄の乳化特性は、分離なしで均質な製品を取得するのに十分ではない。例えば、マヨネーズの場合、高温で製品を殺菌すると、製品の分離を引き起こす。卵黄(及び卵黄を含有する食品)中のリン脂質をリゾリン脂質に修飾するために、非リゾ−ホスホリパーゼを用いることができる。酵素修飾卵黄を用いて、高温殺菌での製品の分離を回避することができる。
非リゾ−ホスホリパーゼを加工肉製品に使用することができる。非リゾ−ホスホリパーゼは、加工肉製品の乳化の改善に寄与すると共に、稠度の向上及び調理損失の低減に寄与する。加工肉に添加された非リゾ−ホスホリパーゼは、食肉のリン脂質をリゾリン脂質に転化する。リゾリン脂質の乳化特性のために、この成分は、食肉中の脂肪の乳化改善によって稠度の向上及び調理によって生じる損失の低減に寄与する。
ダイズ油などの未処理の植物油は、1〜2%のリン脂質を含有する。リン脂質は、油の品質を高めると共に、油中の沈殿を防止するために精製工程中に油から除去される。リン脂質の除去は、精油工程中のいわゆる精錬工程によって実施される。精錬は、化学又は酵素手段によって実施することができる。精錬工程では、「非リゾ−ホスホリパーゼ」を用いて、リン脂質をリゾリン脂質に転化することができ、これは、より水溶性であり、水での洗浄により油から除去することができる。リン脂質の酵素的加水分解は、過酷なアルカリ性又は酸性条件を必要とする化学的精錬と比較してより穏やかな工程である。非リゾホスホリパーゼを用いた精錬で生じる廃液は、より少量である。
非リゾ−ホスホリパーゼを乳製品に用いることができる。非リゾ−ホスホリパーゼは、チーズ生産での生産量増加に寄与する。牛乳に添加された非リゾ−ホスホリパーゼは、乳リン脂質をリゾリン脂質に転化する。リゾリン脂質の乳化特性のために、これは、より多くの脂質をチーズカードに閉じ込めることによってチーズ生産量の増加に寄与することになる。
卵は、ほとんどのケーキ製品の主要な部分である。非リゾ−ホスホリパーゼを用いて、リゾ−リン脂質の生成により卵のリン脂質を修飾することができ、これは、ケーキ混合工程中の乳化の改善に寄与して、より柔らかく、且つより柔軟なクラムを付与する。また、非リゾ−ホスホリパーゼをケーキ生地に直接使用して、小麦粉のリン脂質を修飾することもできる。
この実施例では、「非リゾ−ホスホリパーゼ」CRC08319とPowerbake 4080の組合せをSOLEC Fの形態の追加基質の存在下及び非存在下で試験した。SOLEC Fは、DuPontの商品である。SOLEC Fは、取り扱いが容易な脱油ダイズレシチンである。「非リゾ−ホスホリパーゼ」CRC08319とPowerbake 4080は、追加基質の存在下で衝撃及び非衝撃量の両方に著しい改善を示す。CRC08319及びPowerbake 4080の非存在下での追加基質の効果は非常に限定的であり、衝撃安定性に関して恐らくマイナスですらある。スポンジ及び生地焼成の流れは、上の「アッセイ及び方法」セクションに記載される「スポンジ及び生地」の説明に従って実施した。
Claims (101)
- 約55/45以上のsn1/sn2特異度比を有することによって特徴付けられるホスホリパーゼA1を含む単離ポリペプチドであって、前記ホスホリパーゼA1は、0.02未満のリゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比及び/又は0.12未満のNALPE/NAPE活性比を有する、単離ポリペプチド。
- 前記sn1/sn2特異度比は、約60/40、70/30、80/20、90/10、95/5又は99/1である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記sn1/sn2特異度比は、約74/26又は89/11である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.009未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.008未満である、請求項4に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.007未満である、請求項5に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.006未満である、請求項6に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.005未満である、請求項7に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.004未満である、請求項8に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.003未満である、請求項9に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.002未満である、請求項10に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.001未満である、請求項11に記載の単離ポリペプチド。
- 前記sn1/sn2特異度比は、約60/40、70/30、80/20、90/10、95/5又は99/1である、請求項12に記載の単離ポリペプチド。
- 前記sn1/sn2特異度比は、約74/26又は89/11である、請求項12に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも80%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項17に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項19に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と100%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項15に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と100%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項21に記載の単離ポリペプチド。
- 生地を製造する方法であって、小麦粉、食塩、水、砂糖、脂肪、レシチン、油、乳化剤及び酵母からなる群から選択される生地成分を、請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載のホスホリパーゼA1を含む単離ポリペプチドと混合するステップを含む方法。
- 請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む生地。
- 改善された生地伸展性及び/又は安定性を有する、請求項24に記載の生地。
- 生地及び/又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも1種の追加の酵素をさらに含む、請求項24に記載の生地。
- 前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼA1と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項26に記載の生地。
- 前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項27に記載の生地。
- 前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項28に記載の生地。
- 前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項28に記載の生地。
- 前記非マルトース生成アミラーゼは、主に4〜8つのD−グルコピラノシル単位を含む1つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項30に記載の生地。
- 前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項27に記載の生地。
- 前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項32に記載の生地。
- 前記ホスホリパーゼは、配列番号17及び/又は配列番号18を含む、請求項33に記載の生地。
- 請求項24〜34のいずれか一項に記載の生地を焼成するステップを含む、焼成製品を調製する方法。
- 請求項35に記載の方法によって得ることができる焼成製品。
- 改善されたクラム孔径、気泡の改善された均質性、クラストとクラムとが分離していないこと、増加した体積、増加したクラストのカリっとした食感及び改善されたオーブンスプリングからなる群から選択される少なくとも1つの改善された特性を有する、請求項36に記載の焼成製品。
- 前記改善された特性は、クラストのカリっとした食感である、請求項37に記載の焼成製品。
- 小麦粉と、請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドとを含む焼成用プレミックス。
- 生地及び/又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも1種の追加の酵素をさらに含む、請求項39に記載のプレミックス。
- 前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼA1と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項40に記載のプレミックス。
- 前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項41に記載のプレミックス。
