CN106884008A - 磷脂酶、编码基因及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及磷脂酶、编码基因及其制备方法。具体而言，本发明一种分离的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸序列，含所述多核苷酸序列的核酸构建物，含所述核酸构建物的宿主细胞。

Description

磷脂酶、编码基因及其制备方法

技术领域

本发明涉及磷脂酶、编码基因及其制备方法。

背景技术

磷脂酶(Phospholipase，PL)是生物体内存在的能水解甘油磷脂的酶，根据磷脂酶水解甘油磷脂的位点(Richmond G.S.等，Int.J.Mol.Sci.2011，12:588-612)不同，可将磷脂酶分为磷脂酶A1(Phospholipase A1，PLA1)、磷脂酶A2、磷脂酶B(Phospholipase B，PLB)、磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)、磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)以及溶血磷脂酶A，如图10所示。图10中的R₁和R₂为脂肪酰基，R₃为氨基醇类如胆碱、乙醇胺、肌醇以及丝氨酸等。

PLA1能够水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLA2则是能够水解Sn-2位的酰基酯键，产生溶血磷脂和脂肪酸。PLB则是能水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位和Sn-2位的两个酰基酯键产生甘油磷酰胆碱和游离脂肪酸的磷脂酶，该酶也同时具有溶血磷脂酶的活性。PLC是能够水解甘油骨架和磷酸基之间的磷酸酯键产生二磷脂酰甘油和磷酸极性醇酯(如磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、磷酸肌醇等)。PLD则是水解磷酸基和氨基醇之间的磷酸酯键生成磷脂酸和氨基醇。溶血磷脂酶A则是指能够水解溶血磷脂的Sn-1位或Sn-2位的脂肪酰基酯键，产物是甘油磷酸胆碱和脂肪酸。

磷脂酶是一种广泛存在于各种生物体中的酶类，譬如人体中就有PLA2、PLB、PLC等多种类型的磷脂酶。因为微生物具有生产周期短、生长条件简单、生产效率高等特点，其一直是工业酶制剂领域研究的重点。因此关于各种微生物磷脂酶的报道也非常多，如能够产PLA1的微生物有：

液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)(CN103074290)、纽波特沙门氏菌(Salmonella newport)、黄白链霉菌(Streptomyces albidoflavus)(Kazutaka M.等，J.Structural.Biology.2013，182:192-196)、(Saxena M.等，Folia Microbiol.1989，34:195-201)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、米曲霉(Aspergillusoryzae)(Shiba Y.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.2001，65(1):94-101)、黑曲霉(Aspergillus niger)(US5378623)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)(赵梦梦等，中国生物制品学杂志.2012，25(7):901-905)等。

能够产PLA2的微生物有：

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)(Ling L.等，BMC Microbio.2013，13:271-284)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)(Sugiyama M.等，J.Biol.Chem.2002，277(22):20051-20058)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(CN1328375)、变铅青链霉菌(Streptomyces livdans)(CN102226165)、超嗜热古菌Aeropyrum pemix(卢冬梅等，微生物学通报.2006，33(5):35-38)等。

能够产磷脂酶B的微生物有：

黑曲霉(Aspergillus niger)(Memon A.等，FEMS Microbio.Lett.1983，18:15-18)、嗜热菌(Thermotoga lettingae)(Wei T.等，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2015)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(Jiang F.等，Bioresour.Technol.2011，102(17):8052-8056)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Masayama A.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2010，74(1):24-30)、链霉菌NA684(Matsumoto Y.等，FEBS J.2013，280:3780-3796)、点青霉(Penicilliumnotatum)(Saito K.等，Biochim.Biophys.Acta.1968，151:706–708)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Selvaraju K.等，Biochim.Biophys.Acta.2014，1841:1383-1392)、牛莫拉菌(Moraxella bovis)(Shiell B.J.等人Protein Expr.Puri.2007，55:262-272)、产朊假丝酵母(Candida utilis)(Biosci.Biotechnol.Biochem.2006，70(2):377-386)、白假丝酵母(Candida albicans)(MukherjeeP.K.等，Microbiology.2003，149:261-267)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Oishi H.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.1996，60(7):1087-1092)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(Oishi H.等，Biosci.Biotechnol.Biochem.1999，63(1):83-90)等。

能够产溶血磷脂酶A的微生物有：

马尔尼菲青霉(Penicillium marneffi)(李凌华等，中华实验和临床感染杂志.2012，6(2):109-112)、大肠杆菌(Escherichia coli)(Karasawa K.等，J.Biochem.1985，98(4):1117-1125)、嗜肺军团菌(Legionella pheumophila)(Flieger A.等，J.Bacteriol.2001，183(6):2121-2124)、格特隐球菌(Cryptococcus gattii)(Wright L.C.等，Biochem.J.2004，384(Pt2)：377-384)、白假丝酵母(Candidaalbicans)(Takahashi M.等，Biochim.Biophys.Acta.1991，1082(2)：161-169)等。

能够产磷脂酶C的微生物有：

粘质沙雷氏菌武汉株(Serratia marcescens wuhan strain)(王常高等人，天然产物研究与开发.2003，15:345-348)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(StinsonM.W.等，Infect.Immun.1979，25(2):558-564)、八丈岛链霉菌(Streptomyceshachijyoensis)(JP49-55893)、产气荚膜梭菌(Clostridum perfringens)(Zbrozyna A.J.Acta Microbiol Pol.1966；15(2):145-151)、双酶梭状芽孢杆菌(Clostridiumbifermantans)(Miles E.M.等，J.Gen.Microbiol.1947，1(3):385-399)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)(Vasil，M.L.等，Infect.Immun.1990，58(12):4020–4029)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(R.等，J.Hyg.Epidemiol.Microbiol.Immunol.1974，18(3):259-70)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(Nygren B.，ActaPathol Microbiol.Scand Suppl.1962，160:1-88)、单核增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(Smith G.A.等，Infect.Immun.1995，63(11):4231–4237)、分枝杆菌属(Mycobacterium)(Johansen K.A.等，Infect Immun.1996，64(8):3259-3266)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)(Birch M.等，Infect Immun.1996，64(3):751-755)、黄曲霉(Aspergillus flavus)(Tuckwell D.等，Mycol.Res.2006，110(Pt 10):1140-51.)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和溜曲霉(Aspergillus tamarii)(CN101410513)、黑曲霉(Aspergillus niger)(WO2004104193)、白假丝酵母(Canidia albicans)(AndaluzE.Yeast，2001，Vol.18，711-721)、克柔氏念珠菌(Candida cruzei)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)(WO2004104193)等。

能够产磷脂酶D的微生物有：

唐德链霉菌(Streptomyces tendae)(Mander P.等，Arch.Pharm.Res.2009，32(10):1461-1467)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)(Simkhada J.R.等，Biotechnol.Lett.2009，31(3):429-435)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(Jacobs A.C.等，Infect.Immun.2010，78(5):1952-1962.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(Wilderman P.J.等，Mol.Microbiol.2001，39(2):291-303)等。

当前市场上在售的磷脂酶品种主要有LecitaseLecitase F、Oil、G999、A2、PLC等。其中Lecitase为一种人工改造的蛋白，表现为PLA1的活性，其基因来源于疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的一种脂肪酶和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)脂肪酶的杂交体。其磷脂酶的最适合作用温度在45℃附近，其脂肪酶的最适合作用温度在20℃。因此当温度高于40℃将以磷脂酶的活性为主，而脂肪酶的活性较低。是一种来自于镰刀菌属微生物Fusarium venenatum的磷脂酶A1，其最适合作用温度为55℃。F的磷脂酶为一种来自于丝状真菌溶血磷脂酶。Oil、Lecitase和A2都是PLA2，前者的基因来源于紫红色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)，后两个磷脂酶商品的基因都是猪胰腺PLA2。G999为一种仅作用于溶血磷脂的溶血磷脂酶A，PLC为一种人工改造的磷脂酶C，其能够快速作用于磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺等底物，但是几乎不作用于磷脂酰肌醇和磷脂酸。

磷脂酶可广泛应用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面(Demaria L.等，Appl Microbiol.Biotechnol.2007，74(2):290-300)。如CN1780908等公开报道了磷脂酶A可以用于烘烤、用于洗涤剂、改善水溶液或糖浆的过滤性以及制备溶血磷脂等。磷脂酶还可以应用于奶酪生产工艺中，其可以提高奶酪的得率(Nielsen P.H.等，Int J.Life CycleAssess.2009，14:137–143)。磷脂酶D可以用于制备高纯度的磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸以及利用磷脂酶D的碱基转移活性可将一些多肽、核苷和多糖类药物通过配位键连接在磷脂载体上，制成具有特殊疗效作用的脂质体等(陈石良等人，工业微生物.1999，29(4):47-50)。

磷脂酶另外一个比较具有十分广阔应用前景的用途是在油脂精炼中，磷脂酶A1、A2、磷脂酶B以及磷脂酶C都可应用于酶法脱胶过程(Clausen K.，Eur.J.Lipid Sci.Tech.103(6)，2001，333-340.；Jiang F.等，Bioresour.Technol.2011，102(17):8052-8056；CN102634411、CN107455等)。

植物油毛油中的磷脂成分非常复杂，以大豆油的毛油为例，其中的磷脂成分有磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、甘油磷脂酰胆碱(PG)、双磷脂酰甘油(DPG)以及鞘磷脂(SM)等(Glonek T.JAOCS.1998，75(5):569-573)。如此多的磷脂成分存在于胶质中，为了达到较好的脱胶效果就要求所使用的磷脂酶具有相对低的底物选择性，通常的PLA和PLB都基本满足此条件，而PLC则具有较高的底物选择性。

EP0513709第一次提出了有效的酶法脱胶的方法，这一方法是首次使用PLA2进行切割磷脂的Sn-2的脂肪酸，在40℃或60℃的温度条件下，在pH5.0-5.5的条件下能够使脱胶油中的磷残留量降低到5ppm以下。

US2007/13477则公开了PLA1在植物油酶法脱胶中的最佳pH值在4.5和5.0之间。并提到反应的优选pH在约4.0的条件下进行最理想，此时体系中钙镁离子会较少与缓冲液中的阴离子结合成难溶盐。

EP1788080公开了一种使用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的磷脂酶C进行脱胶的方法。WO2008/094847则公开了一种磷脂酶A1、磷脂酶A2和磷脂酶C共同作用的脱胶工艺。