- 前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項42に記載のプレミックス。
- 前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項42に記載のプレミックス。
- 前記非マルトース生成アミラーゼは、主に4〜8つのD−グルコピラノシル単位を含む1つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項44に記載のプレミックス。
- 前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項41に記載のプレミックス。
- 前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項46に記載のプレミックス。
- 前記ホスホリパーゼは、配列番号17及び/又は配列番号18を含む、請求項47に記載のプレミックス。
- 請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む顆粒又は凝集粉を含有する焼成改良剤。
- 生地及び/又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも1種の追加の酵素をさらに含む、請求項49に記載の焼成改良剤。
- 前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼA1と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項50に記載の焼成改良剤。
- 前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項51に記載の焼成改良剤。
- 前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項52に記載の焼成改良剤。
- 前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項52に記載の焼成改良剤。
- 前記非マルトース生成アミラーゼは、主に4〜8つのD−グルコピラノシル単位を含む1つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項54に記載の焼成改良剤。
- 前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項51に記載の焼成改良剤。
- 前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項56に記載の焼成改良剤。
- 前記ホスホリパーゼは、配列番号17及び/又は配列番号18を含む、請求項57に記載の焼成改良剤。
- 生地及び/又はそれから製造される焼成製品を改善するために有用な少なくとも1種の追加の酵素を添加するステップをさらに含む、請求項23に記載の生地を製造する方法。
- 前記追加の酵素は、アミラーゼ、シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、トランスグルタミナーゼ、リパーゼ、ガラクトリパーゼ、前記ホスホリパーゼA1と異なるホスホリパーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、プロテアーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ及びオキシダーゼからなる群から選択される、請求項59に記載の方法。
- 前記アミラーゼは、エキソアミラーゼである、請求項60に記載の方法。
- 前記エキソアミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである、請求項61に記載の方法。
- 前記エキソアミラーゼは、非マルトース生成アミラーゼである、請求項61に記載の方法。
- 前記非マルトース生成アミラーゼは、主に4〜8つのD−グルコピラノシル単位を含む1つ又は複数の直鎖マルトオリゴ糖をアミロペクチンの側鎖の非還元末端から切断することにより、デンプンを加水分解する、請求項63に記載の方法。
- 前記追加の酵素は、ホスホリパーゼである、請求項60に記載の方法。
- 前記ホスホリパーゼは、ガラクトリパーゼ活性を有する、請求項65に記載の方法。
- 前記ホスホリパーゼは、配列番号17及び/又は配列番号18を含む、請求項66に記載の方法。
- 請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む酵素による乳化剤の処理を含む、リン脂質乳化剤の修飾の方法。
- リン脂質は、レシチン又はリゾ−レシチンである、請求項68に記載の方法。
- 脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法であって、前記脂質含有食品マトリックスに、請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを添加するステップを含む方法。
- 前記脂質含有食品マトリックスは、卵及び卵含有食品、焼き菓子製品の生地、加工肉、牛乳を主成分とする製品及び植物油からなる群から選択される、請求項70に記載の脂質含有食品マトリックス中においてリゾリン脂質を生成する方法。
- 請求項1〜22、75〜92又は95〜101のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項72に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
- 請求項73に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.019未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.018未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.017未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.016未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.015未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.014未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.013未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.012未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.011未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記リゾホスホリパーゼ/ホスホリパーゼ活性比は、0.01未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.11未満である、請求項1に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.10未満である、請求項85に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.09未満である、請求項86に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.08未満、好ましは0.07未満である、請求項87に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.06未満である、請求項88に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.05未満である、請求項89に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.04未満である、請求項90に記載の単離ポリペプチド。
- 前記NALPE/NAPE活性比は、0.03未満である、請求項91に記載の単離ポリペプチド。
- 乳化剤を添加するステップをさらに含む、請求項23に記載の生地を製造する方法。
- 前記乳化剤は、i)レシチン若しくはリゾ−レシチンなどのリン脂質乳化剤;又はii)DATEM、モノグリセリド若しくはジグリセリドなどの非リン脂質乳化剤からなる群から選択される、請求項93に記載の生地を製造する方法。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも80%の配列同一性を有するタンパク質配列を含むホスホリパーゼA1酵素を含む単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項95に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項95に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項97に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項95に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項99に記載の単離ポリペプチド。
- 前記ホスホリパーゼA1は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14又は配列番号16と100%の配列同一性を有するタンパク質配列を含む酵素である、請求項95に記載の単離ポリペプチド。
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