综上所述，现有的商品化磷脂酶以及现有报道的磷脂酶仍然不能满足实际应用的需求。譬如，在植物油的酶法脱胶工艺中，某些商品化的磷脂酶存在作用pH值偏高、残留脂肪酶活性以及某些磷脂酶的温度稳定性过高导致残留从而影响后期成品油的品质等。为此开发新型的磷脂酶就顺应了技术发展的需求，本发明则提供了一种具有特定磷脂酶活性的蛋白和多肽。具体地，所述的磷脂酶能够水解磷脂的脂肪酰基酯键，产生溶血磷脂。该磷脂酶不能水解三油酸甘油酯，没有脂肪酶活性，最适合作用温度为50℃，最适合作用pH值为7.5，在pH5.5-9.5的宽广pH范围内皆具有很好的磷脂酶活性。本发明多肽的磷脂酶活性不被EDTA及大多数的金属离子抑制。本发明多肽在pH6.0-9.0的范围内具有很好的稳定性，在40℃以下的稳定性也非常高，当温度超过50℃时该酶迅速失活，因此不用担心后期会残留在产品中。

发明内容

本发明第一方面提供一种分离的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多核苷酸序列；

(2)与(1)所述多核苷酸序列互补的序列；和

(3)(1)和(2)所述多核苷酸序列的长15－30个碱基的片段。

在一个具体实施例中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，所述核酸构建物含有本发明的多核苷酸序列。

在一个具体实施例中，所述核酸构建物含有SEQ ID NO:1或3所示的多核苷酸序列。

在一个具体实施例中，所述核酸构建物还含有调控序列。

在一个具体实施例中，所述调控序列为启动子和转录终止子。

在一个具体实施例中，所述启动子为T7启动子。

在一个具体实施例中，所述转录终止子为T7终止子。

在一个具体实施例中，所述核酸构建物是表达载体。

在一个具体实施例中，所述表达载体用pET24a载体构建。

本发明第四方面提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的核酸构建物。

在一个具体实施例中，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌、假单胞菌、米曲霉、黑曲霉、里氏木霉和酿酒酵母。

本发明还包括本发明的多肽、多核苷酸序列、核酸构建物和宿主细胞在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良、食品工业和医药工业中的用途，尤其是在制备油脂精炼、磷脂改性、饲料改良、食品工业和医药工业中使用的磷脂酶中的用途。

附图说明

图1：野生酶的纯化结果SDS-PAGE及活性酶谱图。M：蛋白分子量Marker；1：野生纯化蛋白的非还原电泳；2：本发明多肽的活性酶谱条带。

图2：pET24a-stpl载体图。

图3：本发明多肽水解磷脂酰胆碱和三油酸甘油酯的TLC结果。1：1，2-二油酸甘油酯；2：1，3-二油酸甘油酯；3：1-油酸甘油酯；4：2-油酸甘油酯；5：三油酸甘油酯；6：pH6.0体系下的本发明多肽对Triolein的作用；7：pH7.8体系下的本发明多肽对Triolein的作用；8：pH6.0体系下的本发明多肽对磷脂酰胆碱的作用；9：pH7.8体系下的本发明多肽对磷脂酰胆碱的作用。

图4：STPL水解磷脂酰胆碱的磷脂成分变化的TLC结果。1：磷脂酰胆碱；2：本发明多肽在pH6.0体系下的水解磷脂酰胆碱的磷脂类产物；3：本发明多肽在pH7.8体系下水解磷脂酰胆碱的磷脂类产物；4：溶血磷脂酰胆碱。

图5：pH值对本发明多肽活力的影响。

图6：温度对本发明多肽活力的影响。

图7：金属离子及EDTA对本发明多肽酶活性的影响。

图8：本发明多肽的pH稳定性曲线。

图9：本发明多肽的温度稳定性曲线。

图10：磷脂酶的分类。

具体实施方式

本发明提供了一种具有磷脂酶活性的多肽，其编码基因序列，该多肽的重组制备方法、该多肽的酶学性质及其应用等。

具有磷脂酶活性的多肽

本发明的多肽可获得自任何属的微生物。在优选的方面，其来源于原核微生物细胞及其胞外产物。在更优选的方面，本发明的多肽是来源于放线菌纲(Actinobacteria)微生物的多肽。更优选的是本发明的多肽来源于链霉菌目(Streptomycetales)的微生物。更优选的是本发明多肽是来自于链霉菌科(Streptomycetaceae)的微生物。最优选的是本发明多肽是来自于链霉菌属(Streptomyces)的微生物。

在具体实施例中，本发明的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的序列。本发明还包括在SEQ ID NO:2所示序列的基础上具有一个或多个(通常为1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，和/或在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内)氨基酸的多肽。这些变异形式仍然具有本发明的活性。优选是保守性变异形式。

例如，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、如6His或Flag的标签，或Xa因子或凝血酶或肠激酶的蛋白水解酶位点。应理解，这些氨基酸序列的存在不会影响到所得多肽的活性。因此，本发明也包括在本发明多肽的C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为8以内)所得的多肽，这些多肽仍具有本文所述的磷脂酶活性。

根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明所提供的多肽具有能够水解二脂肪酰基磷脂的Sn-1位的磷脂酶活性，分子量约为25KDa。本发明的磷脂酶不能水解三油酸甘油酯，没有脂肪酶活性。本发明磷脂酶的最适合作用温度为40～53℃，优选50℃；在pH5.5-9.5的宽广pH范围内皆具有很好的磷脂酶活性，最适合作用pH值为7.5。本发明多肽的磷脂酶活性不被EDTA及大多数的金属离子抑制。本发明多肽在pH6.0-9.0的范围内具有很好的稳定性，在40℃以下的稳定性也非常高，当温度超过50℃时该酶迅速失活，因此不用担心会有残留。因而该多肽无疑会在食品加工、油脂脱胶、医药等多个领域具有十分广阔的应用前景。

多核苷酸

本申请包括本发明多肽的编码核苷酸序列，SEQ ID NO:1显示了本发明多肽的编码序列之一。所述“编码序列”包括编码本发明所述多肽的核酸序列，与SEQ ID NO：1高度同源的序列。编码本发明多肽的序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，但与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有差别的核苷酸序列。SEQ ID NO:3显示了本发明多肽的编码核苷酸序列的另一例子。

编码本发明多肽的序列包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的片段、类似物、衍生物和变异形式。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码本发明多肽的多核苷酸。

本发明的多肽的编码序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

核酸构建体

本发明也涉及包括与指导编码序列在合适宿主细胞中，在与该调控序列相适合的条件下表达的一个或多个调控序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体。编码本发明多肽的多核苷酸可以多种方式被操作以保证该多肽的表达。在其插入载体之前该多核苷酸序列的操作可能根据该表达载体而是合乎需要或必需的。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。

调控序列可以是合适的启动子序列，为用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列包含接到多肽表达的转录调控序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

用于指导本发明的核酸构建体，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从噬菌体T7启动子、大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因等。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞正转录的合适启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉糖化酶(glaA)、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、里氏木霉葡聚糖内切酶等基因获得的启动子及其突变、截短和混合(hybrid)启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子可获得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用启动子由Romanos et al.，1992，Yeast 8:423-488描述。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，为宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

用于细菌宿主的优选终止子可以是来自T7噬菌体的终止子。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子获得自米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主细胞的优选终止子获得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C、酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶、巴斯德毕赤酵母醇氧化酶基因等。

调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。签到序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。

调控序列也可以是编码与多肽的氨基酸末端连接的氨基酸序列并且指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。核苷酸序列编码序列的5′端可固有地包含天然连接具有编码分泌多肽的编码区节段的翻译阅读框的信号肽编码区。备选地，编码序列的5′端可包含与该编码区外源的信号肽编码区。当编码序列非天然地包含信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。备选地，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入选择的宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区，即分泌进入培养基，都可用于本发明。

表达载体

本发明也涉及包括本发明多核苷酸的重组表达载体。在此各种核酸和调控序列可被连接在一起以产生可能包括一个或多个容许在这种位点插入或取代该编码多肽的核苷酸序列的方便限制性位点的重组表达载体。备选地，本发明的核苷酸序列可通过插入核苷酸序列或包括进入适当表达载体的序列的核酸构建体而被表达。在制造表达载体时，编码序列位于载体中以使得该编码序列可操作地连接用于表达适当调控序列。

重组表达载体可以使能够方便地经受重组DNA方法并且可导致感兴趣的核苷酸序列表达的任何载体(如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与其中被导入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性或闭合的环形质粒。

载体可以是自主复制的载体，即作为染色体外实体存在，其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于保证自我复制的任何方式。备选地，载体可以是当被导入宿主细胞时，整合到基因组中并且与其已经被整合进入的染色体一起复制的载体。此外，可使用一起包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA的单个载体或质粒或两个或多个载体或质粒，或转座子。

本发明的载体优选包含一个或多个容许容易选择转化、转染、转导等细胞的可选择标记。可选择的标记是基因，其产物提供对抗生素或病毒的抗性、对重金属的抗性、原养型至营养缺陷型等。

本发明的载体优选包含容许该载体整合进入宿主细胞基因组或该载体在细胞中独立于基因组自主个复制的元件。

一个以上拷贝的本发明的多核苷酸可被插入宿主细胞以增加该基因产物的产量。多核苷酸拷贝数的增加可通过将至少一个附加拷贝的序列整合进入宿主细胞基因组或通过包括可扩增的选择标记基因和该多核苷酸来获得，其中包含扩增拷贝的选择标记基因并且由此包含附加拷贝多核苷酸的细胞可通过在存在适当的选择剂时培养该细胞来筛选。

本发明的载体优选包含人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。

本发明的表达载体更为优选地选择可用于大肠杆菌中表达的载体。本发明的载体优选商品化的载体如pET系列的载体，更优选地采用pET24a载体。

宿主细胞

本发明也涉及包括被用于重组生产多肽的本发明多核苷酸的重组宿主细胞。包括本发明多核苷酸的载体被导入宿主细胞以使得该载体如早先说明的作为染色体的组成部分或作为染色体外的自我复制载体来维持。宿主细胞的选择很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

宿主细胞可以是单细胞微生物或非单细胞微生物。单细胞微生物例如革兰氏阳性细菌，包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌等；或链霉菌细胞，例如钱青紫链霉菌；或革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌和假单胞菌属。在优选的方面，细菌宿主是枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和大肠杆菌细胞。

宿主细胞也可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物、酵母或真菌细胞。在优选的方面，宿主细胞是真核细胞，如在此使用的“真核”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门等。

在更优选的方面，宿主细胞是子囊菌门的细胞如酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)以及Komagataella属等。

在最优选的方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、变铅链霉菌(Streptomyces lividans)、紫红链霉菌(Streptomyces violaceoruber)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)等。在另外最优选方面，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)和变铅链霉菌(Streptomyces lividans)细胞。

生产方法

本发明涉及生产本发明多肽的方法，包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞；以及(b)回收该多肽。

具体而言，本发明涉及生产本发明多肽的方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:3所示的编码具有磷脂酶活性的多肽的核苷酸序列；以及(b)回收该多肽。

在优选的方面，本发明的多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或增加一段因重组表达方式所产生的氨基酸序列。

本发明的生产方法中，细胞可以利用本领域已知的方法在适于生产多肽的培养基中培养。例如，细胞可通过在实验室或工业发酵罐中进行的摇瓶培养和小规模或大规模的发酵(包括连续的、分批的、分批补料或固态发酵)，在合适的培养基和容许该多肽表达和/或分离的条件下进行培养。培养发生在利用本领域已知的方法包括碳源和氮源和无机盐的合适培养基中。合适的培养基可获得自商业供应者或可根据公开的组合物来制备。如果该多肽分泌进入培养基，该多肽可从培养基直接回收。如果该多肽不分泌进入培养基，它可从细胞裂解物回收。

多肽可利用本领域已知的特异于该多肽的方法来检测。这些检测方法可包括特异抗体的使用，酶产物的形成，或酶底物的消失。例如，酶活性测定可如在此说明的用来测定多肽的活性。

在优选的方面，本发明采用来源于大豆的磷脂酰胆碱为底物来测定该多肽的活力大小，该方法以大豆来源的磷脂酰胆碱为反应底物，通过本发明多肽的催化产生游离脂肪酸。而后采用游离脂肪酸定量检测试剂盒(Wako PureChemical Industries，Ltd，Osaka，Japan)进行定量。根据产生游离脂肪酸的量从而计算出酶的活性。本发明的酶活力单位定义为每分钟催化产生1微摩尔的游离脂肪酸为1个单位。

本发明所描述的多肽可利用本领域已知的方法来回收。例如，多肽可通过常规方法，包括但不限于离心、过滤、超滤、萃取、层析、喷雾干燥、冷冻干燥、蒸发或沉淀等从培养基回收。

本发明的多肽可通过本领域已知的多种方法来纯化，包括但不限于色谱法(如离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦、分子排阻)，电泳法(例如等电聚焦)、差异溶解度(如盐析沉淀)、SDS-PAGE或萃取法等。

多肽的性能及用途

本发明的多肽具有磷脂酶A活性，可应用于油脂精炼、磷脂改性、饲料改良剂、食品工业和医药工业等多个方面，包括但不限于用于烘烤、用于洗涤剂、改善水溶液或糖浆的过滤性等。

本发明的多肽可以纯的酶制品的形式提供，也可以组合物的形式提供。组合物可以是粉末组合物，也可以是液体组合物，或糊状组合物。以组合物形式提供时，根据该含酶组合物的不同用途，该组合物可含有不同的辅料。可将本领域已知的辅料添加到本发明的组合物中，这类辅料包括但不限于山梨醇、山梨酸钾、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、蔗糖、甘露糖、海藻糖、淀粉、氯化钠、氯化钙等稳定剂或其他物质中的一种或多种。

本发明方法中使用的本发明多肽的量可根据实际情况加以确定。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社2002，[美]J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔著，黄培堂等译)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。本发明中所用化学品若无特别说明，均商购自sigma公司，为生物级或分析纯级。

实施例

本发明采用来源于大豆的磷脂酰胆碱为底物来测定该多肽的活力大小，该方法以大豆来源的磷脂酰胆碱为反应底物，通过本发明多肽的催化产生游离脂肪酸。而后采用游离脂肪酸定量检测试剂盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd，Osaka，Japan)进行定量。根据产生游离脂肪酸的量从而计算出酶的活性。本发明的酶活力单位定义为每分钟催化产生1微摩尔的游离脂肪酸为1个单位。

培养基(用于重组蛋白发酵、液体菌株培养等)：

LB培养基：1wt％胰蛋白胨，0.5wt％酵母提取物，1wt％NaCl。

实施例1：本发明多肽野生酶的分离纯化和部分氨基酸序列信息鉴定

取1支新鲜培养的分离自土壤的链霉菌BMW0189斜面(麦芽汁葡萄糖琼脂培养基37℃培养24-48h)，从该斜面接种1-3环菌至30mL装液量的250mL规格的种子摇瓶中，而后于37℃，180rpm(5cm振幅)培养，培养时间为20h左右。

种子摇瓶培养基为：

硫酸铵0.1％，酵母粉0.5％，Tryptone 0.5％，三水合磷酸氢二钾0.12％，氯化钾0.1％，无水硫酸镁0.06％；

取1mL培养好的液体种子接种至30mL装液量的250mL规格的发酵摇瓶中，35℃，180rpm(5cm振幅)，发酵时间为24h。

发酵培养基为：

A：硫酸铵0.1％，酵母粉0.5％，Tryptone 0.5％，三水合磷酸氢二钾0.12％，氯化钾0.1％，无水硫酸镁0.06％；

B：大豆混合磷脂(美亚斯)，3g/45mL；

C：无水氯化钙溶液0.24％；

混合：121℃灭菌20min，而后按照A20mL+B5mL+C5mL的比例进行混合，每个250mL的发酵摇瓶的装液量为30mL。

收集培养好的发酵液，离心去除菌体得到去除菌体的发酵液约700mL。于4℃条件下缓慢加入25％饱和度的硫酸铵进行盐析。盐析结束后，于冰箱静置2h左右，10000rpm，15min离心回收上清液。继续往上相中加入硫酸铵直至饱和度达到80％，而后静置2h左右，4℃，10000rpm，离心20min，收集沉淀。

将沉淀溶解于100mL的含0.8M硫酸铵且pH7.5的50mM Tris.HCl缓冲液中；

采用5mL的疏水层析预装色谱柱(HiTrapTM phenyl HP 5mL，GEhealthcare)对上述沉淀溶解液进行层析纯化。层析条件如下：

缓冲液A：50mM Tris.HCl 0.8M硫酸铵，pH7.5

缓冲液B：10mM Tris.HCl，pH7.5

流速：2mL/min

梯度：0-100％缓冲液B，40倍柱体积

收集：每2mL收集

采用平板法(参考Kim M.K.等人的1994年发表的文献，Biotech.Tech.1994，8(9):635-638)检测每个收集样品管是否具有磷脂酶活性。

收集平板法检测活性相对较高的样品管，合并后直接用MonoQ柱(MonoQTM 4.6/100PE，GE Healthcare)进行层析纯化层析条件如下。

缓冲液A：20mM Tris-HCl pH8.0

缓冲液B：20mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl

流速：1mL/min

梯度：0-100％缓冲液B，90倍柱体积

收集：每2mL收集

用上述的平板法对每个样品管进行活性检测，而后对活性较高的样品管进行SDS-PAGE检测。选择SDS-PAGE纯度较高的样品管进行活性酶谱电泳，结果见图1。

酶谱分析的方法参考Cadirci(Cadirci B.H.，Yasa I.An organic solvents tolerantand thermotolerant lipase from Pseudomonas fluorescens P21.J.Mol.Catal.B:Enzym.2010，64:155–161)，Yadav(Yadav R.P.，Saxena R.K.，Gupta R.，et al.Rapidzymogram for lipase.BioTechniques 1998，24(5):754–756)，Masayama(MasayamaA.，Kuwana R.，Takamatsu H.，et al.A Novel Lipolytic Enzyme，YcsK(LipC)，Locatedin the Spore Coat of Bacillus subtilis，Is Involved in Spore Germination.J.Bacteriol.2007，189(6):2369–2375)等人脂肪酶酶谱检测方法基础上建立的。该检测方法与普通SDS-PAGE在凝胶准备、上样和电泳过程等都基本相同。不同的是该方法在电泳样品准备阶段使用的上样缓冲液中不含有DTT或2-巯基乙醇等还原剂，另外电泳样品只是室温放置不能加热或煮沸变性；酶谱检测方法在电泳时与普通SDS-PAGE不同的是要使得电泳过程尽可能产热少，因此可以在90V或更低的电压下电泳。在电泳结束后将含有待检测样品的凝胶放置于0.5-2.5％的Triton X-100缓冲液中进行两次室温振荡，每次30min。而后取出凝胶用20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤3次每次10min以除去残余的Triton X-100并实现酶蛋白的复性。而后将该凝胶置于磷脂平板上，而后于37℃放置数小时后即可用肉眼观察到明显白色条带。

小心地从SDS-PAGE胶上切出目标蛋白条带，而后送样至上海博苑生物科技有限公司进行LC-MS/MS质谱鉴定法对该条带的蛋白进行鉴定(参考盛泉虎等，生物化学与生物物理学报，2000，32(6):595-600)。经过数据分析，得到了两个可靠的肽段信息如下。

肽段1：APSAHVVVLYPR

肽段2：TGDVTGGQLK

实施例2：本发明多肽编码多核苷酸序列的克隆

根据Qiagen RNeasy Plant Mini Kit说明书操作，提取BMW0189的总RNA。根据Promega Reverse Transcription Kit说明书操作，将RNA反转录为cDNA。而后根据实施例1中所得的2个肽段的氨基酸序列信息设计的兼并引物。SEQID NO:4是根据肽段1中的VLGYPR设计上游简并引物，其简并度为128。SEQID:5是根据肽段2中的TGDVTG序列设计的上游引物，其简并度为128。

以SEQ ID NO:4-5作为上游引物，以oligo dT作PCR的下游引物，上述制备的cDNA为模版。Ex Taq 0.5μL，10×Ex PCR缓冲液5μL，dNTP混合物6μL，上游引物1μL，oligo dT 1μL，cDNA 1μL，水33.5μL。反应条件：95℃5min，35个循环(95℃30s，50℃30s，72℃2.5min)，72℃10min，16℃保温。所得阳性PCR产物胶回收后，直接送至上海生工生物工程有限公司测序。

经测序，以SEQ ID NO:5作为上游引物进行PCR反应所获的序列的长度最长，其包括了SEQ ID NO:4作为上游引物的PCR产物。根据此PCR的结果，采用RLM-RACE Kit(Invitrogen)进行5’端序列的克隆，从而得到完整的目标蛋白的编码多核苷酸序列，见SEQ ID NO:1，该基因命名为stpl。

实施例3：本发明多肽表达载体及工程菌的构建

SignalP 4.1server软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对SEQ IDNO:1编码的多肽进行分析，结果确定第1-29位的氨基酸序列为信号肽序列，去除信号肽的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。而后以去除信号肽的序列为基础，对SEQ ID NO:1用大肠杆菌作为宿主进行密码子优化，结果为SEQ ID NO:3。优化后的核苷酸序列由上海生工生物进行基因合成。

以SEQ ID NO:3为模板，以SEQ ID NO:6所示的序列和SEQ ID NO:7所示序列为上下游引物进行目标序列的克隆。

使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离纯化目标条带，并使用美国OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM胶回收试剂盒进行目标条带的回收。胶回收产物用Nde I和Xho I两种限制性内切酶进行酶切反应，而后用OmegaBio-Tek公司的E.Z.N.ATM的产物回收试剂盒回收酶切产物。同时进行pET24a载体的酶切及酶切产物回收。

各取适量的上述两种回收的酶切产物进行混合，加入一定量的连接酶和连接酶缓冲液后，放置于22℃水浴中反应2小时左右。

取出1根装有100μL DH5α感受态细胞，冰浴融化后，相应加入20μL的连接产物，冰浴30min。而后于42℃热激90秒后，立即放置于冰浴中1-2min后，往每管中加入880μL的LB培养基。而后于37℃，200rpm摇床进行预培养60min左右。而后于12000rpm离心3min后，去除部分清液，留约100μL清液，充分悬浮沉淀菌体后，取全部液体涂布于相应的含卡那霉素的平板上，37℃培养过夜。

取出培养过夜的转化平板，挑选部分菌落进行菌落PCR验证，挑选菌落PCR验证结果为阳性的重组子扩大培养。而后提取重组质粒，该质粒即为构建成功的表达载体，命名为pET24a-stpl，其结构见图2所示。

再次将重组质粒pET24a-stpl按上述方法转化至E.coli BL21(DE3)的感受态细胞中，从而得到能够用于诱导表达产生本发明多肽的工程菌菌株BL21-pET24a-stpl。

实施例4：重组酶的制备

将上述构建好的重组菌BL21-pET24a-stpl接种至LB液体培养基中，37℃，150rpm培养过夜。将培养好的菌液按照1％的接种量接种至LB液体中培养约3h，而后加入0.1mM IPTG至摇瓶中，而后于16℃、150rpm进行诱导表达过夜。

收集表达好的发酵液4℃离心5min，收集细胞，去除上清。加入适量的50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液进行悬浮，而后在冰浴的情况下超声波破碎细胞。破碎液经过冷冻离心后收集上清液，而后用固定结合有镍离子的亲和介质对该液体进行亲和层析纯化，纯化好的样品即为本发明所提供的重组多肽STPL。

采用游离脂肪酸定量检测试剂盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd，Osaka，Japan)对酶反应过程中产生的游离脂肪酸进行定量，而后计算出该酶的活力为3.92单位/mL。1个活力单位定义为每分钟催化水解产生1微摩尔的游离脂肪酸所需要的酶量。

实施例5：本发明多肽的部分酶学性质

(1)本发明多肽催化磷脂酰胆碱的产物TLC分析

用实施例4所制备的本发明多肽的重组蛋白水解磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine PC)以及三油酸甘油酯。将0.01mL酶液、0.5mL的0.2MpH值4.5乙酸-乙酸钠缓冲液、0.5mL的4％磷脂酰胆碱水溶液(使用纯度超过98％的磷脂酰胆碱，购自阿拉丁试剂有限公司)以及1％的Triolein混合，于40℃水浴，反应1小时左右。反应结束后，加入1mL的正己烷进行萃取，振荡混匀，12000rpm离心2分钟，取出上层有机相部分，加入至一新管中。取下层水相重复萃取、离心操作，收集、合并两次的正己烷萃取液，开盖，置于通风橱中将有机相挥发完全。每管中加15μL异丙醇，充分溶解。取5μL点层析板。进行TLC检测(TLC检测方法参见文献Toida J.等，Bioscience BiotechnologyBiochemistry，1998，62(4):759-763)，结果见图3。

由图3可以看出，本发明多肽能够催化水解磷脂酰胆碱产生大量的游离脂肪酸，说明本发明多肽是一种PLA或PLB类磷脂酶。但是本发明多肽不能水解三油酸甘油酯，说明本发明多肽并不具有脂肪酶活性。

取实施例4所制备的本发明多肽10μL加入至1mL体积的1％含量的pH6.0和pH7.8的大豆磷脂酰胆碱溶液中，45℃反应1个小时后，加入1mL的氯仿进行萃取。经过离心后，取出下相0.5mL置于通风橱中风干。风干结束后加入50μL体积的氯仿/甲醇溶液(95:5v/v％)进行溶解，而后取5μL进行点样进行薄层层析分析，结果见图4。

磷脂的TLC检测方法参考Nzai J.M.等人1998年发表的文献(Nzai J.M.，Proctor A.Food Chemistry，1998，63(4):571-576)。

由图4的结果看出，本发明多肽STPL水解磷脂酰胆碱能够产生溶血磷脂，因此本发明多肽是一种磷脂酶A。

(2)pH值条件对本发明多肽磷脂酶及脂肪酶活力的影响

配制0.2M的pH值分别为3.0、3.5、4.0、4.5、5.5、6.1和6.5的乙酸-乙酸钠缓冲液；配制0.2M的pH值为7.0、7.5、8.0和8.5的Tris-HCl缓冲液；配制0.2M浓度的pH值为9.0、9.5和10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。

按照前述的游离脂肪酸检测方法进行磷脂酶活力的检测。分别在以上不同pH条件下的检测本发明多肽STPL的磷脂酶活力值。以最高磷脂酶活力的pH点的磷脂酶酶活作为100％，其它pH的磷脂酶酶活除以该最高酶活，从而得到该pH的相对磷脂酶酶活，以相对磷脂酶酶活为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对磷脂酶酶活。本发明多肽在不同pH值条件下的相对磷脂酶酶活结果见图5。

由图5可以看出，本发明多肽在pH7.5时的磷脂酶活力最高，在pH5.5-9.5的范围内其磷脂酶活力均比较高。

(3)温度对本发明多肽的磷脂酶活力的影响

分别在30℃、32℃、35℃、40℃、45℃、50℃、53℃和55℃一系列的温度下测定实施例4制备所得的重组多肽的磷脂酶活力。以最高磷脂酶酶活的温度点的磷脂酶酶活作为100％，其它温度点的磷脂酶活除以该最高酶活，从而得到该温度点的相对磷脂酶酶活，以相对磷脂酶酶活为纵坐标，温度点为横坐标，以平滑曲线依次连接各温度点的相对酶活，将这些相对酶活以平滑曲线连接，结果见图6。

图6结果显示，本发明多肽的最适合作用温度为50℃。在40-53℃，本发明所提供的重组多肽的磷脂酶活力都超过80％。

(4)金属离子及EDTA对本发明多肽的磷脂酶活力的影响

分别配制250mM的钙离子、镁离子、锰离子、锌离子、钴离子、镍离子、铁离子、钠离子、钾离子母液，配制250mM的EDTA母液。将上述母液分别按照5.0mM的量加入至磷脂酶的反应体系中，测定酶活。以不添加任何离子及EDTA的样品所测的磷脂酶酶活力值为100％，作为对照，计算其它添加物的样品磷脂酶及脂肪酶的相对活力值，结果见图7。

由图7可以看出，5mM的铁离子和锌离子强烈地抑制了对本发明多肽的磷脂酶活性，其活性相应下降超过80％。5mM的钙离子则使得酶活力下降40％左右，而其他的金属离子及EDTA对本发明多肽的磷脂酶活性影响则较小。

(5)本发明多肽的pH稳定性

将实施例4中所制备的本发明多肽与4倍体积的0.2M浓度的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0一系列不同pH值的缓冲液进行混合后，置于4℃的环境中放置1小时后，按照前述的滴定法进行磷脂酶活力的测定。以实施例4中所制备的多肽的磷脂酶活力值为100％，计算各个pH值残留酶活力的相对值，以残留酶活力相对值为纵坐标，pH值为横坐标，以平滑曲线依次连接各pH的相对酶活，结果见图8。

图8的结果显示，本发明制备所得的多肽在pH6.0-9.0的范围内均比较稳定，尤其在pH8.5和pH9.0的体系里的稳定性更佳。

(6)本发明多肽的温度稳定性

将酶液按照500μL量分装成若干小份，分别放置于4℃、25℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的水浴锅中保温30min。而后进行磷脂酶活力的检测，以未孵育的样品的磷脂酶活力值为100％，其它温度点的磷脂酶酶活除以该酶活力值从而得到其相对酶活值，以相对酶活为纵坐标，温度为横坐标，以平滑曲线连接各温度点的相对酶活，结果见图9。

图9的结果显示本发明多肽在40℃以下具有较好的热稳定性，但是温度较高时酶活力很快就下降，超过50℃及以上温度的条件下保温半个小时后完全失活。

Claims (10)

1.一种分离的多肽，所述多肽含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

2.一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

(1)编码权利要求1所述多肽的多核苷酸序列；

(2)与(1)所述多核苷酸序列互补的多核苷酸序列；和

(3)(1)和(2)所述多核苷酸序列的长15－30个碱基的片段。

3.如权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:1或3所示。

4.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物含有权利要求2或3所述的多核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物还含有启动子和转录终止子。

6.如权利要求4或5所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是表达载体，优选为用pET24a载体构建的表达载体。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4－6中任一项所述的核酸构建物。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自芽孢杆菌、大肠杆菌、毕赤酵母、链霉菌、假单胞菌、米曲霉、黑曲霉、里氏木霉和酿酒酵母。

9.一种生产权利要求1所述多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)在有助于生产多肽的条件下培养权利要求7或8所述的宿主细胞；以及(b)回收所述多肽。

10.权利要求1所述的多肽、权利要求2或3所述的多核苷酸、权利要求4－6中任一项所述的核酸构建物或权利要求7或8所述的宿主细胞在油脂精炼、磷脂改性、饲料改良、食品工业和医药工业中的用途。